환경 중 잔류의약물질 대사체 분석방법 확립에 관한 연구(Ⅱ...

발간 등 록번 호 NEIR NO. 2010-85-1260

11-1480523-000702-01

환경 중 잔류의약물질 대사체 분석방법 확립에

관한 연구(Ⅱ) -테트라사이클린계 항생제-

환경건강연구부 화학물질연구과

황승률, 강영렬, 박진수, 구소현, 김일규, 신선경, 석광설

Development of Analytical Method for the

Metabolites of PPCPs in the Environment (Ⅱ)

- Tetracyclines -

Seungryul Hwang, Yongyeul Kang, Jinsoo Park, Sohyun Koo,

Ilgyu Kim, Sunkyoung Shin, Kwangseol Seok

Chemicals Research Division

Environmental Health Research Department

National Institute of Environmental Research

2010

목 차❚

i

목 차

목차 ······························································································································ ⅰ표목차 ·························································································································· ⅱ그림목차 ······················································································································ ⅲAbstract ······················································································································· ⅳ

Ⅰ. 서 론 ·······················································································································1

Ⅱ. 연구내용 및 방법 ································································································2

1. 연구 배경 ·············································································································2

가. 테트라사이클린계 항생제의 대사체 개요 ·················································2

(1) 테트라사이클린계 항생제와 내성 ······························································2

(2) 국내 테트라사이클린계 항생제 현황 ························································3

(3) 테트라사이클린계 항생제 및 대사체의 특성 ··········································4

나. 환경 중 테트라사이클린계 항생제의 대사체 ···········································6

(1) 환경 중 테트라사이클린계 항생제 ····························································6

(2) 테트라사이클린계 항생제의 대사체 분석방법 ········································7

2. 연구 목표 ·············································································································9

3. 연구 내용 및 방법 ························································································· 10

가. 테트라사이클린계 대사체 분석방법 확립 ············································· 10

(1) 시약 및 초자 ································································································10

(가) 시약 ··········································································································10

(나) 초자 ··········································································································10

(2) 테트라사이클린계 대사체 기기분석 ························································11

(가) 질량분석기 ······························································································11

(나) 액체크로마토그래피 ··············································································11

(3) 테트라사이클린계 대사체 전처리 ····························································11

목 차❚

i

(가) 시료의 준비 ····························································································11

(나) 고체상추출법 ··························································································12

나. 환경시료의 테트라사이클린계 대사체 분석 ···········································13

(1) 환경시료 ········································································································13

(2) 대사체 분석 ··································································································13

Ⅲ. 연구결과 및 고찰 ······························································································15

1. 테트라사이클린계 대사체 분석방법 ·····························································15

가. LC/MS/MS 분석 방법 ················································································15

(1) 질량이온 ········································································································15

(2) 크로마토그래피 ····························································································17

나. SPE 전처리 방법 ··························································································21

(1) 카트리지 ········································································································21

(2) 검출한계 ········································································································24

2. 환경시료 테트라사이클린 대사체 분석 ····················································· 25

가. 환경시료 ·········································································································25

나. 테트라사이클린계 대사체 검출 ·································································26

Ⅳ. 결 론 ···················································································································27

참고문헌 ······················································································································29

부록(질량스펙트럼) ··································································································31

목 차❚

ii

표 목 차

<Table 1> Consumption of veterinary antibiotics in Republic of Korea(2009) 3

<Table 2> Metabolites of tetracycline, chlortetracycline and oxytetracycline · 5

<Table 3> Tetracyclines in dung slurry of cow, pig and chicken in China · 6

<Table 4> Previously reported analytical methods for tetracycline and their

transformation products ·······································································8

<Table 5> Precursor ions and product ions of tetracyclines and their

metabolites ···························································································16

<Table 6> Analytical condition of LC/MS/MS ···············································17

<Table 7> Precision and accuracy of SPE-LC/MS/MS analysis ·················23

<Table 8> Method detection limit of tetracyclines and their metabolites 24

목 차❚

iii

그 림 목 차

<Fig. 1> Chemical structure of tetracyclines ·······················································4

<Fig. 2> Biological activity of tetracycline metabolites ····································5

<Fig. 3> Environmental samples(wastewater and surface water) ················14

<Fig. 4> LC/MS/MS chromatogram of tetracyclines and their metabolites · 18

<Fig. 5> Calibration curve of tetracycline and metabolites ··························19

<Fig. 6> Calibration curve of chlortetracycline and metabolites ·················20

<Fig. 7> Calibration curve of oxytetracycline and metabolites ····················20

<Fig. 8> Pretreatment of tetracycline and their metabolites using HLB cartridge 22

<Fig. 9> Pretreatment of tetracycline and their metabolites using MAXcartridge 22

<Fig. 10> Detected level of tetracycline and their metabolites in wasteMass

spectrum of tetracycline ·····································································31

Abstract❚

iv

Abstract

Tetracycline antibiotics have been widely used to treat disease and protect

health of human and animals in the world. In Korea, the consumption of

tetracycline antibiotics was 288 tones/year in 2009, which means

approximately 29% of totally used veterinary antibiotics. Administrated

tetracycline antibiotics are excreted through urine and feces of animals and

seems to be introduced into the environment especially surface water, soil

etc. It is suspected that antibiotics including tetracyclines in the environment

might cause the adverse effect on ecosystem and human health. In the case

of tetracyclines, there are kinds of metabolites and transformation products

due to metabolism, degradation etc., which have similar biological activity

comparing with their parent compounds. Therefore, to assess the adverse

effect of tetracyclines completely, it is important to investigate the

occurrence, fate and behavior of the metabolites and transformation products

in the environment.

In this study, we try to develop the analytical method of the 8 metabolites of

3 tetracyclines(tetracycline, chlortetracycline, oxytetracycline) using SPE-LC

/MS/MS and analyzed the surface water and livestock wastewater sample

collected at the contaminated sites and near the stream. As LC/MS/MS has

tandem mass spectrometer system, we can confirm the precursor ions and

product ions; ETC(445→410), ATC(427→410), EATC(427→410), ECTC(479→444),

EACTC(461→444), EOTC(461→426), α-apo-OTC(443→426), β-apo-OTC(443→426).

For the extraction and cleanup we used the SPE using HLB and MAX cartridge

the recovery range was 78∼238%, 77∼150% respectively. The recovery of EOTC,

α-apo-OTC, β-apo-OTC were higher than 120%, caused by the transformation of

oxytetracycline under acidic condition. Tetracyclines and their metabolites

successfully detected in the livestock wastewater and surface water samples at

MDL range of 0.011∼0.056 and the error of duplicate sample was below 1%.

Ⅰ. 서 론❚

1

Ⅰ. 서 론

최초의 항생제 페니실린은 1928년 영국 런던의 성메리병원에서 플레밍에

의해 발견되었으며, 푸른곰팡이 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum)에서

생산되는 화합물이다. 페니실린의 발견과 실용화에 따라 세균에 의한 감염성

질병을 치료할 수 있게 되었고 제2차 세계대전에서 수많은 부상자들을 구할

수 있었다. 그러나 1946년 페니실린 내성을 가진 내성균이 발견되었으며 새로

운 항생제의 개발과 내성균의 출현이 반복되었다. 최근 다양한 항생제에 대한

내성을 나타내는 다재내성균이 발견되고 있으며 국내에서도 슈퍼박테리아로

언론에 보도되어 국민적 관심과 우려를 제기하고 있다.

2009년 국내 항생제 사용량은 경제협력개발기구 30개국 중 벨기에와 함께 1위이며

성인 1,000명 중 31.4명이 세계보건기구 1일 표준량의 항생제를 복용하고 있는 것으

로 조사되었다(OECD, 2010). 또한 국내 주요 축산물 생산량 대비 동물용 항생제 사

용량도 0.54 kg/톤으로 미국(0.31 kg/톤), 일본(0.39 kg/톤)에 비해 많은 것으로 조사

되었다(Safe Food, 2010). 사람과 동물에 사용된 항생제의 일부는 대사체로 변형되어

분뇨로 배설되고 하수 및 폐수처리장을 통해 하천, 토양 등 환경으로 유입된다. 환경

중 항생제 및 대사체는 생리활성물질로서 생태계 교란, 내성균 출현 등 건강과 안전

에 잠재적 영향을 미칠 수 있으므로 관심의 대상이 되고 있다. 2007∼2009년 국내

의료기관에서 다재내성균으로 알려진 아시네토박터 바우마니균(acinetobacter

baumannii)의 세파로스포린계 제3세대 항생제 세프타지딤(ceftazidime)에 대한 내성

률이 70%이었으며, 2008년 가축에서 분리한 대장균의 대표적인 동물용 항생제 테트

라사이클린(tetracycline) 내성률도 71.8%에 이르는 것으로 밝혀졌다.

최근 환경부가 실시한 환경 중 의약물질 실태조사 결과 일부 항생제가 하천수, 퇴

적물, 토양 등에서 검출됨에 따라 주요 항생제의 사람과 생태계에 대한 영향을 확

인하기 위해 환경 배출, 이동, 변환, 소멸에 대한 거동연구의 필요성이 제기되었다.

이에 따라 2009년 환경 중 설폰아미드계(sulfonamides) 항생제의 거동을 확인하기

위해 설폰아미드계 대사체에 대한 분석방법 연구가 수행되었으며, 2010년에는 테트

라사이클린계 항생제 3종과 대사체 8종에 대한 분석방법 연구를 수행하고자 한다.

Ⅱ. 연구내용 및 방법❚

2

Ⅱ. 연구내용 및 방법

1. 연구 배경

가. 테트라사이클린계 항생제의 대사체 개요(1) 테트라사이클린계 항생제와 내성

항생제는 세균의 증식을 억제하고 사멸시켜 감염성 질병의 예방과 치

료에 사용되어 왔으나, 지속적으로 다량의 항생제를 광범위하게 사용함에 따

라 항생제에 저항하는 내성균이 출현하게 되었다. 세균의 항생제 내성은 항

생제 오남용의 대표적인 부작용이며 내성균의 발생과 확산으로 치료가 불가

능한 감염성 질환에 의한 피해가 전 세계적인 문제로 부각되고 있다. 최근

여러 종류의 항생제에 대한 내성을 가지는 다재내성균에 의한 감염 사례가

국내 병원에서도 보고되어 국민적 우려와 관심이 증대되고 있다.

항생제는 세균의 세포에 침투하여 표적물질에 결합하며 세포벽, 단백질 및

핵산(DNA, RNA) 합성 억제, 세포대사 방해, 세포막의 변형 등으로 항균효과

를 나타낸다. 이러한 항균작용에 대해 세균은 항생제 활성을 저해하는 효소

의 생산, 항생제의 표적물질 변형, 세포막의 변형으로 항생제 불투과, 세포내

항생제 능동적 유출 등으로 항생제의 작용을 방해하고 내성을 가지게 된다.

따라서 항생제의 내성은 항생제의 사용에서 유래하며 내성균은 주변 환경을

통해 확산되는 것으로 보고되어 있다(Hummel R. 등 1986).

테트라사이클린계 항생제는 전 세계적으로 연간 약 20,000 톤 이상(약 50%

동물용) 사용되고 있는 것으로 확인되었으며, 분뇨를 비료로 사용한 토양에서

20 µg/kg 이상 검출되는 것으로 보고되었다(Seamus O'Connor 등, 2007). 유

럽의 경우, 1999∼2005년 동물용 항생제 사용량은 평균적으로 연간 약 1,300

톤 정도였으며 약 50%가 테트라사이클린계 항생제인 것으로 조사되었다

(Gerard Moulin 등, 2008). 이와 같이 주로 동물용으로 사용된 테트라사이클

린계 항생제는 분뇨로 배설되고 대사체와 함께 토양, 하천수 등 환경으로 유

입되어 내성균 출현과 확산의 원인이 되는 것으로 추정된다.


3

(2) 국내 테트라사이클린계 항생제 현황

국내 테트라사이클린계 항생제는 주로 동물의 질병예방과 성장촉진을

위한 목적으로 사용되고 있으며, 2009년 사용량은 288톤으로 전체 동물용 항

생제 사용량 998톤의 약 29%에 해당된다(Safe Food, 2010). 동물용으로 사용

된 테트라사이클린계 항생제는 약 50∼80%가 대사되지 않고 분뇨로 배설되

며(B. Halling-Sorensen et al, 2002), 축산폐수처리장, 퇴비 등 다양한 경로를

통해 환경생태계로 유입되는 것으로 알려져 있다. 주요 테트라사이클린계 항

생제는 클로르테트라사이클린과 옥시테트라사이클린으로 2006∼2009년 실시

된 환경 중 의약물질 실태조사 결과, 하수 및 축산폐수처리장 유입수 최대 3

mg/L, 방류수 최대 0.5 mg/L, 하천수 최대 0.005 mg/L 수준으로 확인되었

다. 테트라사이클린계 항생제의 국내 하천수에서 검출빈도는 클로르테트라사

이클린 1.3%, 옥시테트라사이클린 7.5%으로 사용량 및 검출농도에 비해 낮은

것으로 조사되었다(국립환경과학원, 2006, 2007, 2008, 2009).

Antibiotics Consumption(kg) Antibiotics Consumption(kg)Tetracyclines

Sulfonamides

Penicillines

Aminoglycosides

Macrolides

Quinolones

Ionophores

Polypeptides

Phenicols

287,712

92,122

150,589

51,209

88,124

37,418

51,366

96,532

54,543

Pleuromutilins

Quinoxalines

Lincosamides

Cephems

Streptogramins

Orthosomycins

Glycolipid

Nitrofurans

Others

35,025

4,601

5,674

3,163

8,164

5,566

2,469

0

23,890

Source : Safe Food 2010, Vol. 5, No. 1, 26-35

<Table 1> Consumption of veterinary antibiotics in Republic of Korea(2009)


4

(3) 테트라사이클린계 항생제 및 대사체의 특성

테트라사이클린계 항생제의 기본적인 화학구조를 가지고 있는 테트라

사이클린은 그림 1과 같이 탄소결합에 의한 4개의 육각 고리로 구성되어 있

으며, 하이드록실기(OH), 아민기(N(CH3)3), 카르보닐기(C=O)가 치환된 분자구

조를 가지고 있다. 탄소결합과 치환된 극성 작용기에 의해 친지질성과 친수

성을 동시에 나타내며 전체적인 이온성은 하이드록실기에 대한 용액의 pH의

영향에 의해 결정된다. 테트라사이클린을 기본구조로 다양한 테트라사이클린

계 항생제가 개발되어 사용되고 있으며 대표적인 것으로 염소와 하이드록시

기가 각각 치환된 클로르테트라사이클린과 옥시테트라사이클린이 있다.

<Fig. 1> Chemical structure of tetracyclines.

테트라사이클린계 항생제의 주요 대사체는 탄소에 결합된 아민기

(N(CH3)3)의 입체적 방향이 반대인 에피머, 산(H+) 첨가에 의한 탈수반응과

카르보닐기의 토토머화에 의한 무수물, 염기(OH-) 첨가에 의해 기존의 고리

결합 분해와 새로운 에스테르 5각형 고리결합 형성으로 인한 아포화합물 등

이며 주로 산염기 반응에 의해 생성 변화된다. 테트라사이클린, 클로르테트라

사이클린, 옥시테트라사이클린의 주요 대사체는 표 2와 같다. 이러한 테트라

사이클린계 대사체는 모의약물질과 유사한 생물학적 활성을 나타내는 것으로


5

보고되어 있다(B. Halling-Sorensen et al, 2002). 대표적인 테트라사이클린계

대사체의 미생물에 대한 활성을 그림 2에서 살펴보면, 테트라사이클린의 대

사체인 ATC는 모의약물질보다 비교적 낮은 농도에서 영향을 미치는 것을 확

인할 수 있다.

Tetracyclines Metabolites CAS No. M.W.

Tetracycline

4-Epitetracycline(ETC)

Anhydrotetracycline(ATC)

4-Epianhydrotetracycline(EATC)

23313-80-6

13803-65-1

4465-65-0

444

426

426

Chlortetracycline

4-Epichlortetracycline(ECTC)

Anhydrochlortetracycline(ACTC)

4-Epianhydrochlortetracycline(EACTC)

14297-93-9

514-53-4

-

478

460

460

Oxytetracycline

4-Epioxytetracycline(EOTC)

α-Apo-oxytetracycline(α-Apo-OTC)

β-Apo-oxytetracycline(β-Apo-OTC)

35259-39-3

18695-01-7

18751-99-0

460

442

442

Source : Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002, 42, 263-271

<Table 2> Metabolites of tetracycline, chlortetracycline and oxytetracycline

Source : Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2002, 42, 263-271<Fig. 2> Biological activity of tetracycline metabolites.


6

나. 환경 중 테트라사이클린계 항생제의 대사체(1) 환경 중 테트라사이클린계 항생제

전 세계적으로 다량의 테트라사이클린계 항생제가 동물용으로 사용되

고 있으며 동물의 배설물을 통해서 하천과 토양에 유입되는 것으로 추정되고

있다. 동물에 사용된 테트라사이클린의 경우, 약효의 유지를 위해 하루 40

mg/kg(테트라사이클린/체중) 사용되며, 동물의 배설물이 0.2 kg/kg(배설물/

체중)이므로 배설물에서 테트라사이클린의 농도는 200 mg/kg(테트라사이클

린/배설물)으로 테트라사이클린을 사용한 동물의 분뇨에서 테트라사이클린의

농도를 예상할 수 있다. 실제로 분뇨에서 테트라사이클린이 9∼12 µg/kg 수

준으로 검출된 사례가 보고되어 있으며(Hamscher G. 등, 2000), 분뇨에서 테

트라사이클린의 안정성 확인을 위해 수행된 분해실험의 결과, 8일후 테트라

사이클린 30.3%, 테트라사이클린의 대사체 4-에피테트라사이클린(ETC) 26.5%

잔류하는 것으로 보고되어 테트라사이클린의 변형에 의한 대사체가 생성되는

사실이 확인 되었다(M. Kuhne 등, 2000). 최근 발표된 가축의 분뇨에서 항생

제 조사결과를 검토하면, 주요 테트라사이클린계 항생제인 클로르테트라사이

클린과 옥시테트라사이클린이 소, 돼지, 닭에서 mg/kg(테트라사이클린/체중)

수준으로 검출되고 있으며, 가축의 분뇨가 비료로 사용되면 분뇨에 포함된

다량의 항생제가 토양과 하천에 유입되는 비점오염원으로 작용할 것으로 예

상하고 있다(L. Zhao 등, 2010).

Tetracyclines Animal Detection(%)

Min(mg/kg)

Max(mg/kg)

Mean(mg/kg)

Chlortetracycline

cow 82.1 0.24 27.59 2.22

pig 42.6 0.16 21.06 1.15

chicken 42.6 0.16 17.68 1.09

Oxytetracycline

cow 35.7 0.32 59.59 1.24

pig 41.0 0.15 59.06 2.69

chicken 27.8 0.27 10.56 1.55

Source : Science of the Total Environment 2010, 408, 1069-1075

<Table 3> Tetracyclines in dung slurry of cow, pig and chicken in China


7

그러나, 지금까지 보고된 하천수에서 테트라사이클린계 항생제의 잔류농도

는 테트라사이클린 0.02 µg/L (J.-Y. Pailler 등, 2009), 클로르테트라사이클린

0.16 µg/L (Linda Lissemore 등, 2006), 옥시테트라사이클린 0.13 µg/L (Yang

S. 등, 2004) 수준으로 테트라사이클린계 항생제의 사용량과 분뇨에서 보고된

농도를 고려하면 현저히 낮은 경향을 나타낸다. 이러한 경향은 국내의 환경

중 테트라사이클린계 항생제의 조사결과와 일치하며, 동물에 사용된 테트라

시이클린계 항생제가 배설물을 통해 환경 중으로 유입되는 과정에서 대사체

로 분해·변화되는 사실을 뒷받침한다. 그러므로 테트라사이클린계 항생제가

건강과 환경에 미치는 영향을 정확하게 예상하고 대응하기 위해 환경 중 테

트라사이클린계 항생제의 대사체에 대한 연구가 필요하다.

(2) 테트라사이클린계 항생제의 대사체 분석방법

환경 중 테트라사이클린계 항생제의 대사체 현황을 파악하고 거동을

규명하기 위해 우선적으로 환경시료에 대한 분석방법을 검토해야 한다. 테트

라사이클린계 항생제와 대사체는 pH 조건에 따라 다양한 이온성을 나타내므

로 적합한 전처리 방법과 기기분석 방법을 고려해야한다. 테트라사이클린계

항생제 및 대사체와 같이 극성이 큰 이온성 화합물에 대한 주요 분석방법으

로 추출과 정제에 고체상추출법(SPE, Solid Phase Extraction), 정성 및 정량

에 액체크로마토그래피/질량분석기(LC/MS, Liquid Chromatography/Mass

Spectrometry)가 사용되고 있다. 고체상추출법은 비극성 흡착제가 충전된 컬

럼에 pH를 조절하여 분석대상물질을 비극성으로 조절한 후, 극성 이동상(물)

과 함께 흘려 상대적으로 비극성-비극성 상호작용을 유도하여 비극성 분석대

상물질을 비극성 흡착제에 흡착시키고 극성 불순물은 극성 이동상으로 제거

한다. 극성 불순물이 제거되면 비극성 이동상(유기용매)을 흘려 분석대상물질

을 용출시킨다. 이 방법은 분석대상물질의 극성이 큰 유기화합물의 분석에

사용되며 기기분석에서 방해물질로 작용할 수 있는 극성 불순물을 제거할 수

있는 방법으로 시료의 pH를 조절하여 분석대상물질이 최대한 비극성 친지질

성을 가지도록 한다. 테트라사이클린계 항생제와 대사체는 분자량 400 이상

으로 하이드록실기와 같이 극성 작용기를 가지고 있으므로 일반적으로 환경


8

오염물질의 분석에 사용되는 기체크로마토그래피/질량분석기(GC/MS, Gas

Chromatogrphy/Mass Spectrometry) 방법으로 분석이 거의 불가능하며

LC/MS가 효과적인 방법으로 보고되어 있으며 최근 질량분석기가 보강된 텐

덤질량분석기(MS/MS, Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)가 사용되고

있다.

<Table 4> Previously reported analytical methods for tetracycline and their

transformation products

Sample Extraction Cleanup Analysis MDL Ref.

wastewater

surface water

SPE

(HLB)

SPE

(MAX)

UPLC

/MS/MS

ESI(+)

IDL:

30-500 ng/L

MDL:

0.8-17.5 ng/L

MQL:

2.3-52.5 ng/L

Jia et al.,

2009

muscledirect

injection-

UPLC

/MS/MS

ESI(+)

-

Ma가

McDonald

et al., 2009

urineSPE

(HLB)

filtration

(nylon)

UPLC

/QToF

ESI(+)

LOD:

89-138 ng/L

LOQ:

294-455 ng/L

Hua Jin et

al., 2010

milkSPE

(HLB)

sonication

filtration

(PTEE)

LC

/MS/MS

ESI(+)

LOD:

0.5-10µg/kg

LOQ:

50µg/kg

Yue

Zhenfeng

et al., 2006

manure

(animal)

soils

(agriculture)

Sonication

centrifugation

SPE

(MAX,

HLB)

LC/FLD

or DAD-

AkınKarcıet al,2009


9

지금까지 보고된 하천수, 폐수 등 다양한 시료에서 테트라사이클린계 항생

제 및 대사체에 대한 분석방법은 표 4와 같다. 시료의 전처리에 극성 불순물

을 제거하기 위한 친수친지질성(HLB, Hydrophilic lipophilic Balance) 카트리

지와 비극성 불순물을 제거하기 위한 이온교환(MAX, Mixed mode Aion

eXchange) 카트리지가 사용된다. 하천수와 폐수시료의 테트라사이클린계 항

생제의 대사체 분석을 위해 SPE와 LC/MS/MS를 사용한 방법의 방법검출한

계는 0.0008∼0.0175 µg/L 정도로 기존의 보고된 테트라사이클린계 항생제의

환경시료의 검출농도를 감안하면 환경 중 테트라사이클린계 항생제의 대사체

분석에 적합한 것으로 판단된다.

2. 연구 목표

테트라사이클린계 항생제는 국내에서 사용되는 항생제 중 사용량 1위이며

축산, 양식, 양봉 등 광범위하게 사용되고 있다. 국내 축산폐수처리장의 유입

수 및 방류수에서도 클로르테트라사이클린과 옥시테트라사이클린이 비교적

고농도로 검출된 사례가 있으며, 외국의 경우에도 가축의 분뇨에서 검출된

사례가 보고되어 있다. 또한 테트라사이클린계 항생제는 물리화학적 조건과

생체대사에 의해 대사체로 변화되며 이러한 대사체는 모의약물질인 테트라사

이클린계 항생제와 유사한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 테트라

사이클린계 항생제가 사용된 가축의 분뇨, 양식장 등은 하천과 토양오염의

오염원으로 작용할 수 있으며 테트라사이클린계 항생제와 대사체에 의한 직

접적인 생태계 영향과 내성균 확산에 의한 건강영향에 대한 우려가 제기되고

있다. 국내 하천수에서 클로르테트라사이클린과 옥시테트라사이클린의 검출

빈도와 검출농도는 비교적 낮은 수준으로 테트라사이클린계 항생제의 대사체

생성과 환경유입에 대한 가능성이 예상된다. 따라서 테트라사이클린계 항생

제의 사용과 처리에 의한 오염이 예상되는 하천수, 폐수 등에 대한 대사체

현황과 거동연구를 통해 테트라사이클린계 항생제 사용에 의한 생태계와 건

강영향에 대한 정확한 평가가 이루어질 수 있을 것이다. 본 연구에서는 주요

테트라사이클린계 항생제인 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트


10

라사이클린의 대표적인 대사체 8종(ETC, ATC, EATC, ECTE, ACTC,

EACTC, EOTC, α-Apo-OTC, β-Apo-OTC)에 대한 분석방법을 도입하여 확립

하고 환경시료에 적용하고자 한다.

1. 테트라사이클린계 대사체 8종의 기기분석조건(LC/MS/MS)의 확립

2. 테트라사이클린계 대사체 8종의 전처리 방법(SPE) 확립

3. 축산폐수 및 하천수 시료의 테트라사이클린계 대사체 8종 분석

3. 연구 내용 및 방법

가. 테트라사이클린계 대사체 분석방법 확립(1) 시약 및 초자

(가) 시약

- Na2EDTA(Ethylenediamine tetra-acetic acid, SIGMA, 99%, USA)

- 디클로로메탄(Methylene chloride, Wako, 99.5%, Japan)

- 메탄올(Methanol, J.T.Baker, 100%, USA)

- 아세토나이트릴(Acetonitrile, J.T.Baker, 100%, USA)

- 증류수(Water, J.T.Baker, USA)

- 염산(Hydrochloric Acid, Wako, 35~37%, Japan)

- 개미산(Formic acid, Fluka, 98%, Germany)

(나) 초자

- HLB cartridge(6 cc/200 mg, Oasis Waters)

- MAX cartridge(6 cc/200 mg, Oasis Waters)

- 메스플라스크(10 mL, 50 mL, 100 mL)

- 피펫(5 mL, 10 mL)

- 둥근바닥플라스크(500 mL, 5 L)


11

(2) 테트라사이클린계 대사체 기기분석

(가) 질량분석기

테트라사이클린계 대사체의 LC/MS/MS 분석을 위해 표준물질 8종의

질량스펙트럼에서 주요 분해이온들을 확인해야 한다. 직접주입법으로 10 µL

실린지를 사용하여 각각의 대사체 표준용액을 1 µL/mim의 유속으로 질량분

석기에 주입하며 전기분무이온화(ESI, Electrospray Ionization)-(+) 조건에서

스캔모드(scan mode)로 각 대사체의 질량스펙트럼을 확인하고 주요 이온을

분해시켜 생성된 2차 생성이온들을 확인한다. 테트라사이클린계 대사체에 대

한 질량분석기의 선택반응모니터링(SRM, Selected Reaction Monitoring)을 위

해 질량스펙트럼에서 주요 이온은 선구이온(precursor ion)으로 충돌에너지에

의해 생성되는 2차 질량스펙트럼에서 생성이온(product ion)을 확정한다.

(나) 액체크로마토그래피

테트라사이클린계 대사체의 분리를 위한 액체크로마토그래피 조건은

고정상 컬럼의 종류와 이동상의 극성 및 유속에 의해 결정된다. 제품으로 판

매되는 액체크로마토그래피용 컬럼(C18 및 C8)을 장착하여 테트라사이클린계

대사체 표준용액을 주입하고 이동상(아세토니트릴과 0.1% 개미산)의 비율을

변화시키는 기울기 용리조건으로 분석조건을 확립한다. 액체크로마토그래피

컬럼의 종류에 따라 이동상의 용리조건을 바꾸어 주면서 테트라사이클린계

대사체의 분리능을 확인한다.

(3) 테트라사이클린계 대사체 전처리

(가) 시료의 준비

수질시료는 여과하여 부유물질을 제거하고 Na2EDTA(0.5 g/L)를 첨가

하여 금속에 의한 테트라사이클린계 대사체의 착물형성을 방지한다. 시료에

0.1 N 염산을 첨가하여 pH 3으로 산성화시켜 테트라사이클린계 대사체가 친

지질성을 가지도록 한다.


12

(나) 고체상추출법

테트라사이클린계 대사체는 극성 유기화합물로 pH 조건에 따라 친수성

과 친지질성으로 변화되며 환경시료에 포함된 불순물을 제거하기 위해 SPE

를 사용한다. 주로 사용되는 SPE 카트리지는 친수성 및 친지질성을 효과적으

로 가지고 있는 HLB 카트리지이며 비극성 불순물을 제거하기 위해 이온교환

수지가 충전되어 있는 MAX 카트리지를 사용한다.

HLB 카트리지는 증류수(Na2EDTA, 염산으로 pH 3 조절) 6 mL, 메탄올 6

mL, 디클로로메탄 6 mL 순서로 전처리하여 활성화 시킨다. 일정량의 표준물

질이 첨가된 수질시료(Na2EDTA, 염산으로 pH 3 조절)를 HLB 카트리지에

가해주고 5 mL/min의 유속으로 흘려준다. 수질시료가 HLB 카트리지에 적

재되면 증류수 10 mL를 흘려 시료에 포함된 이온성 불순물을 제거하고 진공

으로 건조한다. 건조된 HLB 카트리지는 메탄올 6 mL를 가해주어 테트라사

이클린계 대사체를 용리시키고 용리액은 질소를 이용하여 0.5 mL까지 농축

한다. 농축된 시료 용리액을 2 mL 갈색 바이알에 옮기고 내부표준물질

(Terbutylazine-2-hydroxy, 1 mg/L) 50 µL와 0.1% 개미산(메탄올) 1.0 mL를

가해주고 LC-MS/MS로 분석한다.

오염이 심각한 시료의 경우, MAX 카트리지를 추가로 사용하여 정제하며

MAX 카트리지는 초순수 1 mL, 5N NaOH 1 mL, 메탄올 1 mL로 전처리하

여 활성화 시킨다. HLB 카트리지의 용리액을 0.3 mL로 농축하고 증류수(5%

NH3·H2O으로 pH 7 조절) 8 mL로 희석한 후, MAX 카트리지에 적재한다.

MAX 카트리지는 메탄올 1 mL, 5% NH3·H2O 1 mL로 세척하고 50% 아세토

니트릴/물(1% 개미산) 3 mL로 용리하여 질소로 최종 1 mL까지 농축한다.

최종 농축된 용리액은 기기분석을 위해 2 mL 갈색 바이알에 옮기고 내부표

준물질(Terbutylazine-2-hydroxy, 1 mg/L) 50 µL를 가해주고 LC-MS/MS로

분석한다. 테트라사이클린계 대사체 표준물질을 사용하여 HLB 카트리지와

MAX 카트리지의 전처리 과정에서 회수율을 구한다.


13

나. 환경시료의 테트라사이클린계 대사체 분석(1) 환경시료

본 연구사업에서는 하천수, 폐수 등 환경시료의 테트라사이클린계 대사체

조사에 필요한 분석방법을 도입하고 상시 분석이 가능하도록 확립하고자

SPE-LC/MS/MS 방법의 분석조건을 적용하였다. 확립된 테트라사이클린계 대

사체 분석방법을 사용하여 축산폐수와 하천수를 분석하여 실제로 테트라사이

클린계 대사체를 검출하고 환경시료에 대한 적용 가능성을 확인한다. 테트라

사이클린계 대사체가 검출될 것으로 예상되는 하천수 및 폐수시료를 채취하기

위해 축산단지의 폐수가 유입되는 하천의 상류에서부터 하류까지 12개 지점을

선정하여 시료 2 L를 채취하였다. 주요 시료채취 지점은 그림 3과 같다.

(2) 대사체 분석

하천수 및 폐수시료 일정량(50∼500 mL)을 분취하여 GF/F 여지를 통과

시켜 여과하고 Na2EDTA와 0.1 N 염산을 첨가하여 pH 3으로 조절한다. HLB

카트리지와 MAX 카트리지를 사용하여 불순물을 제거하고 0.5 mL까지 농축

한다. 농축된 시료는 내부표준물질(Terbutylazine-2-hydroxy, 1 mg/L) 50 µL

와 0.1% 개미산(메탄올) 1.0 mL를 가해주고 LC-MS/MS로 분석한다. 축산폐

수가 유입되는 지점과 주변 지점의 시료는 50 mL, 하천수는 500 mL를 분취

하여 분석한다. 테트라사이클린계 대사체의 표준용액을 정량에 적합한 농도

범위(10∼2,000 ng/mL)로 조제하여 3개 이상의 농도에서 분석하여 검량선을

작성한다. 테트라사이클린계 대사체의 방법검출한계를 구하기 위해 각각의

대사체 표준물질 60 ng을 가해주고 본 연구에서 도입한 전처리방법과 기기분

석방법(SPE-LC/MS/MS)을 적용하여 10회 반복하여 분석하고 표준편차에 자

유도=9에서 스튜던트-t 값을 곱하여 구한다.


14

<Fig. 3> Environmental samples(wastewater and surface water).

Ⅲ. 연구결과 및 고찰❚

15

Ⅲ. 연구결과 및 고찰

1. 테트라사이클린계 대사체 분석방법

가. LC/MS/MS 분석 방법(1) 질량이온

테트라사이클린계 대사체는 LC/MS/MS의 이온화방식인 ESI-(+)으로 이

온화하면 분자질량이온 [M+H]+이 생성되며, [M+H]+을 전구이온으로 다시

충돌에너지를 가해주고 2차적인 분해를 통해 [M+H]+에서 NH3(17) 또는

H2O(18)가 제거된 [M+H-NH3]+, [M+H-NH3-H2O]

+, [M+H-NH3-H2O]

+이 생

성이온으로 만들어진다(Yue Zhenfeng 등, 2006).

본 연구에서도 선행연구에서 보고된 전구이온과 생성이온을 확인하기 위

해 각각의 테트라사이클린계 대사체 표준물질을 LC/MS/MS에 직접 주입하

였으며 질량분석기의 튜브렌즈와 충돌에너지를 조절하여 표 5와 같이 전구이

온과 생성이온을 확인하였다. 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테

트라사이클린과 각각의 에피머의 주요 생성이온은 분자질량이온 [M+H]+에

서 NH3(17)와 H2O(18)이 제거된 [M+H-NH3-H2O]+이었으며 무수테트라사이

클린, 무수클로르테트라사이클린, 무수옥시테트라사이클린은 분자질량이온

[M+H]+에서 NH3(17)가 제거된 [M+H-NH3]+이었다.

테트라사이클린계 대사체의 주요 생성이온은 ETC(445→410), ATC(427→

410), EATC(427→410), ECTC(479→444), EACTC(461→444), EOTC(461→426), α

-apo-OTC(443→426), β-apo-OTC(443→426)이었으며, 5개의 그룹 ETC, (ATC,

EATC), ECTC, (EACTC, EOTC), (α-apo-OTC, β-apo-OTC)으로 나누어 분석

할 수 있다. 부록에 첨부된 선구이온과 생성이온의 질량스펙트럼을 확인하면

테트라사이클린과 ETC는 차이가 있으며, ATC와 EATC, 클로르테트라사이클

린과 ECTC, 옥시테트라사이클린과 EOTC, α-apo-OTC와 β-apo-OTC는 유사

한 생성이온의 질량스펙트럼을 나타낸다.


16

<Table 5> Precursor ions and product ions of tetracyclines and their metabolites

Compounds Precursor ion Tubelens Production CollisionenergyTetracycline

(TC)445 105

410 20

154 25

427 15

4-Epitetracycline

(ETC)445 100

410 20

154 30

427 13

Anhydrotetracycline

(ATC)427 90

410 17

154 28

321 30

4-Epianhydrotetracycline

(EATC)427 90

410 17

154 30

321 30

Chlortetracycline

(CTC)479 100

444 20

462 17

154 30

4-Epichlortetracycline

(ECTC)479 100

444 20

462 17

154 30

4-Epianhydrochlortetracycline

(EACTC)461 90

444 19

154 33

355 33

Oxytetracycline

(OTC)461 98

426 20

444 15

154 30

4-Epioxytetracycline

(EOTC)461 85

426 20

444 16

154 35

α-Apo-oxytetracycline

(α-apo-OTC)443 85

426 17

408 27

229 38

β-Apo-oxytetracycline

(β-apo-OTC)443 85

426 17

408 27

229 38

ISTD

(Terbutylazine-2-OH)212 80

156 15

69 27


17

(2) 크로마토그래피

테트라사이클린계 대사체의 LC/MS/MS 분석을 위해 질량분석기 분석조건

과 함께 액체크로마토그래피에서 분리가 필요하다. 기존의 테트라사이클린계 대

사체의 분리를 위해 주로 사용된 액체크로마토그래피용 컬럼은 실리카겔 흡착제

에 n-옥탄이 결합된 C8 역상컬럼이다(L. Zhao 등, 2010). 본 연구에서는 상업적으

로 판매되는 C8 역상컬럼 Phenomenex Luna C8 column(3.0 µm, 3.0 mm×150

mm), XterraTM MS C8 column (3.5 µm, 3.0 mm×150 mm) 및 극성화합물 분리

에 범용으로 사용되는 C18 역상컬럼 XterraTM MS C18 column (3.5 µm, 3.0

mm×150 mm)을 사용하여 테트라사이클린계 항생제와 대사체를 분리하였다.

<Table 6> Analytical condition of LC/MS/MS

LC/MS/MS Analytical parametersColumn

Mobile phase

Gradient

Column flow rate

Injection volume

Column temperature

Sample room temp.

Ionization mode

Spray voltage

Sheath gas pressure

Aux gas pressure

Capillary temperature

Skimmer offset

Collision Energy

Phenomenex Luna C8 column

(3.0 μm; 3.0 mm×150 mm)

A : 0.1% Formic acid in Water

B : Acetonitrile

Time(min) 0 15 16 19 25 35

Solvent B(%) 16 70 80 80 16 16

0.3 mL/min

5 μL

30 ℃

10 ℃

Positive ion electrospray

4800 V

40 arb

10 arb

350℃

9 V

1.5 m Torr (Ar)


18

<Fig. 4> LC/MS/MS chromatogram of tetracyclines and their metabolites.

액체크로마토그래피용 역상컬럼에서 테트라사이클린계 대사체 분리결과

C18 컬럼에서 동일한 선구이온과 생성이온으로 질량모니터링이 이루어지는

클로르테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린과 대사체인 에피머의 피크가

겹쳐져 분리에 적합하지 않았으며 각각의 대사체 피크의 끌림 현상을 확인할

수 있었다.

최근 테트라사이클린계 대사체의 분석에 사용되는 것으로 보고된 C8 컬럼

의 경우, 2가지 제조사의 컬럼을 사용하여 분리능을 확인하였으며 C18 컬럼에

서 분리가 불완전했던 클로르테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린과 에피

머의 피크분리가 향상되었다. 또한 테트라사이클린과 대사체의 피크의 끌림

현상도 C18에 비해 감소되었다.


19

이러한 결과는 pH 조건에 따라 테트라사이클린계 항생제와 대사체의 친지

질성 및 친수성이 변화되는 특징과 C8 역상컬럼은 C18 역상컬럼에 비해 친

지질성이 약한 고정상에 의한 상호작용의 차이에서 기인하며 고정상과 분석

대상 테트라사이클린계 항생제와 대사체의 친지질성 상호작용에 의해 피크

의 끌림 현상이 발생하는 것으로 추정된다. 따라서 C8 역상컬럼과 테트라사

이클린계 항생제 및 대사체의 친지질성 및 친수성 상호작용을 최적화하여 각

각의 피크를 분리하기 위해 이동상의 극성을 조절할 필요가 있다.

기존의 테트라사이클린계 항생제 및 대사체의 분석에 사용된 HPL 컬럼의

경우 규격이 5 µm, 3.0 mm×450 mm 으로 이동상의 조건은 유속 1 mL/min

수준이었으나 질량분석기의 사용에 따라 소량의 시료를 진공상태의 이온원으로

주입하기 위해 실리카겔의 입자크기가 작고 짧은 컬럼을 사용하게 되었으며 이

동상의 조건도 유속 0.3 mL/min 수준으로 컬럼에서 피크의 분리와 질량분석기

에서 질량분리를 통해 분석이 가능하게 되었다.

<Fig. 5> Calibration curve of tetracycline and metabolites(X=ng, Y=Peak).


20

<Fig. 6> Calibration curve of chlortetracycline and metabolites(X=ng, Y=Peak).

<Fig. 7> Calibration curve of oxytetracycline and metabolites(X=ng, Y=Peak).


21

액체크로마토그래피에서 질량분석기를 검출기로 사용하게 되어 기존의 자외선,

형광 등을 검출기로 사용했을 때보다 향상된 감도와 선택성을 얻을 수 있는

것으로 알려져 있다. 테트라사이클린계 항생제와 대사체를 표 5의 분석조건으

로 LC/MS/MS 분석하였으며 농도범위에서 검량선을 작성하였다. 테트라사이클린

계 항생제와 대사체의 검량선은 결정계수 0.99 이상이었다.

테트라사이클린계 항생제와 대사체의 LC/MS/MS 분석결과 표준물질과 시료의

분석에 의해 분석시스템에 잔류하는 현상이 발생하였으며 공시료의 크로마토그램

에서 테트라사이클린계 항생제와 대사체의 일부가 검출되었다. 이러한 현상은

LC/MS/MS의 시료주입부, 컬럼, 질량분석기 등에 테트라사이클린계 항생제와 대

사체가 잔류하여 나타나는 것으로 시료주입 사이에 분석시스템을 세척을 위한 과

정을 삽입하여 공시료에서 검출되는 테트라사이클린계 항생제와 대사체를 감소시

킬 수 있었다.

나. SPE 전처리 방법(1) 카트리지

테트라사이클린계 대사체의 전처리 방법 확립을 위해 기존의 선행연구

에서 제시된 HLB 카트리지와 MAX 카트리지에 의한 추출 및 정제방법을 도

입하였으며 그림 7 및 그림 8에 제시된 전처리 과정의 효율성을 확인하기 위

해 회수율을 구하였다. 테트라사이클린계 항생제의 경우, pH 조건에 따라 대

사체로 변화되므로 표준물질의 보관에서 발생하는 오차를 최소화하기 위해

표준물질은 사용시에 즉시 조제하였다.

카트리지를 사용한 전처리 과정의 회수율 결과를 보면 테트라사이클린계

항생제의 회수율 범위는 73∼105%이었으며 대사체의 회수율 범위는 77∼

238%이었다. 테트라사이클린계 항생제의 회수율 범위는 적정한 수준으로 평

가되는데 반해, 대사체의 회수율 범위는 다소 높은 수준으로 판단된다. 전처

리 과정의 회수율에서 HLB 카트리지에서 높게 나타난 대사체는 ATC,

EACTC, EOTC, α-apo-OTC, β-apo-OTC이었으며 MAX 카트리지에서 회수율

이 높게 나타난 대사체는 EACTC이었다.


22

<Fig. 8> Pretreatment of tetracyclines and their metabolites using HLB cartridge.

< F ig . 9> P re trea tm en t o f te tra cyc line s and th e ir m e tabo lite s u s ing M A X cartridge.

특히 옥시테트라사이클린의 대사체인 α-apo-OTC와 β-apo-OTC의 HLB 카


23

트리지 회수율은 각각 229%, 238%으로 높은 수준이었으며, 상대표준편차도

21.0%, 17.9%로 반복실험의 편차도 큰 것으로 나타났다. 테트라사이클린계

대사체 중 무수테트라사이클린(ATC, EATC, ACTC, EACTC)은 테트라사이

클린계 항생제에 산(H+)이 첨가되면 케토-엔올 토토머화와 비편재화에 의해

발생하며(B. Halling-Sorensen et al, 2002), HLB 카트리지를 사용한 전처리에서

회수율의 변화가 큰 것으로 나타났다. 카트리지를 사용한 전처리에서 산(H+)

첨가 조건의 경우, 무수테트라사이클린 또는 아포테트라사이클린으로 변형되

므로 정확한 pH 조절이 필요하다.

<Table 7> Precision and accuracy of SPE-LC/MS/MS analysis

No. CompoundsExtraction Clean up

Recovery(%)

RSD(%)

Recovery(%)

RSD(%)

1 Tetracycline 105 5.5 82 4.5

2 4-Epitetracycline 78 5.4 77 9.7

3 Anhydrotetracycline 170 12.6 94 8.8

4 4-Epianhydrotetracycline 113 10.9 121 5.1

5 Chlortetracycline 104 6.1 73 9.8

6 4-Epichlortetracycline 84 4.5 84 4.0

7 4-Epianhydrochlortetracycline 201 29.4 150 12.3

8 Oxytetracycline 82 6.4 85 2.3

9 4-epioxytetracycline 136 9.9 95 9.7

10 α-Apo-oxytetracycline 229 21.0 118 8.5

11 β-Apo-oxytetracycline 238 17.9 121 6.5

(2) 검출한계


24

테트라사이클린계 항생제 및 대사체의 SPE-LC/MS/MS 분석방법을 적

용하여 환경시료를 분석한 결과, 검출한계를 구하기 위해 각각의 테트라사이

클린계 항생제 및 대사체 약 60 ng(LC/MS/MS 기기검출한계의 약 10배)에

해당되는 정확한 양을 공시료(500 mL)에 첨가하여 분석하였다. 본 연구에서

제시된 SPE-LC/MS/MS 분석방법의 검출한계는 5.6∼32.4 ng/시료 이었으며

사용된 수질시료 500 mL에 대해 0.011∼0.056 ng/mL(µg/L) 정도였다.

수질시료에서 테트라사이클린계 항생제 및 대사체의 SPE-LC/MS/MS 분

석방법의 방법검출한계를 구하기 위한 반복실험의 회수율은 66∼234%, 상대

표준편차는 9.3∼53.9%으로 클로르테트라사이클린 및 아포옥시테트라사이클

린의 경우, 회수율과 상대표준편차의 차이가 큰 것으로 나타났다.

<Table 8> Method detection limit of tetracyclines and their metabolites

No. Compounds MDL(ng)n=10, t=2.821

Recovery(%)

RSD(%)

1 Tetracycline 0.025 61-125 20.7

2 4-Epitetracycline 0.021 66-123 17.9

3 Anhydrotetracycline 0.017 75-119 14.0

4 4-Epianhydrotetracycline 0.018 68-118 15.2

5 Chlortetracycline 0.065 60-247 53.9

6 4-Epichlortetracycline 0.017 75-118 14.3

7 4-Epianhydrochlortetracycline 0.018 72-122 14.9

8 Oxytetracycline 0.018 71-121 15.3

9 4-epioxytetracycline 0.011 82-116 9.3

10 α-Apo-oxytetracycline 0.019 73-125 15.6

11 β-Apo-oxytetracycline 0.056 80-234 47.0


25

2. 환경시료의 테트라사이클린계 대사체 분석

가. 환경시료하천수 및 폐수시료에서 SPE-LC/MS/MS 방법을 적용한 테트라사이클린

계 항생제 및 대사체의 분석을 위해 축산폐수가 유입되는 하천의 시료를 선

택하여 위의 분석방법으로 분석하였다. 하천수 및 폐수시료에서 테트라사이

클린계 항생제 및 대사체의 분석을 위해 축산폐수가 유입되는 하천의 시료를

선택하여 위의 SPE-LC/MS/MS 분석방법으로 분석하였다. 주요 시료는 S1이

고농도 축산폐수이며 S2∼S6까지 축산폐수가 유입된 소하천 지점의 시료이

다. 하천수 지점 S7은 농수로의 시료이며 S8은 S1이 유입된 하천과 만나는 하

천의 상류지점이다. 따라서 S6, S7, S8지점의 하천수가 합류하여 S9지점으로

유하한다. 하천수 시료 S10은 S9의 하류지점의 시료이며 S11과 S12는 각각

S10이 유입되는 본류의 상류 및 하류지점의 시료이다.

나. 테트라사이클린계 대사체 검출하천수 및 폐수시료에서 주요 테트라사이클린계 항생제 및 대사체가 검출

되었으며 축산폐수인 S1에서는 조사대상 테트라사이클린계 항생제 3종 및 대

사체 8종이 모두 검출되었다. 축산폐수가 유입된 하천수 조사지점의 특성에

따라 S1∼S6의 시료에서 테트라사이클린계 항생제와 대사체가 주로 검출되

었으며 다른 하천과 합류된 S9, S10에서는 검출농도가 감소하였다. 축산폐수

및 하천수에서 검출된 주요 대사체는 에피머였으며 테트라사이클린계 항생

제와 비는 ETC/TC 0.9∼1.1, ECTC/CTC 0.9∼1.8, EOTC/OTC 0.6∼0.7으로

하천수가 유입되는 하류로 갈수록 대사체의 비율이 감소하는 특징을 나타냈

다. 테트라사이클린계 항생제의 에피머 이외의 대사체의 비는 0.2∼0.9으로

에피머에 비해 낮은 수준으로 조사되었다. 조사대상 시료 12건에서 β

-apo-OTC는 검출되지 않았으며 α-apo-OTC의 검출농도도 0.09∼0.89

ng/mL(µg/L) 정도로 낮았다. 분석결과의 재현성을 확인하기 위해 이중반복

시료 2건(S6 및 S12)을 분석하였으며 검출된 S6 시료에서 테트라사이클린계

대사체의 시료간 오차는 1%이내였다.


26

<Fig. 10> Detected level of tetracycline and their metabolites in wastewater and surface water samples.

Ⅳ. 결 론❚

27

Ⅳ. 결 론

항생제 사용에 의한 환경 및 건강영향 조사를 위해 항생제와 함께 분해산

물을 포함한 대사체의 발생, 이동, 소멸 등 거동에 대한 연구의 필요성이 대

두되었기 때문에 항생제 대사체의 분석방법 확립에 관한 연구를 수행하였으

며, 2010년 테트라사이클린계 항생제의 대사체에 대한 분석방법을 확립하기

위해 대표적인 테트라사이클린계 항생제인 테트라사이클린, 클로르테트라사

이클린, 옥시테트라사이클린의 대사체 8종(ETC, ATC, EATC, ECTC,

EACTC, EOTC, α-apo-OTC, β-apo-OTC)에 대한 분석방법 마련을 위해 수행

하였으며, 주요 결과는 다음과 같다.

1. 환경 중 테트라사이클린계 대사체 8종의 분석을 위해 SPE-LC/MS/MS방

법을 사용하였으며 선구이온과 생성이온은 ETC(445→410), ATC(427→410),

EATC(427→410), ECTC(479→444), EACTC(461→444), EOTC(461→426),

α-apo-OTC(443→426), β-apo-OTC(443→426)이었다.

2. LC/MS/MS의 크로마토그래피 조건으로 C8 및 C18 역상컬럼과 산성

이동상을 사용하여 분석하였으며 C8 역상컬럼이 분리에 효과적이었다.

3. 전처리 방법으로 사용된 SPE에는 HLB 카트리지와 MAX 카트리지가 사용

되었으며 회수율은 각각 78∼238%, 77∼150%이었다. HLB 카트리지를 사용

했을 때 α-apo-OTC와 β-apo-OTC의 회수율이 높았으며 산(H+)조건에서

옥시테트라사이클린이 α-apo-OTC와 β-apo-OTC로 쉽게 전이된 결과였다.

4. 수질시료에서 테트라사이클린계 대사체의 SPE-LC/MS/MS 방법검출

한계는 0.011∼0.056 µg/L(시료량 500 mL)이었으며, β-apo-OTC의 상대

표준편차가 47.0%로 저농도에서 시료간 검출량의 차이가 비교적 큰 것으로

나타나 검출한계가 높은 원인이 되었다.

Ⅳ. 결 론❚

28

5. 위의 SPE-LC/MS/MS 방법을 적용하여 하천수 및 폐수시료의 테트라

사이클린계 대사체를 분석한 결과, 축산폐수 및 하천수 시료에서 검출

되었으며 테트라사이클린계 항생제와 대사체의 비는 0.2∼1.8으로 에피

머에서 높고 α-apo-OTC에서 낮았다. 분석결과의 재현성을 확인하기 위해

반복시료 2건을 분석하였으며 검출된 S6 시료에서 테트라사이클린계 대

사체의 시료간 오차는 1%이내였다.

본 연구에서는 테트라사이클린계 대사체의 효과적인 분석방법으로 최근

보고된 SPE-LC/MS/MS 방법을 적용하여 전처리 방법 및 기기분석 방법을

시험하였으며, 검출한계, 정확도 및 정밀도에 대해 검증하였다. 또한 테트라

사이클린계 대사체의 검출이 예상되는 축산폐수 및 하천수 시료를 분석하

여 실제 환경 중 테트라사이클린계 대사체를 확인하였다. 비록 연구대상 테

트라사이클린계 대사체가 8종에 불과하고 일부 대사체의 경우, 회수율 및

상대표준편차가 비교적 높은 결과를 얻었으나, pH에 의한 테트라사이클린

계 대사체의 변형이 다양한 점을 감안할 때, 향후 감도 및 선택성 측면에서

보다 효과적인 분석방법 개발과 환경 분야에서 비교적 생소한 LC/MS/MS

의 활용을 위한 기초연구로 의미를 부여할 수 있다.

참 고 문 헌❚

29

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부 록❚

31

부 록

(질량스펙트럼)

부 록❚

32

<부록 Fig. 1> Mass spectrum of tetracycline.

<부록 Fig. 2> Mass spectrum of 4-Epitetracycline.

부 록❚

33

<부록 Fig. 3> Mass spectrum of tetracycline of anhydrotetracycline.

<부록 Fig. 4> Mass spectrum of 4-Epianhydrotetracycline.

부 록❚

34

<부록 Fig. 5> Mass spectrum of chlortetracycline.

<부록 Fig. 6> Mass spectrum of 4-Epichlortetracycline.

부 록❚

35

<부록 Fig. 7> Mass spectrum of 4-Epianhydrochlortetracycline.

<부록 Fig. 8> Mass spectrum of oxytetracycline.

부 록❚

36

<부록 Fig. 9> Mass spectrum of 4-Epioxytetracycline.

<부록 Fig. 10> Mass spectrum of α-Apo-oxytetracycline.

부 록❚

37

<부록 Fig. 11> Mass spectrum of β-Apo-oxytetracycline.

환경 중 잔류의약물질 대사체 분석방법 확립에 관한 연구(Ⅱ...

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