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新規活動性結核の迅速診断法
関西医科大学
医学部 衛生・公衆衛生学講座
准教授 神田 靖士
結核の現状
世界総人口の1/4が感染
1年間に世界で約1040万人の新規患者が発生し、130万人が結核で死亡している(2017)。
HIV感染者の死亡の第一原因でHIV感染者の死因の40%が結核であった(2016)。
国連は2030年までに結核の流行を終了させる目標を掲げている。
〜2018年WHO統計〜
世界における結核の現状と問題点
アフリカ、東南アジアなどで特に流行
診断の遅れが隠れ患者を出し、新たな流行を引き起こす。
診断法は存在するが、流行地では実施が困難である。
（高価、設備が必要）
出典：WHOのホームページ
肺結核の診断(国内)
気道症状（咳、痰、血痰）
全身症状（発熱、全身倦怠感、体重減少）
胸部レントゲン、胸部ＣＴ、気管支鏡検査
喀痰培養検査 (液体培養で1−4週間を要する）
PCR法（遺伝子増幅法）
結核診断キット
肺結核の診断(発展途上国)
気道症状（咳、痰、血痰） 2週間以上継続した咳
全身症状（発熱、全身倦怠感、体重減少）
胸部レントゲン、胸部ＣＴ、気管支鏡検査
喀痰培養検査(液体培養で1−4週間を要する）
PCR法（遺伝子増幅法）
診断キット
政府広報オンラインより
既存の血清中抗体を用いた診断法
既存の診断キット（T-spot TB)
血液2-8mlを採取し末梢血単核球を結核特異抗原と反応させ、IFN-γの産生細胞を計測する手法
✓ 2012年日本で体外診断薬として承認
✓ 結果まで約24時間必要
✓ 保険点数630点(6300円)
✓ 細胞の分離と培養の機器が必要
出典
発展途上国で実施する上での問題点
➢ 採血が必須(血液を扱うためリスクあり)
➢ 診断まで時間がかかる(24時間必要)
➢ 機器が必須(発展途上国では設備がない）
➢ 高価である(発展途上国では使用不可）
➢ HIV感染などで免疫不全要因があれば偽陰性になる
目的
発展途上国において使用可能な
✓ 安価に
✓ 確実に
✓ 迅速に
✓ 安全に
肺結核（活動性結核）を診断する新たな診断法を開発することを目的とする。
a)
Control patients
300
75
18.8
4.7
1.2
0.29
0.073
0.0183
ng/dotb)
1
2
negative
Dot blot 法の結果と評価法
Evaluation of the dot-blot assay
(a) Several amounts of duplicate purified MPB64 protein were dotted on membranes and detected by pooled serum of healthy and patients to optimize the amount of recombinabt protein by Dot-blot assay.
(b) A strong positive reaction was rated as 2, a weak but positive reaction as 1 and no reaction as negative.
MPB64を使用したDot-Blot法の問題点
➢ 活動性結核患者は陽性となるが、健常者も偽陽性となることがある。
交差反応性を示す抗体の存在
BCGワクチン接種の影響
結核感染に特異的なmiRNAの探索
ラオス国内で収集した活動性結核患者の検体
Total RNAの抽出
Small RNA librariesの作成
逆転写反応
次世代シークエンサーによる解析
サンプルの情報
✓ ラオス国内で県立結核センターに結核疑いで受診した者
✓ 咳や体重減少の症状があった者
Sample No. 結核感染
(GeneXpert)
喀痰中の結核菌 HIV
003 Ｘ Ｘ Ｘ
004 ○ ○ Ｘ
007 ○ ○ ○
008 ○ ○ Ｘ
○：陽性 Ｘ：陰性
患者で高頻度、コントロールで低頻度で検出されたmiRNA
miRNA control（003）
患者（004）
患者（007）
患者（008）
hsa-X1 0.37 0.72 0.72 0.89
hsa-X2 0.23 0.67 1.04 0.63
hsa-X3-1 0.29 0.56 0.73 0.88
hsa-X3-3 0.3 0.54 0.84 0.77
hsa-X3-2 0.3 0.51 0.72 0.89
（高発現；0.5％以上、低発現；0.5％未満）. 発現頻度（％）示す。
コントロールで高頻度、患者で低頻度で検出されたmiRNA
miRNAcontrol（003）
患者（004）
患者（007）
患者（008）
hsa-Z1 15.66 0.03 0.04 0.02
hsa-Z2 3.446 0.11 0 0.15
hsa-Z3 3.08 0.14 0.02 0.13
hsa-Z4 2.87 0.06 0.05 0.02
hsa-Z5 1.74 0 0 0.05
hsa-Z6 0.88 0 0 0
hsa-Z7 0.59 0.04 0.02 0
hsa-Z8 0.54 0.04 0.06 0.02
hsa-Z9 0.52 0.01 0 0
（高発現；0.5％以上、低発現；0.5％未満）、発現頻度（％）
既存の診断キットと新規バイオマーカーを指標とした診断法の比較
Ｔスポット.TB新規バイオマーカーを用
いた診断法
必要な機器、設備遠心機、細胞培養装置が必要
特別な装置は必要なし（シェーカーくらい）
判定までにかかる時間 少なくとも24時間必要 2時間程度（予測）
判定の正確性
感度: 97.5%
特異度: 99.1%
*HIV感染など免疫不全状態では陰性と判定されることがある。
数種類のmiRNAを組み合わせることで確実に判定可能
安全性（医療従事者側）
採血が必要(HIVなどの感染リスクあり）
喀痰及び血液は扱わない
コスト 高価 6,300円/検体 不明(1/5~1/10程度）
安価で安全な活動性結核迅速診断法の確立
結核の流行地における早期診断により感染の拡大の予防と結核感染による死亡率の低下
国内における需要
医療従事者の検診、結核患者との接触者検診、学校における集団検診など結核感染の有無をチェックする目的で実施
実用化を目指すため、コラボしていただける企業を探しています。
新規バイオマーカーを指標とした診断法の開発の重要性
お問い合わせ先
関西医科大学 産学連携知的財産統括室
顧問 佐々木 健一
溝上 大樹
ＴＥＬ 072－804－2328
ＦＡＸ 072－804－2686
e-mail [email protected]