1

新規異種タンパク質可溶性発現技術新規異種タンパク質可溶性発現技術新規異種タンパク質可溶性発現技術新規異種タンパク質可溶性発現技術

富山県立大学富山県立大学富山県立大学富山県立大学

工学部・生物工学研究センター工学部・生物工学研究センター工学部・生物工学研究センター工学部・生物工学研究センター

ERATOERATOERATOERATO浅野酵素活性分子プロジェクト浅野酵素活性分子プロジェクト浅野酵素活性分子プロジェクト浅野酵素活性分子プロジェクト

研究総括研究総括研究総括研究総括 浅野浅野浅野浅野 泰久泰久泰久泰久

研究推進主任研究推進主任研究推進主任研究推進主任 松田松田松田松田 元規（説明者）元規（説明者）元規（説明者）元規（説明者）

浅野酵素活性分子プロジェクト浅野酵素活性分子プロジェクト浅野酵素活性分子プロジェクト浅野酵素活性分子プロジェクト

富山県立大学富山県立大学富山県立大学富山県立大学

ＪＳＴＪＳＴＪＳＴＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業戦略的創造研究推進事業戦略的創造研究推進事業戦略的創造研究推進事業 ＥＲＡＴＥＲＡＴＥＲＡＴＥＲＡＴOOOO

「「「「ERATOERATOERATOERATO浅野酵素活性分子プロジェクト」浅野酵素活性分子プロジェクト」浅野酵素活性分子プロジェクト」浅野酵素活性分子プロジェクト」 （研究総括：浅野泰久）（研究総括：浅野泰久）（研究総括：浅野泰久）（研究総括：浅野泰久）

酵素工学

グループ

生物

有機化学

グループ

生物

資源探索

グループ

新規異種タンパク質新規異種タンパク質新規異種タンパク質新規異種タンパク質可溶性発現技術可溶性発現技術可溶性発現技術可溶性発現技術

新規新規新規新規酵素遺伝子酵素遺伝子酵素遺伝子酵素遺伝子

資源探索資源探索資源探索資源探索酵素による酵素による酵素による酵素による

物質生産技術物質生産技術物質生産技術物質生産技術

酵素による物質生産およびアミノ酸定量の実用化酵素による物質生産およびアミノ酸定量の実用化酵素による物質生産およびアミノ酸定量の実用化酵素による物質生産およびアミノ酸定量の実用化

酵素活性酵素活性酵素活性酵素活性

分子分子分子分子

2

研究開発を支援する研究開発を支援する研究開発を支援する研究開発を支援する

情報科学研究情報科学研究情報科学研究情報科学研究

研究総括紹介研究総括紹介研究総括紹介研究総括紹介

富山県立大学工学部・生物工学研究センター

浅野泰久 教授

1982年 3月 京都大学 農学博士取得 （応用微生物学）1982年 4月～9月 アメリカ合衆国パデュー大学薬学部博士研究員1982年10月～84年3月 アメリカ合衆国オハイオ州立大学理学部博士研究員1984年 4月～90年3月 相模中央化学研究所研究員および副主任研究員1990年 4月～95年3月 富山県立大学助教授1995年 4月～現在 富山県立大学教授

研究分野応用微生物学、分子酵素学、有機化学、生化学

主な研究業績

・ニトリルヒドラターゼの発見→アクリルアミドの工業生産で実用化アクリルアミドの工業生産で実用化アクリルアミドの工業生産で実用化アクリルアミドの工業生産で実用化・フェニルアラニン脱水素酵素の研究→フェニルケトン尿症検査試薬として実用化フェニルケトン尿症検査試薬として実用化フェニルケトン尿症検査試薬として実用化フェニルケトン尿症検査試薬として実用化・酸性フォスファターゼによるイノシンリン酸化反応の発見→イノシン酸工業生産で実用化イノシン酸工業生産で実用化イノシン酸工業生産で実用化イノシン酸工業生産で実用化・D-アミノペプチダーゼ、アルカリD-ペプチダーゼの発見など（他多数）

4

自然界に存在する酵素

優れた特徴・穏やかな環境（温度、pH等）で反応を触媒・目的外の反応が起こりにくい・有害物質の排出が少ない

産業へ利用

環境にやさしいテクノロジー

遺伝子工学で改良した酵素

酵素の物質生産への利用

いくつかの化学物質の生産で実用化されているがまだ数は少ない

高性能な酵素を開発することにより、産業に貢献する高性能な酵素を開発することにより、産業に貢献する高性能な酵素を開発することにより、産業に貢献する高性能な酵素を開発することにより、産業に貢献する

5

プロジェクト研究概要プロジェクト研究概要プロジェクト研究概要プロジェクト研究概要

酵素遺伝子資源の探索 異種タンパク質可溶性発現

酵素を用いた有用化合物生産酵素研究開発支援プログラム

6

異種タンパク質可溶性発現における現在の問題

酵素の利⽤

・物質⽣産プロセスへの利⽤

・分析や計測などへの利⽤

・医療への利⽤

・エネルギー⽣産への利⽤

・環境浄化への利⽤

など

微生物

の酵素 発酵法、菌体反応

直接利⽤動植物

の酵素

異種発現系による⼤量⽣産

不溶性発現

＋

M S IS S IS S IS S IS S IS S IS S IS S IS

SDS-PAGE (M:マーカー、S:可溶性画分、IS：不溶性画分)

7

新規異種タンパク質可溶性発現技術の開発天然、遺伝子データベースから

有用酵素を発見

詳細な構造、性質を確認したい産業に利用したい

酵素が大量に必要酵素を安定供給する必要がある

異種発現により酵素を生産

封入体の形成により活性がある酵素を確保できない！！

②培養条②培養条②培養条②培養条件の検討件の検討件の検討件の検討②培養条②培養条②培養条②培養条件の検討件の検討件の検討件の検討

①融合タンパク①融合タンパク①融合タンパク①融合タンパク質として発現質として発現質として発現質として発現

④巻き戻し④巻き戻し④巻き戻し④巻き戻し ③宿主③宿主③宿主③宿主ベクター系のベクター系のベクター系のベクター系の

検討検討検討検討

高発現型高発現型高発現型高発現型

変異酵素の変異酵素の変異酵素の変異酵素の

作成作成作成作成

アミノ酸残基の置換

による大腸菌での可溶性発現の改善

従来の異種タンパク質可溶性発現技術とその問題点

①融合タンパク質として発現する方法・構造が大幅に変化する。

・分子量の大幅な増大によりタンパク質あたりの活性が低下する。

・コストが高い。

②温度など培養条件の検討による方法・効果が無い場合も多い。

・実用化の範囲が限定される。

③他の宿主ベクター系を使用する方法・多大な経費と労力が必要な試行錯誤が必要。

・用途によっては使用できない宿主があり実用化の範囲が限定される。

④封入体の巻き戻しにより回収する方法・効果が無い場合も多い。

・実用化の範囲が限定される。

従来の異種タンパク質可溶性発現技術とその問題点

10

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Act

ivit

y (U

/mL

)

Ala Val Leu Ile Met Trp Phe Pro Gly Ser Thr Tyr Cys Asn Gln Lys His(wt)

Arg Asp Glu

His103 mutants of hydroxynitrile lyase fromManihot esculenta (Me HNL)

A V L I M W F P G S T Y C N Q L H R D EWT

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

Activity (

U/m

l)

キャッサバ由来HNLの変異による⼤腸菌での可溶性発現

His103 mutants of HNL

from M. esculenta L.

Hydroxynitrile lyase(HNL)

Cyanohydrin Ketone or aldehyde

Manihot esculenta（キャッサバ）

（トウダイグサ科の熱帯低木）

Y. Asano et al Protein Eng. Des. Sel., 24, 607-616 (2011).

変異導⼊ (H103X, 変異導⼊ (H103X, K176P, K199P, K244P)による可溶性向上

K224

K199

K176

研究開発の背景

アミノ酸残基の置換による高発現型変異酵素を作成！

11

異種タンパク質可溶性発現研究の⼿順

手法

・ランダム変異によるスクリーニング

・構造からの合理的変異導⼊

対象酵素

・産業用酵素

・好熱性細菌、酵⺟、植物、昆⾍などに

由来する酵素

変異型可溶性発現酵素の獲得

変異型酵素の情報の蓄積変異型酵素の情報の蓄積

異種タンパク質可溶性発現の⼀般法則の解明

構造・機能の解析

フィードバック

12

異種タンパク質可溶性発現変異体

スクリーニング法の改良･ ランダム変異導⼊法

Error-prone PCR法 → 大腸菌XL-1Red

・コロニーピッキング

Bench-top Colony Pickerの使用

・抗⽣物質耐性能を利⽤したin vivoスクリーニング

D. Matsui and Y. Asano Biosci Biotechnol Biochem 79, 1473Patent application PCT/JP2014/053965

抗生物質耐性マーカーと融合した

酵素の可溶性発現

抗生物質耐性マーカーと融合した

酵素の不溶性発現

抗生物質耐性能

抗生物質含有培地marker

可溶性発現

発現しないor 不溶性発現

あり

なし

T. thermophilus HB8 ORFeomeのののの異種タンパク質可溶性発現の解析異種タンパク質可溶性発現の解析異種タンパク質可溶性発現の解析異種タンパク質可溶性発現の解析････ Annotated proteins in a plasmid collection of T. thermophilus HB8 � 937 proteinsS. Yokoyama et al, Nature Struct. Biol. 7, 943-945 (2000) .

� SDS-PAGE分析により大腸菌宿主での可溶性および不溶性発現を確認

････ 不溶性画分のみで発現が確認されたタンパク質の遺伝子不溶性画分のみで発現が確認されたタンパク質の遺伝子不溶性画分のみで発現が確認されたタンパク質の遺伝子不溶性画分のみで発現が確認されたタンパク質の遺伝子

� 159 (内酵素内酵素内酵素内酵素 85)

13

Soluble proteins

27%

Aggregated enzymes

9%

Aggregated proteins

8%

Other proteins

56%

異種タンパク質可溶性発現の実例①異種タンパク質可溶性発現の実例①異種タンパク質可溶性発現の実例①異種タンパク質可溶性発現の実例①T. thermophilus HB8 ORFeome 由来酵素遺伝子由来酵素遺伝子由来酵素遺伝子由来酵素遺伝子

*N.D.; not detected, **Protein concentrations of 1.0 mg/ml were used to determine the enzyme activities 14

Enzyme name Substitution

Soluble fraction in SDS-PAGE

Enzyme activity of the crude extract** (U/mg)

WT Mutant WT Mutant

Glucosidase V48M - + N.D.* 0.01

Metapyrocatechase K2G - + N.D. 0.10

Arginine decarboxylase A56G/G65L/R67H - + N.D. 0.09

3-Hydroxybutyrate dehydrogenase S140G - + N.D. 0.12

L-allo-Threonine aldolase A132P - + N.D. 0.02

Tryptophan synthase V24E/V36G - + N.D. 0.01

Glutamate dehydrogenase V299G - + 0.001 0.05

15

Variant’s activity (U/ml)

ChMOXWT N.D.

V150P 0.08

異種タンパク質可溶性発現の実例②異種タンパク質可溶性発現の実例②異種タンパク質可溶性発現の実例②異種タンパク質可溶性発現の実例②ヤンバルトサカヤスデ由来マンデロニトリル酸化酵素ヤンバルトサカヤスデ由来マンデロニトリル酸化酵素ヤンバルトサカヤスデ由来マンデロニトリル酸化酵素ヤンバルトサカヤスデ由来マンデロニトリル酸化酵素

大腸菌で発現困難な動物由来酵素遺伝子の可溶性発現に成功

マンデロニトリル

酸化酵素

16

異種タンパク質可溶性発現の実例③異種タンパク質可溶性発現の実例③異種タンパク質可溶性発現の実例③異種タンパク質可溶性発現の実例③ショウジョウバエ由来酵素ショウジョウバエ由来酵素ショウジョウバエ由来酵素ショウジョウバエ由来酵素

Wild type MutantPosition Residue Activity Residue Activity

DmDAO 152 Ile N.D. Pro 0.02 U/ml

DmODC117 Lys N.D. Leu 0.45 U/ml176 Leu N.D. Glu 0.04 U/ml

DmGDH174 Val N.D. Asp 0.14 U/ml257 Lys N.D. Tyr 0.91 U/ml261 Leu N.D. Glu 0.05 U/ml

D-アミノ酸酸化酵素

(DmDAO)

L-オルニチン脱炭酸酵素

(DmODC)

L-グルタミン酸脱水素酵素

(DmGDH)

17

異種タンパク質可溶性発現の実例④異種タンパク質可溶性発現の実例④異種タンパク質可溶性発現の実例④異種タンパク質可溶性発現の実例④ヒト成長ホルモンヒト成長ホルモンヒト成長ホルモンヒト成長ホルモン

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

hGH

con

c. (

ng/m

l)

ELISAによる粗酵素可溶性画分のヒト成長ホルモンの検出

ヒト成長ホルモン（hGH)でも、大腸菌BL21(DE3)で顕著に発現量が増加する変異導入部位を発見した。

酵素以外のタンパク質でも可溶性発現できることを確認

200,000

116,250

97,400

66,200

45,000

31,000

M WT L46K F55H L82R L88E R95S V97E L114K

18

本プロジェクトでは、これらの異種タンパク質

可溶性発現の事例から得られた情報をもとに変異するべきアミノ酸残基を推定する方法およびプログラムについても、開発に成功しています。

19

異種タンパク質可溶性発現の異種タンパク質可溶性発現の異種タンパク質可溶性発現の異種タンパク質可溶性発現の新技術の新技術の新技術の新技術の特徴・従来技術との比較特徴・従来技術との比較特徴・従来技術との比較特徴・従来技術との比較

• 融合タンパク質と比べ、構造の変化が少ない。

• 広い範囲の培養条件で酵素を生産できる。

• 高コストの宿主ベクター系を使用せずに、一般的な宿主である大腸菌で生産が可能となる。（他の宿主に適用できる）

• 酵素遺伝子の開発に成功すれば、一般的な工程で生産が可能となり、生細胞でも利用できる。

20

異種タンパク質可溶性発現技術の異種タンパク質可溶性発現技術の異種タンパク質可溶性発現技術の異種タンパク質可溶性発現技術の想定される用途想定される用途想定される用途想定される用途

• 組換え微生物での生産が困難なため実用化が難しい動植物由来酵素の利用が可能となる。

• 生産コストの削減の効果が得られる。

• 酵素以外にもバイオ医薬品、抗体などの生産にも利用できる。

（新規医薬品やバイオシミラーなどへの展開）

21

異種タンパク質可溶性発現の異種タンパク質可溶性発現の異種タンパク質可溶性発現の異種タンパク質可溶性発現の実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題実用化に向けた課題

現在現在現在現在：：：：可溶性発現量の向上を示す多数の例を開発した。しかし、実用化レベルまで生産性を向上させる例の蓄積が必要。

今後今後今後今後：：：：複数のアミノ酸残基の置換を導入することによる実用化レベルまで発現量を向上させる実験を行う。

22

企業への期待企業への期待企業への期待企業への期待

・異種タンパク質可溶性発現を適用する課題（生産困難な酵素）を持つ、企業との共同研究を希望

→組換え微生物による生産性の低さから実用化できない酵素を実用化できる可能性がある。

・バイオ医薬品、バイオシミラー分野への展開

→異種タンパク質可溶性発現の導入が生産性の向上に有効な可能性がある。

23

本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：活性型変異酵素の製造法および新規活性型変異酵素

• 出願番号 ：特願2015-117808• 出願人 ：公立大学法人富山県立大学

• 発明者 ：浅野泰久、松井大亮、奥祐子

24

お問い合お問い合お問い合お問い合わわわわせせせせ先先先先

富山県立大学

ERATO浅野酵素活性分子プロジェクト

研究推進主任 松田 元規（ライセンス担当）

ＴＥＬ 0766－88－ 2280ＦＡＸ 0766－88－ 2422e-mail m-matsuda＠pu-toyama.ａｃ.ｊｐ