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東北薬科大学第一衛生化学教室 (〒9818558 仙台市青葉区小松島 441)e-mail: shuhei＠tohoku-pharm.ac.jp

69YAKUGAKU ZASSHI 124(2) 69―87 (2004) 2004 The Pharmaceutical Society of Japan

―Reviews―

敗血症性ショックモデルとしてのエンドトキシンの病態生理

―酸化ストレスからのアプローチ―

坂 口 修 平

Metabolic Aspects of Endotoxin as a Model of Septic Shock―Approached from Oxidative Stress―

Shuhei SAKAGUCHI

First Department of Hygienic Chemistry, Tohoku Pharmaceutical University,441 Komatsushima, Aoba-ku, Sendai 9818558, Japan

(Received October 1, 2003; Accepted November 29, 2003)

Despite the remarkable progress in intensive care medicine, sepsis and shock continue to be major clinical problemsin intensive care units. Septic shock may be associated with a toxic state initiated by the stimulation of monocytes by bac-terial toxins such as endotoxin, which is released into the bloodstream. This study describes the role of oxidative stress inendotoxin-induced metabolic disorders. We demonstrate that endotoxin injection results in lipid peroxide formation andmembrane injury in experimental animals, causing decreased levels of free radical scavengers or quenchers. Interesting-ly, it was also suggested that tumor necrosis factor (TNF)induced oxidative stress occurs as a result of bacterial or en-dotoxin translocation under conditions of reduced reticuloendothelial system function in various disease states. In addi-tion, we suggest that intracellular Ca2＋, Zn2＋, or selenium levels may participate, at least in part, in the oxidative stressduring endotoxemia. On the other hand, it is also suggested that the extent of endotoxin-induced nitric oxide (NO) for-mation may be due, at least in part, to a change in heme metabolic regulation during endotoxemia. However, in our ex-perimental model, NO is not crucial for lipid peroxide formation during endotoxemia. Sho-saiko-to is one of the mostfrequently prescribed Kampo medicines and has primarily been used to treat chronic hepatitis. We report that Sho-saiko-to decreases the rh TNFinduced lethality in galactosamine-hypersensitized mice and protects mice against oxygen toxic-ity and Ca2＋ overload in the cytoplasm or mitochondria during endotoxemia. We further suggest that Sho-saiko-toshows a suppressive eŠect on NO generation in macrophages stimulated with endotoxin and that it may be useful in im-proving endotoxin shock symptoms.

Key words―septic shock; endotoxin; oxidative stress; free radical formation; Sho-saiko-to

はじめに

ショックとは生活機能が極端に低下したときの状

態で，原因はなんであれ生体に強い衝撃が加わって

生じる非生理的な生命を脅かす状態を総称する言葉

で，“死の前兆”を意味する 1つの症候群である．

ショックは慢性的に進行する状態や 1つの疾病及び

単一の病態ではなく，原因のいかんを問わず，共通

するショックの病態は相対的あるいは絶対的な循環

血液量の減少による末梢循環不全であり，ほぼ共通

の終末像を呈する．直接の原因，ショックを誘発す

る因子は極めて多く，病態生理学的にも広範囲にま

たがっている．1)最近の生化学，免疫学の進歩がシ

ョックを理解する上で重要な示唆を与え，研究者に

とって興味のつきない多くの問題を提供してくれて

いる．病態生理学的には心拍出量の低下，急な低血

圧，有効微小循環血量の欠乏，播種性血管内凝固

（disseminated intravascular coagulation, DIC）とそ

れに基づく全身組織と重要臓器組織の酸素欠乏

（ anoxia），毛細血管透過性の亢進，網内系

（reticuloendothelial system, RES）の機能低下及び

それらの結果としての代謝的失調と細胞代謝不全，

代謝性アシドーシスの発生を伴う．ショックは原因

から心原性（cardiogenic shock），出血性（血液量

減少性，hypovolemic shock），敗血症性（ septic

shock）などに分類されるが，いずれも組織循環障

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7070 Vol. 124 (2004)

害から臓器障害，多臓器不全症候群（multiple or-

gan dysfunction syndrome, MODS）に至り，末期に

は不可逆性ショック状態になるものと考えられてい

る．2,3)

筆者らは長年，ショックモデルとしてのエンドト

キシン血症の病態生理学の研究に興味を持ってい

た．この間，生化学の進歩を基にしたエンドトキシ

ン及びショック研究は目覚しく，また，筆者らもエ

ンドトキシン血症の病態機構を明らかにするために

フリーラジカル産生，4―9) RES機能，10,11)リポプロ

テイン代謝，12―14)グリコーゲン枯渇機構，15,16)細胞

内 Ca2＋ 動態，17―19)サイトカイン，20,21)一酸化窒素

（nitoric oxide, NO)，22―24)必須微量元素25,26)そして

漢方方剤小柴胡湯のショック防止効果27―31)に関心

を持ち研究を進めてきた．敗血症性ショック（本総

説ではグラム陰性桿菌から生じるエンドトキシンシ

ョックを示す）の複雑な病態機構を論じるために，

筆者らの研究成績を基にエンドトキシンで惹起され

る酸化ストレス（oxidative stress）からアプローチ

していき，さらにその病態論から小柴胡湯の敗血症

性ショックの防御機構についても述べていきたい．

1. ショックとエンドトキシン

感染，非感染侵襲による多臓器障害，多臓器不全

（multiple organ failure, MOF）への発症の原因と

して種々の humoral mediatorsの関与が報告され，

その対策が医療の現場で行われている．中でもグラ

ム陰性菌感染症によるショック，すなわち敗血症性

ショックはその診断と治療の進歩にも関わらず死亡

率が高く，米国では年間の死亡者が 21万にも及ん

でいると推定され，重要疾患の 1つでもある．32)敗

血症性ショックが持続すれば hyperdynamic stateは

hypodynamic stateとなる．この状態では低酸素症

が顕著になり，代謝アシドーシスが進行し，やがて

多臓器不全に陥り予後は極めて悪い．ショック学は

戦争とともに発展し，特に米国などでは国家プロジ

ェクトとして研究が行われ，ショックの病態研究と

その治療法開発が飛躍的に進歩してきた．1970年

代後半より高齢者などいわゆる compromized host

の増加，手術の拡大化とともに，ショック研究の対

象は敗血症性ショックが主体となってきている．1)

グラム陰性菌敗血症性ショックの原因物質として

重要なエンドトキシンは多様な生物活性を持ってお

り，現在基礎医学，臨床医学の連携をはかりながら

研究が進められている．臨床的にはエンドトキシン

を簡単に検出するカブトガニ血球由来の limulus

testが開発されて以来，各種疾患の各種病態とエン

ドトキシンとの関係が明らかにされつつある．例え

ば，ショックの原因が出血性やその他の要因であっ

ても，RES 機能が低下したとき，腸内起因菌の内

因性のエンドトキシンが肝 KupŠer細胞内で解毒さ

れず，bacterial translocation (BT）により末梢血中

にエンドトキシンが認められ，エンドトキシン血症

の状態になること，33)また，腹部手術などの高度な

外科侵襲，あるいは肝，胆，膵疾患などに内因性エ

ンドトキシンの解毒不全が関与し，一見相互に何の

関連もないような疾患が敗血症性ショック，すなわ

ちエンドトキシンショックの終末代謝像と近似して

いることが知られるようになってきた．最近では臨

床的に外科領域のショックばかりではなく，内科領

域でもエンドトキシンが注目されてきている．

2. エンドトキシと SIRS

生体に対するエンドトキシンの多彩な作用はエン

ドトキシンによる直接的な作用によるものでなく，

エンドトキシンの刺激を受けた種々の細胞から産生

される humoral mediatorsを介して引き起こされる

ことが明らかになってきた．34)エンドトキシンによ

って刺激を受けた単球マクロファージ，血管内皮

細胞，好中球などから産生されるサイトカイン，エ

イコサイド，血小板活性化因子（PAF），活性酸

素，エラスターゼ，NOなどの作用により全身的な

過剰炎症反応が惹起され，血圧低下，微小循環障害

から細胞障害，さらに臓器障害が引き起こされ

る．35)

敗血症とは血液中に細菌が存在すること，あるい

はエンドトキシンに代表される細菌毒素が存在する

ことが必要条件であり，細菌感染症の過程で高熱，

白血球の増加や減少，呼吸促拍，頻脈などの一連の

臨床症状を示す病態として捉えられてきたが，同様

な症状は外傷，熱症，膵炎，出血性ショックなどの

非感染性疾患，ウイルス，真菌感染など細菌感染症

でも認められる．その原因のいかんに関わらず，共

通する臨床症状は刺激に対する全身の炎症反応であ

る．敗血症性ショックなどは「かならずしも感染に

よらない，生体の過剰な侵襲に対する全身性炎症反

応症候群 systemic in‰ammatory response syndrome

(SIRS）として理解されつつあり，36) humoral medi-

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71

Fig. 1. Concept of Systemic In‰ammatory Response Syndrome (SIRS)(ACCP/SCMCC, 1992)

71No. 2

atorsの炎症性サイトカインが initial mediatorとし

て作用し，最終的に組織，臓器障害を引き起こす酸

化ストレスがこの多臓器不全に関与していることが

示唆されている．35)従来，敗血症の概念が不明確で

あったが，1992年にアメリカ胸部内科医協会と集

中治療医学会のコンセンサンス委員会で SIRSの概

念が導入され，37)敗血症の位置づけが明確になり，

この概念が各国で受け入れられつつある．すなわち

SIRSは感染がなくても急性膵炎，炎症，外傷，そ

の他の疾患で発熱，頻脈，呼吸回数の促進，白血球

増加などの症状を呈する場合を総称し，さらに，感

染が証明されて同様の症状を呈する場合を敗血症と

することが提唱されている（Fig. 1）．37)この概念の

導入により，SIRSの段階で敗血症の前段階として

治療を開始し，敗血症から敗血症性ショック，それ

に引き続いて発症する可能性の高い多臓器不全を防

止しようとしている．この SIRSの段階ではサイト

カインが大きな要因となっており，humoral media-

torsに対する対策が考えられている．33)

3. エンドトキシンのシグナル伝達機構

現在までに知られているエンドトキシンによる細

胞活性化の分子機構は次のように考えられてい

る．38)エンドトキシンの細胞上の受容体に関しては

単球マクロファージの分化抗原である分子量 53

kDa の糖タンパク CD14 が知られている．エンド

トキシン（ lipopolysaccharide, LPS）は血清中の

LPS 結合 タンパク質（LPS binding protein, LBP）

などに結合し，複合体となって CD14と結合して細

胞を活性化する．これまで CD14がエンドトキシン

の受容体と考えられていたが，CD14 は glycosyl

phosphatydylinositol (GPI）アンカーを介して細

胞膜表面に結合している膜型分子，あるいは GPI

アンカーが欠損した遊離分子であるため，細胞ドメ

インを持たないことからエンドトキシンのシグナル

伝達に関わるもう 1つの受容体の存在が示唆されて

きた．39)実際，CD14欠損マウスはエンドトキシン

に対する反応性は低下するが反応はする．最近，細

胞内へのシグナル伝達を行う LPSレセプターとし

て Tolllike receptor 4 (TLR4）が見出された．

TLR4 ノックアウトマウスは LPS に低応答性であ

る．また，TLR4が LPS低応答性マウス C3H/HeJ

の LPS低応答性の原因遺伝子であり，C3H/HeJマ

ウスでは TLR4 の細胞質内ドメインに点変異性が

存在するため機能的 TLR4 が発現していない．

TLR4 はアダプタ分子である MD-2 と会合してお

り，複合体として LPSを認識することで細胞内へ

シグナルを伝達する．40)以上のことから今日では少

なくともマウスにおいては TLR4が LPSの受容体

であると考えられている．

4. エンドトキシンと酸化ストレス

一般に脂質過酸化はオゾンや高酸素状態などのと

きに生成するが，低酸素状態でも起こり，活性酸素

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7272 Vol. 124 (2004)

を発生することが 1970年代の後半から知られるよ

うになってきた．活性酸素種は従来から研究されて

きた毒性に加え，生体のレドックス制御の観点から

細胞内情報伝達シグナルとしての役割が注目されて

きている．酸化ストレスとは活性酸素生成亢進・抗

酸化防御システムの破綻であり，酸化促進物質が優

勢になった状態と定義されており，種々の疾病の発

生と進展に関与する．エンドトキシンによる臓器障

害を考える場合フリーラジカルの関与も重要であ

る．一般にショックでは DICを生起する．エンド

トキシン血症ではこの DIC のモデルともなる．

DIC は血管凝固に続く末梢循環での血栓形成か

ら，末梢組織の酸素供給が障害されて酸素欠乏とな

り，フリーラジカルの生成によりリソゾーム膜やミ

トコンドリア膜の脂質過酸化が起こり，組織障害や

代謝障害となって不可逆性ショック状態に移行する

ものと考えられている．35)ショックの本態は組織還

流の低下であり，細胞は低酸素状態に置かれる．エ

ンドトキシン血症時に著しい高乳酸血症を呈するこ

とは筆者らも41)観察しており，これは組織 anoxia,

ischemiaからくる嫌気的状態の指標であり重症状態

を示す．そこで筆者らはいち早く，1980 年代の初

頭からエンドトキシン血症での脂質過酸化生成とそ

の消去機構の障害についての実験を開始した．4―9)

4-1. フリーラジカルの生成と生体膜障害 エ

ンドトキシン血症は腎，肺，肝など主要な臓器に障

害を引き起こす多臓器不全が，その中でも肝が最も

早期に高頻度に障害が生じる．このようなことから

主として基礎的な動物実験は肝を中心に行われてき

た．現在，エンドトキシンが容易に検出され，臨床

家にとってもエンドトキシンは興味ある対象になっ

ており，Nolanと Leibowitz42)が腸管由来のエンド

トキシンが肝疾患の成因，進展に関与することを指

摘以来，肝疾患とエンドトキシンとの関連が一段と

注目を集めている．Shibayama43) は肝を含む臓器

障害の主原因は臓器内の微小血管内に形成されたフ

イブリン血栓による循環障害であると述べている

が，肝障害の成因を考える場合，フリーラジカルの

関与も重要である．筆者らはこの考えに基づいて研

究を進めてきた．

ショックモデルでの活性酸素の消長は極めて短時

間であり，把握は困難である．そこで筆者らは肝臓

中の過酸化脂質（thiobarbituric acid, TBA）を定量

することで推定した．4)当時，この TBA 法はフ

リーラジカル生成を推定するのに大変有益な方法で

あった．44)マウスにエンドトキシン（200 mg, i.p.）

を投与すると 18 h 後に肝内の過酸化脂質，スー

パーオキサイド産生系の xanthine oxidase (XOD）

活性が顕著な増大を示した．過酸化脂質の増大は

TBA値であるが，肝 plasma membrane（細胞膜）

に変化が予想された．そこで， superoxide dis-

mutase (SOD), glutathione reductase (GSSGR),

glutathione peroxidase (GSHPx）活性を観察する

と活性の低下が見られ，フリーラジカル消去機構の

障害が観察された．4)この GSHPxGSSGR 系は

膜脂質をフリーラジカル攻撃から防御するのみでな

く，oxidationreduction系や SH酵素及び膜 SHの

酸化を防御するものと考えられていた．このことは

筆者らの検討により，エンドトキシンによる血清

LDHの逸脱が還元型グルタチオン（GSH）の投与

により防御できたことからも理解できた．45)さらに

エンドトキシン投与による肝細胞膜の損傷を SDS

ポリアクリルアミド電気泳動パターンで検討した

（Fig. 2）．4)予想通り分子量 65 kDa付近のバンドの

消失が観察され，140 kDa付近の数ヵ所のタンパク

画分に顕著な変化が認められ，フリーラジカル産生

による肝細胞膜の損傷が示唆できた．このエンドト

キシンによる肝細胞膜の損傷は a-トコフェロール

の投与により完全に，GSHではほとんど膜が修復

された．一方，コーチゾンではやや異なった修復パ

ターンを示した．a-トコフェロール，GSHは肝の

脂質過酸化を抑制するが，コーチゾンはエンドトキ

シンによる脂質過酸化は抑制しない．a- トコフェ

ロール，コーチゾンは同じく膜を修復しても，過酸

化脂質の抑制と言う点では作用機構が異なるものと

考えられた．このことについて，ビタミン E（Vit.

E）欠乏，過剰食飼育マウスでの肝脂質過酸化を検

討すると，エンドトキシンを投与した Vit. E 過剰

食マウスは脂質過酸化は見られず，Vit.E欠乏食マ

ウスでは普通食による脂質過酸化を上回る顕著な増

大を示した（Fig. 3）．5)一方，臓器障害の指標であ

る LDH isozymeパターンを比較すると，エンドト

キシン投与では LDH-3, 5の各臓器からの逸脱が，

Vit. E欠乏マウスでは特に顕著に見られ，膜電気泳

動パターンと一致した．Vit. Eは膜を安定させ，リ

ソゾーム酵素の放出を防止し，エンドトキシンによ

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73

Fig. 2. Scanograms of SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoregrams of Plasma Membrane ProteinThe gel patterns were scanographed by a Shimadzu CS-910 from scanner.

73No. 2

る組織障害の防御に役立っていることが示唆され

た．5)

リソゾーム膜の障害がフリーラジカルで容易に起

こることは衆知の事実である．エンドトキシン血症

時には高乳酸血症を伴うが，組織内の pHの低下は

リソゾーム膜の不安定化を引き起こし，膜リン脂質

の高度不飽和脂肪酸の過酸化はリソゾーム膜からの

水解酵素の放出を促し，組織障害の増大をもたらす

ものと考えられる．

RES とマクロファージを同一視して扱うことに

は議論もあるかもしれないが，RESは主として肝

KupŠer細胞などの sessileマクロファージと好中球

や単球などの wardering マクロファージに大別さ

れ，生体自己防衛機能の一端として phagocytic sys-

tem を形成している．ショック時の RES機能の低

下は病態生理上重要な意味を持ち，その予後に重大

な影響を及ぼす．エンドトキシンなどが KupŠer細

胞で貪食消化，解毒されず長時間血流中に滞留する

ようになり，臓器組織の障害を招く．筆者らは代表

的な RES機能抑制剤である酢酸鉛によるエンドト

キシンの感受性増大の一因にフリーラジカル

scavenger 系の活性低下が起因するものと推定し

た．46)肝はショックによる細胞障害を受け易く，シ

ョックによる多臓器不全への中心的役割を担ってい

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74

Fig. 3. EŠect of a-Tocopherol-Deˆcient or -Excess Diet on Lipid Peroxide Level in Liver or Endotoxin-Poisoned MiceMice were fed the diets for 40 days, and then injected with endotoxin (5 mg/kg i.p.) Control mice were injected with saline alone. Each result represents the

mean S.E. from 16 mice. Deˆcient diet: dl-a-tocopherol acetate below 5 I.U./kg. Normal diet: dl-a-tocopherol acetate 20 I.U./kg. Excess diet: dl-a-tocopherolnicotinate 200 I.U./kg.

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るとされ，フリーラジカルがその成因に関与してお

り，敗血症性ショックの病態解明にエンドトキシン

によるフリーラジカル産生機構が重要な示唆を与え

る．4―9)

4-2. エンドトキシンによる 細胞内 Ca2＋ の増大

と細胞障害 Ca2＋濃度の変化は細胞内外の Ca2＋

プールにより調節されている．細胞外 Ca2＋濃度は

1―2 mMであるのに対し細胞質の濃度は約 100 nM

にすぎず，細胞外には著しく高濃度の Ca2＋ が存在

するが，通常は細胞膜がバリアーの役割を果たして

いる．細胞内では小胞体，ミトコンドリア内に

Ca2＋ が比較的高濃度に存在し，必要により膜を通

過して細胞内へ流入する．それゆえ，何らかの障害

により細胞内に大量の Ca2＋ が流入すると細胞障害

が発現する．エンドトキシン血症は単にホルモンの

不均衡などでは clearcutに理解できない複雑な病

態代謝を示しており，1つの代謝応答がまた 1つの

代謝応答につながり複雑多岐に及んでいる．この複

雑な応答を考える場合，細胞内 Ca2＋ は非常に魅力

的な示唆に富んでおり，筆者らは一連の研究の流れ

の中でエンドトキシン血症の代謝異常を解く鍵とし

て細胞内 Ca2＋ の動態からアプローチしてき

た．17―19)

現在，肝細胞障害と細胞内，特に細胞質中の

Ca2＋ との関係が次第に明らかにされてきている．

最も重要な Ca2＋源は小胞体，ミトコンドリアなど

より，むしろ細胞外液よりの Ca2＋ の流入であり，

肝細胞障害の出現は持続的な Ca2＋濃度上昇が細胞

質に認められることが重要である．このようなこと

から，筆者らは肝の単一細胞の cytosolicfree Ca2＋

濃度［Ca2＋]iを画像解析システム ARGUS100CA

を使用して検討した．18)エンドトキシン投与 18 h

後にマウスの［Ca2＋]iの増大を認めた（Fig. 4(A））．

さらに肝細胞膜 Ca2＋ATPase 活性が対照に比較し

て 28％低下した．Kessler47)らは肝細胞膜の Ca2＋

ATPaseの分子量は 140 kDaであることを示してお

り，この細胞膜 Ca2＋ATPaseは活性酸素による脂

質過酸化によって阻害されることが認められてい

る．48)筆者らの検討によりエンドトキシンによる肝

細胞膜 Ca2＋ATPase活性の低下はフリーラジカル

による脂質過酸化が肝細胞膜（60―150 kDa），特

に 140 kDa を損傷させることにより起こることが

示唆された（Fig. 4(B））．18)したがって，エンドト

キシンで起こるフリーラジカル産生による肝細胞膜

Ca2＋ポンプ機能障害が細胞外から細胞内へ［Ca2＋]i

の流入を導くと考えられる．

一方，筆者らの検討においても肝ミトコンドリア

ではエンドトキシンは Ca2＋ を増大させ，脂質過酸

化を惹起させ，Ca2＋ATPase活性を高めることを

認めた（Table 1）．17)これらの事実は肝ミトコンド

リアへの Ca2＋ の蓄積をもたらし，活性酸素の発生

により，ミトコンドリア膜が損傷を受けることは明

白であり，ミトコンドリアの膜過酸化は Ca2＋ の膜

透過性に大きな影響を持つことになる．ミトコンド

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Fig. 4. Changes in Cytosolic-Free Ca2＋ Concentration [Ca2＋]i in Individual Vital Cells (A) and Scangrams of SDS-PolyacrylamideGel Electropherograms (B) in Liver Plasma Membrane Protein of Mice 18 h after Endotoxin Administration

A: [Ca2＋]i in an individual vital cell was shown by computer graphics using the ARGUS100CA ststem. B: a: molecular weight of protein (140 kDa) of Ca2＋

ATPase40) in liver plasma membrane, b: region of endotoxin-induced membrane damage.

Table 1. Changes in ATPase Activity in Liver Mitochondria of EndotoxinPoisoned Mice at 18 h

Treatment

Mitochondria fraction

Ca2＋, Mg2＋ATPase Mg2＋ATPase(nmol/mg of protein) Ca2＋ATPase

None 467±4(100％) 429±6(100％) 38±2 (100％)

Endotoxin 447±4( 96％) 390±2( 91％) 57±5(150％)

Each value represents the mean±S.E. of 12 mice. Asterisk () indicates a signiˆcant diŠerence from the control value at p＜0.05.

75No. 2

リアは酸化的リン酸化により細胞内のエネルギーを

生成しているため，その障害は細胞死に直結する．

このことはエンドトキシンはミトコンドリア損傷の

指標である state 3, respiratory control index (RCI）

の低下を導くことからも明らかである．8)

エンドトキシンによるショック機構の 1 つとし

て，フリーラジカル生成機構を述べてきたが，ここ

でアラキドン酸の遊離を考えた場合細胞内 Ca2＋ も

また関与する．すなわち細胞内 Ca2＋ の増大→ホス

ホリパーゼ A2(PLA2）の活性化→アラキドン酸生

成の一連の反応が起こるものと考えられた．このこ

とは筆者らの実験から，8,19) vitamin D3及び Ca2＋ 欠

乏マウスにエンドトキシンを投与しても肝の脂質過

酸化が起こらず，Ca2＋ 拮抗剤のベラパミルや

PLA2阻害剤のデキサメタゾンの投与も脂質過酸化

を抑制することからも間接的に示唆できる．現在ま

でに哺乳動物から 3 種の PLA2，すなわち分泌性

（sPLA2）で分子量 14 kDaのⅠ型（膵臓型），Ⅱ型

（非膵臓型，炎症型）と分子量 85 kDa の細胞質

PLA2（ cPLA2）が単離されている． sPLA2 と

cPLA2 の示す酵素学的性質の違いとして，sPLA2

は活性発現に mMオーダーの Ca2＋ が必要であるの

に対し，cPLA2 は細胞内で起こる nM単位の Ca2＋

濃度変化に呼応して活性化される．cPLA2 はアラ

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Table 2. Changes in Superoxide Dismutase (SOD) and Glutathione Peroxide (GSHPx) Ac-tivities and NonProtein Sulfhydryl (NpSH) Level in Liver of EndotoxinPretreated Mice3 h after Recombinant Human Tumor Necrosis Factor (rhTNF) Administration

TreatmentSOD GSHPx NpSH

(Units/mg of protein) (mg/g of wet liver)

Control 2.52±0.39a) 0.68±0.03 1.34±0.16

LPS 2.96±0.41 0.65±0.05 1.25±0.07rhTNF 3.11±0.34 0.76±0.02 1.29±0.06

LPS＋rhTNF 2.16±0.36 0.51±0.04 0.98±0.07

a) Mean value±S.E. of 10 mice.signiˆcant diŠerence from the value of endotoxin or rhTNFinjected mice( p＜0.05). Control: saline, lipopolysaccharide (LPS): endotoxin (0.5 mg/kg, i.p.), rhTNF (1×104 units/mouse, i.v.).

76 Vol. 124 (2004)

キドン酸を選択的に遊離するが，sPLA2 には脂肪

酸選択性は認められないなどの点から，細胞活性化

の初期過程における膜リン脂質からのアラキドン酸

の選択的遊離は cPLA2により制御されていると考

えられている．49)このことは cPLA2 ノックアウト

マウスの解析により cPLA2 が種々の刺激に応じて

誘導される脂質 mediatorの産生において中心的な

役割を担っていることが確認されている．50)また，

炎症サイトカインによるプライミングの際に，

cPLA2の活性化が必須であることが cPLA2をノッ

クアウトした細胞で証明されている．したがって，

アラキドン酸はその代謝経路で脂質 mediatorを産

生するだけでなく，起炎物質として炎症にも関与す

る．51)

筆者らは実験的エンドトキシン血症では酸化スト

レスが生じ，顕著な脂質過酸化が細胞・組織障害を

きたすことを証明しており，その一因として細胞内

Ca2＋ の増大を示唆してきた．17―19)これは cPLA2活

性発現に必要な nM単位の［Ca2＋]i増大により，ア

ラキドン酸カスケードが亢進され，DIC に関与す

る PAF やロイコトリエン D4, MDA を含めた脂質

mediator が産生されると考えられ，エンドトキシ

ンで起こるショックに細胞内 Ca2＋ が深く関与して

いることは間違いないものと思われた．

5. 腫瘍壊死因子（TNF）と酸化ストレス

5-1. TNF とエンドトキシンの相乗作用 Tu-

mor necrosis factor (TNF）は腫瘍部位に出血壊死

を誘導する因子として見出されたが，現在では炎症

を通した生体防御機構に広く関わる炎症サイトカイ

ンとして理解されている．敗血症性ショックにおい

ては炎症反応を惹起するサイトカインとして中心的

な役割を演じ，前述した SIRSがその病態の本質で

ある考え方がなされてきている．37)本来，TNF は

エンドトキシンなどの刺激により単球マクロフ

ァージを始めとする多種類の細胞で生産され，炎症

反応や免疫機構に広く関わり，生体の恒常性の維持

に重要な役割を果たしている．52)しかしながら，過

剰に産生されるとショックを誘発することから，

TNFはエンドトキシンショックの重要な mediator

の 1 つであると考えられており， Beutler と

Cerami53)は TNFは致死活性を持ち，エンドトキシ

ン致死活性の mediatorであると述べている．しか

し，エンドトキシンの混入のない recombinant hu-

man TNF (rhTNF）はそれ自身致死活性はない．こ

のことは Hsuehら54)によるエンドトキシンと TNF

の強い相乗作用は，組織障害や致死に重要な役割を

担うとの報告からもうなずけ得る．

そこで，エンドトキシン血症での TNFの酸化ス

トレスの影響をエンドトキシンとの相乗作用から検

討した．9) rhTNFとエンドトキシンの併用投与によ

りマウスの致死作用の増大と肝 SOD, GSHPx 活

性の低下の相乗作用が見られ，rhTNF 投与では見

られない酸化ストレスが誘導されてきた（Table

2）．このことは RES機能抑制剤である酢酸鉛処理

マウスにポリミキシン Bを前投与すると，酢酸鉛

で誘導されてくる rhTNFの脂質過酸化が抑制され

たことからも理解できる．このポリミキシン Bは

エンドトキシン（LPS）の lipid A部分と結合して，

エンドトキシンの活性を中和することが知られてお

り， rhTNF で誘導されてくる酸化ストレスは

rhTNF とエンドトキシンが相乗的に作用すること

が間接的に証明された．9)TNFは本来，生体防御機

hon p.9 [100%]

77

Table 3. EŠect of Galactosamine on Changes of CytosolicFree Ca2＋ Concentration in Single Cells and Plasma Mem-brane Ca2＋ATPase Activity in Liver of ZymosanPretreat-ed Mice 18 h after Endotoxin Administration

Treatment

Plasma membraneCa2＋ATPase

Single cells[Ca2＋]a)i

(nmol/mg of protein) (nmol/cell)

Control 157.2±2.3b) 127.3±10.6c)

LPS 120.2±3.8 145.7±3.1

LPS＋GalN 87.6±4.5 171.9±4.3

GalN 148.7±6.4 132.5±2.6

a) [Ca2＋]i; Cytosolicfree Ca2＋ concentration. b) Mean value±S.E.of 10 mice. c) Mean value±S.E. of 6 experiments.signiˆcant diŠerencefrom the value of endotoxininjected mice ( p＜0.05). Control: saline,LPS: endotoxin (1 mg/kg, i.p.), GalN: galactosamine (400 mg/kg, i.p.).

Table 4. EŠects of Endotoxin on Rectal Temperature inrhTNF/GalNTreated Mice

TreatmentRectal temperature (°C)

4 h 18 h

Control 37.3±0.09a) 37.1±0.07

LPS 0.1 mg/kg (i.p.) 37.0±0.11 36.8±0.15rhTNF 5×103 units/mouse (i.v.) 37.2±0.13 37.3±0.17

rhTNF/GalN 700 mg/kg (i.p.) 36.8±0.14 36.4±0.24

LPS/GalN 37.1±0.16 36.5±0.27

LPS/rhTNF 36.7±0.12 36.8±0.21LPS/rhTNF/GalN 32.2±0.12No survival

a) Mean value±S.E. of 5 mice. , p＜0.05, signiˆcantly diŠerent fromrhTNF/GalNtreated group. Mice with a body temperature of 37―38°Cwere employed in this experiment after selection by measuring twice at 15min intervals.

77No. 2

構に関わるサイトカインであり，エンドトキシンの

存在下では過剰にフリーラジカルを産生し，ショッ

クに導くことが示唆された．

5-2. TNF と D- ガラクトサミン エンドトキ

シン血症モデルとして用いられる D-ガラクトサミ

ン（D-GalN）は動物に投与するとエンドトキシン

と同様に TNF の感受性を顕著に増強する．

Freudenberg らは55) C3H/HeJ系エンドトキシン耐

性マウスでは D-GalNとエンドトキシンを投与して

やると，肝の uridine triphosphate (UTP）は激減す

るが死に至らない．しかし，感受性マウスの C3H/

HeN系のマクロファージを移入してやると D-GalN

処理 C3H/HeJ系マウスはエンドトキシンに対して

感受性になり死に至ることを観察した．このことか

らエンドトキシンと D-GalNの併用による致死活性

はマクロファージが重要であることが示された．筆

者ら19)は zymosan でマクロファージを活性化させ

てやると，一般的に D-GalNのマウス腹腔内投与量

は 700 mg/kgであるが，400 mg/kgの投与量でエン

ドトキシン感受性になることを見出した．エンドト

キシン（1 mg/kg, i.p.）の低用量の投与で肝細胞膜

Ca2＋ATPase活性は顕著に低下を示し，［Ca2＋]iを

増大させ，顕著な脂質過酸化に導いた（Table 3)．19)

しかし，エンドトキシン刺激による TNF産生が D-

GalNの投与でも増強が見られず，56)また肝 KupŠer

細胞の TNF の mRNA レベルも変化しないと言わ

れている．このことからも D-GalN負荷による動物

の TNFの感受性増大は，TNFの産生亢進による作

用増強よりはむしろ他の機構により感受性を高めて

いるかもしれない．それではその作用機構は何であ

ろうか？ 筆者らはその機構を説明するために前述

の TNFとエンドトキシンの相乗作用からアプロー

チした．

5-3. D-GalN負荷による TNF感受性増大機構と

内因性エンドトキシンの関与 現在までに知られ

ている D-GalN 負荷による TNF の感受性増大機構

を上記したが，その機構を抗エンドトキシン作用を

持つポリミキシン B を使用した筆者ら20,21)の実験

から内因性エンドトキシンの関与を考察していく．

ポリミキシン Bの前投与は D-GalN負荷マウスによ

る rhTNF の顕著な致死と LDH isozyme の逸脱を

防御する．21)このことは糖脂質代謝でも観察され

た．20)また，D-GalN 負荷マウスに影響を及ぼさな

い rhTNF（5×103U/mouse, i.v.）量にエンドトキ

シン（0.1 mg/kg, i.p.）の低用量を併用投与すると

直腸体温の顕著な低下が見られ，致死作用を示し，

8 h で全例死亡した（Table 4)．20)これらの知見か

ら D-GalN による TNF 感受性増大機構に腸管由来

の内因性のエンドトキシンが関与することが示唆さ

れた．BTが存在することは実験的にも臨床的にも

確認されている．しかし，BT と死亡率や MODS

への進展など，ヒトにおけるその正確な役割はいま

だ明らかにされていない．33) Deitchら57)はショック

状態では BTが起こることを観察しており，彼らは

侵襲下での腸管のバリアの破綻を強調している．ま

た，D-GalN投与時の実験肝障害でも起こることが

報告されており，重要な示唆を与えている．

敗血症性ショックモデルとして D-GalNを負荷し

hon p.10 [100%]

78

Fig. 5. EŠects of Zn2＋ -Deˆcient Diet on Lipid Peroxide (A)and Metallothionein (B) Levels in Liver of Rats 18 h afterEndotoxin Challenge

Rats were fed the Zn2＋ -deˆcient diet for 8 weeks, and were then injectedwith endotoxin (6 mg/kg i.p.). Lipid peroxide and metallothionein levelswere determined as described in Materials and Methods. A: Zn2＋ -adequatediet (Control), B: endotoxin/Zn2＋ -adequate diet, C: endotoxin/Zn2＋

-deˆcient diet, D: Zn2＋ -deˆcient diet. Data are results from ˆve experimentsand each value represents the mean S.E. for ˆve rats per group.p＜0.05,compared to endotoxin/Zn2＋ -adequate diet group.

78 Vol. 124 (2004)

た実験モデルが使用されており，このモデルによる

エンドトキシンの感受性はサイトカイン，特に

TNF のメディエート作用によると述べられてい

る．55)その感受性機構に内因性のエンドトキシンの

関与が示唆され，20,21) SIRSの病態での酸化ストレ

ス産生機構の一端が伺われる．本モデルは急性肝障

害モデルとしても使用され，肝障害の発症・進展に

エンドトキシンの関与を考察する場合に有益な情報

を与える．

6. 酸化ストレスに対する必須微量元素のセレン

及び亜鉛の役割

エンドトキシン血症時に血中亜鉛の急速な消失が

しばしば観察されている．58)エンドトキシンの主要

なターゲット臓器は肝であるが，急性，慢性を問わ

ず肝疾患において低亜鉛血症が知られており，肝疾

患と亜鉛との関連は興味深い．この亜鉛は必須微量

元素として免疫や細胞機能調節に関与するととも

に，酸化ストレスによって生じる細胞障害を防御し

メタロチオネインを誘導する．59)また，必須微量元

素のセレン（Se）は GSHPxの構成成分であり，

脂質過酸化抑制を示す．このような観点から本稿で

はエンドトキシン血症時に惹起される酸化ストレス

の要因の 1つとしての必須微量元素の関与を述べて

いく．メタロチオネイン（MT)60)はその構成アミ

ノ酸の約 1/3をシステインが占め，芳香族アミノ酸

やヒスチジンを含まない分子量 7000の水銀，カド

ミウムなどの重金属の毒性軽減に関与する熱安定性

低分子タンパク質である．MT は金属結合能が高

く，生体内で亜鉛や銅などの必須金属と結合し，そ

の代謝調節作用の働きを有する生体防御タンパク質

と考えられている．さらに，最近ではスーパーオキ

シドラジカル（0－2 ）や過酸化脂質（L00・）などの

フリーラジカルを消去するいわゆるラジカル

scavengerとしての機能が注目されている．MT は

様々の物理的，化学的条件による酸化ストレスによ

っても誘導合成される．また，エンドトキシンは肝

臓の MTの誘導剤でもある．エンドトキシンで誘

導される酸化ストレスに MT がどのような役割を

果たすのかを観察するために，筆者らは亜鉛欠乏食

で飼育したラットを使用して酸化ストレスに対する

MTの防御作用を検討した．26)

亜鉛欠乏食飼育ラットは普通食飼育に比べ，顕著

に肝脂質過酸化は誘導される（Fig. 5(A））．このと

き，亜鉛欠乏飼育ラットでは普通食で誘導されるエ

ンドトキシンによる肝内 MT 合成の誘導が顕著に

低下した（Fig. 5(B））．26)最近，遺伝子工学的な手

法を用いた MTを過剰発現したトランスジェニッ

クマウスや，ジーンターゲティング法による MT

遺伝子ノックアウトマウスが作成され，酸化ストレ

スに対する生体防御因子としての MTの重要性が

明らかにされている．61)このことは筆者らの上記の

検討でも，亜鉛欠乏食飼育ではエンドトキシンによ

る顕著な肝 MTの誘導が見られないが，脂質過酸

化は顕著に増大する逆相関関係を示し，エンドトキ

シンで誘導される酸化ストレスに対する MTの防

御効果が示された．26)亜鉛はそれ自体抗酸化作用が

あるとされ，活性酸素消去酵素である SODにおい

hon p.11 [100%]

79

Fig. 6. EŠects of ZnSO4 and TPEN on Enhancement of In-tracellular Ca2＋ in J774A.1 Cells Stimulated with Endotoxin

J774A.1 cells (1×106/ml) were loaded with 1 mM ‰uo 3 for 30 min.Cells were incubated with endotoxin (10 mg/ml) in the presence or absenceof 100 mM ZnSO4 and 1 mM TPEN for 1 h and the mean ‰uorescence intensityof ‰uo 3 of 104 cells was measured with FACScan. Data represent the means S.E. from three independent experiments performed in triplicate. p＜0.05, compared to untreated cells.p＜0.05, compared to cells treated withendotoxin alone.

79No. 2

ても共役的な役割を果たしており，MT を誘導す

る．血中亜鉛は敗血症で低下することが知られてお

り，58)エンドトキシンによる致死作用は亜鉛投与に

よって改善されることが報告されている．エンドト

キシン血症での亜鉛濃度と脂質過酸化との密接な関

係が示唆され，生体内亜鉛濃度がエンドトキシンで

誘導される酸化ストレスに関与すると思われる．ま

た，ZnSO4 (100 mM）の添加はエンドトキシンで誘

導される細胞内 Ca2＋ の増大を明らかに抑制した

が，亜鉛拮抗剤の TPEN（1 mM）は細胞内 Ca2＋ の

増大には関与しなかった（Fig. 6）．26)この事実は，

亜鉛が細胞内 Ca2＋ の増大を抑制することによりフ

リーラジカル産生を含むエンドトキシン血症の代謝

を制御することを示唆する．エンドトキシンによる

亜鉛欠乏状態では，生体の多数の亜鉛含有酵素活性

の低下によりタンパク質，糖，脂質代謝に障害を引

き起こすことが推定され，エンドトキシン血症の病

態の進展過程での亜鉛の病態生理学的意義はかなら

ずしも明確ではないが，生体亜鉛濃度は酸化ストレ

スと密接な関係を有することは間違いない．したが

って，敗血症では亜鉛の低下はエンドトキシンによ

る酸化ストレスの要因を考える上で興味ある示唆を

与えてくれる．

一方，セレン（Se）含有 GSHPx はこれまでに

細胞質型，消化管型，血漿型，リン脂質型の 4種類

が知られており，いずれも活性中心に微量元素であ

る Seを含有するセレノシステインを持つ活性酸素

消去酵素である．この Seの脂質過酸化抑制作用は

GSHPxを介した作用である．62)筆者らはエンドト

キシンによる肝の脂質過酸化生成の一因として Se

の影響を観察した．25) Se欠乏食で 10週間飼育した

ラットの肝 Se 濃度は普通食飼育に比べ 43％低下

し，このときの肝 GSHPx活性は 47％の低下を示

した．この条件下でエンドトキシンを投与すると，

普通食飼育ラットにエンドトキシンを投与した場合

よりも酸化ストレスが増大し（Fig. 7），細胞障害

の指標である LDH活性，及びその isozymeの逸脱

も顕著に見られた．Seは GSHPx活性中心を構成

し，抗酸化的役割を持った必須微量元素であるが，

一方ではその化学形によっては酸素分子と反応し活

性酸素を生成する二面性を持っている．63)筆者ら4)

はエンドトキシンで誘導される肝の脂質過酸化生成

時に肝 GSHPx活性の低下を見ている．エンドト

キシン血症での Seの役割は GSHPxを介した作用

であり，必須微量元素 Seの生体濃度がエンドトキ

シンで惹起される酸化ストレスに影響を及ぼしてい

る．25)

7. エンドトキシンと一酸化窒素

NOはガス状ラジカル物質であり，血管由来弛緩

因子（EDRF）の本体が NOと同定されて以来，そ

の産生，生理的役割に関する研究が加速され，血管

系ばかりでなく，種々な疾病の病態生理において細

胞機能の媒介伝達，調節，免疫に関することが明ら

かにされつつある．64) NO合成酵素（NOS）は 3種

類のアイソフォームから構成されており，神経型

(n) NOS (NOS-1），誘導型(i) NOS (NOS-2），内

皮型(e) NOS (NOS-3）に分類されている．nNOS

と eNOS はそれぞれニューロン及び内皮細胞に構

成的（constitutive）に発現し，Ca2＋ 依存性である

ことから cNOSと呼ばれる．一方，iNOSは炎症性

サイトカインやエンドトキシンによって誘導（in-

ducible）され，Ca2＋ 非依存性である．敗血症性シ

ョックではエンドトキシンの刺激により種々なサイ

トカインが産生され，これらサイトカインにより

iNOS由来の NOの過剰産生が持続すると顕著な末

hon p.12 [100%]

80

Fig. 7. Changes in Xanthine Oxidase Activity (a) Lipid Peroxide (b) and Non-Protein Sulfhydryl (c) Levels in the Liver of RatsGiven the Se-Deˆcient Diet 18 h after Endotoxin Administration

Rats were fed the diets for 10 weeks, and then injected with endotoxin (4 mg kg－1i.p.). A: Se-adequate diet (control), B: endotoxin/Se-adequate diet, C: en-dotoxin/Se-deˆcient diet, D: Se-deˆcient diet. MDA: malondialdehyde. Each value represents the mean S.E. of ˆve rats.: Signiˆcantly diŠerent from the valueof endotoxin/Se-adequate diet group (p＜0.05).

80 Vol. 124 (2004)

梢血管抵抗の低下がもたらされ，敗血症性ショック

が引き起こされると考えられている．65)このことは

次のように解釈されている．ショックの初期には血

管内 cNOS 活性化による NO は血行動態の変化に

関与しているが，後期には持続性の iNOSが誘導さ

れ，難治性の低血圧，内皮細胞障害，心筋収縮抑制

などが惹起され多臓器不全に陥る．NOが敗血症性

ショックにおいてどのような病態生理を有するか，

現在でも議論の分かれるところである．

NO のエンドトキシンに対する研究の多くは

NOS 阻害剤を用いた実験結果を基に，NO の生体

に及ぼす功罪を論議している．64)例えば，NOS 阻

害剤がエンドトキシンや TNFによる血圧の低下を

制御し，見かけ上はショックを改善する．しかし，

血圧の改善と臓器血流や生命予後にはかならずしも

結びつかず病態は悪化する．また，NOS阻害剤が

エンドトキシンに対する致死性を上昇させ，臓器障

害を悪化させることが報告されており，66) NOの防

御側面も強調されている．しかしながら，これらの

実験に使用する NOS阻害剤は iNOSによる過剰に

生成される NO とともに，臓器血流を制御する

cNOS 由来の NO も阻害することから，NOS阻害

剤の障害の悪化作用は循環病態を介した二次的な作

用の現象とも考えられなくはない．これらの NOS

阻害剤として cNOS を保護し iNOS を制御する

iNOSに特異的な阻害剤が求められているが，現在

のところ満足すべきものはない．

筆者らはエンドトキシンに対する酸化ストレスの

NO の影響を cNOSの比較的選択的阻害剤 L- アル

ギニン類似化合物（L-NMMA, L-NAME, L-NA），

及び iNOSの比較的選択的阻害剤アミノグアニジン

（AG）を投与して比較検討した．22,23) L-アルギニン

類似化合物，AGの投与はエンドトキシンによる肝

の脂質過酸化生成に対してはほとんど影響を及ぼさ

ない．22)また，致死率，細胞障害の指標となる

LDH活性とその isozyme,23)及びマウスマクロファ

ジー様培養細胞（J774A.1）の cytotoxicity に対し

ても AGの影響はほとんど認められなかった（Fig.

8)．22)事実，MacMicking ら67)の報告によれば，

iNOSノックアウトマウスではエンドトキシンによ

る血圧低下は見られず，また感染抵抗性や抗腫瘍性

といった防御機能は低下している．しかし，iNOS

ノックアウトマウスでは敗血症による臓器障害の発

生や死亡率は野生型との間に有意差がなかった．こ

れらの報告67)と筆者らの結果22,23)から考察すると，

過剰生成された NO はショックで誘導される末梢

血管抵抗性の低下には重要な役割を担うが，酸化ス

トレスによる臓器障害にはむしろ防御的に作用し，

エンドトキシンによる臓器障害には NO 以外の因

子が関与していることが示唆された．NOは eNOS

由来の細胞保護作用と iNOS由来の細胞障害作用の

二面性を持っている．例えば，NO は 0－2 と反応

し，細胞毒性の強いラジカルである peroxynitrite

(ONOO－）を産生し細胞障害を引き起こす．68)一

方，NOが 0－2 と結合するためにアンチオキシダン

トとして働いている可能性も指摘されており，これ

hon p.13 [100%]

81

Fig. 8. EŠects of Aminoguanidine on Endotoxin-Induced Intracellular Peroxide Production (A) and Cell Growth Inhibition (B) inJ774A.1 Cells

A: After DCFH-DA loading, cells were incubated with or without 10 mg/ml endotoxin for 5 min. Aminoguanidine (AG, 300 mM) was added to the cells 10 minbefore endotoxin treatment. Then, the ‰uorescence of intracellular DCF was determined by ‰ow cytometry. B: Cells were incubated with endotoxin (1 and 10 mg/ml) in the presence or absence of 300 mM aminoguanidine for 48 h. Cell survival was measured by the MTT assay. Each point represents the mean S.E. of 8 deter-minations.

81No. 2

は 0－2 を消去することにより HaberWeiss 反応や

Fenton 反応が進行するのを防止すると考えられ

る．そこで，筆者らは鉄及びヘム代謝の観点からエ

ンドトキシン血症での NO産生を検討した．24)

エンドトキシン血症では hypoferremia を呈す

る．24,69)このとき，血清セルロプラスミンは増大す

る．これは血清中の Fe2＋ はセルロプラスミンによ

って Fe3＋ に酸化されてフェリチンに取り込まれる

ことを意味する．ヘム代謝は鉄と密接な関係にあ

り，ヘム分解の律速酵素であるヘムオキシゲナーゼ

（HO）の誘導型 isozyme である HO1 はエンドト

キシンで誘導され，酸化ストレスの防御作用を有し，

NO によっても誘導される．70)また，cytochrome

P450 (cyt P450）にはヘム鉄が含まれており，NO

はこの活性中心に位置するヘム鉄に結合し錯体を形

成することにより不可逆的に cyt P450 を低下させ

る．筆者らはエンドトキシン血症で HO 活性の誘

導と cyt P450 の低下を確認している．24)ヘム合成

阻害薬 CoCl2 (100 mM）及び鉄の阻害薬 deferoxa-

mine (100 mM）を使用して，J774A.1細胞でエンド

トキシン（1 mg/ml）により誘導される NO産生を

観察した．CoCl2の添加はエンドトキシン誘導によ

る NO の産生を増大させたが，deferoxamine の添

加は NOの産生を抑制しなかった（Fig. 9）．24)この

ことはエンドトキシンで誘導される NO 産生は少

なくとも一部はヘム代謝の調節を受けることを示唆

している．一方，筆者らの結果24)からエンドトキシ

ンで誘導される脂質過酸化には hypoferremia が関

与するが，この脂質過酸化生成時の Fenton反応に

は NO の関与が少なく，エンドトキシンで惹起さ

れる酸化ストレス4―9)に対して，前述したように

NOは影響を及ぼさないこと22,23)が裏付けられた．

上述したように亜鉛はエンドトキシンによる酸化

ストレスを防御する．一方，敗血症性ショックでは

NOラジカルによる顕著な末梢血管抵抗の低下がも

たらされ，ショックが引き起こされる．65)

そこで，エンドトキシン（ 1 mg /ml）処理

J774A.1細胞での亜鉛による NO産生の影響を観察

した．26) ZnSO4（50 mM）の添加は J774A.1 細胞で

のエンドトキシンによる NO 産生の誘導を抑制し

た．この結果から亜鉛が NO の産生を抑制するこ

とにより，エンドトキシンで誘導される末梢血管抵

抗性の低下に起因するショックを防御することが示

唆された．同様な NO産生の抑制は Seの添加によ

っても観察された．25)これは SeGSHPxにより脂

肪酸の hydroperoxideの還元作用などにより内因性

hon p.14 [100%]

82

Fig. 9. EŠects of Cobalt Chloride and Deferoxamine onProduction of Nitric Oxide by Cells Stimulated with En-dotoxin

J774A.1 cells were incubated in 12-well plates and treated with endotox-in (1 mg/ml) and interferon-g (IFN, 100 U/ml) for 48 h in the presence orabsence of cobalt chloride (100 mM) or deferoxamine (100 mM). Nitric oxideproduction by J774A.1 cells was assayed by measuring the accumulation ofnitrite in culture media using Griess reaction. LPS: endotoxin, CoCl2: cobaltchloride. Each bar represent the mean S.E. of three experiments. Sig-niˆcant diŠerence from the value of cells treated with endotoxin/IFN (p＜0.05).

82 Vol. 124 (2004)

NOを酸化ストレスから保護しているものと考えら

れる．このことは Asahiら71)により GSHPx は内

因性の NO によって不活性されることが報告され

ており，エンドトキシン血症時での酸化ストレスの

際の GSHPx 活性低下1)は NO 産生からも説明で

きる．

8. 敗血症性ショックと漢方方剤小柴胡湯

小柴胡湯はサイコ，ハンゲ，オウゴン，タイソ

ウ，ショウキョウ，ニンジン，カンゾウの 7種類の

生薬から構成されており，わが国では従来から胸脇

苦満を伴う各種の急性及び慢性の肝疾患や炎症性疾

患に応用されている漢方方剤である．この小柴胡湯

の薬理作用は免疫調節作用，肝保護作用，抗炎症作

用，抗アレルギー作用など多岐にわたっている．72)

敗血症性ショックの治療は困難な症例が多く，多臓

器不全に陥れば予後は極めて不良である．このショ

ックの治療に副腎皮質ステロイドの持つ生体の“防

御効果増強”の根拠により，臨床では敗血症性ショ

ックにおいても副腎皮質ステロイド初期大量投与が

行われてきたが，ステロイドの副作用の発現の面で

問題を残している．筆者らは小柴胡湯の多彩な薬理

作用，特に“グルココルチコイド増強作用”に着目

して小柴胡湯による敗血症の防御効果を検討してき

た．27―31)

敗血症性ショックは SIRSという概念で包括する

試みがなされている．37)このような病態の背景には

高サイトカイン血症が存在する．D-GalNで感作さ

れたマウスに TNF を投与すれば致死活性が 3000

倍に高まる．73)そこで，筆者らはこのモデルを用い

て小柴胡湯のショック防御効果を観察するために，

最初に rhTNF に対する致死率を観察した．27)小柴

胡湯は GalN負荷マウスでの rhTNF の致死作用を

防御し，また，rhTNF 投与による直腸体温の低下

が抑制され，小柴胡湯の rhTNFに対する致死防御

効果が示された．ショック患者の重篤な合併症の 1

つに DICがあり，合併した場合には病態が複雑に

なり治療はより困難となる．炎症と凝固は互いにリ

ンクしており，敗血症重症化の本態である微小循環

障害発生に，根源的な役割を果たしていると考えら

れている．そこで，筆者ら31)は DICの診断に使用

される ˆbrinogen の変化を観察した．rhTNF の投

与では顕著な ˆbrinogenの低下が見られるが，小柴

胡湯の前投与はその著しい低下を防御することが認

められたこのことは Kuboら74)がエンドトキシンで

誘発されるラットの DIC での血小板，ˆbrinogen

の消費が小柴胡湯の構成成分でもある bicalein, bai-

calinにより防御できることを示唆しており，筆者

らの結果を裏付けるものである．

小柴胡湯を前投与することによりエンドトキシン

による肝の脂質過酸化，活性酸素産生系の XOD活

性の亢進が抑制され，SOD及び GSHPxの低下が

軽減された．一方，フリーラジカル scavengerの肝

内 GSH 及び 0－2 , OH・の scavenger である a- トコ

フェロールはエンドトキシンにより顕著な減少が見

られるが，小柴胡湯はそれらの減少を抑えた．した

がって，小柴胡湯はエンドトキシンによるフリーラ

ジカル産生亢進及びフリーラジカル消去機構低下の

両者を抑制し，エンドトキシンによって惹起される

フリーラジカルの毒性から生体を防御するものと考

えられた．28)このことはオウゴンエキス及びそのフ

ラボノイド成分の baicalein, baicalinが強い抗酸化

作用を示し，in vivoにおいても a-トコフェロール

と同程度の抗酸化作用を示すこと，75)また，小柴胡

湯による脂質過酸化反応の抑制は主に baicalein,

hon p.15 [100%]

83

Fig. 10. Scanograms of SDS-Polyacrylamide Gel Electropherograms of Liver Plasma Membrane Protein(a): cotrol, (b): endotoxin, (c): endotoxin＋TJ-9 (Sho-saiko-to), (d): TJ-9. Endotoxin (6 mg/kg) was administered i.p. into TJ-9 (500 mg/kg/d, p.o.) -

pretreated mice. After treatment, the mice were sacriˆced at 18 h postintoxication. Each sample (10―20 mg of protein) was subjected to SDSgel electrophoresis.Gels were stained for protein with 0.1％ Coomassie blue and decolored. Each plasma membrane preparation was from 10 mice. : endotoxin-induced membraneprotein damage.

83No. 2

ginsenoside Rfが関与していることが示唆されてい

る．76)さらに，筆者らは小柴胡湯の肝細胞膜の障害

に対する効果を SDSポリアクリルアミド電気泳動

で検討した．28)小柴胡湯の前投与はエンドトキシン

で見られる 65 kDa, 140 kDa付近のタンパクの損傷

を修復し，肝細胞膜を保護する作用が示唆された

（Fig. 10）．一方，臓器障害指標の LDH isozymeパ

ターンを比較すると，エンドトキシンによる LDH

3,5 isozyme で見られる逸脱を小柴胡湯は防御し

た．このことは小柴胡湯が膜を安定させ，リソゾー

ム酵素の放出を防止し，組織障害の防御に役立って

いることが示され，膜泳動パターンと一致した．28)

肝はショックによる細胞障害を受け易く，ショック

による多臓器不全への進展の中心的役割を担ってい

るとされ，フリーラジカルがその成因に関与してお

り，小柴胡湯のフリーラジカルに対する抑制は抗シ

ョック作用として重要な機序を与える．

敗血症性ショックでの末梢血管抵抗の低下は主と

して iNOSによる NO産生が深く関わっていること

が示されており，65)筆者らは小柴胡湯の防御効果を

NO産生からアプローチした．30,31) rhTNFのみでは

NO は産生しないが，エンドトキシンと rhTNF の

併用により相乗的に NO が産生される．そこで，

エンドトキシン/rhTNFで刺激した J774A.1細胞を

使用して小柴胡湯に対する NO 産生作用を検討し

た．31)小柴胡湯の構成成分であり柴胡の活性成分の

1つであるサイコサポニン aは，経口投与により腸

内細菌叢で 9種類の化合物に変化する．このことは

直接小柴胡湯を培養細胞に添加しても意味をなさな

い．そこで，筆者らは in vitroでの血清薬理学的手

法を使用して解析した．あらかじめ，小柴胡湯を経

口投与したマウスの血清添加は，エンドトキシン/

rhTNF で刺激した J774A.1 細胞からの NO 産生を

抑制した（Fig. 11）．31)したがって，小柴胡湯は

NOの産生を抑制することにより，エンドトキシン

で誘導される血圧の低下を防御することが示唆され

た．従来より末梢血管抵抗性の低下を示している敗

血症性ショック患者では，組織還流維持の目的で還

流圧を保つため，血圧上昇を目的としてノルエピネ

フリンなどの血管収縮剤の使用が行われてきたが，

小柴胡湯の有効性が NO の抑制の面からも理解で

きる．65)

さらに，筆者らは小柴胡湯の防御効果を細胞内の

Ca2＋ 動態からも観察した．小柴胡湯の前投与29)は

エンドトキシンによる 0－2 産生に起因する肝細胞膜

Ca2＋ ポンプ機能障害を回復させ，細胞外から細胞

hon p.16 [100%]

84

Fig. 11. EŠect of TJ-9-Pretreated Serum on Production of NO in J774A.1 Cells Stimulated with Endotoxin/rhTNFMice were pretreated with TJ-9 (500 mg/kg/d, p.o.). The pooled serum was obtained from 10 mice pretreated, with TJ-9. Control serum was obtained from

TJ-9-non-treated 10 mice. Cells (1×106 cells/well) were incubated with combinations of endotoxin/rhTNF and TJ-9-pretreated serum (10―100 ml). Nitrite ac-cumulation in the culture medium was determined as described in Materials and Methods. Each bar represents the mean S.E. of 3 experiments. None: unstimulat-ed. J774A.1 cells, LPS: endotoxin (1 mg/ml). rhTNF: recombinant human tumor necrosis factor(1×104 units/ml), Control: TJ-9-non-treated serum. TJ-9: Sho-saiko-to (500 mg/kg/d, p.o.)-pretreated serum. a) p＜0.05, compared with LPS alone-treated group. b) p＜0.05, compared with rhTNF/LPS-treated group. c) p＜0.05, compared with group treated with rhTNF/LPS plus control serum.

84 Vol. 124 (2004)

内への流入を防ぎ，［Ca2＋]iの増大を抑制させた

（Fig. 12）．一方，小柴胡湯はエンドトキシンによ

るミトコンドリア Ca2＋ATPase活性の増大を抑制

し，ミトコンドリア損傷の指標である state 3, RCI

の低下を改善した．小柴胡湯はミトコンドリア内

Ca2＋ の蓄積を抑えることによりミトコンドリア機

能障害を軽減させる．29) Ca2＋ は生体の諸機能の発

現にとって不可欠な因子であり，組織で細胞内情報

伝達物質として働き，細胞内 Ca2＋濃度は細胞活性

やホメオスタシスにおいて重要な役割を担ってい

る．したがって，小柴胡湯のエンドトキシンによる

ショックの防御機構に細胞内 Ca2＋ が深く関与して

いることは間違いない．

おわりに

ショックの病態は侵襲に対する生体反応の集大成

であり，その終末像は原因の違いに関わらず，全身

性の過剰な炎症反応とこれに伴う微小循環不全によ

る臓器不全として理解できる．敗血症性ショックの

病態は，主としてエンドトキシン血症に基づくもの

である．ショックの病態の究明や治療の進歩によっ

て，ショック患者ではショックそのものによる死亡

は減少しているが，ショックから離脱後の多臓器不

全が問題になってきている．したがって，ショック

治療では虚血・低還流，低酸素や humoral media-

tors の過剰産生状態から引き起こされる細胞・組

織・臓器障害を防止することが究極の目的になる．

現在，敗血性ショックの治療は感染症あるいは感染

源に対する原因療法と強力な全身管理が必要で，中

心となるのは輸液による体液管理であるが，最近の

SIRSの考えから抗サイトカイン療法や薬物による

mediator のコントロールも行われている．しか

し，サイトカインを始めとする種々のメディエー

ターが関係する生体反応は侵襲に対する生存や生体

防御に必須の反応であるので，これを無制限に制御

することはかならずしもよい結果を招くとは限らな

い．米国では年間約 75万人が敗血症に陥り，21万

人もの患者がそのために死亡している現実があ

る．32)敗血症に対して，これまで数多くの治療法の

開発が試みられたが，満足のいく治療法は見出され

ていない．その点，小柴胡湯はサイトカイン，NO

を含めたフリーラジカル，細胞内 Ca2＋ を制御する

ことにより細胞・組織障害を防止することが考えら

れる．77)漢方方剤は数種類の生薬が組み合わされた

複合体で，個々の薬理作用は単一剤ほど強くない

hon p.17 [100%]

85

Fig. 12. Changes in Cytosolic-Free Ca2＋ Concentration ([Ca2＋]i), in a Single Liver Cell in TJ-9 Pretreated Mouse 18 h after En-dotoxin Administration[Ca2＋]i in a single liver cell was measured by micro‰uorometric analysis using a Hamamatsu Photonics ARGUS-100CA image processor ˆtted with computer

apparatus and a video camera. Control: saline, ETOX: endotoxin (6 mg/kg i.p.), TJ-9: Sho-saiko-to (500 mg/kg/d, p.o.).

85No. 2

が，促進と抑制のような相反する薬理作用を有し，

病態が複雑な症例に適している．このようなことか

ら漢方方剤ではあるが，小柴胡湯は術前投与による

ショック予防効果を発揮する可能性が期待できる．

以上，本総説では酸化ストレスから見た敗血症の病

態論について述べてきたが，エンドトキシンは自然

免疫系を動かす代表的な因子であり，広汎な生体反

応を有する極めて活性の高い物質であることが多く

の医学・生物の研究者を魅了している．今後，内外

のエンドトキシン研究の発展が敗血症性ショックの

治療面での飛躍的な進歩につながることに期待した

い．

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