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Fertilità a 360°? Spunti e nuove riflessioni sulla PMA – Edizione 2016

Responsabile scientifico: Dr Claudio Castello, Responsabile del Centro Fisiopatologia della Riproduzione,

Ospedale Maria Vittoria, Torino

Sanitanova è accreditato dalla Commissione Nazionale ECM (accreditamento n. 12 del 7/2/2013) a fornire

programmi di formazione continua per tutte le professioni.

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ECM.

Data inizio svolgimento: 30/06/2016; ID evento: 12-160288

Modulo 4. L’impianto endometriale: il grande incompreso

Autore: Dr.ssa Roberta Rizzo, Ricercatore presso Dipartimento di Scienze Mediche, Sezione di Microbiologia

e Genetica Medica - Università degli Studi di Ferrara

Revisione scientifica: Dr.ssa Giovanna Orlando, Biologa esperta in embriologia presso G.EN.E.R.A - Reparto

di Procreazione Medicalmente Assistita della Clinica Valle Giulia, Roma

Obiettivi formativi:

Al termine del modulo didattico, il discente dovrebbe essere in grado di:

conoscere gli aspetti biochimici, immunologici e biologici, morfologici dell’impianto;

conoscere il ruolo delle cellule endometriali stromali ed epiteliali nell’impianto embrionale;

comprendere il ruolo del fibroma e delle infezioni microbiche nella ricettività endometriale.

Il processo di impianto embrionale

Nel corso degli anni i protocolli di procreazione medicalmente assistita (PMA) hanno avuto un

miglioramento significativo; ciononostante a oggi la percentuale di impianto si attesta intorno al 40-50%.

Punto debole del processo sembra essere il meccanismo di impianto in sè, una fase essenziale della

riproduzione tuttavia attualmente poco conosciuta.

L'impianto è quel processo in cui l’embrione entra in contatto con la parete uterina (endometrio) (vedi

Figura 1). Affinché ciò avvenga, l’endometrio deve subire diversi cambiamenti in una breve finestra

temporale. Poco prima dell'ovulazione, l'endometrio comincia ad addensarsi e a espandersi in risposta al

rilascio di estrogeni dalle ovaie. A seguito del concepimento, quando l'embrione si muove attraverso le

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tube di Falloppio, inizia a proliferare e cambia forma. A questo punto il rilascio di progesterone dalle ovaie

innesca la decidualizzazione, un complesso di modifiche (vedi Figura 2) quali:

1) il richiamo di linfociti intorno alle arteriole dell'endometrio;

2) l’accumulo di glicogeno, quale molecola che immagazzina energia, a livello dei tessuti connettivi

dell'utero;

3) l’accumulo di liquido interstiziale.

I cambiamenti morfologici e biochimici generati offrono un ambiente ospitale per l'embriogenesi.

Il successo dell’impianto dipende tuttavia dal contatto dell’endometrio con la blastocisti. Quando la

blastocisti aderisce alla parete uterina, il trofoblasto secerne enzimi che digeriscono la matrice

extracellulare del tessuto endometriale. Le cellule del trofoblasto iniziano quindi a insinuarsi tra le cellule

endometriali, facendo aderire la blastocisti alla superficie uterina. Ulteriori secrezioni enzimatiche

permettono alla blastocisti di collocarsi tra le cellule stromali uterine; nel contempo le cellule del

trofoblasto continuano a dividersi formando la parte fetale della placenta denominata corion. Quest’ultimo

si compone di due membrane, le quali secernono enzimi e fattori di segnalazione in grado di rimodellare il

sistema vascolare uterino consentendo al sangue materno di irrorare, attraverso i villi coriali, i vasi

sanguigni fetali. Il sangue fetale e materno non si mescolano, ma il rapporto tra i due sistemi circolatori

consente il trasferire nutrienti e ossigeno dalla madre al feto e anidride carbonica e urea dal feto alla

madre.

Nel suo percorso attraverso l'utero, la blastocisti si muove in modo da allinearsi specificamente: la massa

cellulare interna (Inner Cell Mass, ICM) si colloca in adiacenza della parete uterina e il trofoblasto a contatto

con l’endometrio. La posizione dell’ICM rispetto all’endometrio stabilisce la direzione dorso-ventrale

dell’asse embrionale, con il lato dorsale dell'embrione rivolto verso la parete uterina. Questo è il primo

evento embrionale che determina l'organizzazione del futuro organismo. Se l’impianto avviene con

successo, l'endometrio insieme con il tessuto uterino formano la porzione materna della placenta,

chiamata decidua.

Di contro, se l'impianto fallisce, la blastocisti unitamente all’endometrio viene eliminata durante le

mestruazioni.

Figura 1. Sviluppo e impianto embrionale nell'uomo. (da http://what-when-how.com/nursing/normal-

pregnancy-maternal-and-newborn-nursing-part-2/)

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Figura 2. Placenta (da http://what-when-how.com/nursing/normal-pregnancy-maternal-and-newborn-

nursing-part-2/)

La ricettività endometriale

La ricettività endometriale può essere definita come la capacità della mucosa uterina di consentire

l'impianto embrionale. L'impianto consta di tre fasi distinte e consecutive: contatto, attecchimento e

invasione. I processi di contatto e invasione della superficie epiteliale uterina sono alla base del

conseguimento di una gravidanza ed è necessario un perfetto sincronismo tra la fase di sviluppo

embrionale e i cambiamenti nell'ambiente endometriale per il corretto svolgimento del processo.

L'endometrio umano è ricettivo per l'impianto della blastocisti solo per un tempo molto breve durante la

fase luteale, intervallo che inizia circa sette giorni dopo l'ovulazione e non dura più di due giorni. È la

cosiddetta "finestra di impianto", che può essere definita come il periodo di massima ricettività uterina: si

ritiene cada nei giorni 20-24 del ciclo e si manifesta con l'espressione di peptidi e proteine considerati come

biomarcatori di ricettività uterina2.

Al fine di ottenere un impianto embrionale, sono necessari due fattori importanti: embrioni di qualità e

ricettività endometriale, fattori responsabili dell'interazione embrione-madre necessaria per

l’attecchimento e l'invasione da parte della blastocisti dell’endometrio. La ridotta ricettività uterina è una

delle principali ragioni del fallimento delle tecniche di PMA3,4, dove il fallimento dell’impianto e

dell’invasione del trofoblasto nella decidua materna sono attualmente considerati come i principali fattori

limitanti per l’esito positivo della gravidanza.

La ricettività dell’endometrio durante la finestra di impianto è correlata a:

1) spessore dell’endometrio;

2) struttura dell’endometrio;

3) irrorazione sanguigna dell’endometrio.

Un endometrio sottile può causare:

1) non responsività agli estrogeni;

2) ridotto flusso sanguigno;

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3) aumento dell’esposizione al testosterone;

4) danno permanente alla membrana basale dell’endometrio.

La valutazione dello spessore endometriale è un indicatore sensibile per identificare donne con un elevato

rischio di mancato impianto, come avviene ad esempio con un endometrio sottile (< 6 mm)5,6. Un

endometrio con uno spessore nella norma non è però sempre garanzia di un impianto embrionale. A oggi

gli interventi clinici adottati al fine di incrementare lo spessore endometriale comprendono:

1) farmaci (es. estrogeni, vitamina E, Granulocyte-colony stimulating factor);

2) scratch endometriale, al fine di indurre uno stato infiammatorio locale, che favorisce l’impianto;

3) ricostituzione tramite l’utilizzo di cellule staminali autologhe7.

Il processo di impianto embrionale è estremamente complesso e interessa numerosi fattori cellulari e

molecolari (vedi Figura 3).

Figura 3. Molecole implicate nel processo di impianto embrionale. AA, acido arachidonico; BMP2, proteina

morfogenetica 2; cPLA2α, fosfolipasi citosolico A2α; COUP-TFII, fattore trascrizione -2; COX2,

cicloossigenasi-2; E, estrogeni; EC, cellule epiteliali (epiteli luminali e ghiandolari); ENaC, canale del sodio

epiteliale; ER, recettore degli estrogeni; ErbB1 / 4, recettore del fattore di crescita epidermico 1/4; ERK,

chinasi extracellulare; FGF, fattore di crescita dei fibroblasti; GE, epitelio ghiandolare; gp130, glicoproteina

130; Hand2, Heart And Neural Crest Derivatives Expressed protein 2; HB-EGF, fattore di crescita-EGF like

legante l’eparina; Hoxa10/11, homeobox A10/11; ICM, massa cellulare interna; IHH, Indian homolog; KLF5,

Kruppel-like fattore 5; LIF, fattore inibitorio della leucemia; LIFR, recettore LIF; LPA3, recettori dell'acido

lisofosfatidico 3; MSX1, MSH homeobox 1; P4, progesterone; PG, prostaglandina; PPAR-δ; peroxisome

proliferator-activated receptors δ; PR, recettore del progesterone; Ptc, patched; RXR, recettore X dei

retinoidi; SC, cellule stromali; SGK1, chinasi 1 inducibile da siero e glucocorticoidi; Smo, Smoothened;

STAT3, trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3; Tr, trofectoderma; Wnt4/5a, Wingless-Type

MMTV integration site family members 4/5a..

Colori compartimenti: blu, stroma; rosa, epitelio luminale; arancio, epitelio ghiandolare; viola, epitelio al

sito di attecchimento. (da Jeeyeon Cha et al. Nature Medicine; 2012).

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Le modificazione dell'endometrio in seguito al processo di impianto portano alla decidualizzazione

dell'endometrio. La decidualizzazione coinvolge diversi processi, tra cui la poliploidia delle cellule stromali,

e diversi tipi di molecole, come i recettori delle citochine, enzimi, ormoni e fattori di trascrizione (vedi

Figura 4).

Figura 4. Processo di decidualizzazione. ADM, adrenomedullina; BV, vasi sanguigni; DEDD, Death effector

domain containing protein; IL-11Rα, recettore interleuchina 11α; mTORC1, mammalian target of rapamycin

complex 1; SGK1, chinasi 1 inducibile da siero e glucocorticoidi; SphK1 / 2, sfingosina chinasi 1/2. (da

Jeeyeon Cha et al. Nature Medicine; 2012).

Valutazione della ricettività endometriale

Gli approcci tecnologici a oggi utilizzati per valutare la ricettività endometriale includono la microscopia

ottica ed elettronica, l’analisi delle cellule e delle colture di tessuti, l’immunoistochimica e le analisi

biochimiche8. L'identificazione di marcatori biologici di ricettività endometriale ha sicuramente un

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significato clinico di rilievo, in quanto consentirebbe di migliorare i tassi di impianto in cicli naturali e di

PMA. Un marcatore biologico ideale di ricettività endometriale deve possedere alcune caratteristiche: deve

essere presente nell’endometrio in prossimità del sito di impianto e deve apparire durante la finestra di

impianto e scomparire dopo questo periodo9. Di seguito sono riportati i più importanti biomarcatori di

ricettività endometriale a oggi identificati.

Pinopodi Strutture cellulari presenti sulla superficie uterina dell'epitelio apicale. Tali microprotrusioni transitorie

interdigitano con i microvilli sulla superficie del sinciziotrofoblasto apicale della blastocisti durante

l'attecchimento iniziale. Vengono classificati in base al loro sviluppo e alla superficie dell’endometrio da essi

occupata (vedi Tabella 1).

Tabella 1. Classificazione dei pinopodi

Sviluppo In fase di maturazione

Sviluppati completamente

In regressione

Dimensione Abbondate

Moderato

Piccolo

Sistema immunitario materno Diversi meccanismi materni ed embrionali agiscono per prevenire il rigetto immunitario dell'embrione/feto.

Questi meccanismi sono particolarmente rilevanti nelle tecniche di riproduzione assistita, al fine di

comprendere i processi che impediscono un corretto impianto embrionale.

Le cellule del sistema immunitario materno svolgono un ruolo importante nel processo di impianto e

decidualizzazione10 (vedi Tabella 2).

Tabella 2. Ruolo delle cellule immunitarie della decidua nel processo di impianto e decidualizzazione

Macrofagi (Mϕ) Cellule T Cellule Natural Killer

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Ruolo di regolazione a livello interfaccia materno-fetale.

Rimodellamento del tessuto a opera dei macrofagi M2

Inibizione infiammazione

Mantenimento tolleranza verso feto semi-allogenico

Ruolo regolatorio

Specifica tolleranza immunitaria verso alloantigeni fetali

Funzione di espressione citochine

Rimodellamento tessuto

Macrofagi

I macrofagi sono le cellule del sistema immunitario innato che eliminano gli agenti microbici

dall’endometrio. Il numero di macrofagi endometriali aumenta nella fase secretoria rispetto alla fase

proliferativa. I macrofagi deciduali costituiscono circa il 20-25% del totale dei leucociti deciduali e sono il

principale tipo cellulare presentante l'antigene (APC) nella decidua umana. In particolare, i macrofagi M2,

polarizzati dalle citochine Th2 dimostrano un’aumentata secrezione del IL-1R antagonista e sono essenziali

per il rimodellamento tissutale e la tolleranza immunitaria durante la gravidanza (vedi Figura 5). I fattori

proangiogenici secreti da macrofagi consentono il rimodellamento vascolare per garantire un'adeguata

circolazione utero-placentare.

Figura 5. Macrofagici caratteristici della decidua. Mo, monociti; TLR, recettori toll-like; iNOS, NO sintasi

inducibile; NO, ossido nitrico; IDO, indoleamina diossigenasi ; COX2, cicloossigenasi 2; PGE2, prostaglandina

E2; IL, interleuchina; TNF, fattore di necrosi tumorale

(Modificata da Nagamatsu T, et al Am J Reprod Immunol 2010; 63:. 460-71).

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Linfociti T

Durante la gravidanza, vengono secrete citochine di tipo 1 (reazione immunitaria pro-infiammatoria

mediata da TNF-α, IFN-γ, ecc.) e di tipo 2 (risposta anti-infiammatoria caratterizzata da IL-4, IL-10, ecc.). Il

processo di impianto dell'embrione e la successiva invasione dell’endometrio è caratterizzato da un

reazione pro-infiammatoria Th111. La seconda fase della crescita fetale è caratterizzata da un ambiente anti-

infiammatorio Th2. La fase finale della gravidanza, il parto, è caratterizzata da infiammazione e da un

afflusso di cellule immunitarie. Anche se il numero di cellule T presenti nella decidua diminuisce durante la

gravidanza rispetto all’endometrio non gravido, queste cellule T possono influenzare l’impianto del feto

tramite la produzione di citochine.

Cellule T regolatorie

Ci sono diversi tipi di linfociti T regolatori: le cellule Tr1 (IL-10 secernenti), le cellule Th3 (TGF-β secernenti),

cellule TofB (cellule T regolatorie stimolate dalle cellule B), e le cellule Foxp3 + Treg. Ci sono due linee

distinte di cellule Foxp3 + Treg. Un lineaggio specifico, le cellule nTreg, proviene dal timo. Le altre cellule

iTreg sono indotte in periferia mediante l’attivazione delle cellule T naive in presenza di TGF-β. Le cellule

Foxp3 + Treg possono essere attivati da APC e svolgono un ruolo nella regolazione immunitaria contro altre

cellule del sistema immunitario come le cellule Th1 e Th2, le cellule B e le cellule NK. Anche se non vi è

alcun dato che mostri una variazione nel numero di cellule Treg nella fase luteale del ciclo mestruale, è

noto un incremento delle cellule Treg nel sangue periferico durante la gravidanza12. Lo studio di donne con

aborti ricorrenti (RPL) ha mostrato una diminuzione delle cellule Treg nel sangue periferico e nella decidua

rispetto a donne che avevano subito un aborto elettivo13. Questi risultati indicano come le cellule Treg

possano essere profondamente coinvolte nella tolleranza immunitaria materna nei confronti del feto,

tuttavia non è ancora chiaro come le cellule Treg proteggano il feto. Una ipotesi prevede che le cellule Treg

si espandano a seguito del riconoscimento di antigeni paterni e si localizzino all'interfaccia feto-materna,

dove aiutano l'impianto dell'embrione, la placentazione e la crescita del feto attraverso la secrezione di

TGF-β, IL-10, LIF, HO-1 ecc. (vedi Figura 6).

Figura 6. I possibili meccanismi di origine, l'espansione, la migrazione, e la funzione delle cellule Treg

durante la gravidanza. APC, cellule presentanti l'antigene; TGF-β, fattore di crescita trasformante-β; IL,

interleuchina; LIF, fattore inibitore leuke¬mia; HO-1, eme-ossigenasi-1

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(modificato da Leber A, et al Am J Reprod Immunol 2010; 63:. 445-59).

Cellule NK

Le cellule NK sono componenti chiave del sistema immunitario innato in grado di eliminare le cellule

infettate da virus e le cellule tumorali attraverso la secrezione di prodotti citotossici, come granzima e

perforina. Le cellule NK endometriali mostrano diverse caratteristiche fenotipiche rispetto alle cellule NK

nel sangue periferico. Le cellule NK del sangue periferico rappresentano il 10-15% di tutti i linfociti e la

maggior parte di essi esprimono CD56+/CD16+, un sottoinsieme citotossico. D'altra parte, la maggior parte

delle cellule NK endometriali sono CD56+/CD16-, una popolazione di cellule meno tossiche. Durante un

ciclo mestruale, le cellule NK endometriali aumentano di numero nella fase secretoria rispetto alla fase

proliferativa14. Tuttavia, la proporzione di cellule NK endometriali rimane costante durante il ciclo. Nella

fase secretoria tardiva e all'inizio della gravidanza, la percentuale di cellule endometriali/deciduali NK

aumenta rapidamente fino a diventare il 70% dei leucociti uterini15. Il numero di cellule NK endometriale e

deciduali inizia ad aumentare nella fase mid-secretoria e in gravidanza, raggiungendo un picco alla fine del

primo trimestre e diminuendo a termine gravidanza. Tali risultati suggeriscono un ruolo chiave delle cellule

NK uterine nella creazione e nel mantenimento della gravidanza. La maggior parte delle cellule NK

endometriali di donne non gravide non esprimono CD16 (un marcatore di citotossicità), NKp30, NKp44

(marker di attivazione delle cellule) o L-selectina (una molecola di adesione). Tuttavia, esse sono

caratterizzati dall'espressione di altri marcatori di attivazione, come HLA-DR, CD69, NKp46 e NKG2D. Le

cellule NK in questa fase sono funzionalmente meno citotossiche e producono poche citochine. Se

l'impianto ha luogo, le cellule endometriali secernono IL-15, che fa sì che le cellule NK endometriali di

differenzino in cellule NK deciduali. Le cellule NK della decidua iniziano ad aumentare la produzione di

citochine, fattori di crescita e fattori angiogenetici16, richiamando il flusso sanguigno a livello dell’interfaccia

feto-materna per il rimodellamento delle arterie a spirale e per aiutare la migrazione del trofoblasto. Alcuni

fattori angiogenetici (VEGF, PlGF, angiopoietina-2 e NKG5) sono prodotti dalle cellule NK deciduali,

unitamente a citochine e fattori di crescita, come TNF-α, IL-10, GM-CSF, IL-1β, TGF-β1, CSF- 1, LIF e IFN-γ.

Attraverso questo meccanismo, le cellule NK deciduali sembrano contribuire all'impianto dell'embrione e

alla decidualizzazione dell’endometrio. Diverse teorie sono state proposte relativamente all'origine delle

cellule NK uterine. Si ritiene che probabilmente le cellule NK endometriali derivino dalle cellule NK del

sangue periferico e siano reclutate nell'utero (vedi Figura 7).

Figura 7. Le cellule NK (eNK) endometrialI e deciduali (dNK)

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(modificato da Manaster I, et al Placenta 2008; 29 Suppl. A: S60-6 [41]). NK, natural killer; NCR, recettori di

citotossicità naturali; IFN, interferone; IL, interleuchina. (modificato da Leber A, et al Am J Reprod Immunol

2010; 63:. 445-59).

La percentuale di sottotipi NK endometriali varia significativamente tra donne fertili e infertili17, con un

decremento delle cellule NK CD16-/CD56bright nelle condizioni di infertilità idiopatica, suggerendo come la

mancanza di un repertorio cellulare vada a modificare l'assetto recettivo endometriale.

Molecole solubili Esistono molte molecole che sembrano guidare l'interazione tra madre e feto.

Citochine e fattori di crescita

Citochine e fattori di crescita possono agire come potenti segnali intercellulari di regolazione endometriale.

Essi regolano la proliferazione cellulare, il differenziamento e l’apoptosi18,19. Le citochine prodotte dalla

mucosa uterina e dall'embrione possono giocare un ruolo nell’interazione materno-embrionale,

migliorando la ricettività endometriale e controllando l'espressione di proteine d’adesione. Tra le principali

citochine e fattori di crescita che possono avere ruolo nell’impianto umano facilitando la ricettività

endometriale ci sono: LIF, interleuchina-1, HB-EGF, CSF-1, IGFBP-1, KGF.

Molecole HLA (Antigene leucocitario umano) di classe I non classiche: HLA-G

L’antigene HLA-G è una molecola non-classica HLA di classe I caratterizzata da:

1) un basso polimorfismo allelico;

2) una ristretta distribuzione tessutale;

3) uno splicing alternativo dell’mRNA che genera sette isoforme proteiche;

4) una possibile funzione biologica nell’induzione della tolleranza verso il “non self” e anti-

infiammatori20.

Questa funzione è possibile in quanto HLA-G è ligando per recettori inibitori (ILT2, ILT4, KIR2DL4) espressi

dalle cellule del sistema immunitario (vedi Figura 8).

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Figura 8. Funzioni della molecola HLA-G. Il gene HLA-G si trova sul cromosoma 6 (6p21.3) e mostra un basso

polimorfismo allelico rispetto agli altri HLA di classe I. Le regioni più polimorfiche del gene sono nella

regione di regolazione 5’ (5’UTR) e la regione 3’ non tradotta (3’UTR) che possono contribuire alla

regolazione dell’espressione di HLA-G21. Un polimorfismo di inserzione/delezione di 14 bp (rs16375) in

3’UTR dell’esone 8 è stato correlato alla stabilità dell’mRNA e dalla quantità della proteina HLA-G21,22.

L’allele con un’inserzione di 14bp è stato associato a livelli d’espressione di HLA-G più bassi rispetto

all’allele con la delezione di 14bp22. Diversamente dagli antigeni HLA di I classe, le sette isoforme HLA-G

sono generate da splicing diversi del loro trascritto primario. Quattro di queste, HLA-G1 -G2, -G3 e -G4,

sono forme legate alla membrana, mentre tre, HLA-G5,-G6 e -G7 sono molecole solubili. Le isoforme

solubili contengono l’introne 4 che include un codone di stop e anticipa l’arresto della traduzione

dell’mRNA prima del dominio transmembrana. Le isoforme maggiormente analizzate sono l’HLA-G1 di

membrana e in forma solubile, ottenuta con taglio proteolitico e la forma solubile HLA-G5.

Nelle tecniche odierne di riproduzione in vitro, l’impianto dell’embrione rimane un evento complesso e

poco conosciuto. La maggioranza degli embrioni trasferiti non impianta e solo una minoranza darà luogo a

una gravidanza a termine. Attualmente la selezione embrionaria si basa su criteri morfologici e di divisione

cellulare. Articoli scientifici recenti hanno riportato l’importanza di alcune molecole nella regolazione dello

sviluppo dell’embrione prima dell’impianto e sull’impianto stesso. Un possibile marker sembra essere la

proteina sHLA-G (HLA-G solubile). sHLA-G è stata trovata nel supernatante di colture di embrioni umani

ottenuti tramite IVF23; in particolare la presenza di questa proteina secreta dall’embrione è un prerequisito

obbligatorio, benché da solo non sufficiente, per l’instaurarsi e il procedere della gravidanza. Inoltre, una

scarsa espressione di sHLA-G da parte della madre, sia nel plasma sia nei tessuti placentari, è stata

associata con pre-eclampsia, aborti spontanei ricorrenti e fallimenti delle terapie IVF24. Nelle donne con

infertilità idiopatica nei lavaggi uterini sono stati rilevati livelli di sHLA-G più bassi rispetto alle donne fertili,

suggerendone un importante ruolo nella creazione del microambiente endometriale17. La concentrazione

della proteina sHLA-G rilasciata dall’embrione e prodotta dalla donna dipende in gran parte dal genotipo

del gene HLA-G, in particolar modo da alcune varianti che alterano l’espressione del gene e/o che causano

una degradazione maggiore del trascritto. Le differenze nella concentrazione di HLA-G sono quindi in buona

parte determinabili dall’analisi del gene HLA-G. Nel quadro della diagnostica di infertilità di coppia, il

genotipo paterno e materno vengono stimati per avere un’informazione a priori della capacità di

produzione della molecola HLA-G sia da parte della madre sia da parte del feto.

Molecole d’adesione cellulare

Durante la finestra dell'impianto, l’endometrio umano e l'embrione esprimono molecole di adesione che

contribuiscono all’attecchimento della blastocisti alla mucosa uterina. Le integrine sono glicoproteine

transmembrana appartenenti alla famiglia di molecole di adesione cellulare25, sono espresse sulle cellule

epiteliali dell'endometrio26,27 e sono assenti in condizioni di infertilità, come l’endometriosi o l’infertilità

idiopatica. Si ipotizza che supportino l’impianto embrionale26-29. Le integrine in particolare sono espresse

sull'endometrio durante la finestra di impianto30.

L'interazione con il glicocalice si verifica tramite glicoproteine, quali le mucine, di cui una delle principali

componenti è la mucina 1 (MUC1), una proteina transmembrana che sembra avere un doppio ruolo: in

primo luogo funge da barriera sia alle infezioni microbiche sia all’attacco enzimatico, in secondo luogo la

sua espressione è alterata dagli ormoni; una diminuita espressione di MUC1 è associata a ricettività

endometriale. Questo suggerisce che alti livelli di mucina inibiscono l'impianto. È interessante notare che la

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stessa proteina è altamente espressa successivamente nell’amnios placentare, dove vengono nuovamente

richiesti il suo ruolo anti-batterico e anti-adesivo.

Inoltre, sono espresse altre molecole, quali l'osteopontina (OPN), caderina, troponina e CD44; è inoltre

presente l'attivazione di proteasi (MMPs e Adams) e di componenti della membrana epiteliale laterali, tra

cui i desmosomi.

3.4. ERA test

Nell’ottica costante dell’ottimizzazione dei risultati dell’IVF, anche per quanto riguarda la recettività

endometriale, attualmente gli sforzi dei ricercatori sono orientati all’isolamento di molecole “target” che

consentano di individuare in maniera poco invasiva la finestra d’impianto. Le sostanze coinvolte sono

migliaia e come conseguenza è estremamente difficile identificare quelle maggiormente correlate

all’impianto; a oggi nessuna può ancora avere un’ applicazione clinica. Recentemente è stato messo a

punto un test di recettività endometriale denominato ERA test31,32 . È una metodica sviluppata dopo

decenni di ricerca, che prevede una biopsia di tessuto endometriale 7 giorni dopo il picco di LH o o 5 giorni

dopo l’assunzione di progesterone. Il prelievo viene effettuato con una sottile cannula in utero che aspira

una piccolissima quantità di tessuto. Sul materiale prelevato si analizza l’espressione di 238 geni coinvolti

nella recettività dell’endometrio. Se l’endometrio è recettivo significa che la finestra d’impianto

corrisponde al periodo in cui è stata effettuata la biopsia. Se non è recettivo è possibile che la finestra

d’impianto sia spostata in avanti, quindi il prelievo va ripetuto in un ciclo successivo circa due giorni più

tardi rispetto al precedente. Può essere quindi utilizzato per individuare la finestra d’impianto qualche

mese prima del trasferimento di embrioni sia su ciclo spontaneo sia dopo preparazione artificiale

dell’endometrio con estrogeni e progestinici. Il test non è attendibile per la valutazione della finestra

d’impianto in cicli stimolati o durante l’assunzione di contracettivi, per l’interferenza dovuta all’assunzione

di ormoni33. La recettività dell’endometrio è, infatti, strettamente dipendente dai livelli circolanti di

estrogeni e progesterone che possono variare tra una stimolazione e l’altra in base al tipo di farmaco usato,

al protocollo, al dosaggio, alla riserva ovarica del ciclo in corso. Grazie a questo test si sta cercando di

inserire in PMA il concetto di PET (Personalized Embryo Transfer), in quanto la conoscenza della finestra di

impianto permetterebbe di trasferire l’embrione quando l’endometrio è pronto a riceverlo. La

personalizzazione dei trattamenti e delle strategie è un concetto sicuramente vincente in medicina della

riproduzione perché permette di recuperare quella quota di insuccessi dipendente da fattori individuali.

Infatti solo tenendo conto delle caratteristiche di ciascuna paziente è possibile mettere a punto strategie

adeguate per bypassare le difficoltà che dovessero emergere e aumentare così le probabilità di successo.

La validità e l’accuratezza del test sono stati dimostrati da studi multicentrici. ERA ha una sensibilità e

specificità rispettivamente di 0,99 e 0,89 e un’alta riproducibilità31. Garrido-Gómez e coll.31 hanno

dimostrato come il profilo di trascrittomica non cambia in modo significativo tra i cicli e su periodi

relativamente lunghi (3 anni). Essi hanno inoltre stabilito una concordanza tra ERA e il picco di LH pari al

0,922 (0,815-1,000) e una riproducibilità del 100%. Il test ERA ha messo in luce come la finestra di impianto

non sia fissa, come si credeva in precedenza, e la sincronia embrio-endometriale sia fondamentale per il

successo dell'impianto. È stato stabilito come molti fallimenti della PMA possono essere attribuiti ad

asincronia embrio-endometriale, considerando che la stimolazione ovarica per il reclutamento follicolare

avanza lo sviluppo dell'endometrio, portando a un successivo trasferimento degli embrioni a finestra di

impianto già conclusa. Ruiz-Alonso e coll.32 hanno dimostrato come la finestra di impianto cambi nel 25,9%

dei pazienti RIF, mentre nei controlli i non recettivi erano solo il 12% dei pazienti. Questo suggerisce come

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esista un fattore endometriale in un quarto dei pazienti con RIF e che questo potrebbe contribuire alla loro

IF.

3. 5. Effetto dei cicli PMA sulla maturazione endometriale

Nel tentativo di correlare lo sviluppo endometriale con i sistemi di stimolazione PMA34,35, si è potuto

osservare come nei cicli di fecondazione in vitro sia con agonisti sia con antagonisti GnRH, vi sia un

avanzamento dello stato di crescita endometriale al giorno del pick up di più di 2 giorni rispetto a un

endometrio da ciclo naturale nel giorno dell’ovulazione.

Questo progresso è maggiormente pronunciato nei cicli con un precoce aumento di progesterone nel siero

o prima del giorno di iniezione di hCG34.

Solo una minoranza di endometri (7/39 in cicli con GnRH-agonisti e 6/55 in cicli con GnRH-antagonisti) ha

presentato un avanzamento endometriale di > 3 giorni rispetto a un ciclo naturale34,35. In queste biopsie

erano presenti vacuoli ghiandolari anche al polo delle cellule luminali ed era presente un edema stromale

variabile. In un ciclo naturale, queste caratteristiche non sono attese prima del giorno 4 ± 5 della fase

luteale.

I dati a oggi a disposizione sembrano comunque suggerire come l’avanzamento di crescita endometriale

abbia un basso effetto sull’esito della PMA rispetto alle caratteristiche iniziale dell’endometrio, che

difficilmente possono essere sopperite da un embrione, anche se di buona qualità.

Anormalità dell’utero: il fibroma

I fibromi uterini sono il disturbo ginecologico più comune nelle donne in età riproduttiva; la loro prevalenza

varia dal 20 al 50%. Essi sono associati a subfertilità in circa il 5-10% dei casi36; vari fattori quali la

dimensione, la posizione e il numero possono alterare il loro effetto sullo stato di fertilità di una donna37.

Tuttavia, nessuna conclusione definitiva è stata raggiunta per quanto riguarda l'effetto dei fibromi uterini

sui risultati della fecondazione in vitro e la questione resta controversa. Molti studi hanno dimostrato che

fibromi della sottomucosa e intramurali sono associati a una riduzione dei tassi di impianto e di gravidanza,

in particolare nel caso di fibromi uterini di grandi dimensioni (ad esempio > 4 cm)38, mentre altri studi

hanno fallito nel dimostrare tale associazione39. I dati ad oggi a disposizione sembrano suggerire che se

nessuna distorsione della cavità uterina è presente né gli esiti della fecondazione in vitro, né il flusso di

sangue uterino ed endometriale sono influenzati dalla presenza di fibromi. Di contro, i fibromi uterini che

deformano la cavità uterina non solo mettono in pericolo il flusso di sangue endometriale ma anche i tassi

di impianto e di gravidanza clinica in pazienti sottoposti a fecondazione in vitro.

Diverse teorie sono state proposte come possibili, al fine di spiegare come i fibromi possono ridurre la

fertilità:

a) alterazione dell'anatomia locale, con distorsione della cavità endometriale o ostruzione delle tube

di Falloppio;

b) cambiamenti funzionali, ad esempio aumento della contrattilità uterina, insufficienza sanguigna

endometriale e infiammazione cronica dell'endometrio;

c) modificazioni dell'ambiente ormonale locale;

d) effetti molecolari paracrini sull'endometrio adiacente, ad esempio secrezione di amine vasoattive e

sostanze infiammatorie locali nella misura in cui sono in grado di compromettere la fertilità.

È anche possibile che più di uno di questi meccanismi possono essere presenti contemporaneamente.

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Ripetuto Fallimento di Impianto (RIF)

Il tasso di successo della PMA dipende da molti fattori; i più importanti e discussi in letteratura sono l'età

materna, la cause di sterilità, la risposta ovarica alla stimolazione, l'influenza del partner e della qualità

dello sperma, la qualità degli embrioni e le varie patologie uterine. Alcune coppie non riescono ad avere

una gravidanza dopo il trasferimento di embrioni di buona qualità senza alcuna evidente ragione e questo

diventa un grave problema per le procedure di IVF/ICSI40. Si ipotizza che, in queste coppie, la scarsa

ricettività dell'endometrio possa essere una ragione per il fallimento dell'impianto. Si ritiene che sia

necessario allineare i criteri per la definizione di RIF e classificare i diversi tipi di RIF, al fine di sviluppare

linee guida per le procedure di trattamento, che si tradurrebbero in un aumento di pazienti con

un'aumentata opportunità di concepire.

Infezioni

L'endometrio umano, in comune con altri superfici mucose, produce una vasta gamma di antimicrobici

naturali (vedi Tabella 3). Questi sono espressi dalle cellule epiteliali e dai leucociti endometriali che hanno il

potenziale di proteggere le mucose durante tutto il ciclo mestruale e la gravidanza. Le azioni di queste

molecole possono limitare la diffusione delle infezioni sessualmente trasmissibili e prevenire le infezioni

uterine che provocano la nascita pretermine. L'importanza dell'espressione di questi antimicrobici naturali

è fondamentale per la salute riproduttiva delle superfici mucose dell'endometrio, in quanto le conseguenze

delle infezioni del tratto genitale femminile includono infertilità, gravidanza ectopica e nascita

pretermine41,42.

Tabella 3. Espressione anti-microbici naturali nel tratto riproduttivi femminile.

Sito espressione Anti-microbico

Vagina HD5 HBDI

Elafina hCAP-18

HDS SLPI

Cervice HD5 HBDI

Elafina SLPI

hCAP-18 Tube Falloppio HD5

HBDI SLPI

Decidua primo trimestre SLPI Amnios SLPI

Decidua a termine SLPI Lattoferrina

Chorion HD5 Placenta HNPI

HBDI HBD3

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Cosa fare in PMA?

Nonostante il ridotto numero di prove che dimostrano come le anomalie uterine possano mettere in

pericolo il successo dell’impianto embrionale durante un protocollo di PMA, si raccomanda un attento

studio dell'utero e della ricettività endometriale prima di iniziare un ciclo di PMA43. Nei casi in cui l'aspetto

uterino sia normale ma non si ottenga una risposta positiva al trattamento, è necessario affrontare una

valutazione approfondita della ricettività endometriale (vedi Figura 9). Attualmente è disponibile un test di

valutazione della ricettività endometriale (ERA test), che in particolare identifica la finestra di impianto,

valutando da un punto di vista molecolare lo stato di ricettività endometriale.

In futuro si rendono di fondamentale importanza studi volti all'identificazione dei meccanismi utili per

incrementare la ricettività endometriale (come lo scratching endometriale), qualora sia necessario in un

quadro di PMA compromessa.

Le coppie con RIF rappresentano una popolazione diversa, nella quale l'alta incidenza di anomalie

dell'embrione44 suggerisce di abbinare metodiche di selezione degli embrioni.

Il messaggio finale è di prestare attenzione non solo all'embrione, ma anche all'utero e in particolare

all’endometrio.

PMA

Normale Anormale

Ciclo PMA

Trattamento Nessun

trattamento

disponibile

Test ricettività

endometriale Incremento

ricettività

Esito positivo Esito negativo

Test ricettività

endometriale

Ciclo PMA

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Figura 9. Diagramma di flusso per lo studio della componente uterina in donne al loro primo ciclo di PMA.

“Scratching” endometriale: effetto sulla ricettività endometriale Le donne con fallimenti multipli nei cicli di PMA, nonostante gli embrioni siano apparentemente di buona

qualità, possono essere candidate per lo “scratching” endometriale, che sembra migliorare il tasso di

impianto45,46.

Il processo di “graffiare” l’endometrio sembra incrementare il tasso di impianto per due motivi:

aumento dei globuli bianchi endometriali, in grado di secernere fattori di crescita necessari per

l’impianto dell'embrione;

“accensione” dei geni associati all’impianto embrionale, ovvero aumento dell’espressione di geni

ritenuti responsabili della preparazione dell'endometrio all'impianto.

La procedura viene eseguita nella fase luteale del ciclo (cioè dopo l'ovulazione) e viene effettuata nel ciclo

precedente la stimolazione ovarica per la PMA. Prendendo in esame sette studi clinici45, con 2062

partecipanti, è stato dimostrato come lo scratching endometriale nel ciclo precedente la stimolazione

ovarica conferisca il 70% in più di probabilità di tradursi in una gravidanza clinica rispetto all’assenza di

intervento, con i tassi di gravidanza clinica due volte più elevati in seguito a scratching. Questi risultati

suggerisco l’utilizzo di questa metodica nel ciclo precedente la stimolazione ovarica per migliorare i risultati

di gravidanza nelle donne con RIF. Tuttavia, sono necessari grandi studi randomizzati prima che lo

scratching endometriale possa essere inserito nella pratica clinica di routine.

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6.

Questionario ECM

1. L'impianto embrionale è un processo in cui l’embrione entra in contatto con:

a) la parete uterina (endometrio)

b) il follicolo

c) il corpo luteo

d) il sistema immunitario materno

2. La ricettività endometriale può essere definita come:

a) la capacità dell'endometrio di proliferare durante il ciclo mestruale

b) la capacità della mucosa uterina di consentire l'impianto embrionale

c) la formazioni di endometrio in sede extra uterina

d) la capacità dell'endometrio di contrastare la formazione della placenta

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3. I pinopodi sono:

a) molecole di adesione

b) citochine

c) strutture cellulari presenti sulla superficie uterina dell'epitelio apicale

d) estroflessioni dei macrofagi

4. I fattori proangiogenici secreti da macrofagi consentono:

a) il rimodellamento vascolare per garantire un'adeguata circolazione utero-placentare

b) di bloccare la placentazione

c) di interferire con il processo di impianto

d) di aderire all'epitelio endometriale

5. Le cellule Treg nel sangue periferico durante la gravidanza:

a) diminuiscono

b) incrementano

c) non sono presenti

d) non subiscono modificazioni

6. Nelle condizioni di infertilità idiopatica le cellule NK CD16-CD56bright:

a) decrementano

b) incrementano

c) non sono presenti

d) non subiscono modificazioni

7. La molecola solubile HLA-G è stata rilevata:

a) in assenza di impianto

b) incrementata in gravidanze patologiche

c) nel supernatante di colture di embrioni umani ottenuti tramite IVF

d) in alcun campione biologico derivante da donne gravide

8. Le integrine:

a) sono espresse sull'endometrio durante la finestra di impianto

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b) non sono espresse sull'endometrio durante la finestra di impianto

c) sono molecole citotossiche

d) non sono molecole di adesione

9. Alti livelli di mucina:

a) favoriscono l'impianto

b) non sono riscontrati nell'endometrio

c) hanno effetto apoptotico

d) inibiscono l'impianto