8/2/2019 edwar yersinia

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V o l . 2 1 , N o . 6O U R N A L OF C L I N I C A L M I C R O B I O L O G Y , J u n e 1 9 8 5 , p . 9 1 4 - 9 1 80 0 9 5 - 1 1 3 7 / 8 5 / 0 6 0 9 1 4 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 5 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

R a p i d M i c r o b i o c h e m i c a l M e t h o d f o r P r e s u m p t i v e I d e n t i f i c a t i o n o fG a s t r o e n t e r i t i s - A s s o c i a t e d Members o f t h e F a m i l yE n t e r o b a c t e r i a c e a eDAVID C . T . YONG,1 J . STEPHEN THOMPSON,2* AND ANNE PRYTULA'

L a b o r a t o r y S e r v i c e s B r a n c h , O n t a r i o M i n i s t r y o f H e a l t h , W i n d s o r R e g i o n a l P u b l i c H e a l t h L a b o r a t o r y , W i n d s o r N9A6 S 2 , 1 a n d P e te r b o r o u g h R e g i o n a l P u b l i c H e a l t h L a b o r a t o r y , P e t e r b o r o u g h K9J 6 Y 8 , 2 O n t a r i o , CanadaR e c e i v e d 4 D e c e m b e r 1 9 8 4 / A c c e p t e d 1 8 M a r c h 1 9 8 5

A m e t h o d f o r r a p i d s c r e e n i n g o f i s o l a t e s o f p a t h o g e n i c m e m b e r s o f t h e f a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e i s d e s c r i b e d .F l o w c h a r t s are u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t r i p l e sugar i r o n agar, o - n i t r o p h e n y l - 3 - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e - p h e n y l -a l a n i n e - m o t i l i t y s u l f a t e s c r e e n i n g m e d i a , o x i d a s e t e s t , a n d s i x r a p i d b i o c h e m i c a l t e s t s , n a m e l y , l y s i n ed e c a r b o x y l a s e , u r e a s e , i n d o l e , e s c u l i n h y d r o l y s i s , m a l o n a t e , a n d x y l o s e . T h i s s c h e m e i s u s e d t o p r o v i d e a ni n e x p e n s i v e b u t r ap i d p r e s u m p t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f S a l m o n e l l a , S h i g e l l a , E d w a r d s i e l l a , A e r o m o n a s , P l e -s i o m o n a s , V i b r i o , a n d Y e r s i n i a i s o l a t e s f r o m s t o o l c u l t u r e s .

I n c l i n i c a l b a c t e r i o l o g y , r a p i d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i at h a t c a u s e g a s t r o e n t e r i t i s i s e s s e n t i a l f o r d i a g n o s t i c , e p i d e -m i o l o g i c a l , a n d p u b l i c h e a l t h r e a s o n s . When l a r g e n u m b e r so f f e c a l s p e c i m e n s a r e p r o c e s s e d b y a l a b o r a t o r y , t h e r e i s an e e d f o r r a p i d s c r e e n i n g o f n e g a t i v e s p e c i m e n s a n d c o n f i r -m a t i o n o f p o s i t i v e s p e c i m e n s . A m e t h o d o l o g y t h a t c a nr e d u c e t u r n - a r o u n d t i m e b y 1 d a y i s t h e r e f o r e e x t r e m e l yu s e f u l .I n o u r l a b o r a t o r i e s , t h e s e a r c h f o r e n t e r i c p a t h o g e n sc o n s i s t s o f i n i t i a l s c r e e n i n g b y a t w o - t u b e m e t h o d , t r i p l es u g a r i r o n ( T S I ) a g a r a n d o - n i t r o p h e n y l - , 3 - D - g a l a c t o p y r a n o -s i d e - p h e n y l a l a n i n e m o t i l i t y ( O N P G - P A - M ) s u l f a t e a g a r ( 1 3 ) ,b e f o r e c o n f i r m a t i o n b y a d d i t i o n a l b i o c h e m i c a l a n d s e r o l o g i -c a l t e s t i n g .A 4 - h r a p i d m i c r o b i o c h e m i c a l ( R M ) m e t h o d i s d e s c r i b e df o r p r e s u m p t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f p a t h o g e n i c e n t e r i c b a c t e r i a .T h i s m e t h o d , i n w h i c h s m a l l a m o u n t s o f m e d i a a r e u s e d w i t hl a r g e i n o c u l a o f b a c t e r i a , i s b a s e d o n m e t h o d s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f N e i s s e r i a g o n o r r h o e a e ,G a r d n e r e l l a v a g i n a l i s , a n d c o r y n e b a c t e r i a ( 1 4 , 1 6 , 1 7 ) .W e h a v e a l s o p r o p o s e d a s e r i e s o f f l o w c h a r t s , b a s e d o nk e y r e a c t i o n s , f o r u s i n g t h e RM t e s t s t o s e l e c t a p p r o p r i a t ef u r t h e r t e s t s f o r e a c h i s o l a t e . T h i s a p p r o a c h i s s i m i l a r t o t h a tu s e d b y S h a y e g a n i e t a l . ( 1 1 ) f o r i d e n t i f y i n g n o n f e r m e n t a t i v eg r a m - n e g a t i v e b a c i l l i . T h e c h a r t d e s i g n i s s i m i l a r t o t h a t u s e db y E l l n e r e t a l . ( 5 ) f o r i d e n t i f i c a t i o n o f a n a e r o b e s .T h i s m e t h o d i s i n t e n d e d t o s c r e e n f o r s p e c i e s o f S a l m o -n e l l a , S h i g e l l a , E d w a r d s i e l l a , A e r o m o n a s , P l e s i o m o n a s ,V i b r i o , a n d Y e r s i n i a i n f e c a l s a m p l e s . I t i s n o t i n t e n d e d f o r

c o m p l e t e i d e n t i f i c a t i o n , n o r i s i t i n t e n d e d f o r i d e n t i f i c a t i o n o fo r g a n i s m s f r o m o t h e r t y p e s o f s p e c i m e n s .MATERIALS AND METHODS

C u l t u r e s . A t o t a l o f 1 , 4 7 5 c l i n i c a l i s o l a t e s f r o m s t o o l s a m -p l e s w e r e e x a m i n e d , i n c l u d i n g 6 2 6 S a l m o n e l l a , 2 4 S h i g e l l a ,2 1 5 E s c h e r i c h i a c o l i , 7 3 E n te r o b a c te r , 6 2 P r o te u s , 3 5 P r o v -i d e n c i a , 3 2 0 C i t r o b a c t e r , 3 6 K l e b s i e l l a , 2 3 S e r r a t i a , 1* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

E d w a r d s i e l l a t a r d a , 1 V i b r i o c h o l e r a e , 4 A e r o m o n a sh y d r o p h i l a , 2 P l e s i o m o n a s s h i g e l l o i d e s , 4 6 Y e r s i n i a , a n d 7A r i z o n a ( S a l m o n e l l a s u b g e n u s I I I ) i s o l a t e s . I n a d d i t i o n , 2 4s t o c k c u l t u r e s o f e n t e r i c o r g a n i s m s w e r e o b t a i n e d f r o m t h eC e n t r a l P u b l i c H e a l t h L a b o r a t o r y , O n t a r i o M i n i s t r y o fH e a l t h , T o r o n t o , C a n a d a .A l l o r g a n i s m s w e r e i n i t i a l l y i s o l a t e d o n o n e o r m o r e o f t h ef o l l o w i n g e n t e r i c i s o l a t i o n m e d i a : m o d i f i e d s a l m o n e l l a - s h i g -e l l a a g a r ( O x o i d L t d . ) , M a c C o n k e y a g a r ( G I B C O D i a g n o s -t i c s ) , c e f s u l o d i n - i r g a s a n - n o v o b i o c i n a g a r ( 1 0 ) , t h i o s u l f a t ec i t r a t e b i l e s u c r o s e c h o l e r a m e d i u m ( O x o i d ) , a n d b i s m u t hs u l f i t e a g a r ( O x o i d ) .S i n g l e - c o l o n y i s o l a t e s f r o m e n t e r i c i s o l a t i o n m e d i a w e r ei n o c u l a t e d i n t o s l a n t s o f T S I a g a r ( G I B C O ) a n d t u b e s o fONPG-PA-M s u l f a t e m e d i u m ( 1 3 ) , f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n a t3 6 C f o r 1 8 t o 2 4 h . E a c h i s o l a t e was i d e n t i f i e d b y u s i n g API2 0 E ( A n a l y t a b P r o d u c t s ) . G r o w t h f r o m t h e T S I s l a n t w a su s e d t o i n o c u l a t e t h e f o l l o w i n g RM a n d c o n v e n t i o n a l s u b -s t r a t e s : l y s i n e d e c a r b o x y l a s e , i n d o l e , u r e a , e s c u l i n , m a l o n -a t e , a n d x y l o s e . O x i d a s e t e s t s w e r e p e r f o r m e d w i t h f i l t e rp a p e r i m p r e g n a t e d w i t h a f r e s h l y p r e p a r e d 1% s o l u t i o n o fN , N , N ' , N ' - t e t r a m e t h y l - p - p h e n y l e n e d i a m i n e d i h y d r o c h l o -r i d e ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) . I n o c u l u m f r o m T S I a g a r w a sr u b b e d o n t h e f i l t e r p a p e r w i th a s t e r i l e p l a t i n u m l o o p .S a l m o n e l l a s e r o l o g y w a s p e r f o r m e d w i t h o m n i v a l e n t 0 +V i a n d o m n i v a l e n t H a n t i s e r a o b t a i n e d f r o m t h e E n t e r i cR e f e r e n c e S e c t i o n , C e n t r a l P u b l i c H e a l t h L a b o r a t o r y, T o -r o n t o . T h e 0 + V i a n t i s e r u m c o n t a i n e d 0 g r o u p s A t o W a sw e l l a s V i a n t i s e r u m . S l i d e a g g l u t i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d i ne a c h a n t i s e r u m a n d a p h e n o l i z e d s a l i n e c o n t r o l w i t h g r o w t hf r o m a T S I a g a r s l a n t .P r e p a r a t i o n o f RM m e d i a . M e d i a f o r th e RM b i o c h e m i c a lt e s t s w e r e p r e p a r e d a s f o l l o w s . L y s i n e d e c a r b o x y l a s e b r o t hc o n t a i n e d 0 . 5 g o f M o e l l e r d e c a r b o x y l a s e b a s e ( D i f c o L a b -o r a t o r i e s ) , 0 . 5 g o f L - l y s i n e h y d r o c h l o r i d e ( S i g m a ) ; a n d 2 5 m lo f d i s t i l l e d w a t e r ; pH w a s a d j u s t e d t o 6 . 2 w i t h 1 N NaOH.D e c a r b o x y l a s e c o n t r o l b r o t h c o n t a i n e d 0 . 5 g o f M o e l l e rd e c a r b o x y l a s e b a s e ( D i f c o ) a n d 2 5 m l o f d i s t i l l e d w a t e r ; pHw a s a d j u s t e d t o 6 . 2 w i t h 1 N NaOH. T r y p t o p h a n e b r o t h f o ri n d o l e d e t e r m i n a t i o n c o n t a i n e d 1 g o f t r y p t o s e ( D i f c o ) a n d 2 5m l o f d i s t i l l e d w a t e r ; pH w a s a d j u s t e d t o 7 . 4 w i t h 1 N NaOH.U r e a b r o t h c o n t a i n e d 2 5 m l o f " u r e a b a s e " a n d 2 . 0 g o f u r e a

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ENTEROBACTERIACEAE IDENTIFICATION 9 1 5TABLE 1 . C o m p a r i s o n o f RM a n d c o n v e n t i o n a l b i o c h e m i c a lr e a c t i o n s o f c l i n i c a l i s o l a t e s

N o . o f N o . ( % ) o fS u b s t r a t e s p e c i m e n s r e a c t i o n s i nt e s t e d a g r e e m e n tL y s i n e 1 , 4 7 5 1 , 4 7 5 ( 1 0 0 )U r e a s e 1 , 4 7 5 1 , 4 7 2 ( 9 9 . 8 )I n d o l e 1 , 4 7 5 1 , 4 7 5 ( 1 0 0 )E s c u l i n 1 , 1 2 2 1 , 1 2 2 ( 1 0 0 )M a l o n a t e 1 , 3 1 5 1 , 3 1 1 ( 9 9 . 7 )X y l o s e 1 , 1 2 2 1 , 1 1 6 ( 9 9 . 5 )( c r y s t a l l i n e ; S i g m a ) ; pH was a d j u s t e d t o 7 . 0 w i t h 1 N NaOH.( U r e a b a s e c o n t a i n e d 0 . 0 1 g o f y e a s t e x t r a c t [ D i f c o ] , 0 . 0 1 go f m o n o p o t a s s i u m p h o s p h a t e , a n d 1 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r . )E s c u l i n b r o t h c o n t a i n e d 0 . 0 3 g o f e s c u l i n h y d r a t e c r y s t a l l i n e( S i g m a ) , 0 . 0 2 g o f f e r r i c c i t r a t e , 0 . 3 g o f B a c t o - P e p t o n e( D i f c o ) , 0 . 1 7 g o f s o d i u m c h l o r i d e , a n d 2 5 m l o f d i s t i l l e dw a t e r ; pH was a d j u s t e d t o 7 . 2 w i t h 1 N NaOH. X y l o s e b r o t hc o n t a i n e d 2 5 m l o f RM b a s e a n d 0 . 5 g o f x y l o s e ( S i g m a ) ; pHwas a d j u s t e d t o 7 . 3 w i t h 1 N s o d i u m h y d r o x i d e (RM b a s ec o n t a i n e d 2 . 0 g o f C a s a m i n o A c i d s [ c e r t i f i e d ; D i f c o ] , 0 . 0 3 go f L - c y s t e i n e h y d r o c h l o r i d e [ S i g m a ] , 0 . 0 3 g o f s o d i u m s u l -f a t e , 2 . 5 g o f n e o p e p t o n e [ D i f c o ] , 0 . 1 g o f p h e n o l r e d , a n d 1 0 0ml o f d i s t i l l e d w a t e r ) . M a l o n a t e b r o t h c o n t a i n e d 0 . 2 g o fm a l o n a t e b r o t h ( D i f c o ) , 0 . 0 3 g o f b r o m o t h y m o l b l u e , a n d 2 5ml o f d i s t i l l e d w a t e r .

A l l RM m e d i a were f i l t e r s t e r i l i z e d w i t h a m e m b r a n e f i l t e r( p o r e s i z e , 0 . 2 , u m ; N a l g e n e s m a l l s t e r i l i z a t i o n f i l t e r u n i t ;S y b r o n / N a l g e ) a n d s t o r e d a t 2 t o 8 C i n g l a s s d r o p p e rb o t t l e s .P r e p a r a t i o n o f c o n v e n t i o n a l m e d i a . L y s i n e d e c a r b o x y l a s eb r o t h a n d d e c a r b o x y l a s e c o n t r o l b r o t h w e r e made as d e -s c r i b e d i n t h e d i r e c t i o n s o f t h e m a n u f a c t u r e r w i t h M o e l l e rd e c a r b o x y l a s e b a s e ( D i f c o ) a n d L - l y s i n e h y d r o c h l o r i d e

TABLE 3 . G u i d e f o r c h a r t s e l e c t i o nT e s t r e s u l t s ' i n d i c a t i n g u s e o f t h e f o l l o w i n g c h a r t :TEST A B C D E F

H 2 S b + +T S I

S l a n t A A K KB u t t A A A AG a s - + +PA - - - - - -ONPG - +

T e s t r e s u l t s : A , a c i d ; K , a l k a l i n e ; + , p o s i t i v e ; - , n e g a t i v e .b H , S p r o d u c t i o n may b e d e t e r m i n e d f r o m T S I a g a r o r ONPG-PA-M s u l f a t em e d i u m .

( S i g m a ) . T r y p t o s e b r o t h f o r i n d o l e d e t e r m i n a t i o n c o n s i s t e do f 1 0 g o f t r y p t o s e ( D i f c o ) , 5 g o f s o d i u m c h l o r i d e , a n d 1 , 0 0 0m l o f d i s t i l l e d w a t e r . U r e a a g a r s l a n t s c o n s i s t e d o f u r e a a g a rb a s e a n d 40% u r e a ( O x o i d ) a n d w e r e m a d e a s d e s c r i b e d i nt h e d i r e c t i o n s o f t h e m a n u f a c t u r e r . E s c u l i n a g a r s l a n t s ( 1 5 )c o n s i s t e d o f 1 g o f e s c u l i n ( S i g m a ) , 0 . 5 g o f f e r r i c c i t r a t e , 4 0g o f h e a r t i n f u s i o n a g a r ( D i f c o ) , a n d 1 , 0 0 0 m l o f d i s t i l l e dw a t e r . X y l o s e b r o t h ( 1 5 ) c o n s i s t e d o f 2 2 . 5 g o f h e a r t i n f u s i o nb r o t h ( D i f c o ) , 1 0 g o f x y l o s e ( S i g m a ) , 0 . 0 2 g o f b r o m o c r e s o lp u r p l e , a n d 1 , 0 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r . M a l o n a t e b r o t h( D i f c o ) w a s m a d e a s d e s c r i b e d i n t h e d i r e c t i o n s o f t h em a n u f a c t u r e r .M e t h o d o f i n o c u l a t i o n o f RM s u b s t r a t e s . J u s t b e f o r e u s e ,a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 5 m l ( 1 d r o p ) o f e a c h s t e r i l e m e d i u m w a sd i s p e n s e d i n t o s t e r i l i z e d m i c r o t u b e s ( d i s p o s a b l e b o r o s i l i c a t eg l a s s , 6 b y 5 0 mm; K i m b l e ) . T h e t u b e s w e r e p l a c e d i nm i c r o t i t e r V p l a t e s ( D y n a t e c h L a b o r a t o r i e s , I n c . ) , a n d t h em e d i a w e r e a l l o w e d t o warm t o r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 2 C )

TABLE 2 . P r e s u m p t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f 2 4 s t o c k c u l t u r e s b y u s i n g t h e RM a n d f l o w c h a r t methodR e a c t i o n s i n RM t e s t s 'O r g a n i s m F l o w c h a r t r e s u l tLY S URE IND ESC MAL XY L

S a l m o n e l l a t y p h i + - - - - + P o s s i b l e S a l m o n e l l a ( S . t y p h i )S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m + - - - - + P o s s i b l e S a l m o n e l l a s p .S a l m o n e l l a n e w p o r t + - - - - + P o s s i b l e S a l m o n e l l a s p .S a l m o n e l l a p a r a t y p h i A - - - - - - P o s s s i b l e S a l m o n e l l a p a r a ty p h i AS a l m o n e l l a p a r a t y p h i B + - - - - - P o s s i b l e S a l m o n e l l a s p .A r i z o n a s p . + - - - + + P o s s i b l e A r i z o n a s p .S h i g e l l a f l e x n e r i - - + - - - P o s s i b l e S h i g e l l a s p .S h i g e l l a s o n n e i - - - - - - P o s s i b l e S h i g e l l a s p .Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a - + - - - - P o s s i b l e Y e r s i n i a s p .Y e r s i n i a i n t e r m e d i a - + + + - + P o s s i b l e Y e r s i n i a s p .Y e r s i n i a f r e d e r i k s e n i i - + + + - + P o s s i b l e Y e r s i n i a s p .Y e r s i n i a k r i s t e n s e n i i - + - - - + P o s s i b l e Y e r s i n i a s p .Y e r s i n i a p s e u d o t u b e r c u l o s i s - + - - - + P o s s i b l e Y e r s i n i a s p .E s c h e r i c h i a c o l i + - + - - + D i s c a r dP r o t e u s m i r a b i l i s - + - + - + D i s c a r dP r o v i d e n c i a r e t t g e r i - + + + - - D i s c a r dP r o v i d e n c i a s t u a r t i i - + + + - - D i s c a r dC i t r o b a c t e r f r e u n d i i - - - - + + D i s c a r dE d w a r d s i e l l a t a r d a + - + + - - P o s s i b l e E d w v a r d s i e l l a s p .E n t e r o b a c t e r c l o a c a e - - - + + + D i s c a r dK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e + + - + + + D i s c a r dS e r r a t i a m a r c e s c e n s + - - + - - D i s c a r dV i b r i o c h o l e r a e + - + - - - P o s s i b l e V i b r i o s p .Aeromonas h y d r o p h i l a - - + + - - P o s s i b l e A e r o m o n a s s p .

" A b b r e v i a t i o n s : L Y S , l y s i n e d e c a r b o x y l a s e ; URE, u r e a s e ; I N D , i n d o l e ; E S C . e s c u l i n ; MAL. m a l o n a t e ; XYL. x y l o s e ; + , p o s i t i v e r e s u l t ; - , n e g a t i v e r e s u l t .

V O L . 2 1 , 1 9 8 5

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9 1 6 YONG, THOMPSON, AND PRYTULAH2S +P A -ONPG -

T S I A / AH 2 S -Ga s -PA -

F I G . 1 . C h a r t A . S c h e m e f o r o r g a n i s m s t h a t a r e H 2 S p o s i t i v e ,PA n e g a t i v e , a n d ONPG n e g a t i v e . S y m b o l s : - * , p o s i t i v e r e s u l t ; l . ,n e g a t i v e r e s u l t ; < , t e s t ( a s i n d i c a t e d ) ; () , n o f u r t h e ri d e n t i f i c a t i o n n e c e s s a r y ( n o n p a t h o g e n i c o r g a n i s m ) ; i , f u r t h e ri d e n t i f i c a t i o n n e c e s s a r y .b e f o r e i n o c u l a t i o n . O n e - t h i r d o f a l o o p f u l ( l o o p d i a m e t e r , 3mm) o f p u r e g r o w t h o f e a c h i s o l a t e ( g r o w n f o r 1 8 t o 2 4 h o nT S I a g a r s l a n t s ) w a s i n o c u l a t e d i n t o e a c h m e d i u m . T h o r o u g hm i x i n g o f i n o c u l u m a n d s u b s t r a t e w a s n e c e s s a r y t o q u i c k e nt h e r e a c t i o n t i m e . A f t e r i n o c u l a t i o n , t h e m e d i a i n t h e u r e aa n d d e c a r b o x y l a s e t u b e s w e r e o v e r l a i d w i t h 2 d r o p s o fs t e r i l e m i n e r a l o i l . T h e i n o c u l a t e d t u be s w e r e i n c u b a t e d i n as h a l l o w w a te r b a t h a t 3 6 C .

H2S +PA -ONPG +

F I G . 2 . C h a r t B . S c h e m e f o r o r g a n i s m s t h a t a r e H 2 S p o s i t i v e , PAn e g a t i v e , a n d ONPG p o s i t i v e . S y m b o l s a re d e s c r i b e d i n t h e l e g e n dt o F i g . 1 .

Disca r d )F I G . 3 . C h a r t C . S c h e m e f o r o r g a n i s m s w i th a n a c i d s l a n t , a na c i d b u t t w i t h o u t g a s i n T S I a g a r , a n d H 2 S - n e g a t i v e a n d P A - n e g a t i v er e s u l t s . S y m b o l s a r e d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 .

L y s i n e d e c a r b o x y l a s e r e s u l t s w e r e r e a d a f t e r 2 h o fi n c u b a t i o n ; a p o s i t i v e t e s t r e s u l t was i n d i c a t e d b y a p u r p l ec o l o r , p r o v i d e d t h a t t h e d e c a r b o x y l a s e c o n t r o l t u b e wasy e l l o w . T h e i n d o l e r e s u l t w a s r e a d i n 4 h . A f t e r t h e a d d i t i o no f o n e d r o p o f K o v a c r e a g e n t , a p o s i t i v e t e s t p r o d u c e d a r e dc o l o r . A l l o t h e r t e s t r e s u l t s w e r e o b s e r v e d a f t e r 2 h , b u tt u b e s s h o w i n g n e g a t i v e r e a c t i o n s w e r e i n c u b a t e d f o r a t o t a lo f 4 h . A p o s i t i v e u r e a s e t e s t was i n d i c a t e d b y a p i n k c o l o r .A p o s i t i v e m a l o n a t e t e s t w a s b l u e , a n d a n e g a t i v e t e s t wasg r e e n . I n t h e e s c u l i n t e s t , a p o s i t i v e r e s u l t was i n d i c a t e d b yd e v e l o p m e n t o f a b l a c k c o l o r . A p o s i t i v e x y l o s e t e s t wasy e l l o w a n d a n e g a t i v e t e s t was r e d .

RESULTST a b l e 1 s h o w s 9 9 . 8 % a g r e e m e n t b e tw e e n t e s t r e s u l t so b t a i n e d w i t h c o n v e n t i o n a l a n d RM m e t h o d s i n 7 , 9 8 4 i n d i -v i d u a l t e s t s . A l l RM r e a c t i o n s w e r e c o m p l e t e w i t h i n 4 h ,a l t h o u g h w i th m o s t s u b s t r a t e s , p o s i t i v e r e a c t i o n s w e r e a p -p a r e n t w i t h i n 2 h o f i n o c u l a t i o n . U r e a s e , m a l o n a t e , a n dx y l o s e t e s t s y i e l d e d m o r e p o s i t i v e r e a c t i o n s i n t h e c o n v e n -t i o n a l t e s t s t h a n i n t h e RM t e s t s , w i t h t h r e e , f o u r , a n d s i xd i s c r e p a n c i e s , r e s p e c t i v e l y . T h r e e K l e b s i e l l a i s o l a t e s s h o w e df a l s e - n e g a t i v e u r e a s e r e s u l t s ; t h r e e E s c h e r i c h i a c o l i , t w oP r o v i d e n c i a , a n d o n e S e r r a t i a i s o l a t e s h o w e d f a l s e - n e g a t i v ex y l o s e r e s u l t s ; a n d t w o K l e b s i e l l a a n d t w o E n t e r o b a c t e ri s o l a t e s s h o w e d f a l s e - n e g a t i v e m a l o n a t e r e s u l t s w i t h RMm e d i a . T e s t s w h i c h w e r e n e g a t i v e b y t h e RM m e t h o d b u tp o s i t i v e w i t h c o n v e n t i o n a l s u b s t r a t e s w e r e c o n s i d e r e d t o b ef a l s e - n e g a t i v e .T a b l e 2 s h o w s t h e r e a c t i o n s o f 2 4 s t o c k c u l t u r e s t e s t e d b yt h e RM m e t h o d . A l l RM r e s u l t s a g r e e d w i t h t h o s e o f

J . C L I N . M I C R O B I O L .

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ENTEROBACTERIACEAE IDENTIFICATION 9 1 7c o n v e n t i o n a l t e s t s a n d w i t h p u b l i s h e d r e s u l t s f o r e a c h s p e -c i e s ( 3 , 4 , 6 ) .A l l S a l m o n e l l a , S h i g e l l a , E d w a r d s i e l l a t a r d a , V i b r i o c h o l -e r a e , A e r o m o n a s h y d r o p h i l a g r o u p, P l e s i o m o n a s s h i g e l -l o i d e s , a n d Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a i s o l a t e s w e r e d e t e c t e d b yt h i s s y s t e m . T h i s i n c l u d e d o n e l a c t o s e - p o s i t i v e s t o c k c u l t u r eo f S a l m o n e l l a n e w p o r t t h a t w a s H 2 S n e g a t i v e i n T S I a g a r .

DISCUSSIONG o o d c o r r e l a t i o n ( 9 9 . 8 % ) w a s d e m o n s t r a t e d b e t w e e n t h e

RM a n d c o n v en ti o n a l b i o c h e m i c a l t e s t s . T h e r e w e r e d i s c r e p -a n c i e s i n 1 3 i n d i v i d u a l t e s t s , w i t h t h e RM t e s t s a p p e a r i n g t ob e u n d e r s e n s i t i v e i n e a c h i n s t a n c e . None o f t h e d i s c r e p a n -c i e s o c c u r r e d i n a t e s t c r i t i c a l t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h eo r g a n i s m i n v o l v e d . O t h e r p a p e r s h a v e d e s c r i b e d r a p i d t e s t sf o r s c r e e n i n g o f e n t e r i c p a t h o g e n s ( 2 , 9 , 1 2 ) , e s c u l i n t e s t s ( 8 ) ,a n d i d e n t i f i c a t i o n s c h e m e s ( 7 ) . B u r n s e t a l . ( 1 ) h a v e p r o -p o s e d a n e x t e n s i v e s e r i e s o f f l o w c h a r t s t o a i d i n t h ei d e n t i f i c a t i o n o f b o t h f e r m e n t a t i v e a n d n o n f e r m e n t a t i v e g r a m -n e g a t i v e b a c t e r i a . T h e p r o p o s e d m e t h o d f a c i l i t a t e s t h e d i s -c a r d i n g o f i s o l a t e s w h i c h h a v e n o c l i n i c a l r e l e v a n c e w i t h o u te x t e n s i v e i d e n t i f i c a t i o n . I n t h i s r e g a r d , a n i m p o r t a n t s c r e e n -i n g s t e p i s t h e u s e o f a p o s i t i v e p h e n y l a l a n i n e d e a m i n a s e( P A ) r e a c t i o n t o s c r e e n f o r P r o te u s, P r o v i d e n c i a , a n d M o r -g a n e l l a s p p . , w h i c h a r e d i s c a r d e d a s n o r m a l e n t e r i c f l o r aw i t h o u t f u r t h e r b i o c h e m i c a l t e s t i n g .T a b l e 3 d i r e c t s t h e i n v e s t i g a t i o n i n t o o n e o f t h e f l o w c h a r t s

T S I A/AH 2 S -Gas +P A -

F I G . 4 . C h a r t D . Scheme f o r o r g a n i s m s t h a t h a v e a n a c i d s l a n t ,a n a c i d b u t t w i t h gas i n T S I a g a r , a n d H 2 S - n e g a t i v e a n d P A - n e g a t i v er e s u l t s . S y m b o l s ar e d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 .

P o s s i b l eS h i g e l l a( A e r o g e n i c )

F I G . 5 . C h a r t E . S c h e m e f o r o r g a n i s m s w it h a n a l k a l i n e s l a n t , a na c i d b u t t w i t h g a s i n T S I a g a r , a n d H 2 S - n e g a t i v e a n d P A - n e g a t i v er e s u l t s . S y m b o l s a r e d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d t o F i g . 1 .

b a s e d o n r e a c t i o n s o b t a i n e d i n t h e p r e l i m i n a r y s c r e e n i n gm e d i a , T S I a n d ONPG-PA-M s u l f a t e .F i g u r e 1 i s t h e s i m p l e s t c h a r t a n d w o u l d p r o b a b l y b e t h em o s t e x t e n s i v e l y u s e d i n a l a b o r a t o r y p r o c e s s i n g a l a r g en u m b e r o f S a l m o n e l l a s p p . i s o l a t e s . T h e k e y i s t h e s a m e f o ra l l s i x f l o w c h a r t s . E a c h s y m b o l g i v e s p r o c e s s i n g d i r e c t i o n s .F o r e a c h s u b s t r a t e a l l a r r o w s f r o m t h e r i g h t - h a n d a p e xr e p r e s e n t p o s i t i v e r e a c t i o n s . T h e o v o i d d i s c a r d s y m b o lm e a n s t h a t t h e o r g a n i s m h a s b e e n s c r e e n e d a s a n o n p a t h o -g e n a n d n o f u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n i s n e c e s s a r y . T h e r e c t a n g u -l a r i d e n t i f y s y m b o l m e a n s t h a t f u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n i sn e c e s s a r y t o c o n f i r m t h e p r e s u m p t i v e i d e n t i f i c a t i o n o r t od i f f e r e n t i a t e b e t w e e n s e v e r a l p o s s i b i l i t i e s . I d e n t i f i c a t i o n wasp e r f o r m e d b y u s i n g A P I 2 0 E d u r i n g t h i s p r o j e c t , b u t o th e rs y s t e m s o r c o n v e n t i o n a l t e s t i n g c o u l d b e u s e d .F o r t h e s e f l o w c h a r t s , t h e T S I r e a c t i o n s , P A , ONPG, a n dm o t i l i t y w e r e a l l d e r i v e d f r o m t h e t w o m e d i a u s e d f o rp r e l i m i n a r y s c r e e n i n g , T S I s l a n t s a n d ONPG-PA-M s u l f a t ea g a r . O f t e n , o n l y t h e s e r e a c t i o n s w o u l d b e n e c e s s a r y t op r o d u c e a p r e l i m i n a r y i d e n t i f i c a t i o n . When t h e c h a r t s i n d i -c a t e d t h a t m o r e t e s t s w e r e n e c e s s a r y , t h e r e m a i n i n g s u b -s t r a t e s w e r e i n o c u l a t e d s i m u l t a n e o u s l y . T h e f l o w c h a r t s t h e np r o v i d e d a n o r d e r i n w h i c h t o i n t e r p r e t t e s t r e s u l t s .F i g u r e s 2 t h r o u g h 6 p r e s e n t s c h e m e s o f v a r i o u s c o m p l e x -i t i e s , b u t t h e d i r e c t i o n s f o r u s e r e m a i n t h e s a m e .S i n c e t h e i n i t i a l s t u d y , t h i s s c h e m e h a s b e e n u s e d r o u -t i n e l y i n o n e o f o u r l a b o r a t o r i e s f o r 2 2 m o n t h s . D u r i n g t h i s

V O L . 2 1 , 1 9 8 5

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9 1 8 YONG, THOMPSON, AND PRYTULAT S I K / AH2S -Ga s -PA -

P o s s i b l eS h i g e l l s

F I G . 6 . C h a r t F . S c h e m e f o r o r g a n i s m s w i t h a n a l k a l i n e s l a n t , a na c i d b u t t w i t h n o ga s i n T S I a g a r , H 2 S - n e g a t i v e , a n d P A - n e g a t i v er e s u l t s . S y m b o l s ar e d e s c r i b e d i n th e l e g e n d t o F i g . 1 .p e r i o d , c a . 2 1 , 0 0 0 s t o o l c u l t u r e s w e r e p r o c e s s e d , r e s u l t i n g i nt h e d e t e c t i o n o f t h e f o l l o w i n g p a t h o g e n s : S a l m o n e l l a s p p .( 1 , 7 1 2 i s o l a t e s ) , S h i g e l l a spp. ( 1 9 i s o l a t e s ) , Y e r s i n i a e n t e r o -c o l i t i c a ( 6 3 i s o l a t e s ) , a n d V i b r i o c h o l e r a e ( 4 i s o l a t e s ) . S i x t y -s ev e n i s o l a t e s o f n o n p a t h o g e n s w h i c h were n o t s c r e e n e d o u tb y t h e f l o w c h a r t s c h e m e b u t r e q u i r e d f u r t h e r i d e n t i f i c a t i o nb y API 2 0 E i n c l u d e d C i tr o b a c te r spp. ( 2 8 i s o l a t e s ) , a n a e r o -g e n i c E s c h e r i c h i a c o l i ( 3 8 i s o l a t e s ) , a n d M o r g a n e l l a mor-g a n i i ( 1 i s o l a t e ) .T h e s e RM t e s t s , when u s e d w i t h t h e f l o w c h a r t s c h e m e ,p r o v i d e a p r a c t i c a l a n d e c o n o m i c a l d i a g n o s t i c t o o l f o r d e a l -i n g w i t h r o u t i n e e n t e r i c b a c t e r i o l o g y .

ACKNOWLEDGMENTSW e a re g r a t e f u l f o r t h e a s s i s t a n c e o f A . A . B o r c z y k t h r o u g h o u t t h ep r o j e c t a n d f o r r e v i e w o f t h e m a n u s c r i p t . W e a l s o t h a n k S . Toma f o rc r i t i c a l r e v i e w , R . T e r r o , D . S . H o d g e , a n d F . E . C a h o o n f o r a d v i c e ,

a n d W i l l e m v a n d e r K o l k a n d t h e R e g i o n a l A u d i o - V i s u a l s t a f f f o r t h eg r a p h i c s .LITERATURE CITED

1 . B u r n s , M . C . , E . R . R i c h t e r , M. S . R h e i n s , a n d G . J . B a n i w a r t .1 9 8 2 . An i d e n t i f i c a t i o n s c h e m e f o r g r a m n e g a t i v e f e r m e n t a t i v ea n d n o n f e r m e n t a t i v e b a c t e r i a . P u b l i c H e a l t h L a b . 4 0 : 8 6 - 1 0 8 .2 . D a v i s , J . R . , C . E . S t a g e r , R . D . W e n d e , a n d S . M. H . Q a d r i .1 9 8 1 . C l i n i c a l l a b o r a t o r y e v a l u a t i o n o f t h e A u t o M i c r o b i c s y s t e mE n t e r o b a c t e r i a c e a e b i o c h e m i c a l c a r d . J . C l i n . M i c r o b i o l .1 4 : 3 7 0 - 3 7 5 .3 . D e v e n i s h , J . A . , a n d D . A . S c h i e m a n n . 1 9 8 1 . An a b b r e v i a t e ds c h e m e f o r i d e n t i f i c a t i o n o f Y e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a i s o l a t e d f r o mf o o d e n r i c h m e n ts i n CIN ( c e f s o l u d i n - i r a g a s a n n o v o b i o c i n ) a g a r .C a n . J . M i c r o b i o l . 2 7 : 9 3 7 - 9 4 1 .4 . E d w a r d s , P . R . , a n d W. H . E w i n g . 1 9 7 2 . I d e n t i f i c a t i o n o fE n t e r o b a c t e r i a c e a e , 3 r d e d . B u r g e s s P u b l i s h i n g C o . , M i n n e a p -o l i s , M i n n .5 . E l l n e r , P . D . , P . A . G r a n a t o , a n d C . B . M a y . 1 9 7 3 . R e c o v e r y a n di d e n t i f i c a t i o n o f a n a e r o be s : a s y s t e m s u i t a b l e f o r t h e r o u t i n ec l i n i c a l l a b o r a t o r y . A p p l . M i c r o b i o l . 2 6 : 9 0 4 - 9 1 3 .6 . M a r t i n , W. J . , a n d J . A . W a s h i n g t o n I I . 1 9 8 0 . E n t e r o b a c t e r i a -c e a e , p . 1 9 5 - 2 1 6 . I n E . H . L e n n e t t e , A . B a l o w s , W. J . H a u s l e r ,J r . , a n d J . P . T r u a n t ( e d . ) , M a n u a l o f c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y , 3 r de d . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .7 . N o r d , C . E . , A . A . L i n d b e r g , a n d A . D a h l b a c k . 1 9 7 5 . F o u rh o u r - t e s t s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f E n t e r o b a c t e r i a c e a e . M e d .M i c r o b i o l . I m m u n o l . 1 6 1 : 2 3 1 - 2 3 8 .8 . Q a d r i , S . M. H . , a n d J . C . S m i t h . 1 9 8 2 . R a p i d d e g r a d a t i o n o fe s c u l i n t o e s c u l a t i o n b y g r a m n e g a t i v e b a c t e r i a . P u b l i c H e a l t hL a b . 4 0 : 2 7 - 3 3 .9 . S a n d e r s , A . C . , a n d K . O k a b e . 1 9 5 4 . A r a p i d s c r e e n i n g m e t h o df o r t h e i s o l a t i o n o f e n t e r i c p a t h o g e n s . P u b l i c H e a l t h L a b .1 2 : 1 2 - 1 4 .1 0 . S c h i e m a n n , D . A . 1 9 7 9 . S y n t h e s i s o f a s e l e c t i v e a g a r m e d i u m f o rY e r s i n i a e n t e r o c o l i t i c a . C a n . J . M i c r o b i o l . 2 5 : 1 2 9 8 - 1 3 0 4 .1 1 . S h a y e g a n i , M . , A . M. L e e , a n d L . M. P a r s o n s . 1 9 7 7 . A s c h e m ef o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f n o n f e r m e n t a t i v e g r a m n e g a t i v e b a c t e r i a .H e a l t h L a b . S c i . 1 4 : 8 3 - 9 4 .1 2 . S t a g e r , C . E . , E . E r i k s o n , a n d J . R . D a v i s . 1 9 8 3 . R a p i d m e t h o df o r d e t e c t i o n , i d e n t i f i c a t i o n , a n d s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g o f e n t e r i cp a t h o g e n s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 1 7 : 7 9 - 8 4 .1 3 . T h o m p s o n , J . S . , a n d A . A . B o r cz y k. 1 9 8 4 . U s e o f a s i n g l e - t u b em e d i u m , o - n i t r o p h e n y l - p - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e - p h e n y l a l a n i n e -m o t i l i t y s u l f a t e , f o r s c r e e n i n g o f p a t h o g e n i c m e m b e r s o f t h ef a m i l y E n t e r o b a c t e r i a c e a e . J . C l i n . M i c r o b i o l . 2 0 : 1 3 6 - 1 3 7 .1 4 . T h o m p s o n , J . S . , D . R . G a t e s - D a v i s , a n d D . C . T . Y o n g . 1 9 8 3 .R a p i d m i c r o b i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f C o r y n e b a c t e r i u md i p h t h e r i a e a n d o t h e r m e d i c a l l y i m p o r t a n t c o r y n e b a c t e r i a . J .C l i n . M i c r o b i o l . 1 8 : 9 2 6 - 9 2 9 .1 5 . V e r a , J . S . , a n d D . A . P o w e r . 1 9 8 0 . C u l t u r e m e d i a , p . 9 6 5 - 9 9 9 .I n E . H . L e n n e t t e , A . B a l o w s , W. J . H a u s l e r , J r . , a n d J . P .T r u a n t ( e d . ) , M a n u a l o f c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y , 3 r d e d . A m e r i c a nS o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .1 6 . Y o n g , D . C . T . , a n d A . P r y t u l a . 1 9 7 8 . R a p i d m i c r o - c a r b o h y d r a t et e s t f o r c o n f i r m a t i o n o f N e i s s e r i a g o n o r r h o e a e . J . C l i n . M i -c r o b i o l . 8 : 6 4 3 - 6 4 7 .1 7 . Y o n g , D . C . T . , a n d J . S . T h o m p s o n . 1 9 8 2 . R a p i d m i c r o b i o c h e m -i c a l m e t h o d f o r i d e n t i f i c a t i o n o f G a r d n e r e l l a ( H a e m o p h i l u s )v a g i n a l i s . J . C l i n . M i c r o b i o l . 1 6 : 3 0 - 3 3 .

J . C L I N . M I C R O B I O L .