金黄色葡萄球菌肠毒素u的原核表达 ·...
TRANSCRIPT
第!!
卷!
第"
期 陕西师范大学学报!自然科学版"
#$%&!!
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年**
月+$,-./%$012//.34'$-5/%6.478-94:
;
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'/:,-/%1<48.<8=>4:4$.
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#
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文章编号!
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*)&*BACD
"
E
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E
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收稿日期!
()*"@)!@)"
基金项目!西安市科技局现代农业推进计划#
'S*()C̀ !
$'陕西省科学院应用基础研究项目#
()*D] )̀?
$
!"
通信作者!万一%男%研究员&
=@5/4%
!
H/.
;
4"B"B
!
94./&<$5
金黄色葡萄球菌肠毒素U
的原核表达(纯化及鉴定
张!
琨!张月娟!万!
一"
#陕西省微生物研究所 分子生物学研究中心%陕西 西安?*))!D
$
摘!
要!为高效获取金黄色葡萄球菌肠毒素Y
!
1=Y
"用于1=Y
的快速检测#通过原核表达方法表达
1=Y
#对其纯化方法进行研究#并通过\89:8-.@X%$:
和制备的1=Y
纳米磁性免疫层析快速检测试
纸条检测其抗原性&研究表明(
1=Y
成功克隆入原核表达载体W
=U((X
!
f
"#并在#98b7RYK(*
!
c=D
"中得到有效表达#表达量达"B&Cj
'采用'4
柱亲和层析和c=J=
阴离子层析两步纯化得到
纯度为AB&(j
的1=Y
#
\89:8-.@X%$:
和1=Y
免疫层析快速检测试纸条检测显示所纯化的重组1=Y
具有1=Y
的抗原性#可用于1=Y
快速检测试纸的应用研究&
关键词!金黄色葡萄球菌肠毒素Y
'原核表达'纯化'免疫层析快速检测
中图分类号!
a?C
!
文献标志码!
J
T)"P*)
1
"(#,/J
M
)/22#"-
%
M
.)#+#,*(#"-*-!#!/-(#+#,*(#"-
"+2(*
M
G
1
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\J'N4
"
#
[898/-<2S8.:8-$0Q$%8<,%/-Y4$%$
G;
%
12//.34Q4<-$X4$%$
G;
L.9:4:,:8
%
P4R/.?*))!D
%
12//.34
%
S24./
$
452()*,(
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W
2
;
%$<$<<,9/,-8,98.:8-$:$34.Y
#
1=Y
$
8004<4.:%
;
0$-:28-898/-<2
$0-/
W
4>>8:8<:4$.$01=Y
%
1=YH/983
W
-8998>X
;W
-$F/-
;
$:4<83
W
-8994$.9
;
9:85
%
:28
W
,-404</:4$.
58:2$>$0:28-8<$5X4./.:1=YH/99:,>48>
%
/.>4:9/.:4
G
8.4<4:
;
H/94>8.:4048>X
;
\89:8-.X%$:
/.>:285/
G
.8:4<455,.$<2-$5/:$
G
-/
W
24<-/
W
4>/99/
;
9:-4
W
0$->8:8<:4.
G
1=Y&1:,>48992$H8>
:2/:1=YH/98008<:47883
W
-8994$.4.=&<$%4YK(*
#
c=D
$
X
;
1c1@TJO=>8:8<:4$.
%
/.>:28"B&Cj
$09
W
8<4/%83
W
-8998>
W
-$>,<:4.:$:/%9$5/:4<
W
-$:84.9
%
/.>:28
W
-$>,<:H4:2
W
,-4:
;
$0AB&(j
<$,%>X8$X:/4.8>X
;
,94.
G
:H$@9:8
WW
,-404</:4$.94.<%,>4.
G
'4/004.4:
;
<2-$5/:$
G
-/
W
2
;
/.>c=J=
/.4$.83<2/.
G
8<2-$5/:$
G
-/
W
2
;
&U2883
W
-8994$.
W
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W
8<404</%%
;
:$Q<JX/
G
/4.9:1=Y
H/9
W
-$78>X
;
\89:8-.X%$:/.>:28 5/
G
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G
-/
W
24<-/
W
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W
0$-
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G
1=Y
%
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^
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W
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W
2
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'
W
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W
-8994$.
'
W
,-404</:4$.
'
455,.$<2-$5/:$
G
-/
W
24<
-/
W
4>/99/
;
! !
金 黄 色 葡 萄 球 菌 肠 毒 素 #
9:/
W
2
;
%$<$<</%
8.:8-$:$34.
%
1=
$为一类结构相关*毒力相似*抗原
性不 同 的 胞 外 蛋 白 质%是 金 黄 色 葡 萄 球 菌
#
AD2
H
Z
1
Rb8b88IQ2I*/IQ
$引起食物中毒的主要因
素(
*
)
&目前%
1=
已成为一个世界性卫生问题%据统
计%由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的
比例在美国为DDj
*在加拿大达到!Bj
(
(@D
)
%我国每
年也有多起此类中毒事件发生(
!
)
&根据1=
血清学
特征可将其分为1=J@1=+
十个毒素血清型%其中
1=Y
最为耐热%产毒量最大#
B))
)
G
"
5K
$
(
B
)
%食入
)&))!
)
G
"
F
G
剂量就能诱发人的临床症状%而)&)(
)
G
"
F
G
剂量就足以致死(
"
)
&快速检测出食品中的
1=Y
才能有效控制食物中毒的发生和蔓延&
1=Y
一方面可用于1=Y
单克隆抗体的制备及作
?)
!!!
陕西师范大学学报!自然科学版" 第!!
卷
为阳性抗原在1=Y
引起的食物中毒的快速诊断中发
挥作用'另一方面1=Y
还是一种具有超抗原活性的
外毒素(
?@C
)
%其作为超抗原可激活比普通抗原多达数
千倍的U
淋巴细胞%产生细胞介素*干扰素和肿瘤坏
死因子%从而达到抗肿瘤的作用(
A@*(
)
%在治疗自身免
疫性疾病*抗肿瘤等方面具有良好应用前景(
*D@*!
)
&因
此%
1=Y
蛋白的高效制备显得较为重要&
基于以上背景%本研究全基因合成1=Y
基因序
列%使之在大肠杆菌中得到高效表达%对1=Y
的纯
化方法进行了摸索%通过\89:8-.@X%$:
鉴定其抗原
性%并初步测试了1=Y
作为抗原应用于免疫层析快
速检测试纸开发研究的可行性&
%
!
材料和方法
%&%
!
材料
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒!参考'SYL
中的1=Y
基因序列#
O8.Y/.F
!
JNCB((!!&*
$%同时在基因序
列两端添加N=/
+
和(Zb
+
酶切位点%由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成基因并克隆至
W
=U((X
#
f
$载体中%得到W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒&
1=Y
纳米磁性免疫层析快速检测试纸条!本实
验室自行制备&
%&=
!
培养基
KY
培养基#
*K
$!分别称取蛋白胨*)
G
%酵母粉
B
G
%氯化钠*)
G
加水溶解后调节W
Z
值至?&)
%定
容到*K
#固体培养基中加入*&Bj
的琼脂$%
*(*m
高压灭菌*B54.
&
%&>
!
主要试剂
限制性内切酶N=/
+
*
(Zb
+
%低相对分子质量
标准蛋白均购自U/F/-/
生物公司'胰蛋白胨*酵母
提取物购自英国I34>8
公司'溶菌酶*
c'/98
+
购自
西安沃尔森生物技术公司'
LTUO
*
1c1
*丙烯酰胺和
甲叉丙烯酰胺购自J58-89<$
公司'脱氧胆酸钠*氯
化钠*磷酸二氢钠*磷酸二氢钾*氯化钾等其他试剂
均为国产分析纯&
小鼠抗1=Y
单克隆抗体SC"(()Q
%购自美国
Q8-4>4/.K4081<48.<8L.<
'山羊抗小鼠二抗%购自杭
州隆基生物技术有限责任公司'
=SK
发光试剂盒购
自上海史瑞克生物有限公司&
%&?
!
主要仪器设备
UOK
2
*"S
台式离心机%上海安亭科学仪器厂'
cK
2
"QS
大容量冷冻离心机%湖南湘仪仪器公司'
#I[U=P
2
(
涡旋仪%其林贝尔仪器公司'
TZ1
2
DS
型精密W
Z
计%上海雷磁仪器厂'
1ZZ
2
D
生化
培养箱%重庆四达实验仪器厂'恒温摇床%上海一恒
实验仪器厂'蛋白电泳仪%北京市六一仪器厂'
c=J=
高流速琼脂糖微球和'4
柱填料%西安保赛
生物科技公司'
J]UJ
纯化仪%
O=
公司&
%I@ 'LU
表达载体的构建及诱导表达
提取W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒%用N=/
+
和(Zb
+
进
行双酶切验证&同时%将W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒转
入感受态大肠杆菌YK(*
#
c=D
$%将在含J5
W
#
*))
)
G
"
5K
$的KY
平板上筛选到的阳性克隆命名为
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$%并送至上海生工生
物工程技术服务有限公司测序%以验证阳性克隆中
的1=Y
基因序列&
从平板中挑取W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$
单克隆%在含J5
W
#
*))
)
G
"
5K
$的KY
液体培养基
中D?m
摇床培养过夜%次日按*j
转接至新鲜的含
J5
W
#
*))
)
G
"
5K
$的KY
液体培养基中%
D?m
摇瓶
培养至J"))
为)&"
时%用终浓度为*55$%
"
K
的
LTUO
诱导!2
%
*()))-
"
54.
离心收集菌体%
*Bj
1c1@TJO=
检测1=Y
蛋白表达%以未诱导的含
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒的重组菌作为对照&
%IA 'LU
蛋白的纯化
将1=Y
发酵菌体用裂解缓冲液#
*)55$%
"
K
U-49
%
W
Z
值为C&)
$悬浮%加入溶菌酶! m
裂解()
54.
%再加入c'/98
*
Q
G
S%
(
及脱氧胆酸钠%充分搅拌
至不黏稠%
!m
*
*()))-
"
54.
离心%分别收集上清
和沉淀&
*Bj1c1@TJO=
检测1=Y
的表达形式&
菌体裂解上清液透析至上样缓冲液#
*)55$%
"
KTY1
%
W
Z
值为?&!
$中&过'4
柱亲和层析进行纯
化%用含)&(5$%
"
K
咪唑的上样缓冲液洗脱目的蛋
白%收集洗脱峰%目的蛋白透析至水中%
*Bj1c1@
TJO=
检测纯化结果&
透析后洗脱峰冻干后%溶解于上样缓冲液#
B
55$%
"
K'/S%
%
*)55$%
"
KU-49@ZS%
%
W
Z
值为C&B
$
中%过c=J=
柱进行二次纯化%上样后收集穿过峰%
透析至纯水中%
*Bj1c1@TJO=
检测纯化结果&
%IB
!
'LU
蛋白的鉴定
*&?&*
!
1=Y
的\89:8-.@X%$:
鉴定!
参照5分子克
隆实验指南6
(
*B
)
%蛋白样品经1c1@TJO=
后电转移
至'S
膜上进行\89:8-.X%$:
分析%一抗为小鼠抗
1=Y
单克隆抗体%二抗为Z[T
标记的山羊抗
兔L
G
O
&
*&?&(
!
免疫层析法鉴定!
将特异性检测1=Y
的试
纸条和1=Y
溶液平衡至室温%在样品垫上加入C)
(
*))
)
K
浓度为*
(
)&)*5
G
"
5K
的1=Y
溶液%同时
以)&)*5$%
"
K
%
W
Z
值为?&!
的TY1
溶液为阴性对
照%
*)
(
*B54.
后直接用肉眼观测条带颜色的深
!!
第"
期!!
张琨 等(金黄色葡萄球菌肠毒素Y
的原核表达+纯化及鉴定?*
!!!
浅%从而判断检测结果&
=
!
结果分析
=I%
!
'LU
表达质粒的鉴定
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒经N=/
+
和(Zb
+
双酶
切鉴定%在?*?X
W
处有明显条带%结果见图*
%大小
与预期相符&同时%测序结果也表明所合成的1=Y
基因序列与'SYL
上1=Y
的基因序列#
O8.Y/.F
!
JNCB((!!&*
$一致&
图%
!
M
LH==5
"
_
#
&'LU
质粒酶切鉴定
Q#
F
I%
!
9/2()#,(#"-3*
M
"+
M
LH==5
"
_
#
&'LU
Q&(B)X
W
@*c'J%/>>8-
'
*&
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
质粒'
(&
质粒W
=U((X
#
f
$
@1=Y
双酶切&
=I=
!
'LU
的诱导表达
与未诱导#图(
泳道*
$相比%经诱导的W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$#图(
泳道(
$在(A&)Fc
附
近有新生条带产生%大小与预期理论值基本相符&
Y/.>1</.B&)
分析表明%
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$目的蛋白占全菌总蛋白的"B&Cj
&
图=
!
表达产物的'O'&T4]L
分析
Q#
F
I=
!
'O'&T4]L
M
)"+#;/"+(G/
M
)/22/!)/,"35#-/!
M
)"(/#-
Q&(B)X
W
@*c'J%/>>8-
'
*&
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$
未诱导'
(&
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$诱导&
=I> 'LU
的纯化
目的蛋白在菌体裂解上清和沉淀中均有表达&
())55$%
"
5K
咪唑可以有效洗脱目的蛋白%洗脱的
1=Y
蛋白经Y/.>9</.B&)
扫描显示纯度为A)&*j
#图DY
泳道!
$&
c=J=
柱二次纯化后%
1c1@TJO=
分析显示在穿过峰中有单一的目的蛋白条带#图
!Y
%泳道(
$&收集穿过峰获得纯度为AB&(j
的目
的蛋白#
Y/.>9</.B&)
扫描$&
图> 'LU
的表达及<#
柱纯化结果
Q#
F
I> 'O'&T4]L
M
)"+#;/"+(G/'LU/J
M
)/22#"-*-!
M
.)#+#,*(#"-
J
!
'4
纯化层析图谱'
Y
!
'4
柱纯化结果&
Q&(B)X
W
@*c'J%/>>8-
'
*&
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$裂菌上清'
(&'4
柱纯化穿过峰'
D&*))55$%
"
K
咪唑洗脱峰'
!&())55$%
"
K
咪唑洗脱峰&
图? 'LU
的OL4L
纯化结果
Q#
F
I? 'O'&T4]L
M
)"+#;/"+(G/'LU
M
.)#+#,*(#"-
J&c=J=
纯化层析图谱'
Y&c=J=
柱纯化结果&
Q&(B)X
W
@*c'J%/>>8-
'
*&'4
柱纯化洗脱峰'
(&c=J=
纯化穿过峰'
D&())55$%
"
K'/S%
洗脱峰'
!&*5$%
"
K
'/S%
洗脱峰&
?(
!!!
陕西师范大学学报!自然科学版" 第!!
卷
=I?
!
'LU
的鉴定
(&!&*
!
\89:8-.@X%$:
鉴定!
\89:8-.X%$:
结果显
示%在相对分子质量(A&)Fc
附近检测到目的蛋白
#图!
泳道(
$%表明W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$
的诱导表达产物可特异地与小鼠抗1=Y
单克隆抗
体结合%而未诱导菌体的总蛋白则不能与小鼠抗
1=Y
单克隆抗体结合#图!
泳道*
$&结果表明%
W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$在YK(*
#
c=D
$宿主
菌中得到了有效表达&
(&!&(
!
免疫层析法鉴定!
将不同浓度的1=Y
蛋白
液滴加在本实验室制备的1=Y
纳米磁性免疫层析
快速检测试纸条结合垫处%
*B54.
后在U
线处出现
阳性条带%条带的深浅与1=Y
的浓度呈正相关%而
阴性对照在U
线处无条带出现#图B
$&
1=Y
检测试
纸是根据双抗夹心法原理制备的%样品垫上喷点有
表面偶联抗1=Y
单抗的顺磁微粒%
U
线固定有与
1=Y
特异性结合的另一种抗1=Y
单抗%
S
线固定有
能跟磁珠表面抗体特异结合的二抗&当含有1=Y
的溶液在层析作用下通过试纸条时%
1=Y
与磁珠结
合%并在U
线处与另一种抗1=Y
单抗结合%磁珠在
U
线处聚集而显色呈现阳性反应'但不含1=Y
的溶
液则不能在U
线处不显色%呈现为阴性反应%结果
见图"
&该检测法进一步证明1=Y
蛋白作为抗原能
图@ 'LU
的/̂2(/)-&5;"(
鉴定
Q#
F
I@ /̂2(/)-&5;"(*-*;
1
2#2"+(G/'LU
*&
未经诱导的W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$'
(&
诱导后的W
=U((X
#
f
$
@1=Y
"
YK(*
#
c=D
$&
图A
!
免疫层析试纸条检测结果
Q#
F
IA
!
HG/!/(/,(#"-)/2.;(2"+;*(/)*;+;"7(/2(
*&*5
G
"
5K1=Y
'
(&)&*5
G
"
5K1=Y
'
D&)&)*5
G
"
5K1=Y
'
!&
阴性对照&
够与小鼠抗1=Y
单克隆抗体特异性结合%可以用于
1=Y
试纸的制备研究&
>
!
讨论
获取1=Y
的传统方案主要是从产1=Y
的葡萄
球菌中分离纯化%这种方法需要大量培养菌体%且纯
化效率较低(
*"
)
&有研究采用基因工程的方法来克
服这些缺陷%如杨立泉等(
*?
)将1=Y
克隆至W
O=Q@
?d0
载体中进行表达%获得的1=Y
表达量为DD&Bj
'
宋云扬等(
*C
)在W
=U((X
#
f
$载体系统中对1=Y
进
行表达%表达量在D)j
左右&在本研究中我们实现
了1=Y
在原核表达系统中的高效表达%表达量为
"B&Cj
'本研究所表达的蛋白为融合蛋白%根据文献
报道融合蛋白能够在一定程度上降低1=Y
的毒性%
避免可能引起的毒性反应(
*A@()
)
&
已有多篇文献报道了1=Y
纯化方法%如张亮
等(
(*
)通过盐析*
1T
阳离子层析柱*金属鳌合层析
柱*
c=J=
阴离子四次柱层析纯化获得纯度A)j
以
上重组1=Y
蛋白'
M8
;
(
((
)等人采用羧甲基阳离子交
换纤维素SQ
2
D(
和葡聚糖凝胶O
2
?B
柱层析对
1=Y
进行纯化%获得纯度为A)&!j
的1=Y
蛋白'朱
俊友等(
(D
)采用羧甲基阳离子交换纤维素SQ
2
D(
和葡聚糖凝胶O
2
?B
柱两步层析也纯化出较纯的
1=Y
&本研究采用'4
柱亲和层析和c=J=
阴离子
层析柱两步纯化%获得了纯度为AB&(j
的1=Y
蛋
白%在精简了纯化步骤的同时提高了目的蛋白纯度&
\89:8-.@X%$:
鉴定表明%本研究纯化的1=Y
具
有良好的抗原性'利用本实验室制备的免疫层析试
纸对纯化1=Y
蛋白进行进一步验证%表明试纸条不
仅可检测到1=Y
蛋白%且检测结果呈浓度正相关
性&因此%本研究获得的1=Y
蛋白可应用于1=Y
免疫层析快速诊断产品的开发研究&
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结论
合成的1=Y
基因成功克隆至原核表达载体
W
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基因 与'SYL
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的 基 因 序 列 #
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阴离子层析两步纯化获得纯度为AB&(j
的1=Y
%
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和1=Y
免疫层析快速检测试
纸条检测显示所纯化的重组1=Y
具有1=Y
的抗原
!!
第"
期!!
张琨 等(金黄色葡萄球菌肠毒素Y
的原核表达+纯化及鉴定?D
!!!
性&本研究所纯化的1=Y
在食品中1=Y
快速检测
研究中具有一定的应用价值&
参考文献!
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金黄色葡萄球麓肠毒素基因与多器官
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