（株）ハイペップ研究所 〒602-8158 京都市上京区下立売通千本東入中務町486-46

TEL: 075-813-2101, FAX: 075-801-0280, E-mail: info@hipep.jp, URL: http://www.hipep.jp/

技術解説：ペプチド合成とDL分析について

ラセミ化とは

ハイペップ研究所のロゴはアミノ酸の分子が鏡に映っているところを示している。原子の並び方によって鏡像異性体ができる。図のように半透明の鏡扉に写っている分子を詳しく見るため、この扉を開き、分子認識を解明するのがハイペップ研究所の技術ノウハウである。

炭素原子には4つの結合手があるが、その4つの手に結合する原子がすべて異なる場合、その分子はキラリティ（不斉）を持つという。

キラリティを持つ分子は、右手と左手のように互いに鏡像である1対の立体異性体を持ち、これを鏡像異性体（エナンチオマー：Enantiomer、対掌体）と呼ぶ。対掌体は偏光面の回転方向を除けば全く同じ物理的・化学的性質を持っている。

立体異性体のうち、鏡像異性体でないものをジアステレオマーという。通常行われているHPLCによる標識試薬による分析は、ジアステレオマーの分離分析である。

鏡像異性体の関係にある分子は、一方をL体、もう一方をD体と呼び区別する。アミノ酸は天然ではL体であるが化学合成ではD体もできる。

化学合成の過程でL体、D体の等量混合物が生成されることをラセミ化という。

ペプチドの構成アミノ酸の一部がラセミ化すると、HPLC で完全に区別することはできない生物学的作用は構造に依存するため、D体・L体の定量分析は重要である

ペプチド含量、アミノ酸分析、エナンチオマーラベリング法ペプチドには付着水や酸あるいはNaなどの塩が共存している場合が多く、実際のペプチドの含有量を正確に知るには、質量

分析やシーケンサーでは不可能で、アミノ酸組成分析が不可欠である。エナンチオマーラベリング法（ELAB法）は、ペプ

チド、タンパク質中のSer, Thr, Trp, Tyrなども含めすべてのアミノ酸を正確に定量分析できる方法である。

本法は、醗酵生成物や食品の検定、加齢や疾病の解明研究のための生体組織・体液分析にも威力を発揮する。

開発から30年経って重要視されてきたDL分析の歴史1980年頃：ドイツでDL分析法の開発が始められる。ドイツから帰国したハイペップ研究所

の創業者はその後、島津製作所で自動DL分析装置を開発したが、なかなか広まらなかった

2000年頃：その後も軒原らは改良を続け、装置販売から受託分析に移行。当時盛んに行わ

れたコンビケムで使われる非天然アミノ酸にまで、当該分析法の適応範囲を拡張した

2010年頃：当該分析法はFDAのGLP／GMP承認を得た（バリデーション確立）さらに、同

一システムを用いて微量検体に残存する水分定量、有機溶媒・有機酸（残存TFA）の定量も

GLP/GMP承認を得たエナンチオマーラベリング法を用いた自

動の分析システム(2000)

アミノ酸組成、エナンチオマー分析法に関する基礎的論文／過去の資料

Frank, H, et al. Rapid gas chromatographic separation of amino acid enantiomers with a novel chiral stationary phase, J. Chromatogr. Sci., 15,174-176, 1977

Frank, H, et al. Enantiomer labeling, a method for the quantitative analysis of amino acids J. Chromatogr., 167,187-196, 1978

Gerhardt, J, et al. Automated Pre-Column Derivatization in Gas Chromatography Amino Acid Analysis via Enantiomer Labelling: An application of

Autoderivat 100, Chromatographia, 19, 251-253, 1984

Frank, H, et al. Quantitative Gas Chromatography Using a New Automated Derivatizer, J. High Resolution Chrom. & Chrom. Comm, 8, 411-414, 1985

Bayer, E, et al. Capillary Gas Chromatographic Analysis of Amino Acids by Enantiomer Labelling, J. Assoc. Off. Anal. Chem., 70, 234-240, 1987

軒原清史他, エナンチオマーラベリング法による新規のＤ／Ｌおよび定量アミノ酸分析システム,島津評論,48, 247-252, 1991

Nokihara, K, et al. Instrumentation and Applications of a Novel Amino Acid Analyzer, Frontiers and Horizons in Amino Acid Research, ed. K. Takai, Elsevier

Science Publishers BV, Amsterdam, The Netherlands, 391-395, 1992

Gerhardt, J, et al. Design and applications of a novel amino acid analyzer for D/L and quantitative analysis with the use of gas chromatography. In: Smith, JA

and Rivier, JE, editors. Peptides: Chemistry, Structure and Biology. Leiden: Escom Science Publishers BV p 531-532, 1992

Gerhardt, J and Nicholson, GJ. Unambiguous determination of the optical purity of peptides via GC-MS. In: Hodges, RS and Smith, JA, editors. Peptides:

Chemistry, Structure and Biology. Leiden: Escom Science Publishers BV, p 241-243, 1994

Schurig, V, et al. Gas-chromatographic enantiomer separation of proteinogenic amino acid derivatives: Comparison of Chirasil-Val and Chirasil-γ-Dex used as

chiral stationary phases. Enantiomer, 4,297-303, 1999

Nokihara, K., and Gerhardt, J., Development of an Improved Automated Gas-chromatographic Chiral Analysis System: Application to Non-natural Amino

Acids and Natural Protein Hydrolysates, Chirality, 13, 431-434, 2001

T002J

1/1

（株）ハイペップ研究所 〒602-8158 京都市上京区下立売通千本東入中務町486-46

TEL: 075-813-2101, FAX: 075-801-0280, E-mail: info@hipep.jp, URL: http://www.hipep.jp/ 2/2

エナンチオマーラベル法によるアミノ酸組成分析とキラル分析

ペプチド・タンパク質の構成ユニットはアミノ酸組成分析の

ためにペプチド結合を切断する

➡ 加水分解でバラバラにしたアミノ酸を分析する

アミノ酸の種類 Amino acid 1 , Amino acid 2

アミノ酸の比率

アミノ酸の絶対量 → ペプチド含量

Amino acid 1 Amino acid 2

ペプチド結合

一般の分析方法

(1) 酸加水分解 6N HCl, 110°C, 24 hrs (標準条件)(2) 検出、分析分離 → 誘導体化 → 検出 (ポストカラム誘導体化)誘導体化 → 分離 → 検出 (プレカラム誘導体化)誘導体化せずにそのまま分離*

問題点① 微量分析ではコンタミネーションが問題となる② Trp, Tyr, Ser, Thr, Met, Cys: 正確にでない③ Ile-Ile, Val-Val など加水分解されにくい配列

段階的誘導体化：Fully automated pre-column derivatization

エナンチオマーラベリング法（ELAB）

ペプチド化学合成

Proteins/Peptides

DNA

L-Amino Acid

ｍRNA

tRNA

各々の鏡像異性体（エマンチオマー）を内部標準にする

周辺機器：ハイスループットで確実な加水分解

Hydrolysis resistant 配列: Ile-Ile, Val-Val etc110°C 24 hrs110°C 48 hrs 外挿法で求める110°C 72 hrs

Standard: 110°C 24 hrs 空気遮断

加水分解の温度は高くても、低くてもラセミ化を起こし易い

*迅速加水分解法：Nokihara, K., Tominaga, Y., Kitagawa, A., Hirata,

A. and Kasama, T. Peptide Science 2015, The Japanese Peptide

Society, pp 69-72, 2016

※加水分解中にもラセミ化は起きる（配列特異的）※逆相HPLCではD/L体を完全に区別できない

セントラルドグマ

ラセマーゼ*

ラセミ体含有

配列特異的ラセミ化合成条件によりラセミ化後処理・精製中にラセミ化※アルカリ条件下で加熱すると容易にラセミ化

下手な合成

ラセミ体は活性が大きく低下することが有る

商品名：AHST-16

同時多種加水分解・誘導体化システム http://hipep.jp/?p=335

アミノ酸キラル分析受託サービス http://hipep.jp/?p=1127

HPLC single peakならOK?*真核生物はラセマーゼ

を持っていない。腸内細菌が産生する。

原料はOK ?ジェネリックペプチドの品質管理？

1st. Step: エステル化

2nd. Step: アセチル化

GCによる分離・定量

T002J