121

緒　　言

多血小板血漿（PRP）療法は，血小板の α顆粒に含まれる様々な増殖因子やサイトカインを，本人の自己血から濃縮採取して治療に用いるサイトカイン

原　　著 聖マリアンナ医科大学雑誌Vol. 42, pp. 121–128, 2014

多血小板血漿の臨床応用に向けての実用化の検討分取法・保存・輸送について

佐さ

藤とう

　有ゆ

里り

1, 2　　　村むら

川かわ

　史ふみ

高たか

1, 2　　　井いの

上うえ

　正まさ

範のり

1, 2　　　木き

苗なえ

　秀ひで

貴たか

2

斎さい

藤とう

　沙さ

織おり

3 　　　菅すが

谷や

　文ふみ

人と

3 　　　相あい

原はら

　正まさ

記き

3 　　　梶かじ

川かわ

　明あき

義よし

3

井いの

上うえ

　　肇はじめ

1, 2, 3

（受付：平成 26年 7月 24日）

抄　　録多血漿板血漿（Platelet Rich Plasma: PRP）は，歯科・整形外科などで利用されるが，形成外

科領域では美容医療に加え，難治性潰瘍と褥瘡に対する有効性が知られている。血小板は種々の成長因子を含有するが，これら有効成分を効率的に分取・保管・取り扱いする方法の標準的手技が確立されていない。そこで，今回，我々は血小板中の EGFを指標として，PRPの分取法や保管および最適な輸送法の検討を行った。1. double-spin 法で調製した PRP中の濃縮率は7.5±3.9倍（n＝30）であった。2. この PRPに含まれる EGF量は，2782.6±1103.3 pg/mlであった。3. PRPを –80℃，–20℃，4℃，25℃で一週間保管したところ，EGF量に大きな変動は見られなかった。4. 1回目の遠心分離後の血漿回収率は，24時間を越えると 25℃保存で急激に低下した。そのため，血液の輸送に関しては 4℃保存で 24時間以内が望ましいことが分かった。5. PPPへの血小板からの増殖因子の逸脱率は，4℃・気泡未混入の条件で，採血後 72時間までであれば，逸脱率 5％を超えないことが分かった。6. PRP中の EGF量は 4℃・気泡未混入の条件が，最も安定していた。これらの結果から，採血後に容器を脱気し，全血を 4℃（冷蔵）運搬して，24時間以内に PRPを調製することが望ましいと思われた。これらにより血液と PRP

の輸送システムを確立し，現在 PRPの医療応用を形成外科領域だけでなく，歯科・整形外科領域へと展開中である。

索引用語多血小板血漿，先進医療，EGF，ELISA

1　聖マリアンナ医科大学　形成外科学　幹細胞再生医学（Angfa寄附）講座

2　株式会社細胞応用技術研究所3　聖マリアンナ医科大学　形成外科学

カクテル療法と考えられている。したがって，例えばトラフェルミン（bFGF： basic Fibroblast Growth

Factor 製剤） よりも低濃度の含有量（1/1,000～1/10,000）であっても複数の増殖因子やサイトカインの生理学的相乗効果が期待出来る1）。実際，2004

年にMarxら2）が PRPの有用性を報告する以前から，難治性皮膚潰瘍3）や糖尿病性下肢潰瘍に対し多施設二重盲検の試み4）や静脈鬱滞性下腿潰瘍への治療の試み5）などが報告され，良い成果が得られている。本

7

122

8

佐藤有里　村川史高　ら

学・形成外科における症例では，ポケット状潰瘍やbFGF療法に抵抗性を示した糖尿病性神経障害による足指熱傷に PRPを適用したところ，各々治療開始100日後および 45日後に完全に上皮化したことが確認出来ている6）。当講座の千代倉ら7）は，PRPに含まれる様々な成長因子を測定するとともに，糖尿病性皮膚潰瘍患者に PRP療法を適用したところ，約 60

日で創閉鎖したことを報告している。PRPの作用機序については，1979年に Zetterら8）

が PRP 中の Vascular Endothelial Growth Factor

（VEGF）による血管新生の促進を報告している。渡部ら9）の報告でも PRPを 2％添加することで線維芽細胞やヒト血管内皮細胞のVEGFの遺伝子発現惹起を確認しただけでなく，Epidermal Growth Factor

（EGF），Platelet Derived Growth Factor （PDGF-

BB）などの遺伝子発現が亢進したと報告している。血管新生作用を有する VEGF，PDGF-BB およびEGFが創傷治癒に寄与したと考察している。一方で，血小板中の増殖因子含有量には個人差があり，血小板数に対する相関性は認められるものの，増殖因子同士（EGFと PDGF-BB （n＝10））の明確な相関性は現在のところ，得られていない6）。

EGFは，熱および酸に耐性の約 6kDaのポリペプチドである。in-vitroにおいては，上皮細胞の分化・増殖を促進させる作用をもち，Kimら10）は，EGFの創傷治癒への効果が， 抗炎症効果や Transforming

Growth Factor （TGF-�1） の発現抑制ならびにコラーゲン形成により誘導されることをマウス実験で報告している。また，潰瘍への EGFの効果と安全性に関する臨床試験11）や，カチオン化したハイドロゲル中に EGFを含浸させて Drug Derivery System （DDS）

化して徐放させ，角膜上皮の治癒を促進したとの報告もあり12），EGFは創傷治癒反応の初期に上皮化に寄与している因子の一つである。今回，我々は EGF

を指標として，PRPの調製に関わる標準化について，PRPの分取法や保管および最適な輸送法の検討を行った。

材料および方法

1.　PRPおよび血清試料の調製Table. 1に従って試料調製を行った。採取したクエン酸ナトリウム含有全血を，4℃或いは 25℃にて気泡含有条件， 気泡除去条件で回転震盪ローター（MACSmix, Miltenyi Biotec）にセットして，経時的（0，24，48，72時間毎）に PRPを調製した。

PRPは，渡部ら7）の方法に従い調製した。健常成人ボランティアより輸血用クエン酸ナトリウム注射液（扶桑薬品（株）・大阪・日本）を 10％含有する末梢血 20 mlを採取した。得られた末梢血は，double-

spin法により 1回目の遠心分離を 200 G，15分行った。血漿 / 赤血球界面に積層され，CD34＋前駆細胞を含む白血球層である buffy-coatを採らぬように血漿（浮遊血小板）層の下 2 mmを残して検体試料を採取した。2回目の遠心分離（1,200 G，15分）を行い，余剰の Platelet Poor Plasma （PPP; 乏血小板血漿）を除去することで，全血 20 mlに対して 10倍濃縮 PRP

を 2 ml調製した。フィブリン凝集塊の有無を確認し，慎重かつ丁寧に凝集塊を崩し，PRP調製液を均質化して，–80℃で測定まで保存した。血清は，抗凝固剤不添加で血液採取し，室温で 4時間以上放置後 1,594 G（＝3,000 rpm），10分間遠心分離し調製して，–80℃に保存した。

condition of whole blood

sample temprature air-filling into syringe

0 hour 24 hour 48 hour 72 hour

without anti-coagulant

serum 25 none none none none

with anti-coagulant

PRP 25

with anti-coagulant

PPP 25

4

PRP ; platelet rich plasma PPP ; platelet poor plasma

Table1.　Classifi cation of Experiment Group

123多血漿板血漿の臨床応用に向けての条件検討

2.　EGF測定Human EGF Quantikine ELISA Kit （R&D Co.,

Minneapolis, USA）を用いて常法に従って測定した。得られた結果は，KC4 Ver. 3.4 解析ソフト（DS

ファーマ（株）・大阪・日本）を用いて解析した。尚，本研究は本学倫理委員会第 1505号の承認の下に実施した。

結果および考察

1.　PRP中の EGF含有量本検討で組み入れた総被験者数 30例に対し，PRP

中の EGF は 2782.6±1106.3 pg/ml であった（Table2）。血清 EGF値から，濃縮率は 7.5±3.9倍と算出さ

れた。治療に有効な double-spin法による血小板濃縮率は，Marxら2）や覚道ら13）によるとそれぞれ 4–7

倍，7.9倍と報告されており，我々の PRP調製法とほぼ同様であった。double-spin法は，これまでの臨床検査による凝固試験法を準用したが，重力加速度は安定していた。したがって手技的にも再現性の高い方法であることが確認出来た。

2.　PRP保存条件における EGF含有量の変化保存環境が，その有効成分の安定性に大きく左右される。輸送過程での温度維持管理や治療延期といった事態が想定されるために，温度毎の PRP中のEGF

量が極端に減少しないかどうかを検証する必要があると考えた。そこで，本検討では Table.2の結果をもとに，採血後調製した被験者 2例の PRPを –80℃， –20℃， 4℃， 25℃で一週間静置し，EGFを定量した（Fig.1）。この結果から，一週間程度なら 25℃（室温）でもEGF 量がほとんど変動しないと考えられた。

以上の結果から，治療に際しては 4℃保存か或いは長期保存の場合は冷凍状態での保管が望ましいと考えられる。

3.　PRP回収率の経時変化の検討PRPを double - spin法により調製する場合，一回

目の遠心（200 G，15分）で赤血球と血小板を含む血漿成分が分離される。この分離容積が高い程，効率良く PRPを調製出来る。Fig.2（a）.に示したように，採血 24時間後までは，赤血球層と血漿層は明瞭な境界を形成して分離出来るが，48時間経過以降から境界層が不明瞭になった。72時間経過した 25℃保存試料は，4℃保存のものと比較して血漿成分量の顕著な減少が認められた（Fig.2グラフ並びに（c）-1）。赤血球数および平均サイズを自動計測器にて測定したところ平均サイズ（8.5–8.9 μm）は 48，72時間で変わらなかったものの，赤血球数に顕著な変化が認められた。 すなわち，4℃・ 気泡未混入で 1.8×

EGF ( pg / ml ) ( n = 30 )

PPP PRP whole blood (WB)concentrated rate

PRP / WB (twofold)number of platelets

in PRP (10 / μl)

39.8 ± 38.3 2782.6 ± 1106.3 475.2 ± 284.3 7.5 ± 3.9 134.3 ± 51.6

EGF ; epidermal growth factor PRP ; platelet rich plasma PPP ; platelet poor plasma

TTable 2. EGF Contents in PRPBlood taken from 30 normal adult volunteer was used for determination of EGF.

Table2.　Measurement of EGF Contents

118092174 2155

2477

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

-80 -20 4 25

EG

F(p

g/m

l)

Fig.1.　EGF contents in PRP after storing for 7 days at var-

ious temperatures.

After preparation of PRP, PPP, Serum, immediately stored at

each temperature through 1 week. Normal adult volunteer

（n＝2） were participated in this assay.

9

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10

佐藤有里　村川史高　ら

107/7.5 ml totalに対し，25℃・気泡混入ありは 1.74

×105/7.5 ml total（n＝1）と約 100分の 1に低下した。したがって，全血の長期保存後の PRP調製は好ましくない。特に搬送過程での全血中への気泡の混在は，溶血・凝集反応を惹起する可能性があり避けるべきと考えられた。以上の結果より，緊急時においては室温保存も可能であるが，血液の輸送に関しては気泡の入らない密栓条件で 24時間以内であることが望ましい。幸い，国内での宅配便は僻地以外では，基本的に 24時間以内に輸送が可能であるので，

輸送システムを考慮しても妥当であると考える。

4.　PRP調製時の血小板損傷に伴う PPPへの EGF

の逸脱率輸送後 PRPの品質について，血小板の破壊が経時

的に進行すると，PPPへの EGFの逸脱量も増加すると考えられる。そこで，血小板が完全破壊されたと考えられる血清中の EGF量を基準とし PPPへの逸脱率を算出した（Fig.3）。その結果，シリンジ内の気泡の有無に関わらず，

室温放置の試料の逸脱率が 24時間までに上昇した。

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

0 24 48 72

(PPP

+PR

P)/

WB×1

00(%

)

hour

25 air ( - )

25 air ( + )

4 air ( - )

4 air ( + )

(a). after centrifugation at (b)-1. 48 hr after blood taking

Fig.2.　Blood Deterioration.

After fi rst-spin at 200 G for 15 min on the conditions （a）–（c）, the volume of serum （PPP＋PRP） was measured as （PPP＋PRP） / whole blood （ml）×100 （％）（n＝3）.Photos are shown after respective fi rst-spin.

（a） Blood state after fi rst-spin at 200 G for 15 min.

Separation layer of red blood cells and plasma was plain.

（b）-1 Preparation sample stored for 48 hours, 25℃, air fi lling. The state of separation layer of red blood cells and plasma

became gradation.

（b）-2 Stored for 48 hours, 4℃ , air without fi lling. The state of separation layer of red blood cells and plasma became gra-

dation.

（c）-1 Preparation sample stored for 72 hours, 25℃ , air fi lling. Plasma volume was remarkably reduced.

（c）-2 Stored for 72 hours, 4℃ , air without fi lling. Though the state of separation layer was gradient, plasma volume was

maintained.

125多血漿板血漿の臨床応用に向けての条件検討

一方，4℃・気泡未混入の条件で逸脱率が 5％を超えることなく，品質が保持された。血小板製剤の消費期限は，調製後 4日間は使用可能であるとされている。また，低温保存では寒冷刺激により血小板が活性化し，非可逆的形態変化を起こして止血効果が低下することが報告されている14）。しかしながら，PRP

に関しては機能的な増殖因子が高濃度に濃縮された試料の調製が必須命題となる。そのため，5％逸脱率を超えない PRPを品質保証の目安とすれば，逆説的であるが 95％ PRP中に増殖因子が保持されていると考えられ，4℃・気泡未混入の条件での血液の輸送が最適であることが判明した。また，この条件ならば 24時間以内の宅配便の

輸送でなくても，ある程度品質が担保されるため僻地対応も可能と考えられる。

5.　PRP内 EGF含量の変化Fig.4 では更に 3 例の被験者について PRP 内の

EGF含量の経時変化を検討した。室温（25℃）・気泡混入条件で，回転震盪した試料の EGF量は直線的に増加していき，0時間では 3416±1677 pg/mlであった含有量が 72時間後には 6428±1426 pg/mlとなった。25℃・気泡未混入の状況でも似たような傾向が認められた。それに対し，4℃で回転震盪した試料は，特に気泡未混入の試料では，採血直後に調製したPRP中のEGF量とほぼ同等の値を示した（72

(2). case of normal adult volunteer (B) (1). case of normal adult volunteer (A)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 24 48 72

EGF

conten

tsin

PPP/Se

rum

(%)

hour

25 air (-)

25 air (+)

4 air (-)

4 air (+)

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0 24 48 72

EGFco

nten

tsin

PPP/Se

rum

(%)

hour

25 air (-)

25 air (+)

4 air (-)

4 air (+)

Fig.3.　Deviating rate of EGF to PPP due to deterioration of blood.

Deviating rate of EGF contents （pg / ml） to PPP was calculated as PPP / Serum×100 （％）.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

0 24 48 72

EGFconten

tsinPR

P(p

g/ml)

hour

25 air (-)

25 air (+)

air (-)

air (+)

Fig.4.　Deterioration assessment by measuring amount of EGF in PRP

Blood taken from adult normal volunteer （n＝3）. EGF contents in PRP

was measured at each parameter. temperature ; 4℃, 25℃ air-fi lling; （＋）, （－） time course during blood storage; 0, 24, 48, 72 hours before prepara-

tion of PRP and PPP.

11

126

12

佐藤有里　村川史高　ら

時間で 2963±1185 pg/ml）。おそらく，長時間の室温での保存で，血小板の劣化・破壊が起こり，血小板の膜内に留まっていたEGFがより多く放出されたと考えられる。EGFは，比較的熱や酸に耐性であるが，その他の成長因子は，血小板の α顆粒中に存在する Lysosomal顆粒などの消化酵素が室温以上の温度で長時間放置されることにより活性化され，分解される可能性も考えられる。このことからも，血液に関しては 4℃での輸送が望ましいと考える。

6.　輸送システムの確立PRPの研究において，各種の報告で見解のバラツキが散見される。これは PRPの調製に，一定の技術を要するからと考えられる。技術が標準化され，更には，輸送を含めた効率的なシステムを有することが好ましいと思われた。そこで，PRPを調製するための搬送システムも視野に入れて，全血および PRP

の輸送について考案した。輸送システムの一環として，Fig.5に示す採血キットを採血前日までに送付している。基本は 6点で，20–50 mlのシリンジ・ルアーキャップ・18G針・21G翼状針・70％イソプロパノール含浸不織布・抗凝固剤である。日本郵政チルド便（0–10℃保存）で輸送されてきた血液は，聖マリアンナ医科大学の形成外科学に設置されたクリーンルーム内に搬入され，PRPを無菌的に調製する。PRP調製時の残渣で，作業工程での品質保証（無菌性）を担保するために，一般細菌検査を実施し，陰性を適格基準としている。一旦，–80℃で保存したPRP を必要に応じて佐川急便株式会社で冷凍（–18℃）宅配便輸送する。輸送に用いる器材の一例を示す（Fig.5，右図）。現在，厚生労働省は，保険診療としては認めてい

ないものの，一定の条件を満たす技術を評価療養として，PRP療法を先進医療として承認している。保健収載以外の医療費は自己負担となるが，2004年より保険診療との併用が認められて以来，日本国内でも徐々に普及の兆しを見せている。多血小板血漿も難治性皮膚潰瘍への適応を第二項先進医療技術（暫定先進医療 A）65種類，828件のうちの一つとして，2011年 9月に聖マリアンナ医科大学（（先 200）第 1号）と 2012年以降，医療法人財団松圓会東葛クリニック病院が，厚生労働省に認可された1）。現在，先進医療 A項に規定される当該難治性皮膚潰瘍の治療においては，陰圧閉鎖療法（Vaccum As-

sisted Closure: VAC）や bFGF療法に抵抗する創部に，PRP療法を施行し，創部の上皮化のみならず，下肢切断の回避を認めた症例を多数経験している6）, 7）。これらの実績に伴い，PRP療法に関心を寄せる提携病院数も増加している。簡便で迅速な調製が可能で，かつ様々な増殖因子やサイトカインを含有する PRPの医療応用の可能性は大きい。現在，形成外科領域に留まらず，歯科領域・整形外科領域へとさらに展開中である。

結　　論

1.　double-spin 法により調製した 30例の PRP中のEGF量は，2782.6±1103.3 pg/mlであり，7.5±3.9

倍濃縮された。2.　25℃で PRPを一週間保存しても EGF量にほとんど変動は見られなかった。3.　血液採取から PRP 調製までの時間について，PRPの調製効率の結果から，血液の輸送に関しては4℃保存で 24時間以内が望ましいことが分かった。4.　血液採取から 72時間までに PRP調製した試料

Fig.5.　Blood taking kit and transportation box

127多血漿板血漿の臨床応用に向けての条件検討

の PPP中への EGF逸脱率は，4℃・気泡除去の条件では，逸脱率 5％を超えなかった。5.　PRP 中の EGF 量を経時的に測定したところ，4℃・気泡除去の条件で，最も血液の劣化が低い値を示した。6.　採血後の全血の搬送は，専用容器にて冷蔵（0–

10℃）宅配便で輸送し，調製したPRPは冷凍（–18℃）輸送にて提携先に搬送するシステムが望ましいと考えられた。

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13

128

14

佐藤有里　村川史高　ら

Abstract

Examination of Practical Use for Clinical Application of

Platelet Rich Plasma （PRP）

Yuri Satoh1, 2, Fumitaka Murakawa1, 2, Masanori Inoue1, 2,Hidetaka Kinae2, Saori Saitou3, Fumito Sugaya3,

Masaki Aihara3, Akiyoshi Kajikawa3, and Hajime Inoue1, 2, 3

Platelet rich plasma （PRP） is useful and effective materials in the fi eld of Plastic Reconstructive Sugery. Concentrated platelets （obtained by double-spin method, defi ned as PRP） involves many growth factors, such as Epidermal Growth Factor （EGF）, Platelet Derived Growth Factor （PDGF）, VEGF （Vascular Endothelial Growth Factor） and so on. These cytokine cocktails orkestrate to promote wound healing and epitelialization which in intractable ulcer and bedsore is known as one of the clinical effectiveness of the plastic surgery area. Although PRP therapy is effective, standardization for PRP preparation, storage and transport with medical institution has not been established. We have evaluated these conditions as an index of EGF content in the plate-lets.

We noted the following results:1.　The amount of EGF in PRP from 30 people and obtained by the double-spin method was 2782.6±1103.3 pg/ml.2.　The concentration rate was 7.5±3.9 times against serum that thought to have destroyed platelet completely.3.　When PRP was stored for one week at –80℃, –20℃, 4℃, and 25℃, we saw remarkable little decrease in the amount of EGF, even in the sample stored at 25℃.4.　The percentage of the plasma content decreased over 24 hours. Therefore, it is preferable that whole blood samples for PRP therapy are transported to a hospital within 24 hours.5.　The deviating rate of EGF was less than 5％ when PRP was stored at 4℃ within 72 hours of blood draw, and with no air in the blood on.

These results indicate that it is best to store whole blood at 4℃ without air fi lling the syringe. The applica-tion of the medical treatment of PRP is being developed with not only plastic surgery but also with the odontol-ogy department and the orthopedics department.

1 Division of Regenerative Medicine （Endowed Chair by ANGFA Co.）, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, St. Marianna University School of Medicine.

2 Laboratory of Cell Applied Techinologies, Co., Ltd.3 Department of Plastic & Reconstructive Surgery, St. Marianna University School of Medicine.