eesti vabariik · eesti vabariik (11) ee-ep 1 957 106 b2 patendiamet (12) eestis kehtiva euroopa...
TRANSCRIPT
EE
-EP
1 9
57 1
06 B
2
(51) Int. Cl.
C07K 16/26 (2006.01)
A61P 25/00 (2006.01)
EESTI VABARIIK (11) EE-EP 1 957 106 B2
PATENDIAMET
(12) EESTIS KEHTIVA EUROOPA PATENDIPATENDIKIRJELDUSE TÕLGE
(10) Registreeringu number: E008957
(11) Patendikirjelduse tõlke
number: EE-EP 1 957 106 B2
(30) Prioriteediandmed: 14.11.2005 US 736623 P
(96) Euroopa patenditaotluse
esitamise kuupäev: 02.11.2006
(96) Euroopa patendi-
taotluse number: 06809207.1
(97) Euroopa patendi väljaand-
misest teatamise kuupäev: 24.07.2019
(97) Euroopa patendi number: EP 1 957 106 B2
Patendikirjelduse tõlke
esitamise kuupäev: 11.09.2019
Patendikirjelduse tõlke
avalikustamise kuupäev: 15.10.2019
(73) Patendiomanik:
Teva Pharmaceuticals International GmbH Schlüsselstrasse 12,8645 Jona, CH
(72) Leiutise autorid:
ZELLER, Joerg Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US
POULSEN, Kristian Todd Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US
ABDICHE, Yasmina Noubia Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US
PONS, Jaume Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US
COLLIER, Sierra Jones Rinat Neuroscience Corp., 230 East Grand Avenue, South San Francisco, California 94080, US
ROSENTHAL, Arnon 150 Normandy Lane, Woodside, California 94062, US
(74) Patendivolinik:
Lembit Mitt AAA Patendibüroo OÜTartu mnt 16, 10117 Tallinn, EE
(54) Kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi vastane antagonist-antikeha ja meetodid selle kasutamiseks
EE-EP 1 957 106 B2
*EE-EP1957106B1*
EE-EP 1 957 106 B2
Leiutise valdkond
[0001] Käesolev leiutis on seotud kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi (CGRP) vastaste
antagonist-antikehade kasutamisega vasomotoorsete sümptomite, nagu näiteks CGRPga
seotud peavalude (näiteks migreeni) ja kuumahoogude ennetamiseks, leevendamiseks või 5
ravimiseks.
Leiutise taust
[0002] GGRP (calcitonin gene-related peptide – kaltsitoniini geeniga seotud peptiid) on 37 10
aminohappe pikkune neuropeptiid, mis kuulub peptiidide perekonda, kuhu kuuluvad
kaltsitoniin, adrenomedulliin ja amüliin. Inimestel esineb kahte CGRP vormi (α-CGRP ja
β-CGRP) ning neil on sarnased toimed. Nad erinevad kolme aminohappe poolest ja on
diferentsiaalselt jaotunud. Diferentsiaalseid toimeid võivad selgitada ka vähemalt kaks
CGRP retseptori alamtüüpi. CGRP on kesknärvisüsteemi neurotransmitter ning see on 15
näidatud olevat tugev perifeerne vasodilaator, kuna CGRPd sisaldavad neuronid on seal
veresoontega tihedalt seotud. CGRP-vahendatud vasodilatatsiooni seostatakse ka
neurogeense põletikuga osana sündmuste jadast, mille tagajärjeks on plasma
ekstravasatsioon (veresoonest väljumine) ja mikrovaskulatuuri vasodilatsioon (veresoonte
laienemine) ning seda esineb migreeni korral. 20
[0003] CGRPd on nimetatud seoses selle võimaliku seotusega vasomotoorsete
sümptomitega (Wyon et al., Scand. J. Urol. Nephrol. 35: 92–96 (2001); Wyon et al.,
Menopause 7(1):25–30 (2000)). Vasomotoorsed sümptomid (VMS), nagu näiteks
kuumahood või öine higistamine on kõige tavalisemad sümptomid, mida seostatakse 25
menopausiga ning mida esineb 60% kuni 80% kõikidest naistest pärast loomulikku või
kirurgiliselt esilekutsutud menopausi. Kuumahood on tõenäoliselt kesknärvisüsteemi
kohanemisreaktsioon suguhormoonide vähenemisele (Freedman, Am. J. Human Biol.
13:453–464 (2001)). Siiamaani on kõige tõhusam ravi kuumahoogude korral hormoonidel
baseeruvad ravimid, sealhulgas östrogeenid ja/või osad progestiinid. Hormonaalsed ravimid 30
võivad olla kuumahoogude leevendamisel tõhusad, kuid need ei sobi kõikidele naistele.
Arvatakse, et täheldatud psühholoogilisi ja emotsionaalseid sümptomeid, nagu näiteks
närvilisust, väsimust, ärrituvust, unetust, depressiooni, mälukaotust, peavalu, ärevust,
2 EE-EP 1 957 106 B2
närvilisust või keskendumisvõimetust põhjustab kuumahoogudele ja öistele higistamistele
järgnev magamatus (Kramer et al., allikas Murphy et al., 3.sup.rd Int'l Symposium on Recent
Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Pariis,
Prantsusmaa: SCI: 3–7 (1992)).
5
[0004] Ka mehed kogevad steroidhormooni (androgeeni) taseme langedes kuumahoogusid.
See kehtib nii vanusega seotud androgeeni vähenemise korral (Katovich, et al., Proceedings
of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129–35) kui ka
hormoonide taseme ekstreemse languse juhtudel, mis on seotud eesnäärmevähi raviga
(Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47–54). Tervelt 10
kolmandik nendest patsientidest kogeb pidevaid ja sagedasi sümptomeid, mis on piisavalt
tugevad, et põhjustada märkimisväärseid vaevusi ja ebamugavust.
[0005] CGRP on tugev vasodilaator, mille puhul on näidatud, et see on seotud muude
vasomotoorsete sümptomite patoloogiaga, nagu näiteks kõikide vaskulaarse peavalu 15
vormidega, sealhulgas migreenide (auraga või ilma) ja kobarpeavaluga. Durham, N. Engl.
J. Med. 350:1073–1075, 2004. CGRP seerumi tasemed on migreeni peavalu korral
patsientide välimises kägiveenis suurenenud. Goadsby et al., Ann. Neurol. 28:183–7, 1990.
Inimese α-CGRP intravenoosne manustamine aurata migreeni all kannatavatele
patsientidele kutsus esile peavalu ja migreeni, mis osutab asjaolule, et CGRP põhjustab 20
migreeni. Lassen et al., Cephalalgia 22:54–61, 2002.
[0006] CGRP võimalikku seost migreeniga on kasutatud alusena mitmete ühendite
arendamiseks ja katsetamiseks, mis inhibeerivad CGRP vabanemist (näiteks sumatriptaan),
antagoniseerivad CGRP retseptori asukohas (näiteks dipeptiidi derivaat BIBN4096BS 25
(Boerhringer Ingelheim); CGRP(8–37)) või toimivad vastastikku ühe või mitme
retseptoriga seotud valguga, nagu näiteks retseptori aktiivsusega seotud membraanivalgu
(receptor activity membrane protein, RAMP) või retseptori komponentvalguga (receptor
component protein, RCP), millest mõlemad mõjutavad CGRP seondumist selle
retseptoritega. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51–53, 2002. Alfa-30
2 adrenoretseptori alamtüübid ja adenosiin A1 retseptorid kontrollivad (inhibeerivad)
samuti CGRP vabanemist ja trigeminaalset aktiveerimist (Goadsby et al., Brain 125:1392–
401, 2002). Adenosiini A1 retseptori agonistil GR79236 (metrafadiil), mis on näidatud
3 EE-EP 1 957 106 B2
inimestel inhibeerivat neurogeense vasodilatsiooni ja trigeminaalse notsitseptsiooni, võib
olla ka migreenivastane toime (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082–1090, 2005; Giffin
et al., Cephalalgia 23:287–292, 2003.)
[0007] Selle teooria puhul tekitab segadust tähelepanek, et ravi ühenditega, mis üksnes 5
inhibeerivad neurogeenset põletikku (näiteks tahhükiniini NK1 retseptori antagonistid) või
trigeminaalset aktiveerimist (näiteks 5HT1D retseptori agonistid), on migreeni korral
osutunud akuutse ravimina suhteliselt ebatõhusaks, mis tekitab osadel uurijatel kahtlusi
seoses sellega, kas CGRP vabanemise inhibeerimine on tõhusa migreenivastase ravi
peamine toimemehhanism. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol. 500:315–330, 2004. 10
[0008] Migreen on kompleksne ja sagedane neuroloogiline haigusseisund, mida
iseloomustavad tugevad, episoodilised peavaluhood ja nendega kaasnevad sümptomid,
mille hulka võivad kuuluda iiveldus, oksendamine, tundlikkus valguse, hääle või liikumise
suhtes. Osadel patsientidel esineb enne peavalu või kaasneb sellega aura. Peavalu võib olla 15
tugev ning see võib teatud patsientide puhul olla ühepoolne.
[0009] Migreenihood häirivad igapäevaelu. USAs ja Euroopa on migreeni all kannatavate
inimeste üldine osakaal üldisest elanikkonnast 11% (6% meestest ja 15-18% naistest).
Indiviididel esinevate hoogude keskmine sagedus on 1,5 hoogu kuus. Kuigi sümptomite 20
leevendamiseks või vähendamiseks on olemas terve hulk ravimeid, soovitatakse nendele
patsientidele, kellel on rohkem kui 3–4 migreenihoogu kuus, ennetava ravi kasutamist.
Goadsby et al., New Engl. J. Med. 346(4): 257–275, 2002.
[0010] Migreeni ravimiseks kasutatud farmakoloogiliste sekkumisvahendite mitmekesisus 25
ja patsientide erinevad reaktsioonid nendele vahenditele on selle häire mitmekülgse olemuse
tõestuseks. Sellest tulenevalt on migreeni ravimiseks juba üle kaheksakümne aasta
kasutatud selliseid suhteliselt mitteselektiivseid ravimeid nagu ergotalkaloide (näiteks
ergotamiin, dihüdroergotamiin, metüsergiid), millel on nii serotonergiline kui ka
adrenergiline, noradrenergiline ja dopaminergiline toime. Muude ravimite hulka kuuluvad 30
opiaadid (näiteks oksükodoon) ja β-adrenergilised antagonistid (näiteks propranolool).
Osad patsiendid, kellel on tavaliselt leebemad sümptomid, suudavad oma sümptomeid
kontrolli all hoida käsimüügiravimitega, nagu näiteks ühe või mitme mittesteroidse
4 EE-EP 1 957 106 B2
põletikuvastase toimeainega (NSAIDid), nagu näiteks aspiriini, atsetaminofeeni ja kofeiini
kombinatsiooniga (näiteks Excedrin® Migraine).
[0011] Hiljem raviti osasid migreeni all kannatavaid patsiente topiramaadiga –
antikonvulsandiga, mis blokeerib elektripingest sõltuvaid naatriumikanaleid ja teatavaid 5
glutamaadi retseptoreid (AMPA-kainaat), võimendab GABA-A retseptori toimet ja
blokeerib süsiniku anhüdraasi. Serotoniin 5HT-1B/1D ja/või 5HT-1a retseptori agonistide,
nagu näiteks sumatriptaani hiljutise suhtelise edukuse tagajärjel osade patsientide puhul on
teadlased välja pakkunud selle häire serotonergilise etioloogia. Kahjuks on aga nii, et kuigi
osad patsiendid reageerivad sellele ravile hästi, siis teised on selle suhtes jällegi suhteliselt 10
resistentsed.
[0012] Samuti on väidetud, et seda häiret põhjustab ioonkanali väärtalitlus amiinergilistes
ajutüve tuumades, kuid migreeni patofüsioloogiast ei saada veel päris hästi aru. Üks
migreeni vorm, perekondlik – hemipleegiline migreen – on näidanud seotust missenss--15
mutatsiooniga P/Q-tüübi pingest sõltuva kaltsiumikanali α1 alamüksuses ning seetõttu
peetakse tõenäoliseks, et teisi ioonkanali mutatsioone leidub ka teistes patsientide
populatsioonides. Samal ajal kui veresoonte dilatatsioon seotud migreeni valusümptomitega
ja halvendab neid, siis praegu arvatakse, et sellised neurovaskulaarsed juhud on pigem selle
haigusseisundi tagajärjed kui põhjustajad. Üldiselt peetakse meelte sisendit moduleerivate 20
ajutüve kanalite väärtalitlust migreeni ühendavaks omaduseks. Goadsby, P.J. et al., New
Engl. J. Med. 346(4): 257–275, 2002.
Leiutise lühikokkuvõte
25
[0013] Siin avalikustatud leiutis puudutab CGRP-vastaseid antagonistlikke antikehasid
kasutamiseks meetodis, millega ravitakse või hoitakse ära peavalu, nagu auraga või aurata
migreen, hemipleegiline migreen, kobarpeavalu, migreenne neuralgia, krooniline peavalu,
pingepeavalu ja muudest tervislikest seisunditest (nagu nakkused või kasvajast tingitud rõhu
suurenemine koljus) tingitud peavalu. 30
[0014] Vastavalt käesolevale leiutisele pakutakse CGRP-vastast antagonist-antikeha, mis
on inimese antikeha või humaniseeritud antikeha, mille seondumisafiinsus (KD) inimese
5 EE-EP 1 957 106 B2
α-CGRP suhtes on 50 nM või väiksem vastavalt pinna plasmonresonantsiga 37 °C juures
mõõdetule, kasutamiseks meetodis indiviidil peavalu (näiteks migreeni ja kobarpeavalu)
ravimiseks või ennetamiseks, mis hõlmab nimetatud indiviidile efektiivses koguses
leiutisekohase CGRP-vastase antagonist-antikeha manustamist.
5
[0015] Mõnes teostustes seob CGRP-vastane antagonistlik antikeha inimese α-CGRP-d ja
β-CGRP-d. Mõnes teostustes seob CGRP-vastane antagonistlik antikeha inimese ja roti
CGRP-d. Mõnes teostustes seob CGRP-vastane antagonistlik antikeha C-terminaalset
epitoopi CGRP aminohapete 25–37 ulatuses.
10
[0016] Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha monoklonaalne antikeha.
Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha humaniseeritud antikeha. Osades
teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese antikeha. Osades teostustes on
CGRP-vastane antagonist-antikeha antikeha G1 (vastavalt siin kirjeldatule). Osades
teostustes sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha tabelis 6 välja toodud antikeha G1 15
või G1 variantide ühte või mitut CDRi (nagu näiteks ühte, kahte, kolme, nelja, viit või
osades teostustes kõiki kuut CDRi). Veel osades teistes teostustes sisaldab CGRP-vastane
antagonist-antikeha joonisel FIG 5 kujutatud raske ahela varieeruva piirkonna
aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 1) ja joonisel FIG 5 kujutatud kerge ahela varieeruva
piirkonna aminohappejärjestust (SEQ ID NO: 2). 20
[0017] Osades teostustes sisaldab antikeha modifitseeritud konstantset piirkonda, nagu
näiteks konstantset piirkonda, mis on immunoloogiliselt inertne (sealhulgas osaliselt
immunoloogiliselt inertne), näiteks ei käivita see komplemendi vahendatud lüüsi, ei
stimuleeri antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (antibody-dependent cell mediated 25
cytotoxity, ADCC), ei aktiveeri mikrogliiat või see vähendab ühte või mitut nendest
toimetest. Osades teostustes on konstantset piirkonda modifitseeritud viisil, mida on
kirjeldatud allikates Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624; PCT patenditaotlus nr
PCT/GB99/01441; ja/või Ühendkuningriigi patenditaotluses nr 9809951.8. Teistes
teostustes sisaldab antikeha inimese raske ahela IgG2 konstantset piirkonda, mis sisaldab 30
alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 on muudetud S330S331-ks (aminohapete loend
viitega looduslikule IgG2 järjestusele). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624. Osades
teostustes on antikeha raske ahela pidev piirkond inimese raske ahel IgG1, mis sisaldab mis
6 EE-EP 1 957 106 B2
tahes alljärgnevaid mutatsioone: 1) A327A330P331 on muudetud G327S330S331-ks; 2)
E233L234L235G236 on muudetud P233V234A235-ks, kus G236 on deleteeritud; 3)
E233L234L235 on muudetud P233V234A235-ks; 4) E233L234L235G236A327A330P331
on muudetud P233V234A235G327S330S331-ks, kus G236 on deleteeritud; 5)
E233L234L235A327A330P331 on muudetud P233V234A235G327S330S331-ks; ja 6) 5
N297 on muudetud A297-ks või mis tahes muuks aminohappeks, v.a N. Osades teostustes
on antikeha raske ahela pidev piirkond inimese raske ahel IgG4, mis sisaldab mis tahes
alljärgnevaid mutatsioone: E233F234L235G236 on muudetud P233V234A235-ks, kus
G236 on deleteeritud; E233F234L235 on muudetud P233V234A235-ks; ja S228L235 on
muudetud P228E235-ks. 10
[0018] Veel mõnes teises teostuses aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud
glükosüleerimise jaoks. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud
glükosüleerimise jaoks oligosahhariidi kinnitumise jäägi (nagu näiteks Asn297) ja/või
flankeerivate jääkide muteerimise teel, mis on N-glükosüleerimist ära tundva järjestuse osa 15
konstantses piirkonnas. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud
glükosüleerimise jaoks. Konstantset piirkonda võib aglükosüleerida N-seotud
glükosüleerimise jaoks ensümaatiliselt või ekspresseerimise kaudu glükosüleerimise
puudulikkusega peremeesrakus.
20
[0019] CGRP-vastase antagonistliku antikeha sidumisafiinsus (KD) inimese α-CGRP suhtes
mõõdetuna pinnaplasmonresonantsiga temperatuuril 37 °C on 50 nM või väiksem.
[0020] CGRP-vastast antagonist-antikeha võib manustada enne ja/või pärast peavalu ja/või
selle ajal. Osades teostustes manustatakse CGRP-vastast antagonist-antikeha enne 25
peavaluhoogu (näiteks enne migreeni või kobarpeavalu). CGRP-vastast antagonist-antikeha
või manustada mis tahes tehnika tasemes tuntud viisil, sealhulgas suukaudselt,
intravenoosselt, subkutaanselt, intraarteriaalselt, intramuskulaarselt, intrakardiaalselt,
intraspinaalselt, rindmikusiseselt, intraperitoneaalselt, intraventikulaarselt, sublinguaalselt,
transdermaalselt ja/või inhalatsiooni teel. Manustamine võib olla süsteemne, näiteks 30
intravenoosselt, või paikne.
7 EE-EP 1 957 106 B2
[0021] Osades teostustes võib CGRP-vastast antagonist-antikeha manustada koos mõne
muu toimeainega, nagu näiteks mõne muu peavalu ravimiseks mõeldud toimeainega.
[0022] Käesolevas leiutises võib kasutada antikehast G1 või selle variantidest tuletatud
CGRP-vastaseid antagonist-antikehasid ja polüpeptiide, mis on välja toodud tabelis 6. 5
Sellest tulenevalt on käesolev leiutis ühes aspektis antikeha G1 (samatähenduslik mõiste
„G1”), mis on toodetud ekspressioonivektoritest, mis kannavad ATCC
deponeerimisnumbrit PTA-6866 ja PTA-6867. Näiteks ühes teostuses on antikeha, mis
sisaldab rasket ahelat, toodetud ekspressioonivektoriga, mis kannab ATCC
deponeerimisnumbrit PTA-6867. Veel ühes edasises teostuses on antikeha, mis sisaldab 10
kerget ahelat, toodetud ekspressioonivektoriga, mis kannab ATCC deponeerimisnumbrit
PTA-6866. G1 raske ahela ja kerge ahela varieeruvate piirkondade aminohappejärjestused
on välja toodud joonisel FIG 5. Antikeha G1 komplementaarsust määrava piirkonna
(complementarity determining region, CDR) osad (sealhulgas Chothia ja Kabati CDRid) on
samuti välja toodud joonisel FIG 5. Siinkohal tuleb aru saada, et viide G1 mis tahes osale 15
või kogu piirkonnale hõlmab järjestusi, mis on toodetud ekspressioonivektoritega, mis
kannavad ATCC deponeerimisnumbreid PTA-6866 ja PTA-6867, ja/või joonisel FIG 5
kujutatud järjestusi. Käesolevas leiutises võib kasutada G1 antikeha variante
aminohappejärjestustega, mida on kujutatud tabelis 6.
20
[0023] Ühes aspektis kasutab käesolev leiutis antikeha, mis sisaldab VH domeeni, mis on
vähemalt 85%, vähemalt 86%, vähemalt 87%, vähemalt 88%, vähemalt 89%, vähemalt
90%, vähemalt 91 %, vähemalt 92%, vähemalt 93%, vähemalt 94%, vähemalt 95%,
vähemalt 96%, vähemalt 97% vähemalt 98%, vähemalt 99% või 100% ulatuses identne
aminohappejärjestusega SEQ ID NO: 1. 25
[0024] Veel ühes aspektis kasutab käesolev leiutis antikeha, mis sisaldab VL domeeni, mis
on vähemalt 85%, vähemalt 86%, vähemalt 87%, vähemalt 88%, vähemalt 89%, vähemalt
90%, vähemalt 91 %, vähemalt 92%, vähemalt 93%, vähemalt 94%, vähemalt 95%,
vähemalt 96%, vähemalt 97% vähemalt 98%, vähemalt 99% või 100% ulatuses identne 30
aminohappejärjestusega SEQ ID NO: 2.
8 EE-EP 1 957 106 B2
[0025] Veel ühes aspektis kasutab käesolev leiutis antikeha, mis sisaldab antikeha G1 või
selle tabelis 6 välja toodud variantide fragmenti või piirkonda. Ühes teostuses on selliseks
fragmendiks antikeha G1 kerge ahel. Veel ühes teostuses on selliseks fragmendiks antikeha
G1 raske ahel. Veel ühes teostuses sisaldab selline fragment ühte või mitut varieeruvat
piirkonda antikeha G1 kergest ahelast ja/või raskest ahelast. Veel ühes teostuses sisaldab 5
selline fragment ühte või mitut varieeruvat piirkonda joonisel FIG 5 välja toodud kergest
ahelast ja/või raskest ahelast. Veel ühes teostuses sisaldab selline fragment ühte või mitut
CDRi antikeha G1 kergest ahelast ja/või raskest ahelast.
[0026] Veel ühes aspektis pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiide (mis võivad olla 10
antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad VH CDR3, mis on esitatud järjestusega SEQ ID
NO: 5 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ ID NO: 5 1, 2, 3, 4 või 5 aminohappe
asenduse poolest. Konkreetses teostuses on sellised aminohappe asendused konservatiivsed
asendused.
15
[0027] Veel ühes aspektis pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiide (mis võivad olla
antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad VL CDR3, mis on esitatud järjestusega SEQ ID
NO: 8 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ ID NO: 8 1, 2, 3, 4 või 5 aminohappe
asenduse poolest. Konkreetses teostuses on sellised aminohappe asendused konservatiivsed
asendused. 20
[0028] Veel ühes teostuses pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiide (mis võivad olla
antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad ühte või mitut alljärgnevatest: a) antikeha G1 või
selle tabelis 6 välja toodud variantide ühte või mitut CDRi; b) CDR H3 antikeha G1 või
selle tabelis 6 välja toodud variantide raskest ahelast; c) CDR L3 antikeha G1 või selle 25
tabelis 6 välja toodud variantide kergest ahelast; d) kolme CDRi antikeha G1 või selle
tabelis 6 välja toodud variantide kergest ahelast; e) kolme CDRi antikeha G1 või selle tabelis
6 välja toodud variantide raskest ahelast; f) kolme CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja
toodud variantide kergest ahelast ja kolme CDRi raskest ahelast. Käesolev leiutis pakub
lisaks polüpeptiide (mis võivad olla antikehad, kuid ei pruugi), mis sisaldavad ühte või mitut 30
alljärgnevatest: a) ühte või mitut (ühte, kahte, kolme, nelja, viit või kuut) CDRi, mis on
tuletatud antikehast G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantidest; b) CDRi, mis on
tuletatud antikeha G1 raskest ahelast pärit CDR H3st; ja/või c) CDRi, mis on tuletatud
9 EE-EP 1 957 106 B2
antikeha G1 kergest ahelast pärit CDR L3st. Osades teostustes on CDR Joonisel FIG 5
kujutatud CDR. Osades teostustes on üks või mitu CDRi, mis on tuletatud antikehast G1
või selle tabelis 6 välja toodud variantidest, vähemalt ligikaudu 85%, vähemalt ligikaudu
86%, vähemalt ligikaudu 87%, vähemalt ligikaudu 88%, vähemalt ligikaudu 89%, vähemalt
ligikaudu 90%, vähemalt ligikaudu 91 %, vähemalt ligikaudu 92%, vähemalt ligikaudu 5
93%, vähemalt ligikaudu 94%, vähemalt ligikaudu 95%, vähemalt ligikaudu 96%, vähemalt
ligikaudu 97%, vähemalt ligikaudu 98% või vähemalt ligikaudu 99% ulatuses identsed
vähemalt ühe, vähemalt kahe, vähemalt kolme, vähemalt nelja, vähemalt viie või vähemalt
kuue G1 või selle variantide CDRiga.
10
[0029] Osades teostustes on CDR Kabati CDR. Teistes teostustes on CDR Chothia CDR.
Teistes teostustes on CDR Kabati ja Chothia CDRi kombinatsioon (tähistatakse ka
nimetusega „kombineeritud CDR” või „laiendatud CDR”). Teisisõnu võivad CDRid mis
tahes antud teostuse puhul, mis sisaldavad rohkem kui ühte CDRi, olla Kabati, Chothia
ja/või kombineeritud CDRid. 15
[0030] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust
KASKXaaVXaaTYVS, kus Xaa positsioonil 5 on R, W, G, L või N; ning kus Xaa
positsioonil 7 on T, A, D, G, R, S, W või V. Osades teostustes on aminohappejärjestus
KASKXaaVXaaTYVS antikeha kerge ahela CDR1. 20
[0031] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust
XaaXaaSNRYXaa, kus Xaa positsioonil 1 on G või A; kus Xaa positsioonil 2 on A või H;
ning kus Xaa positsioonil 7 on L, T, I või S. Osades teostustes on aminohappejärjestus
XaaXaaSNRYXaa antikeha kerge ahela CDR2. 25
[0032] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust
EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG, kus Xaa positsioonil 5 on E, R, K, Q või N; kus
Xaa positsioonil 8 on A, G, N, E, H, S, L, R, C, F, Y, V, D või P; kus Xaa positsioonil 9 on
S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D või M; kus Xaa positsioonil 12 on H või F; kus Xaa 30
positsioonil 15 on E või D. Osades teostustes on aminohappejärjestus
EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG antikeha raske ahela CDR2.
10 EE-EP 1 957 106 B2
[0033] Osades teostustes sisaldab polüpeptiid (nagu näiteks antikeha) aminohappejärjestust
SEQ ID NO:1, kus aminohappejääk järjestuse SEQ ID NO:1 positsioonil 99 on L või see
on asendatud A, N, S, T, V või R-ga; ning kus aminohappejäägid järjestuse SEQ ID NO:1
positsioonil 100 on A või need on asendatud L, R, S, V, Y, C, G, T, K või P-ga.
5
[0034] Osades teostustes on antikeha inimese antikeha. Osades teostustes on antikeha
humaniseeritud antikeha. Osades teostustes on leiutisekohane antikeha monoklonaalne
antikeha. Osades teostustes on antikeha (või polüpeptiid) isoleeritud. Osades teostustes on
antikeha (või polüpeptiid) sisuliselt puhas.
10
[0035] Antikehade raske ahela pidev piirkond võib olla pärit mis tahes tüüpi konstantsest
piirkonnast, nagu näiteks IgG, IgM, IgD, IgA ja IgE; ja mis tahes isotüübist, nagu näiteks
IgG1, IgG2, IgG3 ja IgG4.
[0036] Osades teostustes sisaldab antikeha siin kirjeldatud modifitseeritud konstantset 15
piirkonda.
Jooniste lühikirjeldus
20
[0037]
Joonis FIG 1 on tabel, milles on esitatud 12 närilise antikeha seondumisafiinsused erinevate
asendatud alaniiniga inimese α-CGRP fragmentide suhtes. Seondumisafiinsuseid mõõdeti
25 °C juures Biacore'i kasutades, lastes Fabidel voolata risti üle kiibil olevate CGRPde.
Kastidega ümbritsetud väärtused kujutavad lähtefragmendiga 25-37 seotud alaniini 25
mutantide afiinsuse kaotust (kaldkirjas), välja arvatud K35A, mis tuletati lähtefragmendist
19–37. "a" tähistab afiinsust 19–37 suhtes ning 25–37 fragmendid on keskmine ± kahe
erinevatel sensorkiipidel teostatud sõltumatu mõõtmise standardhälve. "b" tähistab neid
vastastiktoimeid, mis kalduvad lihtsast bimolekulaarse vastastiktoime mudelist kõrvale
kahefaasilise off-kiiruse tõttu, nii et nende afiinsuste kindlaks määramiseks kasutati 30
konformatsioonilise muutuse mudelit. Hallides toonides skaala selgitus: valge (1,0) tähistab
lähtefragmendi afiinsust; helehall (vähem kui 0,5) tähistab lähtefragmendist kõrgemat
11 EE-EP 1 957 106 B2
afiinsust; tumehall (rohkem kui 2) tähistab lähtefragmendist madalamat afiinsust; ning must
tähistab seda, et seondumist ei tuvastatud.
Joonistel FIG 2A ja FIG 2B on kujutatud CGRP 8–37 (400 nmol/kg), antikeha 4901
(25 mg/kg) ja antikeha 7D11 (25 mg/kg) manustamise mõju naha verevoolule, mida
mõõdeti vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. 5
CGRP 8–37 manustati intravenoosselt (iv) 3–5 minutit enne elektriimpulsiga
stimuleerimist. Antikehasid manustati intraperitoneaalselt (IP) 72 tundi enne
elektriimpulsiga stimuleerimist. Iga joonistel kujutatud punkt tähistab ühe roti AUCd, keda
raviti määratletud tingimustes. Iga joonistel kujutatud joon tähistab rottide keskmist AUCd,
keda raviti määratletud tingimustes. AUC (kõvera alune pindala) võrdub Δvool × Δaeg. 10
„Δvool” tähistab vooluühikute muutust pärast elektriimpulsiga stimuleerimist; ning „Δaeg”
tähistab ajavahemikku, mis kulub vereraku voolu tasemel, et jõuda tagasi elektriimpulsiga
stimuleerimisele eelnenud tasemele.
Joonisel FIG 3 on kujutatud antikeha 4901 erinevates annustes (25 mg/kg, 5 mg/kg,
2,5 mg/kg või 1 mg/kg) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti vererakkude 15
vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. Antikehasid manustati
intravenoosselt (IV) 24 tundi enne elektriimpulsiga stimuleerimist. Iga joonisel kujutatud
punkt tähistab ühe roti AUCd, keda raviti määratletud tingimustes. Joonisel kujutatud joon
tähistab rottide keskmist AUCd, keda raviti määratletud tingimustes.
Joonistel FIG 4A ja FIG 4B on kujutatud antikeha 4901 (1 mg/kg või 10 mg/kg 20
intravenoosselt), antikeha 7E9 (10 mg/kg intravenoosselt) ja antikeha 8B6 (10 mg/kg
intravenoosselt) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti vererakkude vooluna
pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. Antikehasid manustati
intravenoosselt (IV), millele järgnes elektriimpulsiga stimuleerimine 30 minutit, 60 minutit,
90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha manustamist. Y-telg tähistab AUC protsenti 25
võrreldes AUC tasemega, kui antikeha ei manustatud (aeg 0). X-telg tähistab antikehade
manustamise ja elektriimpulsiga stimuleerimise vahele jäävat ajavahemikku (minutites). *
tähistab P < 0,05 ja ** tähistab P < 0,01 võrreldes ajaga 0. Andmete analüüsimiseks kasutati
ühesuunalist ANOVA analüüsi Dunnetti mitmekordse võrdlustestiga.
Joonisel FIG 5 on kujutatud antikeha G1 raske ahela varieeruva piirkonna (SEQ ID NO:1) 30
ja kerge ahela varieeruva piirkonna aminohappejärjestust (SEQ ID NO:2). Kabati CDRid
on paksus kirjas ja Chothia CDRid on allajoonitud kirjas. Raske ahela ja kerge ahela
varieeruva piirkonna aminohappejäägid on järjestikku nummerdatud.
12 EE-EP 1 957 106 B2
Joonisel FIG 6 on kujutatud antikeha G1 kaardistamist peptiidi konkurentsiga Biacore'i
kasutades. N-biotinüülitud inimese α-CGRP püüti SA sensorkiibile. G1 Fabil (50 nM) lasti
voolata kiibile konkureeriva peptiidi puudumisel või seda oli eelnevalt inkubeeritud 1 tund
10 um konkureeriva peptiidiga. G1 Fab seondumist inimese α-CGRPga kiibil mõõdeti. Y
telg tähistab seondumise protsenti konkureeriva peptiidi juuresolekuga blokeerimise korral 5
võrreldes seondumisega konkureeriva peptiidi puudumise korral.
Joonisel FIG 7 on kujutatud antikeha G1 (1 mg/kg või 10 mg/kg intravenoosselt) või
vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti
vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul. Antikeha
G1 või vehiikulit manustati intravenoosselt (IV), millele järgnes närvi elektriimpulsiga 10
stimuleerimine 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha
manustamist. Y-telg tähistab AUC protsenti võrreldes AUC tasemega, kui antikeha või
vehiikulit (määratletud 100%-na) ei manustatud (aeg 0). X-telg tähistab antikehade
manustamise ja elektriimpulsiga stimuleerimise vahele jäävat ajavahemikku (minutites). *
tähistab P < 0,05 ja ** tähistab P < 0,01 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks 15
kasutati kahesuunalist ANOVA analüüsi ja Bonferroni järelteste.
Joonisel FIG 8A on kujutatud antikeha G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg või 10 mg/kg intravenoosselt)
või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) manustamise mõju naha verevoolule, mida mõõdeti
vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi jooksul 24 tundi
pärast manustamist. Antikeha G1 ja vehiikulit manustati intravenoosselt (IV) 24 tundi enne 20
närvi elektriimpulsiga stimuleerimist. Y-telg tähistab kõvera alust kogupindala (muutus
vereraku voolus korda muutus ajas stimuleerimisest kuni voolu naasmiseni alustasemele,
AUC). X-telg tähistab antikeha G1 erinevaid annuseid. * tähistab P < 0,05 ja ** tähistab P
< 0,01 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati ühesuunalist ANOVA
analüüsi ja Dunni mitmekordset võrdlustesti. 25
Joonisel FIG 8B on kujutatud antikeha G1 (0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg või 10 mg/kg
intravenoosselt) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) manustamise mõju naha verevoolule,
mida mõõdeti vererakkude vooluna pärast elektriimpulsiga stimuleerimist 30 sekundi
jooksul 7 päeva pärast manustamist. Antikeha G1 ja vehiikulit manustati intravenoosselt
(IV) 7 päeva enne närvi elektriimpulsiga stimuleerimist. Y-telg tähistab kogu AUCd. X-telg 30
tähistab antikeha G1 erinevaid annuseid. ** tähistab P < 0,01 ja *** tähistab P < 0,001
võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati ühesuunalist ANOVA analüüsi ja
Dunni mitmekordset võrdlustesti.
13 EE-EP 1 957 106 B2
Joonis FIG 8C on joonistelt FIG 8A ja FIG 8B saadud andmete kõvera lähendamise analüüs.
Antikeha G1 või vehiikulit manustati intravenoosselt (IV) kas 24 tundi või 7 päeva enne
närvi elektriimpulsiga stimuleerimist. Y-telg tähistab kogu AUCd. X-telg tähistab antikeha
G1 erinevaid annuseid mõõtühikus „mg/kg” logaritmilisel skaalal, et määrata kindlaks EC50.
Joonisel FIG 9 on kujutatud antikeha mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS või vehiikuli (PBS, 5
0,01% Tween 20) mõju keskmise meningeaalse arteri diameetri muutumisele pärast
elektriväljaga stimuleerimist. Antikeha mu7E9, BIBN4096BS või vehiikulit manustati
intravenoosselt (IV) ajahetkel 0 minutit pärast baastaseme reaktsiooni saavutamist
elektrilise stimulatsiooni suhtes. Y-telg tähistab muutust keskmise meningeaalse arteri
diameetris pärast elektriväljaga stimuleerimist. Puhkeasendis diameeter vastab 0%-le. X-10
telg tähistab elektriimpulsiga stimuleerimise aega (minutites). * tähistab P < 0,05 ja **
tähistab P < 0,01 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati ühesuunalist
ANOVA analüüsi ja Dunnetti mitmekordset võrdlustesti.
Joonisel FIG 10 on kujutatud antikeha G1 erinevate annuste (1 mg/kg, 3 mg/kg või
10 mg/kg intravenoosselt) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) mõju keskmise 15
meningeaalse arteri diameetri muutumisele pärast elektriväljaga stimuleerimist. Antikeha
G1 ja vehiikulit manustati intravenoosselt (IV) 7 päeva enne elektriväljaga stimuleerimist.
Y-telg tähistab muutust keskmise meningeaalse arteri diameetris. Puhkeasendis diameeter
vastab 0%-le. X-telg tähistab stimuleerimise pinget. * tähistab P < 0,05, ** tähistab P < 0,01
ja *** tähistab P < 0,001 võrreldes vehiikuliga. Andmete analüüsimiseks kasutati 20
kahesuunalist ANOVA analüüsi ja Bonferroni järelteste.
Joonisel FIG 11A on kujutatud 24 tundi varem intravenoosselt (IV) manustatud antikeha
mu4901 (10mg/kg) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) mõju sisetemperatuuri
vähenemisele, mis kutsuti esile naloksooni (1 mg/kg) subkutaanse süstimisega,
morfiinisõltuvusega rottides. Y-telg tähistab temperatuuri erinevust baastasemest. X-telg 25
tähistab naloksooni süstimise hetkest mõõdetud aega.
Joonisel FIG 11B on kujutatud 24 tundi varem intravenoosselt (IV) manustatud antikeha
mu4901 (10mg/kg) või vehiikuli (PBS, 0,01% Tween 20) mõju saba pinnatemperatuuri
suurenemisele, mis kutsuti esile naloksooni (1 mg/kg) subkutaanse süstimisega,
morfiinisõltuvusega rottides. Y-telg tähistab temperatuuri erinevust baastasemest. X-telg 30
tähistab naloksooni süstimise hetkest mõõdetud aega.
14 EE-EP 1 957 106 B2
Leiutise üksikasjalik kirjeldus
[0038] Käesolev leiutis pakub siin kirjeldatavat CGRP-vastast antikeha kasutamiseks
meetodites indiviidil vasomotoorsete sümptomite, nagu näiteks peavalu (näiteks migreeni,
kobarpeavalu, kroonilise peavalu ja pingepeavalu) või kuumahoogude ravimiseks ja/või 5
ennetamiseks, manustades nimetatud indiviidile terapeutiliselt efektiivses koguses
leiutisekohast CGRP-vastast antagonist-antikeha.
[0039] Käesolev leiutiskirjeldus pakub ka antikehast G1 või selle tabelis 6 välja toodud
variantidest tuletatud CGRP-vastaseid antagonist-antikehasid ja polüpeptiide. Käesolev 10
leiutiskirjeldus pakub ka nende antikehade ja polüpeptiidide valmistamise ja kasutamise
meetodeid.
Üldised tehnikad
15
[0040] Käesoleva leiutise praktiseerimiseks kasutatakse tavapäraseid molekulaarbioloogia
(sealhulgas rekombinantseid tehnikaid), mikrobioloogia, rakubioloogia, biokeemia ja
immunoloogia tehnikaid, mis kuuluvad tehnika tasemesse, välja arvatud juhul kui on
märgitud teisiti. Selliseid tehnikaid on põhjalikult selgitatud erialases kirjanduses, nagu
näiteks allikates Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. väljaanne (Sambrook et al., 20
1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait (toim.), 1984);
Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E.
Cellis (toim.), 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney (toim.), 1987);
Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather ja P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;
Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths ja D.G. Newell 25
(toim.), 1993–1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);
Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir ja C.C. Blackwell (toim.).); Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller ja M.P. Calos (toim.), 1987); Current
Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. (toim.), 1987); PCR: The Polymerase
Chain Reaction, (Mullis et al. (toim.), 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. 30
Coligan et al. (toim.), 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999);
Immunobiology (C.A. Janeway ja P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997);
Antibodies: a practical approach (D. Catty (toim.) IRL Press, 1988–1989); Monoclonal
15 EE-EP 1 957 106 B2
antibodies: a practical approach (P. Shepherd ja C. Dean (toim.), Oxford University Press,
2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow ja D. Lane (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti ja J.D. Capra (toim.), Harwood
Academic Publishers, 1995).
5
Mõisted
[0041] „Antikeha” on immunoglobuliini molekul, mis suudab spetsiifiliselt seonduda
märklauaga, nagu näiteks süsivesikuga, polünukleotiidiga, rasvaga, polüpeptiidiga jne
vähemalt ühe antigeeni äratundmissaidi kaudu, mis paikneb immunoglobuliini molekuli 10
varieeruvas piirkonnas. Siin kasutatuna hõlmab see mõiste terviklikke polüklonaalseid ja
monoklonaalseid antikehi. Antikeha hõlmab mis tahes klassi – IgG, IgA või IgM (või nende
alamklassi) – kuuluvat antikeha, kuid antud antikeha ei pea kuuluma ühtegi konkreetsesse
klassi. Immunoglobuliine saab määrata erinevatesse klassidesse olenevalt aminohappe
raskete ahelate konstantse piirkonna aminohappejärjestusele. Peamisi immunoglobuliinide 15
klasse on viis: IgA, IgD, IgE, IgG ja IgM ning mitmed neist võivad olla omakorda jagatud
alamklassidesse (isotüüpidesse), näiteks IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 ja IgA2. Raske
ahela konstantseid domeene, mis vastavad immunoglobuliinide erinevatele klassidele,
nimetatakse vastavalt alfa-, delta-, üpsilon-, gamma- ja müü-domeenideks.
Immunoglobuliinide erinevate klasside alamüksuste struktuurid ja kolmemõõtmelised 20
konfiguratsioonid on hästi tuntud.
[0042] Käesolevas tähistab mõiste „monoklonaalne antikeha” sellist antikeha, mis on
saadud sisuliselt homogeensete antikehade populatsioonist, st populatsiooni moodustavad
individuaalsed antikehad on identsed, välja arvatud võimalike loomulikult tekkivate 25
mutatsioonide poolest, mida võib esineda väikestes kogustes. Monoklonaalsed antikehad on
ülimalt spetsiifilised, olles suunatud ühe antigeeni saidi vastu. Lisaks erinevalt
polüklonaalsete antikehade preparaatidest, mis tüüpiliselt hõlmavad erinevaid antikehasid,
mis on suunatud erinevate determinantide (epitoopide) vastu, on iga monoklonaalne
antikeha suunatud üheainsa antigeenil asuva determinandi vastu. Laiend „monoklonaalne” 30
osutab antikeha olemusele, st see on saadud sisuliselt homogeensest antikehade
populatsioonist, ning seda ei tuleks käsitleda nõudena valmistada antikeha mis tahes
konkreetset meetodit kasutades. Näiteks võib vastavalt käesolevale leiutisele kasutatavaid
16 EE-EP 1 957 106 B2
monoklonaalseid antikehasid valmistada hübridoomi meetodiga, mida esmakordselt
kirjeldati allikas Kohler et al., 1975, Nature 256:495, või neid võib valmistada
rekombinantse DNA meetoditega, mida on kirjeldatud näiteks USA patendis nr 4 816 567.
Monoklonaalsed antikehad võivad samuti olla isoleeritud faagipankadest, kasutades
tehnikaid, mida on kirjeldatud näiteks allikas McCafferty et al., 1990, Nature 348:552–554. 5
[0043] Käesolevas osutab mõiste „humaniseeritud” antikeha mitte-inimese (näiteks
närilise) antikehade vormidele, mis on spetsiifilised kimäärsed immunoglobuliinid,
immunoglobuliinide ahelad või nende fragmendid (nagu näiteks Fv, Fab, Fab', F(ab')2 või
muud antikeha antigeeni siduvad alamjärjestused), mis sisaldavad mitte-inimese 10
immunoglobuliinist tuletatud minimaalset järjestust. Humaniseeritud antikehad on enamasti
inimese immunoglobuliinid (vastuvõtja antikeha), milles vastuvõtja komplementaarsust
määravast piirkonnast (CDR) saadud jäägid asendatakse mitte-inimese liigi, nagu näiteks
hiire, roti või küüliku CDRist saadud jääkidega (doonori antikeha), millel on soovitud
spetsiifilisus, afiinsus ja bioloogiline aktiivsus. Teatavatel juhtudel asendatakse inimese 15
immunoglobuliini Fv raampiirkonna (framework region, FR) jäägid vastavate mitte-inimese
jääkidega. Lisaks võib humaniseeritud antikeha sisaldada jääke, mida ei leidu vastuvõtja
antikehas ega imporditud CDRis või raamjärjestustes, kuid mis on lisatud antikeha
suutlikkuse edasiseks viimistlemiseks ja optimeerimiseks. Üldiselt sisaldab humaniseeritud
antikeha sisuliselt kõiki vähemalt ühest ja tüüpiliselt kahest varieeruvast piirkonnast, milles 20
kõik või sisuliselt kõik CDR-piirkonnad vastavad mitte-inimese immunoglobuliini omadele
ja kõik või sisuliselt kõik FR-piirkonnad on inimese immunoglobuliini kokkulepitud
järjestuse omad. Humaniseeritud antikeha sisaldab optimaalselt ka vähemalt osa
immunoglobuliini konstantsest piirkonnast või domeenist (Fc), tüüpiliselt inimese
immunoglobuliini omast. Antikehadel võivad olla Fc-piirkonnad, mida on modifitseeritud 25
viisil, mida on kirjeldatud publikatsioonis WO 99/58572. Humaniseeritud antikehade teistel
vormidel on üks või mitu CDRi (üks, kaks, kolm, neli, viis, kuus), mida on muudetud algse
antikeha suhtes ning mida nimetatakse ka üheks või mitmeks CDRiks, mis „on tuletatud”
ühest või mitmest algsest antikehast pärit CDRist.
30
[0044] Käesolevas tähendab „inimese antikeha” sellist antikeha, millel on
aminohappejärjestus, mis vastab antikeha aminohappejärjestusele, mis on toodetud inimese
poolt ja/või mille valmistamiseks on kasutatud mis tahes tehnika tasemes tuntud või siin
17 EE-EP 1 957 106 B2
kirjeldatud tehnikat inimese antikehade valmistamiseks. Inimese antikeha mõiste hõlmab
antikehasid, mis sisaldavad vähemalt ühte inimese raske ahela polüpeptiidi või vähemalt
ühte inimese kerge ahela polüpeptiidi. Üheks selliseks näiteks on antikeha, mis sisaldab
närilise kerge ahela ja raske ahela polüpeptiide. Inimese antikehade valmistamiseks võib
kasutada erinevaid tehnika tasemes tuntud tehnikaid. Ühes teostuses on inimese antikeha 5
valitud faagipangast, kus nimetatud faagipank ekspresseerib inimese antikehasid (Vaughan
et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309–314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157–
6162; Hoogenboom ja Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol.
Biol., 222:581). Inimese antikehasid võib valmistada ka selliselt, et inimese
immunoglobuliini lookused sisestatakse transgeensetesse loomadesse, näiteks hiirtesse, 10
kelle endogeensed immunoglobuliini geenid on osaliselt või täielikult inaktiveeritud. Seda
lähenemisviisi on kirjeldatud USA patentides nr 5 545 807; 5 545 806; 5 569 825;
5 625 126; 5 633 425; ja 5 661 016. Alternatiivselt võib inimese antikeha valmistada
inimese B-lümfotsüütide surematuks muutmise teel, mis toodavad märklaud-antigeeni vastu
suunatud antikeha (selliseid B-lümfotsüüte võib taastada indiviidilt või need võivad olla 15
immuniseeritud in vitro). Vt näiteks Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, lk 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86–95; ja
USA patent nr 5 750 373.
[0045] Käesolevas tähistab mõiste „kaltsitoniini geeniga seotud peptiid” ja „CGRP” mis 20
tahes kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi vormi ja selle variante, mis säilitavad vähemalt
osa CGRP aktiivsusest. Näiteks võib CGRP olla α-CGRP või β-CGRP. Käesolevas hõlmab
CGRP kõiki imetajate liike, kellel on loomuliku järjestusega CGRP, näiteks inimest, koera,
kassi, hobust ja veist.
25
[0046] Käesolevas tähistab mõiste „CGRP-vastane antagonist-antikeha” (mida nimetatakse
ka „CGRP-vastaseks antikehaks”) antikeha, mis on suuteline seonduma CGRPga ja
inhibeerima CGRP bioloogilist aktiivsust ja/või CGRP signaliseerimisega vahendatud
pärisuunalist rada (pärisuunalisi radasid). CGRP-vastane antagonist-antikeha hõlmab
antikehasid, mis blokeerivad, antagoniseerivad, pärsivad või vähendavad (sealhulgas 30
märkimisväärselt) CGRP bioloogilist aktiivsust, sealhulgas CGRP signaliseerimisega
vahendatud pärisuunalisi radasid, nagu näiteks retseptori seondumist ja/või rakulise
reaktsiooni esile kutsumist CGRP suhtes. Käesoleva leiutise mõistes tuleb selgelt aru saada,
18 EE-EP 1 957 106 B2
et mõiste „CGRP-vastane antagonist-antikeha” hõlmab kõiki varasemalt määratletud
mõisteid, pealkirju ja funktsionaalseid olekuid ja omadusi, kusjuures CGRP ise, CGRP
bioloogiline aktiivsus (sealhulgas mittepiiravalt selle suutlikkus vahendada mis tahes
peavalu aspekti) või sellise bioloogilise aktiivsuse tagajärjed on sisuliselt nullitud,
vähendatud või neutraliseeritud märkimisväärsel määral. Osades teostustes seob CGRP-5
vastane antagonist-antikeha CGRPd ja ennetab CGRP seondumist CGRP retseptoriga.
Teistes teostustes seob CGRP-vastane antikeha CGRPd ja ennetab CGRP retseptori
aktiveerimist. CGRP-vastaste antagonist-antikehade näited on siin esitatud.
[0047] Käesolevas osutavad „G1” ja „antikeha G1” samatähenduslikult antikehale, mida 10
toodetakse ekspressioonivektoritega, mille deponeerimisnumbrid on ATCC PTA-6867 ja
ATCC PTA-6866. Raske ahela ja kerge ahela varieeruvate piirkondade
aminohappejärjestused on välja toodud joonisel FIG 5. Antikeha G1 CDRi osi (sealhulgas
Chothia ja Kabati CDRe) on skemaatiliselt kujutatud joonisel FIG 5. Raske ja kerge ahela
varieeruvaid piirkondi kodeerivad polünukleotiidid on näidatud järjestustes SEQ ID NO:9 15
ja SEQ ID NO:10. G1 iseloomustamist on kirjeldatud näidetes.
[0048] Mõisteid „polüpeptiid”, „oligopeptiid”, „peptiid” ja „valk” on siin kasutatud
samatähenduslikena ning need osutavad mis tahes pikkusega aminohapete polümeeridele.
Nimetatud polümeer võib olla hargnemata või hargnenud ahelaga, see võib sisaldada 20
modifitseeritud aminohappeid ning see võib olla aminohapete poolt katkestatud. Need
mõisted hõlmavad ka aminohappe polümeeri, mida on modifitseeritud loomulikul teel või
sekkumisega; näiteks disulfiidsideme moodustamise, glükosüleerimise, lipideerimise,
atsetüülimise, fosforüülimise või mis tahes muu manipuleerimise või modifitseerimise teel,
nagu näiteks märgistava komponendiga ühendamise teel. See määratlus hõlmab ka näiteks 25
polüpeptiide, mis sisaldavad ühte või mitut aminohappe analoogi (sealhulgas näiteks
mittelooduslikud aminohapped jne) ning ka teisi tehnika tasemes tuntud modifikatsioone.
Siinkohal on selge, et kuna polüpeptiidid põhinevad antikehal, siis võivad polüpeptiidid
esineda üheahelalistena või seotud ahelatena.
30
[0049] Mõisted „polünukleotiid” ja „nukleiinhape”, mida kasutatakse samatähenduslikult,
osutavad mis tahes pikkusega nukleotiidide polümeeridele ning hõlmavad DNAd ja RNAd.
Nukleotiidid võivad olla desoksüribonukleotiidid, ribonukleotiidid, modifitseeritud
19 EE-EP 1 957 106 B2
nukleotiidid või alused ja/või nende analoogid või mis tahes substraat, mis võib olla
polümeeri sisestatud DNA või RNA polümeraasiga. Polünukleotiid võib sisaldada
modifitseeritud nukleotiide, nagu näiteks metüülitud nukleotiide ja nende analooge. Kui
seda kasutatakse, siis võib nukleotiidi struktuuri modifikatsiooni edastada enne või pärast
polümeeri koostamist. Nukleotiidijärjestus võib olla katkestatud komponentidega, mis ei 5
ole nukleotiidid. Polünukleotiidi võib lisaks modifitseerida pärast polümeriseerimist, nagu
näiteks märgistava komponendiga ühendamise teel. Muude modifikatsioonide tüüpide
hulka kuuluvad näiteks „korgid”, ühe või mitme looduslikult esineva nukleotiidi
asendamine analoogiga, nukleotiidisisesed modifikatsioonid, nagu näiteks need, mis
teostatakse laenguta aheldustega (näiteks metüülfosfonaadi, fosfotriestrid, fosfoamidaadid, 10
karbamaadid jne) ja laenguga aheldustega (näiteks fosforotioaadid, fosforoditioaadid jne),
need, mis sisaldavad külgrühma fragmente, nagu näiteks valke (näiteks nukleaasid,
toksiinid, antikehad, signaalpeptiidid, plü-L-lüsiin jne), need, mis teostatakse
interkalaatoritega (näiteks akridiin, psoraleen jne), need, mis sisaldavad kelaatoreid (näiteks
metallid, radioaktiivsed metallid, boor, oksüdeerivad metallid jne), need, mis sisaldavad 15
alküülivaid aineid, need, mida teostatakse modifitseeritud aheldustega (näiteks alfa
anomeersed nukleiinhapped jne) ning polünukleotiidi(de) modifitseerimata vormid. Lisaks
võivad mis tahes hüdroksüülrühmad, mis tavaliselt sisalduvad suhkrutes, olla asendatud,
näiteks fosfonaatrühmade või fosfaatrühmadega, kaitstud standardsete kaitserühmadega või
aktiveeritud, et valmistada täiendavaid aheldusi täiendavate nukleotiididega, või olla 20
ühendatud tahketele tugiainetele. 5' või 3' otsa OH võib olla fosforüülitud või asendatud
amiinide või orgaanilise korkimisrühma fragmentidega 1 kuni 20 süsinikuaatomi ulatuses.
Teised hüdroksüülrühmad võivad samuti olla deriveeritud standardseteks kaitserühmadeks.
Polünukleotiidid võivad sisaldada ka tehnika tasemes üldiselt tuntud riboos- või
desoksüriboossuhkrute analoogseid vorme, mille hulka kuuluvad näiteks 2'-O-metüül-, 2'-25
O-allüül-, 2'-fluoro- või 2'-asido-riboos, karboksüülsuhkru analooge, α-anomeerseid
suhkruid, epimeerseid suhkruid, nagu näiteks arabinoosi, ksüloose või lüksoose, püranoosi
suhkruid, furanoosi suhkruid, sedoheptuloose, atsüklilisi analooge ja mittealuselise
nukleosiidi analooge, nagu näiteks metüülribosiidi. Üks või mitu fosfodiestri aheldustest
võivad olla asendatud alternatiivsete aheldusrühmadega. Nende alternatiivsete 30
aheldusrühmade hulka kuuluvad mittepiiravalt teostused, kus fosfaat on asendatud P(O)S
(„tioaat”), P(S)S („ditioaat”), (O)NR2 („amidaat”), P(O)R, P(O)OR', CO või CH2-ga
(„formatsetaal”), kus iga R või R' on üksteisest sõltumatult H või asendatud või asendamata
20 EE-EP 1 957 106 B2
alküülrühm (1–20 C), mis sisaldab valikuliselt eetri (-O-) aheldust, arüül-, alkenüül-,
tsükloalküül-, tsükloalkenüül- või araldüülrühma. Kõik polünukleotiidis sisalduvad
aheldused ei pea olema identsed. Kogu eelnev kirjeldus kehtib kõikide siin osutatud
polünukleotiidide, sealhulgas RNA ja DNA puhul.
5
[0050] Antikeha „varieeruv piirkond” osutab antikeha kerge ahela varieeruvale piirkonnale
või antikeha raske ahela varieeruvale piirkonnale, kas üksi või kombineeritult. Iga raske ja
kerge ahela varieeruv piirkond koosneb neljast raampiirkonnast (FR), mis on ühendatud
kolme komplementaarsust määrava piirkonnaga (CDRid), mida tuntakse ka
hüpervarieeruvate piirkondadena. Igas ahelas sisalduvaid CDRe hoiavad üksteise lähedal 10
tihedalt koos FRid ning need aitavad koos teisest ahelast pärit CDRidega kaasa antikehade
antigeeni sidumissaidi moodustamisele. CDRide kindlaks määramiseks on olemas vähemalt
kaks tehnikat: (1) osakestevahelisel järjestuse varieeruvusel põhinev lähenemisviis (st
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5. väljaanne, 1991, National
Institutes of Health, Bethesda MD)); ja (2) antigeeni-antikeha komplekside 15
kristallograafilistel uuringutel põhinev lähenemisviis (Al-lazikani et al. (1997), J. Molec.
Biol. 273:927–948)). Käesolevas võib CDR osutada ükskõik kumma lähenemisviisi või
mõlema lähenemisviisi kombinatsiooniga määratletud CDRile.
[0051] Antikeha „pidev piirkond” osutab antikeha kerge ahela konstantsele piirkonnale või 20
antikeha raske ahela konstantsele piirkonnale, kas üksi või kombineeritult.
[0052] Epitoop, mis „eelistatult seondub” või „spetsiifiliselt seondub” (kasutatakse siin
samatähenduslikult) antikehaga või polüpeptiidiga, on tehnika tasemes hästi tuntud mõiste,
ning meetodid sellise spetsiifilise või eelistatud seondumise kindlaks määramiseks on 25
tehnika tasemes samuti hästi tuntud. Molekul „seondub spetsiifiliselt” või „seondub
eelistatult”, kui see reageerib või seostub konkreetse raku või ainega sagedamini, kiiremini,
pikema aja jooksul ja/või suurema afiinsusega, kui see seondub alternatiivsete rakkude või
ainetega. Antikeha „spetsiifiliselt seondub” või „eelistatult seondub” märklauaga, kui see
seondub sellega suurema afiinsusega, lihtsamalt ja/või pikema aja jooksul, kui see seondub 30
teiste ainetega. Näiteks on antikeha, mis spetsiifiliselt või eelistatult seondub CGRP
epitoobiga, selline antikeha, mis seondub selle epitoobiga suurema afiinsusega, innukamalt,
lihtsamalt ja/või pikema aja jooksul, kui see seondub teiste CGRP epitoopide või mitte-
21 EE-EP 1 957 106 B2
CGRP epitoopidega. Samuti tuleb käesolevat määratlust lugedes aru saada näiteks seda, et
antikeha (või fragment või epitoop), mis spetsiifiliselt või eelistatult seondub esimese
märklauaga, võib spetsiifiliselt või eelistatult seonduda teise märklauaga, kuid ei pruugi
seda teha. Sellisena ei nõua „spetsiifiline seondumine” või „eelistatud seondumine”
tingimata eksklusiivset seondumist (kuigi see võib seda hõlmata). Üldiselt, kuid mitte 5
ilmtingimata, tähendab viide seondumisele eelistatud seondumist.
[0053] Käesolevas osutab mõiste „sisuliselt puhas” materjalile, mis on vähemalt 50% puhas
(st saasteainetest vaba), enam eelistatult vähemalt 90% puhas, enam eelistatult vähemalt
95% puhas, enam eelistatult vähemalt 98% puhas, enam eelistatult vähemalt 99% puhas. 10
[0054] Mõiste „peremeesrakk” hõlmab individuaalset rakku või rakukultuuri, mis võib olla
või on olnud vektori(te) vastuvõtja polünukleotiidi insertsiooni sisestamiseks.
Peremeesrakkude hulka kuuluvad ühe peremeesraku järglased ning need järglased ei pea
loomuliku, juhusliku või tahtliku mutatsiooni tagajärjel tingimata olema täiesti identsed 15
(morfoloogias või genoomses DNA komplemendis) algse peremeesrakuga. Peremeesraku
hulka kuuluvad rakud, mida on in vivo transfekteeritud käesoleva leiutise
polünukleotiidi(de)ga.
[0055] Mõistet „Fc-piirkond” kasutatakse immunoglobuliini raske ahela C-otsa piirkonna 20
määratlemiseks. „Fc-piirkond” võib olla loomuliku järjestuse Fc-piirkond või variandi Fc-
piirkond. Kuigi immunoglobuliini raske ahela Fc-piirkonna piirid võivad varieeruda, on
inimese IgG raske ahela Fc-piirkond määratletud tavaliselt selliselt, et see ulatub
positsioonil Cys226 või Pro230 asuvast aminohappejäägist selle karboksüülotsa lõpuni.
Jääkide nummerdamiseks Fc-piirkonnas kasutatakse ELi indeksit, mis põhineb Kabati 25
süsteemil. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5. väljaanne, Public
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Immunoglobuliini Fc-
piirkond sisaldab tavaliselt kahte konstantset domeeni –CH2 ja CH3.
[0056] Käesolevas kirjeldab „Fc-retseptor” või „FcR” retseptorit, mis seondub antikeha Fc-30
piirkonnaga. Eelistatud FcR on loomuliku järjestusega inimese FcR. Lisaks on eelistatud
FcR selline, mis seondub IgG antikehaga (gamma-retseptor) ning see hõlmab FcγRI, FcγRII
ja FcγRII alamklasside retseptoreid, sealhulgas nende retseptorite alleelseid variante ja
22 EE-EP 1 957 106 B2
alternatiivselt splaissitud vorme. FcγRII retseptorite hulka kuuluvad FcγRIIA („aktiveeriv
retseptor”) ja FcγRIIB („inhibeeriv retseptor”), millel on sarnased aminohappejärjestused,
mis erinevad peamiselt nende tsütoplasmaatiliste domeenide poolest. FcRe on põhjalikult
käsitletud allikates Ravetch ja Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457–92; Capel et al.,
1994, Immunomethods, 4:25–34; ja de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330–41. 5
Mõiste „FcR” hõlmab ka neonatalset retseptorit (FcRn), mis vastutab ema IgGde lootele
ülekandmise eest (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; ja Kim et al., 1994, J. Immunol.,
24:249).
[0057] Mõisted „komplemendist sõltuv tsütotoksilisus” ja „CDC” osutavad märklaua 10
lüüsimisele komplemendi juuresolekul. Komplemendi aktiveerimisrada käivitatakse
esimese komplemendi süsteemi komponendi (C1q) seondumisega molekuliga (näiteks
antikehaga), mida täiendatakse samatüvelise antigeeniga. Komplemendi aktiveerimise
hindamiseks võib teostada CDC-analüüsi, näiteks sellise, mida on kirjeldatud allikas
Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996). 15
[0058] „Funktsionaalne Fc-piirkond” omab vähemalt ühte loomuliku järjestuse Fc-
piirkonna efektorfunktsiooni „Efektorfunktsioonide” näidete hulka kuuluvad: C1q
sidumine; komplemendist sõltuv tsütotoksilisus (CDC); Fc-retseptori sidumine; antikehast
sõltuv rakuline tsütotoksilisus (ADCC); fagotsütoos; raku pinnaretseptorite (näiteks B-raku 20
retseptori; BCRi) allareguleerimine. Sellised efektorfunktsioonid nõuavad üldiselt seda, et
Fc-piirkond oleks kombineeritud siduva domeeniga (näiteks antikeha varieeruva
domeeniga) ning selle hindamiseks võib kasutada erinevaid tehnika tasemes tuntud
analüüsimeetodeid, näiteks antikeha efektorfunktsioonide hindamiseks kasutatavaid
analüüsimeetodeid. 25
[0059] „Loomuliku järjestuse Fc-piirkond” sisaldab aminohappejärjestust, mis on identne
looduses leiduva Fc-piirkonna aminohappejärjestusega. „Fc-piirkonna variant” sisaldab
aminohappejärjestust, mis erineb loomuliku järjestuse Fc-piirkonna aminohappejärjestusest
vähemalt ühe aminohappe modifikatsiooni võrra, kuid see säilitab vähemalt ühe loomuliku 30
järjestuse Fc-piirkonna efektorfunktsiooni. Eelistatult on Fc-piirkonna variandil vähemalt
üks aminohappe asendus võrreldes loomuliku järjestuse Fc-piirkonna või lähtepolüpeptiidi
Fc-piirkonnaga, näiteks ligikaudu üks kuni ligikaudu kümme aminohappe asendust, ning
23 EE-EP 1 957 106 B2
eelistatult ligikaudu üks kuni ligikaudu viis aminohappe asendust loomuliku järjestuse Fc-
piirkonnas või lähtepolüpeptiidi Fc-piirkonnas. Siin kirjeldatud variandi Fc-piirkonnal on
järjestus, mis on vähemalt ligikaudu 80% ulatuses identne loomuliku järjestuse Fc-
piirkonna ja/või lähtepolüpeptiidid Fc-piirkonnaga, ning enim eelistatult vähemalt ligikaudu
90% ulatuses identne järjestus, enam eelistatult vähemalt ligikaudu 95%, vähemalt 5
ligikaudu 96%, vähemalt ligikaudu 97%, vähemalt ligikaudu 98%, vähemalt ligikaudu 99%
ulatuses identne järjestus.
[0060] Käesolevas osutavad mõisted „antikehast sõltuv rakuline tsütotoksilisus” ja
„ADCC” rakulisele reaktsioonile, kus mittespetsiifilised rakud, mis ekspresseerivad Fc-10
retseptoreid (FcR) (näiteks loomulikke tapjarakke (NK-rakke), neutrofiile ja makrofaage),
tunnevad ära seotud antikeha märklaud-rakul ning seejärel kutsuvad esile märklaud-raku
lüüsi. Huvipakkuva molekuli ADCC aktiivsuse hindamiseks võib kasutada in vitro ADCC
analüüsi, mida on kirjeldatud näiteks USA patentides nr 5 500 362 või 5 821 337. Selliste
analüüside jaoks kasulike efektorrakkude hulka kuuluvad perifeerse vere mononukleaarsed 15
rakud (PBMC) ja NK-rakud. Alternatiivselt või täiendavalt võib huvipakkuva molekuli
ADCC aktiivsust hinnata in vivo, näiteks loommudelis, mida on kirjeldatud näiteks allikas
Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652–656.
[0061] Käesolevas on „ravimine” lähenemisviis, mida kasutatakse kasulike või soovitud 20
kliiniliste tulemuste saavutamiseks. Käesoleva leiutise mõistes kuuluvad kasulike või
soovitud kliiniliste tulemuste hulka mittepiiravalt üks või mitu alljärgnevatest: mis tahes
peavalu aspekti leevendamine, sealhulgas tugevuse vähendamine, valu intensiivsuse
leevendamine, ja muude kaasnevate sümptomite leevendamine, nende esinemise
vähendamine, peavalu all kannatavate inimeste elukvaliteedi parandamine ja muude 25
peavalu ravimiseks kasutatavate ravimite annuse vähendamine. Migreeni puhul kuuluvad
muude kaasnevate sümptomite hulka mittepiiravalt iiveldus, oksendamine ning tundlikkus
valguse, hääle ja/või liikumise suhtes. Kobarpeavalu puhul kuuluvad muude kaasnevate
sümptomite hulka mittepiiravalt silmaaluste või silmaümbruse paistetus, liigsed pisarad,
punased silmad, ninavoolus või ninakinnisus ja punetav nägu. 30
[0062] Peavalu „esinemise vähendamine” tähendab selle tugevuse (mis võib hõlmata
vajaduse vähendamist teiste ravimite ja/või toimeainete järele, mida sellise seisundi puhul
24 EE-EP 1 957 106 B2
üldiselt kasutatakse, sealhulgas näiteks migreeni puhul ergotamiini, dihüdroergotamiini või
triptaani järele ja/või nende teiste ravimite ja/või toimeainete koguse (näiteks nendega
kokkupuute) vähendamist), kestuse ja/või sageduse vähendamist (sealhulgas näiteks
indiviidil episoodilise hoo edasilükkamist või järgmise hooni kuluva aja suurendamist).
Valdkonna asjatundja mõistab, et indiviidide vastuvõtlikkus ravi suhtes võib erineda ning 5
sellisel juhul tähendab näiteks „indiviidil peavalu esinemise vähendamise meetod” CGRP-
vastase antagonist-antikeha manustamist põhjendatud ootuse alusel, et selline manustamine
võib tõenäoliselt põhjustada sellist esinemise vähendamist sellel konkreetsel indiviidil.
[0063] Peavalu või peavalu ühe või mitme sümptomi „leevendamine” tähendab ühe või 10
mitme peavalu sümptomi vähendamist või leevendamist võrreldes sellega, kui CGRP-
vastast antagonist-antikeha ei manustata. „Leevendamine” tähendab ka sümptomi kestuse
lühendamist või vähendamist.
[0064] Käesolevas osutab „peavalu kontrolli all hoidmine” indiviidil ühe või mitme 15
peavalu sümptomi tugevuse või kestuse või peavaluhoogude sageduse säilitamisele või
vähendamisele (võrreldes ravile eelnenud tasemega). Näiteks väheneb indiviidil peavalu
valu kestus või tugevus või hoogude sagedus vähemalt ligikaudu 10%, 20%, 30%, 40%,
50%, 60% või 70% võrreldes ravile eelnenud tasemega.
20
[0065] Käesolevas tähendab peavalu tekkimise „edasilükkamine” haiguse süvenemise
edasilükkamist, pidurdamist, aeglustamist, viivitamist ja/või stabiliseerimist. Selline
edasilükkamine võib olla erineva ajalise pikkusega, olenevalt senisest haigusloost ja/või
ravitavatest indiviididest. Antud valdkonna asjatundjale on ilmselge, et piisav või
märkimisväärne edasilükkamine võib tegelikult hõlmata ka ennetamist, st et uuringualusel 25
ei tekigi peavalu (näiteks migreeni). Meetod, mis „lükkab edasi” sümptomi arengut, on
selline meetod, mis vähendab sümptomi arengu tõenäosust antud ajalises raamistikus ja/või
vähendab sümptomite ulatust antud ajalises raamistikus võrreldes sellega, kui antud
meetodit ei kasutata. Sellised võrdlused põhinevad tüüpiliselt kliinilistel uuringutel, kus
kasutatakse statistiliselt olulist hulka uuringualuseid. 30
[0066] Peavalu „tekkimine” või „süvenemine” tähendab häire esialgseid ilminguid ja/või
selle edasist süvenemist. Peavalu tekke tuvastamiseks ja hindamiseks võib kasutada tehnika
25 EE-EP 1 957 106 B2
tasemes hästi tuntud standardseid kliinilisi tehnikaid. Kuid teke viitab ka süvenemisele, mis
võib jääda märkamatuks. Käesoleva leiutise mõistes osutab teke või süvenemine
sümptomite bioloogilisele kulgemisele. „Teke” hõlmab esinemist, kordumist ja puhkemist.
Käesolevas hõlmab peavalu „puhkemine” või „esinemine” esialgset puhkemist ja/või
kordumist. 5
[0067] Käesolevas on ravimi, ühendi või farmatseutilise koostise „efektiivne annus” või
„efektiivne kogus” selline kogus, mis on piisav kasulike või soovitud tulemuste
saavutamiseks. Profülaktilise kasutamise korral hõlmavad kasulikud või soovitud
tulemused selliseid tulemusi, nagu näiteks haiguse, sealhulgas haiguse bioloogiliste, 10
histoloogiliste ja/või käitumuslike sümptomite ning haiguse tekke ajal esinevate
komplikatsioonide ja vahepealsete patoloogiliste fenotüüpide riski kõrvaldamist või
vähendamist, tõsiduse vähendamist või puhkemise edasilükkamist. Terapeutilise
kasutamise korral kuuluvad kasulike või soovitud tulemuste hulka sellised kliinilised
tulemused, nagu näiteks peavaluhoo valu intensiivsuse, kestuse või sageduse vähendamine 15
ning ühe või mitme peavalu tagajärjel tekkiva sümptomi (biokeemilise, histoloogilise ja/või
käitumusliku sümptomi), sealhulgas haiguse tekkimisel esinevate komplikatsioonide ja
vahepealsete patoloogiliste fenotüüpide vähendamine, haiguse all kannatavate inimeste
elukvaliteedi parandamine, muude haiguse ravimiseks vajalike ravimite annuse
vähendamine, mõne muu ravimi toime parandamine ja/või patsientide haiguse süvenemise 20
edasilükkamine. Efektiivset annust võib manustada ühe korra või mitu korda. Käesoleva
leiutise mõistes on ravimi, ühendi või farmatseutilise koostise efektiivne annus selline
kogus, mis on piisav profülaktilise või terapeutilise ravi otseseks või kaudseks
saavutamiseks. Nagu sellest kliinilises kontekstis aru saadakse, võib ravimi, ühendi või
farmatseutilise koostise efektiivse annuse saavutada koos mõne muu ravimi, ühendi või 25
farmatseutilise koostisega, kuid ei pruugi. Seega võib „efektiivset annust” käsitleda ühe või
mitme terapeutilise toimeaine manustamise kontekstis ning ühte toimeainet võib pidada
efektiivses koguses manustatuks, kui see võimaldab saavutada või saavutab soovitud
tulemuse ühe või mitme teise toimeainega kombineeritult.
30
[0068] „Indiviid” või „uuringualune” on imetaja, enam eelistatult inimene. Imetajate hulka
kuuluvad ka mittepiiravalt kariloomad, spordiloomad, lemmikloomad, primaadid, hobused,
koerad, kassid, hiired ja rotid.
26 EE-EP 1 957 106 B2
[0069] Käesolevas tähendab „vektor” konstrukti, mis suudab edastada ja eelistatult
ekspresseerida ühte või mitut huvipakkuvat geeni või järjestust peremeesrakus. Vektorite
hulka kuuluvad mittepiiravalt viirusvektorid, paljad DNA või RNA ekspressioonivektorid,
plasmiid-, kosmiid- või faagivektorid, katiooniliste kondenseerivate agensitega seotud
DNA või RNA ekspressioonivektorid, liposoomidesse kapseldatud DNA või RNA 5
ekspressioonivektorid ning teatavad eukarüootsed rakud, nagu näiteks tootjarakud.
[0070] Käesolevas tähendab „ekspressiooni kontrolljärjestus” nukleiinhappe järjestust, mis
suunab nukleiinhappe transkriptsiooni. Ekspressiooni kontrolljärjestus võib olla promootor,
nagu näiteks konstitutiivne või esilekutsuv promootor või võimendusjärjestus. 10
Ekspressiooni kontrolljärjestus on toimivalt seotud transkribeeritava
nukleiinhappejärjestusega.
[0071] Käesolevas hõlmab „farmatseutiliselt aktsepteeritav tugiaine” või „farmatseutiliselt
aktsepteeritav abiaine” mis tahes materjali, mis aktiivse toimeainega kombineeritult 15
võimaldab antud koostisosal säilitada bioloogilise aktiivsuse ning ei reageeri uuringualuse
immuunsüsteemiga. Nende näidete hulka kuuluvad mittepiiravalt mis tahes standardsed
farmatseutilised tugiained, nagu näiteks fosfaatpuhverdatud soolalahus, vesi, emulsioonid,
nagu näiteks õli-vees emulsioon, ning erinevat tüüpi märgavad ained. Eelistatud lahjendid
aerosooli või parenteraalse manustamise korral on fosfaatpuhverdatud soolalahus või 20
tavaline (0,9%-line) soolalahus. Selliseid tugiaineid sisaldavaid koostisi formuleeritakse
hästi tuntud tavapäraste meetoditega (vt näiteks Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.
väljaanne, A. Gennaro (toim.), Mack Publishing Co.; Easton, PA, 1990; ja Remington, The
Science and Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack Publishing, 2000).
25
[0072] Käesolevas osutab mõiste „kon” antikeha antigeeniga ühinemise kiiruse konstandile.
[0073] Käesolevas osutab mõiste „koff” antikeha antikeha/antigeeni kompleksist eraldumise
kiiruse konstandile.
30
[0074] Käesolevas osutab mõiste „KD” antikeha ja antigeeni vastastiktoime dissotsiatsiooni
tasakaalukonstandile.
27 EE-EP 1 957 106 B2
[0075] Käesolevas osutab mõiste „vasomotoorne sümptom” vasodilatatsiooniga seotud
haigusseisunditele ning see hõlmab mittepiiravalt peavalu (nagu näiteks migreeni jt),
kuumapahvakuid (kuumahoogusid), külmahoogusid, unetust, unehäireid, meeleoluhäireid,
ärrituvust, liigset higistamist, öist higistamist, päevast higistamist, väsimust jms, mida
põhjustab muu hulgas termoregulatoorne väärtalitlus. 5
[0076] Käesolevas on mõisted „punastamine”, „kuumapahvak” ja „kuumahoog” tehnika
tasemes tunnustatud mõisted, mis osutavad kehatemperatuuri episoodilisele häirele, mis
tüüpiliselt seisneb ootamatus naha punetuses, millega kaasneb tavaliselt uuringualuse
higistamine. 10
A. Meetodid vasomotoorsete sümptomite ennetamiseks või ravimiseks
[0077] Ühe aspektina esitatakse leiutisega antikeha, mis on ette nähtud kasutamiseks
patsiendil peavalu (nt migreen) ravimise või ärahoidmise meetodis, mis hõlmab siin 15
määratletud CGRP-vastase antagonistliku antikeha tõhusa koguse manustamist patsiendile.
[0078] Antud valdkonna asjatundjad suudavad määrata konkreetsete CGRP antikehaga
kombinatsioonis kasutatavate toimeainete sobivad annused. Näiteks võib sumatriptaani
manustada annuses ligikaudu 0,01 kuni ligikaudu 300 mg. Mitteparenteraalse manustamise 20
korral on sumatriptaani tüüpiline annus ligikaudu 25 kuni ligikaudu 100 mg, kus üldiselt
eelistatakse annust ligikaudu 50 mg; parenteraalse manustamise korral on eelistatud annus
ligikaudu 6 mg. Kuid neid annuseid võib varieerida vastavalt tehnika tasemes standardsetele
meetoditele, nii et need oleksid optimeeritud konkreetse patsiendi jaoks või konkreetse
kombineeritud teraapia jaoks. Lisaks võib näiteks tselekoksiibi manustada koguses, mis on 25
vahemikus 50 kuni 500 mg.
[0079] Kõikide siin kirjeldatud meetodite puhul hõlmab viide CGRP-vastastele antagonist-
antikehadele ka koostisi, mis sisaldavad ühte või mitut nendest toimeainetest. Need
koostised võivad lisaks sisaldada sobivaid abiaineid, nagu näiteks farmatseutiliselt 30
aktsepteeritavaid abiaineid, sealhulgas puhvreid, mis on tehnika tasemes hästi tuntud.
Käesolevat leiutist võib kasutada üksi või teiste tavapäraste ravimeetoditega kombineeritult.
28 EE-EP 1 957 106 B2
[0080] CGRP-vastast antagonist-antikeha võib manustada indiviidile mis tahes sobival
viisil. Antud valdkonna asjatundjale peaks olema ilmselge, et siin kirjeldatud näidete
eesmärgiks ei ole käesoleva leiutise piiramine, vaid olemasolevate tehnikate illustreerimine.
Sellest tulenevalt manustatakse osades teostustes CGRP-vastast antagonist-antikeha
indiviidile vastavalt tuntud meetoditele, nagu näiteks manustatakse seda intravenoosselt, 5
näiteks boolusena või pideva infusiooni teel pikema aja jooksul, intramuskulaarselt,
intraperitoneaalselt, intratserebrospinaalselt, subkutaanselt, intraartikulaarselt,
sublinguaalselt, intrasünoviaalselt, insuflatsiooni teel, intratekaalselt, suukaudselt,
inhalatsiooni teel või topikaalselt. Manustamine võib olla süsteemne, näiteks intravenoosne
manustamine, või paikne. Manustamiseks on kasulikud kaubanduslikult kättesaadavad 10
nebulisaatorid vedelate formulatsioonide jaoks, sealhulgas pihustiga nebulisaatorid ja
ultrahelinebulisaatorid. Vedelaid formulatsioone võib vahetult nebuliseerida ja
lüofiliseeritud pulbrit võib nebuliseerida pärast taastamist. Alternatiivselt võib CGRP-
vastase antikeha muuta aerosooliks, kasutades fluorosüsiniku formulatsiooni ja
dosaatorinhalaatorit, või seda võib sisse hingata lüofiliseeritud ja jahvatatud pulbrina. 15
[0081] Ühes teostuses manustatakse CGRP-vastast antagonist-antikeha
asukohaspetsiifilise või sihtmärgistatud lokaalse manustamise tehnikatega.
Asukohaspetsiifiliste või sihtmärgistatud lokaalse manustamise tehnikate näidete hulka
kuuluvad erinevad siirdatavad CGRP-vastase antagonist-antikeha depooallikad või paikse 20
manustamise kateetrid, nagu näiteks infusioonikateetrid, sisemine kateeter või nõel-
kateeter, sünteetilised siirikud, ümbritsevad mähised, šundid või stendid või muud
siirdatavad vahendid, asukohaspetsiifilised tugiained, vahetu süstimine või vahetu
pealekandmine. Vt näiteks PCT publikatsioon nr WO 00/53211 ja USA patent nr 5 981 568.
25
[0082] Manustamiseks võib kasutada erinevaid CGRP-vastase antagonist-antikeha
formulatsioone. Osades teostustes võib CGRP-vastast antagonist-antikeha manustada
puhtalt. Osades teostustes võivad CGRP-vastane antagonist-antikeha ja farmatseutiliselt
aktsepteeritav abiaine olla erinevates formulatsioonides. Farmatseutiliselt aktsepteeritavad
abiained on tehnika tasemes tuntud ning need on suhteliselt inertsed ained, mis lihtsustavad 30
farmakoloogiliselt efektiivse aine manustamist. Näiteks võib abiaine anda vormi või
konsistentsi või toimida lahjendina. Sobivate abiainete hulka kuuluvad mittepiiravalt
stabilisaatorid, märgavad ained ja emulgaatorid, osmolaarsust varieerivad soolad,
29 EE-EP 1 957 106 B2
kapseldavad ained, puhvrid ja nahka imendumist parandavad ained. Abiained ning
formulatsioonid ravimi parenteraalseks ja mitteparenteraalseks manustamiseks on välja
toodud allikas Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack
Publishing (2000).
5
[0083] Osades teostustes on need toimeained formuleeritud süstimise teel manustamiseks
(näiteks intraperitoneaalseks, intravenoosseks, subkutaanseks, intramuskulaarseks jne
süstimiseks). Sellest tulenevalt võivad need toimeained olla kombineeritud farmatseutiliselt
aktsepteeritavate vehiikulitega, nagu näiteks soolalahusega, Ringeri lahusega, dekstroosi
lahusega jms. Konkreetne annustamisrežiim (st annus, ajastus ja kordus) sõltub konkreetsest 10
indiviidist ja selle indiviidi varasemast haigusloost.
[0084] CGRP-vastase antikeha manustamiseks võib kasutada mis tahes sobivat meetodit,
sealhulgas süstimist (näiteks intraperitoneaalselt, intravenoosselt, subkutaanselt,
intramuskulaarselt jne). CGRP-vastaseid antikehi võib manustada ka inhalatsiooni teel 15
vastavalt siin kirjeldatule. Üldiselt võib algne kandidaatannus CGRP-vastaste antikehade
manustamiseks olla ligikaudu 2 mg/kg. Käesoleva leiutise mõistes võib tüüpiline päevane
annus olla vahemikus ligikaudu 3 µg/kg kuni 30 µg/kg kuni 300 µg/kg kuni 3 mg/kg kuni
30 mg/kg kuni 100 mg/kg või suurem, olenevalt eespool nimetatud teguritest. Näiteks võib
kasutada annust, mis on ligikaudu 1 mg/kg, ligikaudu 2,5 mg/kg, ligikaudu 5 mg/kg, 20
ligikaudu 10 mg/kg ja ligikaudu 25 mg/kg. Korduvate manustamiste korral mitme päeva
jooksul või kauem jätkatakse ravi haigusseisundist olenevalt kuni sümptomite soovitud
pärssimiseni või kuni piisava terapeutilise toime saavutamiseni, näiteks valu
vähendamiseni. Annustamisrežiimi näide hõlmab algse annuse manustamist, mis on
ligikaudu 2 mg/kg, millele järgneb iganädalane säilitamisannus, mis on ligikaudu 1 mg/kg 25
CGRP-vastast antikeha, või millele järgneb säilitamisannus, mis on ligikaudu 1 mg/kg ja
mida manustatakse üle nädala. Kuid kasulikud võivad olla ka teised annustamisrežiimid,
olenevalt farmakokineetilise lagunemise mustrist, mida raviarst soovib saavutada. Näiteks
osades teostustes kaalutakse üks kuni neli korda nädalas annustamist. Selle ravimeetodi
edusamme on lihtne jälgida tavapäraste tehnikate ja analüüsimeetoditega. 30
Annustamisrežiim (sealhulgas kasutatud CGRP antagonist(id)) võib aja jooksul varieeruda.
30 EE-EP 1 957 106 B2
[0085] Käesoleva leiutise mõistes sõltub CGRP-vastase antagonist-antikeha sobiv annus
kasutatud CGRP-vastasest antagonist-antikehast (või selle koostistest), ravitava peavalu
tüübist ja tõsidusest (nt migreen), sellest, kas toimeainet manustatakse ennetavatel või
ravieesmärkidel, varasemast ravist, patsiendi kliinilisest ajaloost ja reaktsioonist antud
toimeainele ning raviarsti valikuvabadusest. Raviarst manustab tüüpiliselt CGRP-vastast 5
antagonist-antikeha seni, kuni saavutatakse annus, mis saavutab soovitud tulemusi. Annus
ja/või sagedus võib ravi jooksul varieeruda.
[0086] Empiirilised kaalutlused, nagu näiteks pooleluiga, aitavad annuse kindlaks
määramisele üldiselt kaasa. Näiteks antikehasid, mis ühilduvad inimese 10
immuunsüsteemiga, nagu näiteks humaniseeritud antikehasid või täielikult inimese
antikehasid võib kasutada antikeha pooleluea pikendamiseks ja selleks, et vältida antikeha
ründamist peremehe immuunsüsteemi poolt. Manustamise sagedust võib kindlaks määrata
ja kohandada ravi jooksul ning selle aluseks on üldiselt, kuid mitte ilmtingimata, peavalu
(näiteks migreeni) ravimine ja/või pärssimine ja/või leevendamine ja/või edasilükkamine. 15
Alternatiivselt võivad olla asjakohased CGRP-vastaste antagonist-antikehade pikaajalise
pideva vabanemisega formulatsioonid. Erinevad formulatsioonid ja vahendid pikaajalise
vabanemise saavutamiseks on tehnika tasemes tuntud.
[0087] Ühes teostuses võib CGRP-vastase antagonist-antikeha annused kindlaks määrata 20
empiiriliselt indiviidides, kellele on CGRP-vastast antagonist-antikeha üks või mitu korda
manustatud. Indiviididele manustatakse CGRP-vastase antagonist-antikeha lisanduvaid
annuseid. CGRP-vastase antagonist-antikeha tõhususe hindamiseks võib jälgida haiguse
näitajaid.
25
[0088] CGRP-vastase antagonist-antikeha manustamine vastavalt käesolevas leiutises
esitatud meetodile võib olla katkematu või vahelduv, olenevalt näiteks vastuvõtja
füsioloogilisest seisundist, kas manustamise eesmärk on terapeutiline või profülaktiline,
ning muudest kogenud meditsiinitöötajale tuntud teguritest. CGRP-vastase antagonist-
antikeha manustamine võib olla sisuliselt katkematu eelnevalt kindlaks määratud 30
ajavahemiku jooksul või see võib olla vahedega annuste seeria, näiteks enne peavalu (nt
migreeni) arenemist, selle ajal ja pärast seda; enne peavalu arenemist; peavalu ajal; enne ja
pärast peavalu arenemist; peavalu ajal ja pärast seda; enne peavalu arengut ja selle ajal; või
31 EE-EP 1 957 106 B2
enne peavalu arenemist, selle ajal ja pärast seda. Manustamine võib toimuda enne mis tahes
sündmust, mis võib tõenäoliselt peavalu põhjustada, selle ajal ja/või pärast seda.
[0089] Osades teostustes võib esindatud olla rohkem kui üks CGRP-vastane antagonist-
antikeha. Esindatud võib olla vähemalt üks, vähemalt kaks, vähemalt kolm, vähemalt neli, 5
vähemalt viis või rohkem CGRP-vastast antagonist-antikeha. Üldiselt võivad nendel CGRP-
vastastel antagonist-antikehadel olla täiendavad toimed, mis ei avalda üksteisele kahjulikku
mõju. CGRP-vastast antikeha võib kasutada ka koos mõne muu CGRP antagonisti või
CGRP retseptori antagonistiga. Näiteks võib kasutada ühte või mitut alljärgnevatest CGRP
antagonistidest: CGRP vastu suunatud antisenss-molekul (sealhulgas CGRPd kodeeriva 10
nukleiinhappe vastu suunatud antisenss-molekul), CGRPd inhibeeriv ühend, CGRP
struktuuriline analoog, CGRP retseptori dominant-negatiivne mutatsioon, mis seondub
CGRPga ning CGRP retseptori vastane antikeha. CGRP-vastast antagonist-antikeha võib
kasutada ka koos muude toimeainetega, mille eesmärgiks on parandada ja/või täiendada
nende toimeainete tõhusust. 15
[0090] Käesoleva leiutise kohaselt kasutatava CGRP-vastase antagonist-antikeha
terapeutilisi formulatsioone valmistatakse säilitamiseks selliselt, et soovitud puhtusastmega
antikeha segatakse valikuliste farmatseutiliste tugiainete, abiainete või stabilisaatoritega
(Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack Publishing 20
(2000)) lüofiliseeritud formulatsioonide või vesilahuste kujul. Aktsepteeritavad tugiained,
abiained või stabilisaatorid on vastuvõtjatele kasutatud annustes ja kontsentratsioonides
mittetoksilised ning nende hulka võivad kuuluda puhvrid, nagu näiteks fosfaat, titraat ja
teised orgaanilised happed; soolad, nagu näiteks naatriumkloriid; antioksüdandid, nagu
näiteks askorbiinhape ja metioniin; säilitusained (nagu näiteks oktadetsüüldimetüülbensüül-25
ammooniumkloriid; heksametooniumkloriid; bensalkooniumkloriid, bensetooniumkloriid;
fenool-, butüül- või bensüülalkohol; alküülparabeenid, nagu näiteks metüül- või
propüülparabeen; katekool; resortsinool; tsükloheksanool; 3-pentanool; ja m-kresool);
madala molekulmassiga (vähem kui ligikaudu 10 jääki) polüpeptiidid; valgud, nagu näiteks
seerumi albumiin, želatiin või immunoglobuliinid; hüdrofiilsed polümeerid, nagu näiteks 30
polüvinüülpürrolidoon; aminohapped, nagu näiteks glütsiin, glutamiin, asparagiin, histidiin,
arginiin või lüsiin; monosahhariidid, disahhariidid ja muud süsivesikud, sealhulgas glükoos,
mannoos või dekstriinid; kelaativad ained, nagu näiteks EDTA; suhkrud, nagu näiteks
32 EE-EP 1 957 106 B2
sahharoos, mannitool, trehaloos või sorbitool; sooli moodustavad vastasioonid, nagu näiteks
naatrium; metallikompleksid (näiteks Zn-valgu kompleksid); ja/või mitteioonsed
pindaktiivsed ained, nagu näiteks TWEEN™, PLURONICS™ või polüetüleenglükool
(PEG).
5
[0091] CGRP-vastast antagonist-antikeha sisaldavaid liposoome valmistatakse tehnika
tasemes tuntud meetoditega, mida on kirjeldatud näiteks allikates Epstein, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);
ja USA patentides nr 4 485 045 ja 4 544 545. Parandatud tsirkulatsiooniajaga liposoome on
kirjeldatud USA patendis nr 5 013 556. Eriti kasulikke liposoome saab genereerida 10
pöördfaasilise aurustamismeetodi abil lipiidi koostisega, mis sisaldab fosfatidüülkoliini,
kolesterooli ja PEG-derivatiseeritud fosfatidüületanoolamiini (PEG-PE). Liposoomid
surutakse läbi kindlaksmääratud poori suurusega filtrite, et saada soovitud diameetriga
liposoomid.
15
[0092] Toimeained võivad olla ka sisestatud mikrokapslitesse, mis on valmistatud näiteks
koatservatsioonitehnikate või faasidevahelise polümerisatsiooni teel, näiteks vastavalt
hüdroksümetüültselluloosi või želatiini mikrokapslitesse ning polü-(metüülmetatsülaat)-
mikrokapslitesse kolloidsetes ravimi manustamise süsteemides (näiteks liposoomid,
albumiini mikrosfäärid, mikroemulsioonid, nanoosakesed ja nanokapslid) või 20
makroemulsioonides. Selliseid tehnikaid on kirjeldatud allikas Remington, The Science and
Practice of Pharmacy, 20. väljaanne, Mack Publishing (2000).
[0093] Valmistada võib ka pikaajalise vabanemisega preparaate. Pikaajalise vabanemisega
preparaatide sobivate näidete hulka kuuluvad poolläbilaskvad tahkete hüdrofoobsete 25
polümeeride maatriksid, mis sisaldavad antikeha; nimetatud maatriksid on vormitud
toodete, näiteks kilede või mikrokapslite kujul. Pikaajalise vabanemisega maatriksite
näidete hulka kuuluvad polüestrid, hüdrogeelid (näiteks polü-2-hüdroksüetüül-metakrülaat
või polüvinüülalkohol), polülaktiidid (USA patent nr 3 773 919), L-glutamiinhappe
kopolümeerid ja 7-etüül-L-glutamaat, lagunematu etüleenvinüülatsetaat, lagunevad 30
piimhappe-glükoolhappe kopolümeerid, nagu näiteks LUPRON DEPOT™ (süstitavad
mikrosfäärid, mis koosnevad piimhappe-glükoolhappe kopolümeerist ja
leuproliidatsetaadist), sahharoosatsetaatisobutüraat ja polü-D-(-)-3-hüdroksübutüürhape.
33 EE-EP 1 957 106 B2
[0094] In vivo manustamiseks kasutatavad formulatsioonid peavad olema steriilsed. Seda
on lihtne saavutada näiteks filtreerimisega läbi steriilsete filtreerimismembraanide.
Terapeutilised CGRP-vastase antagonist-antikeha koostised paigutatakse üldiselt
mahutisse, millel on steriilne juurdepääsuava, näiteks intravenoosse lahuse kotti või viaali,
millel on hüpodermilise nõelaga läbistatav kork. 5
[0095] Käesoleva leiutise kohased koostised võivad olla ühikannuste kujul, nagu näiteks
tabletid, pillid, kapslid, pulbrid, graanulid, lahused või suspensioonid või suposiidid
suukaudseks, parenteraalseks või rektaalseks manustamiseks või inhalatsiooni või
insulfatsiooni teel manustamiseks. 10
[0096] Tahkete koostiste, nagu näiteks tablettide valmistamiseks segatakse peamine
toimeaine farmatseutilise tugiainega, näiteks tavapäraste tablettide valmistamiseks
kasutatavate koostisosadega, nagu näiteks maisitärklise, laktoosi, sahharoosi, sorbitooli,
talgi, steaarhappe, magneesiumstearaadi, dikaltsiumfosfaadi või kummidega, ja teiste 15
farmatseutiliste lahjenditega, näiteks veega, et valmistada tahke preformulatsiooni koostis,
mis sisaldab käesoleva leiutise ühendi või selle farmatseutiliselt aktsepteeritava
mittetoksilise soola homogeenset segu. Kui selliseid preformulatsiooni koostisi
kirjeldatakse homogeensetena, siis mõeldakse selle all seda, et toimeaine on ühtlaselt
hajutatud kogu koostise ulatuses selliselt, et koostise võib lihtsalt jagada omakorda võrdselt 20
tõhusateks ühikannuste vormideks, nagu näiteks tablettideks, pillideks ja kapsliteks.
Seejärel jagatakse tahke preformulatsiooni koostis eespool kirjeldatud ühikannuste
vormideks, mis sisaldavad 0,1 kuni ligikaudu 500 mg käesoleva leiutise kohast toimeainet.
Selle uudse koostise tabletid või pillid võib katta või muul tervikuks muuta, et pakkuda
ravimvormi, mis annab pikaajalise toime eelise. Näiteks võib tablett või pill sisaldada 25
sisemise annuse ja välimise annuse komponenti, kusjuures viimane võib esimest
ümbritseda. Need kaks komponenti võivad olla eraldatud enteerse kihiga, mille eesmärgiks
on vältida selle lagunemist maos ning see võimaldab sisemisel komponendil liikuda
terviklikult edasi kaksteistsõrmiksoolde või selle vabanemist edasi lükata. Selliste
enteersete kihtide või kattekihtide valmistamiseks võib kasutada erinevaid materjale, 30
sealhulgas mitmeid polümeerseid happeid ja polümeersete hapete segusid selliste
materjalidega nagu šellak, tsetüülalkohol ja tselluloosatsetaat.
34 EE-EP 1 957 106 B2
[0097] Sobivate pindaktiivsete ainete hulka kuuluvad eelkõige mitteioonsed ained, nagu
näiteks polüoksüetüleensorbitaanid (näiteks Tween™ 20, 40, 60, 80 või 85) ja teised
sorbitaanid (näiteks Span™ 20, 40, 60, 80 või 85). Pindaktiivset ainet sisaldavad koostised
sisaldavad sobivalt 0,05 kuni 5% pindaktiivset ainet ning võib sisaldada seda 0,1 kuni 2,5%.
Siinkohal on selge, et vajaduse korral võib lisada ka teisi koostisosi, näiteks mannitooli või 5
teisi farmatseutiliselt aktsepteeritavaid vehiikuleid.
[0098] Sobivate emulsioonide valmistamiseks võib kasutada kaubanduslikult
kättesaadavaid rasvemulsioone, nagu näiteks Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™,
Lipofundin™ ja Lipiphysan™. Toimeaine võib olla lahustatud eelnevalt kokku segatud 10
emulsiooni koostises või alternatiivselt võib selle lahustada õlis (näiteks sojaoaõlis,
safloorõlis, puuvillaseemneõlis, seesamiõlis, maisiõlis või mandliõlis) ning emulsioon
moodustatakse fosfolipiidiga (näiteks muna fosfolipiidid, sojaoa fosfolipiidid või sojaoa
letsitiin) segamisel. Siinkohal on selge, et emulsiooni tonaalsuse reguleerimiseks võib lisada
ka teisi koostisosi, näiteks glütserooli või glükoosi. Sobivad emulsioonid sisaldavad 15
tüüpiliselt kuni 20% õli, näiteks vahemikus 5 kuni 20% õli. Rasvemulsioon võib koosneda
rasvatilkadest, mille läbimõõt on vahemikus 0,1 kuni 1,0 lm, eelkõige vahemikus 0,1 kuni
0,5 lm, ning selle pH on vahemikus 5,5 kuni 8,0.
[0099] Emulsiooni koostised võivad olla sellised, mis on valmistatud CGRP-vastase 20
antagonist-antikeha segamise teel Intralipid™.või selle komponentidega (sojaoaõli, muna
fosfolipiidid, glütserool ja vesi).
[0100] Inhalatsiooniks või insuflatsiooniks kasutatavate koostiste hulka kuuluvad lahused
ja suspensioonid farmatseutiliselt aktsepteeritavates veepõhistes või orgaanilistes lahustites, 25
või nende segud, või pulbrid. Vedelad või tahked koostised võivad sisaldada sobivaid
farmatseutiliselt aktsepteeritavaid abiaineid vastavalt eespool väljatoodule. Osades
teostustes manustatakse koostisi lokaalse või süsteemse toime saavutamiseks suukaudselt
või nina hingamisteede kaudu. Eelistatult steriilsetes farmatseutiliselt aktsepteeritavates
lahustites olevad koostised võivad olla nebuliseeritud gaaside kasutamise teel. 30
Nebuliseeritud lahuseid võib sisse hingata vahetult nebuliseerimisseadmest või see
nebuliseerimisseade võib olla kinnitatud näomaski, tendi või hootise positiivse rõhuga
hingamisseadme külge. Lahuse, suspensiooni või pulbri koostisi võib manustada (eelistatult
35 EE-EP 1 957 106 B2
suukaudselt või nasaalselt) seadmetest, mis sisestavad formulatsiooni organismi sobival
viisil.
[0101] Peavalu diagnoosimist või hindamist on tehnika tasemes põhjalikult kirjeldatud.
Hindamist võib teostada subjektiivsete mõõtmiste alusel, nagu näiteks selle alusel, kuidas 5
patsient sümptomeid iseloomustab. Näiteks migreeni võib diagnoosida järgmiste
kriteeriumide alusel: 1) episoodilised peavaluhood, mis kestavad 4 kuni 72 tundi; 2) esineb
kaks alljärgnevatest sümptomitest: ühepoolne valu, tuikav valu, süvenev valu liikumise
korral ning keskmise või tugeva intensiivsusega valu; ja 3) esineb üks alljärgnevatest
sümptomitest: iiveldus või oksendamine ning fotofoobia või fonofoobia. Goadsby et al., N. 10
Engl. J. Med. 346:257–270, 2002.
[0102] Ravi tõhusust saab hinnata tehnika tasemes hästi tuntud meetoditega. Näiteks võib
hinnata valu leevendamist. Sellest tulenevalt jälgitakse osades teostustes valu leevendamist
subjektiivselt 1, 2 või mõni tund pärast CGRP-vastase antikeha manustamist. Osades 15
teostustes jälgitakse peavaluhoogude sagedust subjektiivselt pärast CGRP-vastase antikeha
manustamist.
B. CGRP-vastased antagonist-antikehad
20
[0103] Käesolev leiutis on seotud CGRP-vastase antagonist-antikeha kasutamisega, mis
osutab mis tahes antikeha molekulile, mis blokeerib, pärsib või vähendab (sealhulgas
märkimisväärselt) CGRP bioloogilist aktiivsust, sealhulgas CGRP signaliseerimisega
vahendatud pärisuunalisi radasid, nagu näiteks retseptori seondumist ja/või rakulise
reaktsiooni esile kutsumist CGRP suhtes. 25
[0104] CGRP-vastasel antagonist-antikehal peaks olema üks või mitu alljärgnevat
omadust: (a) seondub CGRPga; (b) blokeerib CGRP seondumist selle retseptori(te)ga; (c)
blokeerib või vähendab CGRP retseptori aktiveerimist (sealhulgas cAMP aktiveerimist); (d)
inhibeerib CGRP bioloogilist aktiivsust või CGRP signaliseerimisega vahendatud 30
pärisuunalisi radasid; (e) ennetab, leevendab või ravib mis tahes peavalu aspekti (näiteks
migreeni); (f) suurendab CGRP kõrvaldamist; ja (g) inhibeerib (vähendab) CGRP
sünteesimist, tootmist või vabanemist. CGRP-vastased antagonist-antikehad on tehnika
36 EE-EP 1 957 106 B2
tasemes tuntud. Vt näiteks Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565–73, 1995; Sigma (Missouri,
US), toode nr C7113 (kloon nr 4901); Plourde et al., Peptides 14:1225–1229,1993.
[0105] Käesoleva leiutise mõistes reageerib antikeha CGRPga sellisel viisil, et see
inhibeerib CGRPd ja/või CGRP signaliseerimisega vahendatud pärisuunalisi radasid. 5
Osades teostustes seondub CGRP-vastane antagonist-antikeha nii inimese α-CGRP kui ka
β-CGRPga. Osades teostustes seondub CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese ja roti
CGRPga. Osades teostustes seondub CGRP-vastane antagonist-antikeha C-otsa epitoobiga
CGRP aminohapetes 25–37.
10
[0106] Käesolevas leiutises kasulike antikehade hulka võivad kuuluda monoklonaalsed
antikehad, bispetsiifilised antikehad, heterokonjugaat-antikehad, humaniseeritud antikehad
ja mis tahes muu immunoglobuliini molekuli modifitseeritud konfiguratsioon, mis sisaldab
nõutud spetsiifilisusega antigeeni äratundmissaiti, sealhulgas antikehade glükosüleerimise
variandid, antikehade aminohappejärjestuse variandid ja kovalentselt modifitseeritud 15
antikehad.
[0107] Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha monoklonaalne antikeha.
Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha humaniseeritud antikeha. Osades
teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese antikeha. Osades teostustes on 20
CGRP-vastane antagonist-antikeha antikeha G1 (vastavalt siin kirjeldatule). Osades
teostustes sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha tabelis 6 välja toodud antikeha G1
või G1 variantide ühte või mitut CDRi (nagu näiteks ühte, kahte, kolme, nelja, viit või
osades teostustes kõiki kuut CDRi). Veel teistes teostustes sisaldab CGRP-vastane
antagonist-antikeha Joonisel FIG 5 välja toodud raske ahela varieeruva piirkonna 25
aminohappejärjestust (SEQ ID NO:1) ja Joonisel FIG 5 välja toodud kerge ahela varieeruva
piirkonna aminohappejärjestust (SEQ ID NO:2).
[0108] Osades teostustes sisaldab antikeha modifitseeritud konstantset piirkonda, nagu
näiteks käesolevas kirjeldatud immunoloogiliselt inertset konstantset piirkonda. Osades 30
teostustes on konstantset piirkonda modifitseeritud viisil, mida on kirjeldatud allikates Eur.
J. Immunol. (1999) 29:2613–2624; ja WO99/58572. Teistes teostustes sisaldab antikeha
inimese raske ahela IgG2 konstantset piirkonda, mis sisaldab alljärgnevaid mutatsioone:
37 EE-EP 1 957 106 B2
A330P331 on muudetud S330S331ks (aminohapete loend viitega looduslikule IgG2
järjestusele). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624. Osades teostustes sisaldab antikeha
IgG4 konstantset piirkonda, mis sisaldab alljärgnevaid mutatsioone: E233F234L235 on
muudetud P233V234A235ks. Veel osades teistes teostustes aglükosüleeritakse pidev
piirkond N-seotud glükosüleerimise jaoks. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev 5
piirkond N-seotud glükosüleerimise jaoks oligosahhariidi kinnitumise jäägi (nagu näiteks
Asn297) ja/või flankeerivate jääkide muteerimise teel, mis on N-glükosüleerimist ära
tundva järjestuse osa konstantses piirkonnas. Osades teostustes on pidev piirkond N-seotud
glükosüleerimise jaoks aglükosüleeritud. Konstantset piirkonda võib aglükosüleerida N-
seotud glükosüleerimise jaoks ensümaatiliselt või ekspresseerimise kaudu glükosüleerimise 10
puudulikkusega peremeesrakus.
[0109] Üks viis, kuidas kindlaks määrata antikehade seondumisafiinsust CGRP suhtes, on
mõõta antikeha monofunktsionaalsete Fab fragmentide seondumisafiinsust.
Monofunktsionaalsete Fab fragmentide saamiseks võib antikeha (näiteks IgG) lõhustada 15
papaiiniga või ekspresseerida rekombinantselt. Antikeha CGRP-vastase Fab fragmendi
afiinsust saab kindlaks määrata pinna plasmonresonantsiga (Biacore3000™ pinna
plasmonresonantsi (surface plasmon resonance, SPR) süsteem, Biacore, INC, Piscataway
NJ), mis on varustatud eelnevalt immobiliseeritud streptavidiini sensorkiipidega (SA),
kasutades HBS-EP voolavat puhvrit (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 NaCl, 3 mM EDTA, 20
0,005% v/v pindaktiivset ainet P20). Biotinüülitud inimese CGRP (või mis tahes muu
CGRP) võib lahjendada HBS-EP puhvrisse kontsentratsioonini, mis on väiksem kui 0,5
μg/ml ning pritsida üle individuaalsete kiipide kanalite, kasutades varieeruvaid
kokkupuuteaegu, et saavutada kaks antigeeni tiheduse vahemikku, milleks on 50–200
vastusühikut (response unit, RU) üksikasjalikeks kineetilisteks uuringuteks või 800–1000 25
RU skriininganalüüsideks. Regeneratsiooni uuringud on näidanud, et 25 mM NaOH 25%
v/v etanoolis eemaldab efektiivselt seotud Fabi, säilitades samal ajal CGRP aktiivsust kiibil
rohkem kui 200 süstimise jooksul. Tüüpiliselt süstitakse puhastatud Fabi proovide
seerialahjendusi (kontsentratsioonide ulatus on 0,1–10 × hinnanguline KD) 1 minuti jooksul
kiirusega 100 µl/minutis ning lubatakse kuni 2-tunniseid dissotsiatsiooniaegu. Fab valkude 30
kontsentratsioonid määratakse kindlaks ELISA analüüsiga ja/või SDS-PAGE
elektroforeesiga, kasutades standardina Fabi teadaolevaid kontsentratsioone (vastavalt
aminohappe analüüsiga kindlaks määratule). Kineetilised assotsiatsioonikiirused (kon) ja
38 EE-EP 1 957 106 B2
dissotsiatsioonikiirused (koff) saadakse samaaegselt, kui andmed sobitatakse üldiselt 1:1
Langmuiri seondumismudelisse (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994).
Methods Enzymology 6. 99–110), kasutades programmi BIA Evaluation. Dissotsiatsiooni
tasakaalukonstandi (KD) väärtused arvutatakse võrrandist koff/kon. See protokoll sobib
kasutamiseks antikeha seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks mis tahes CGRP suhtes, 5
sealhulgas inimese CGRP, mõne teise imetaja CGRP (nagu näiteks hiire CGRP, roti CGRP,
primaadi CGRP) ning samuti CGRP erinevate vormide (nagu näiteks α- ja β-vormi) suhtes.
Antikeha seondumisafiinsust mõõdetakse üldiselt 25 °C juures, kuid seda võib mõõta ka
37 °C juures.
10
[0110] CGRP-vastaste antagonist-antikehade valmistamiseks võib kasutada mis tahes
tehnika tasemes tuntud meetodit. Peremeesraku immuniseerimise viisi ja ajakava puhul
järgitakse üldiselt väljakujunenud ja tavapäraseid tehnikaid, mida kasutatakse antikeha
stimuleerimiseks ja tootmiseks vastavalt siin edaspidi kirjeldatule. Üldised tehnikad inimese
ja hiire antikehade tootmiseks on tehnika tasemes tuntud ning neid on siin kirjeldatud. 15
[0111] Siinkohal peetakse võimalikuks, et mis tahes imetajast uuringualust, sealhulgas
inimesi või nendelt saadud antikeha tootvaid rakke saab manipuleerida, et kasutada neid
alusena imetaja, sealhulgas inimese hübridoomi rakuliinide tootmiseks. Tüüpiliselt
inokuleeritakse peremeeslooma intraperitoneaalselt, intramuskulaarselt, suukaudselt, 20
subkutaanselt, intraplantaarselt ja/või intradermaalselt immunogeeni, sealhulgas käesolevas
kirjeldatud immunogeeni annusega.
[0112] Hübridoome võib valmistada lümfotsüütidest ja surematuks muudetud
müeloomirakkudest, kasutades üldist somaatilise raku hübridiseerimise tehnikat, mida on 25
kirjeldanud Kohler, B. ja Milstein, C. (1975) Nature 256:495–497 või mida on
modifitseerinud Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377–381 (1982). Hübridiseerimiseks võib
kasutada kättesaadavaid müeloomi rakuliine, sealhulgas mittepiiravalt X63-Ag8.653 ja
neid, mis on pärit Salki instituudist, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA.
Üldiselt hõlmab selline tehnika müeloomirakkude ja lümfoidrakkude ühildamist, kasutades 30
selleks fusogeeni, nagu näiteks polüetüleenglükooli, või elektriseadmeid, mis on antud
valdkonna asjatundjatele hästi tuntud. Pärast ühildamist eraldatakse rakud
ühildamissöötmest ja neid kasvatatakse selektiivses kasvusöötmes, nagu näiteks
39 EE-EP 1 957 106 B2
hüpoksantiin-aminopteriin-tümidiini (HAT) söötmes, et kõrvaldada hübridiseerimata
lähterakud. Mis tahes siin kirjeldatud söötmeid, mida on või ei ole seerumiga täiendatud,
võib kasutada hübridoomide kultiveerimiseks, mis eritavad monoklonaalseid antikehasid.
Rakkude ühildamise tehnika alternatiivina võib kasutada EBVga surematuks muudetud B-
rakke, et toota käesoleva leiutise teemaks olevaid CGRP-vastaseid monoklonaalseid 5
antikehi. Hübridoome võib soovi korral laiendada ja edasi kloonida ning supernatante
analüüsitakse nende immunogeenivastase toime suhtes tavapäraste immunoanalüüsi
protseduuridega (näiteks radioimmuunanalüüs, ensüümimmuunanalüüs või fluorestsents-
immuunanalüüs).
10
[0113] Hübridoomid, mida võib kasutada antikehade allikana, hõlmavad kõiki derivaate,
lähtehübridoomide järglasrakke, mis toodavad CGRP suhtes spetsiifilisi monoklonaalseid
antikehi või nende osasid.
[0114] Hübridoome, mis toodavad selliseid antikehi, võib kasvatada in vitro või in vivo, 15
kasutades selleks tuntud protseduure. Monoklonaalseid antikehi võib soovi korral isoleerida
kultuurisöötmest või kehavedelikest tavapäraste immunoglobuliini puhastamise
protseduuridega, nagu näiteks ammooniumsulfaadiga sadestamise, geelelektroforeesi,
dialüüsi, kromatograafia ja ultrafiltratsiooni teel. Soovimatu toime (kui see on olemas) saab
eemaldada näiteks selliselt, et preparaadil lastakse voolata üle adsorbentide, mis on 20
valmistatud tahke faasi külge kinnitunud immunogeenist ning seejärel elueeritakse või
vabastatakse immunogeenist soovitud antikehad. Peremeeslooma immuniseerimine inimese
CGRPga või fragmendiga, mis sisaldab immuniseeritavates osakestes immunogeense
valguga konjugeeritud märklaud-aminohappejärjestust, näiteks meriteo hemotsüaniini,
seerumi albumiini, veise türeoglobuliini või sojaoa trüpsiini inhibiitoriga, kasutades 25
bifunktsionaalset või derivatiseerivat ainet, näiteks maleimidobensoüül-sulfosuktsinimiidi
estrit (konjugatsioon tsüsteiini jääkide kaudu), N-hüdroksüsuktsinimiidi (lüsiini jääkide
kaudu), glutaaraldehüüdi, suktsiinanhüdriidi, SOCl2 või R1N=C=NR (kus R ja R1 on
erinevad alküülrühmad), võib anda tulemuseks antikehade populatsiooni (näiteks
monoklonaalsed antikehad). 30
[0115] Soovi korral võib huvipakkuva CGRP-vastase antagonist-antikeha (monoklonaalse
või polüklonaalse) järjestada ning seejärel võib polünukleotiidijärjestuse kloonide
40 EE-EP 1 957 106 B2
vektorisse ekspresseerimiseks või levitamiseks. Huvipakkuvat antikeha kodeerivat
järjestust võib säilitada peremeesrakus sisalduvas vektoris ning seda peremeesrakku võib
seejärel laiendada ja külmutada tulevaseks kasutamiseks. Alternatiivina võib
polünukleotiidijärjestust kasutada geneetilistes manipulatsioonides, et „humaniseerida”
antikeha või parandada antikeha afiinsust või teisi omadusi. Näiteks võib konstantset 5
piirkonda töödelda selliselt, et see sarnaneks rohkem inimese konstantsetele piirkondadele,
et vältida immuunvastust, kui seda antikeha kasutatakse kliinilistes uuringutes ja inimeste
ravimiseks. Antikeha järjestuse geneetiline manipuleerimine võib olla CGRP suhtes
suurema afiinsuse ja CGRP inhibeerimisel suurema tõhususe saavutamiseks. Antud
valdkonna asjatundjale on selge, et CGRP-vastasele antagonist-antikehal võib muuta ühte 10
või mitut polünukleotiidi ning see säilitab endiselt oma seondumisafiinsuse CGRP suhtes.
[0116] Monoklonaalse antikeha humaniseerimine hõlmab nelja üldist etappi. Need on: (1)
lähteantikeha kerge ja raske ahela varieeruvate piirkondade nukleotiidi ja prognoositava
aminohappejärjestuse kindlaks määramine; (2) humaniseeritud antikeha kavandamine, st 15
otsustamine, millist antikeha raampiirkonda kasutatakse humaniseerimisprotsessi ajal; (3)
tegelikud humaniseerimise metodoloogiad/tehnikad; ja (4) humaniseeritud antikeha
transfekteerimine ja ekspresseerimine. Vt näiteks USA patendid nr 4 816 567; 5 807 715;
5 866 692; 6 331 415; 5 530 101; 5 693 761; 5 693 762; 5 585 089; ja 6 180 370.
20
[0117] Kirjeldatud on mitmeid „humaniseeritud” antikeha molekule, mis sisaldavad mitte-
inimese immunoglobuliinist tuletatud antigeeni sidumissaiti, sealhulgas kimäärseid
antikehasid, millel on närilise või modifitseeritud närilise V piirkonnad ja nendega
kaasnevad komplementaarsust määravad piirkonnad (CDRid), mis on ühendatud inimese
konstantsete domeenidega. Vt näiteks Winter et al., Nature 349:293–299 (1991), Lobuglio 25
et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220–4224 (1989), Shaw et al., J Immunol. 138:4534–
4538 (1987), ja Brown et al., Cancer Res. 47:3577–3583 (1987). Teistes viiteallikates on
kirjeldatud närilise CDRe, mis on siirdatud inimese toetavasse raampiirkonda (FR) enne
ühendamist sobiva inimese antikeha konstantse domeeniga. Vt näiteks Riechmann et al.,
Nature 332:323–327 (1988), Verhoeyen et al., Science 239:1534–1536 (1988), ja Jones 30
et al., Nature 321:522–525 (1986). Teistes viiteallikates on kirjeldatud närilise CDRe, mida
toetavad rekombinantselt töödeldud närilise raampiirkonnad. Vt näiteks Euroopa
patendipublikatsiooni nr 0519596. Need „humaniseeritud” molekulid on kujundatud
41 EE-EP 1 957 106 B2
selliselt, et viia miinimumini soovimatu immunoloogiline reaktsioon närilise inimese
vastase antikeha molekulide suhtes, mis piirab neid fragmente kasutavate rakenduste kestust
ja tõhusust inimestest vastuvõtjates. Näiteks võib antikeha konstantset piirkonda töödelda
selliselt, et see on immunoloogiliselt inertne (näiteks ei käivita komplemendi lüüsi). Vt
näiteks WO99/58572. Humaniseeritud antikehade teisi meetodeid, mida võib samuti 5
kasutada, on kirjeldatud allikas Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471–2476 (1991) ja
USA patentides nr 6 180 377; 6 054 297; 5 997 867; 5 866 692; 6 210 671; ja 6 350 861;
ning PCT publikatsioonis nr WO 01/27160.
[0118] Veel ühe võimalusena võib täielikult inimese antikehasid saada kaubanduslikult 10
kättesaadavaid hiiri kasutades, mida on töödeldud selliselt, et need ekspresseerivad
spetsiifilisi inimese immunoglobuliini valke. Humaniseeritud või inimese antikehade
genereerimiseks võib kasutada ka transgeenseid loomi, keda on disainitud selliselt, et need
toodavad soovitavamaid antikehasid (näiteks täielikult inimese antikehasid) või jõulisemat
immuunvastust. Sellise tehnoloogia näited on Xenomouse ™ ettevõttelt Abgenix, Inc. 15
(Fremont, CA) ning HuMAb-Mouse® ja TC Mouse™ ettevõttelt Medarex, Inc. (Princeton,
NJ).
[0119] Alternatiivselt võib antikehasid valmistada rekombinantselt ja ekspresseerida mis
tahes tehnika tasemes tuntud meetodit kasutades. Teise võimalusena võib antikehasid 20
valmistada rekombinantselt faagidisplei tehnoloogiat kasutades. Vt näiteks USA patente nr
5 565 332; 5 580 717; 5 733 743; ja 6 265 150; ja Winter et al., Annu. Rev. Immunol.
12:433–455 (1994). Alternatiivselt võib faagidisplei tehnoloogiat (McCafferty et al., Nature
348:552–553 (1990)) kasutada inimese antikehade ja antikeha fragmentide valmistamiseks
in vitro immuniseerimata doonoritelt pärit immunoglobuliini varieeruva (V) domeeni 25
geenivalikust. Selle tehnika kohaselt kloonitakse antikeha V-domeeni geenid raamistikku
kas filamentoosse bakteriofaagi, nagu näiteks M13 või fd suurema või väiksema kattevalgu
geeni ning demonstreeritakse funktsionaalse antikeha fragmentidena faagiosakese pinnal.
Kuna filamentoosne osake sisaldab faagi genoomi ühetüvelist DNA koopiat, annab antikeha
funktsionaalsetel omadustel põhinev selekteerimine tulemuseks ka selliste omadustega 30
antikeha kodeeriva geeni selekteerimise. Seega matkib faag osasid B-raku omadusi.
Faagidispleid võib teostada erinevates formaatides; ülevaate saamiseks vt näiteks allika
Johnson, Kevin S. ja Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564–571
42 EE-EP 1 957 106 B2
(1993). Faagidisplei jaoks võib kasutada mitmeid V-geeni segmentide allikaid. Clackson
et al., Nature 352:624–628 (1991) isoleerisid mitmekesise oksasolooni vastaste antikehade
maatriksi immuniseeritud hiirte põrnadest saadud V-geenide väikesest juhuslikult
kombineeritud pangast. Immuniseerimata inimdoonoritelt saadud V-geenide repertuaari
võib konstrueerida ning antikehasid mitmekesise antigeenide (sealhulgas iseeneslike 5
antigeenide) maatriksi suhtes võib isoleerida, järgides peamiselt tehnikaid, mida on
kirjeldatud allikates Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581–597 (1991), või Griffith et al., EMBO
J. 12:725–734 (1993). Loomuliku immuunvastuse puhul akumuleerivad antikeha geenid
mutatsioone kõrgel kiirusel (somaatiline hüpermutatsioon). Osad sisestatud muudatustest
annavad kõrgema afiinsuse ning B-rakud, millel on kõrge afiinsus pinna immunoglobuliini 10
suhtes, eelistatult replitseeritakse ja diferentseeritakse järgneva antigeeni väljakutse ajal.
Seda loomulikku protsessi saab matkida, kasutades tehnikat, mis on tuntud nimetusega
„ahela ümberpaigutamine”. Marks, et al., Bio/Technol. 10:779–783 (1992)). Selles
meetodis saab faagidispleist saadud „primaarsete” inimese antikehade afiinsust parandada,
asendades üksteise järel raske ja kerge ahela V-piirkonna geenid immuniseerimata 15
doonoritelt saadud V-domeeni geenide looduslikult esinevate variantide repertuaaridega.
See tehnika võimaldab toota antikehasid ja antikeha fragmente, mille afiinsused jäävad pM–
nM suurusjärku. Strateegiat väga suurte faagi antikeha repertuaaride valmistamiseks (tuntud
ka kui emapangad ehk nn the mother-of-all libraries) on kirjeldatud allikas Waterhouse
et al., Nucl. Acids Res. 21:2265–2266 (1993). Geenide ümberpaigutamist võib kasutada ka 20
närilise antikehadest inimese antikehade tuletamiseks, kus inimese antikehal on närilise
lähteantikehale sarnanevad afiinsused ja spetsiifilisused. Vastavalt sellele meetodile, mida
nimetatakse ka „epitoobi jäljendamiseks”, asendatakse faagidisplei tehnikaga saadud
närilise antikeha raske või kerge ahela V-domeeni geen inimese V-domeeni geeni
repertuaariga, luues seeläbi närilise-inimese kimäärid. Antigeenil selekteerimine annab 25
tulemuseks inimese varieeruvate piirkondade isoleerimise, mis suudavad taastada
funktsionaalse antigeeni sidumissaidi, st epitoop juhib (jäljendab) partneri valikut. Kui seda
protsessi korratakse ülejäänud närilise V-domeeni asendamiseks, siis saadakse selle
tagajärjel inimese antikeha (vt PCT publikatsiooni nr WO 93/06213, avaldatud 1. aprillil
1993). Erinevalt närilise antikehade traditsioonilisest humaniseerimisest CDRide siirdamise 30
teel pakub käesolev tehnika täielikult inimese antikehasid, millel ei ole ühtegi närilise
päritolu raamistikku ega CDR-jääke.
43 EE-EP 1 957 106 B2
[0120] Kuigi eelnev kirjeldus on seotud humaniseeritud antikehadega, on siiski ilmselge,
et käsitletud üldpõhimõtteid võib rakendada ka antikehade kohandamiseks, et kasutada neid
näiteks koertel, kassidel, primaatidel, hobustel ja veistel. Lisaks on ilmselge, et ühte või
mitut siin kirjeldatud antikeha humaniseerimise aspekti võib omavahel kombineerida,
näiteks CDRi siirdamist, raamistiku mutatsiooni ja CDRi mutatsiooni. 5
[0121] Antikehasid võib valmistada rekombinantselt, isoleerides kõigepealt antikehad ja
antikeha tootvad rakud peremeesloomadest, eraldades geenijärjestuse, ning kasutades seda
geenijärjestust antikeha rekombinantseks ekspresseerimiseks peremeesrakkudes (näiteks
CHO-rakkudes). Teine meetod, mida võib kasutada, on seotud antikeha järjestuse 10
ekspresseerimisega taimedes (näiteks tubakas) või transgeenses piimas. Meetodid
antikehade rekombinantseks ekspresseerimiseks taimedes või piimas on avaldatud. Vt
näiteks Peeters, et al., Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. ja D. Huszar, Int. Rev. Immunol
13:65 (1995); ja Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147(1999). Meetodid antikehade
derivaatide, näiteks humaniseeritud, üheahelaliste jne antikehade valmistamiseks on tehnika 15
tasemes tuntud.
[0122] CGRP suhtes spetsiifiliste antikehade isoleerimiseks võib kasutada ka
immunoanalüüse ja voolutsütomeetrilisi sorteerimistehnikaid, nagu näiteks fluorestsents-
aktiveeritud rakusorteerimist (FACS). 20
[0123] Antikehad võivad olla seotud paljude erinevate tugiainetega. Tugiained võivad olla
aktiivsed ja/või inertsed. Hästi tuntud tugiainete näidete hulka kuuluvad polüpropüleen,
polüstüreen, polüetüleen, dekstraan, nailon, amülaasid, klaas, looduslikud ja modifitseeritud
tselluloosid, polüakrüülamiidid, agaroosid ja magnetiit. Käesoleva leiutise mõistes võib 25
selline tugiaine olla oma olemuselt lahustuv või lahustumatu. Antud valdkonna asjatundjad
teavad teisi antikehade sidumiseks sobivaid tugiaineid või nad on suutelised neid kindlaks
määrama rutiinseid katsetamismeetodeid kasutades. Osades teostustes sisaldab tugiaine
fragmenti, mille märklauaks on müokard (südamelihas).
30
[0124] Monoklonaalseid antikehi kodeerivat DNAd on lihtne isoleerida ja järjestada
tavapäraseid protseduure kasutades (kasutades näiteks oligonukleotiidi proove, mis
suudavad spetsiifiliselt seonduda geenidega, mis kodeerivad monoklonaalsete antikehad
44 EE-EP 1 957 106 B2
raskeid ja kergeid ahelaid). Sellise DNA eelistatud allikas on hübridoomi rakud. Kui DNA
on isoleeritud, võib selle paigutada ekspressioonivektoritesse (näiteks
ekspressioonivektoritesse, mida on kirjeldatud PCT publikatsiooni nr WO 87/04462), mis
seejärel transfekteeritakse peremeesrakkudesse, nagu näiteks E. coli rakkudesse, ahvilise
COS rakkudesse, hiina hamstri munasarja (CHO) rakkudesse või müeloomi rakkudesse, mis 5
muidu ei tooda immunoglobuliini valku, et saavutada monoklonaalsete antikehade
sünteesimine rekombinantsetes peremeesrakkudes. Vt näiteks PCT publikatsiooni nr WO
87/04462. Antikeha DNAd saab modifitseerida ka näiteks inimese raske ja kerge ahela
konstantsete domeenide kodeerimisjärjestuse asendamise teel homoloogsete närilise
järjestuste vastu, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984) või mitte-10
immunoglobuliini polüpeptiidi kogu või osa kodeerimisjärjestuse kovalentse sidumise teel
immunoglobuliini kodeerimisjärjestuse külge. Sellisel viisil valmistatakse „kimäärseid” või
„hübriidseid” antikehasid, millel on siin kirjeldatud CGRP-vastase monoklonaalse antikeha
seondumisspetsiifilisus.
15
[0125] Antikehadest tuletatud CGRP-vastaseid antagonist-antikehasid ja polüpeptiide saab
tuvastada või iseloomustada tehnika tasemes tuntud meetodeid kasutades, kus tuvastatakse
ja/või mõõdetakse CGRP bioloogilise aktiivsuse vähendamist, parandamist või
neutraliseerimist. Näiteks võib CGRP-vastast antagonist-antikeha tuvastada ka
kandidaataine CGRPga inkubeerimise teel ning ühe või mitme alljärgneva omaduse 20
jälgimise teel: (a) seondub CGRPga; (b) blokeerib CGRP seondumist selle retseptori(te)ga;
(c) blokeerib või vähendab CGRP retseptori aktiveerimist (sealhulgas cAMP aktiveerimist);
(d) inhibeerib CGRP bioloogilist aktiivsust või CGRP signaliseerimisega vahendatud
pärisuunalisi radasid; (e) ennetab, leevendab või ravib mis tahes peavalu aspekti (näiteks
migreeni); (f) suurendab CGRP kõrvaldamist; ja (g) inhibeerib (vähendab) CGRP 25
sünteesimist, tootmist või vabanemist. Osades teostustes tuvastatakse CGRP-vastane
antagonist-antikeha või polüpeptiid kandidaataine CGRPga inkubeerimise teel ning
seondumist ja/või sellega kaasneva CGRP bioloogilise aktiivsuse vähendamise või
neutraliseerimise jälgimise teel. Seondumisanalüüsi võib teostada puhastatud CGRP
polüpeptiidi(de) või rakkudega, mis loomulikult ekspresseerivad CGRP polüpeptiidi 30
(polüpeptiide) või mida on transfekteeritud, et nad ekspresseeriksid CGRP polüpeptiidi
(polüpeptiide). Ühes teostuses on seondumisanalüüs konkureeriv seondumisanalüüs, kus
hinnatakse kandidaat-antikeha suutlikkust konkureerida tuntud CGRP-vastase agonistiga
45 EE-EP 1 957 106 B2
CGRP sidumise osas. Seda analüüsi võib teostada erinevates formaatides, sealhulgas ELISA
formaadis. Teistes teostustes tuvastatakse CGRP-vastane antagonist-antikeha kandidaataine
CGRPga inkubeerimise teel ja seondumise ja sellega kaasneva raku pinnal ekspresseeritud
CGRP retseptori aktiveerimise inhibeerimise jälgimise teel.
5
[0126] Esialgse tuvastamise järel võib CGRP-vastase antagonist-antikeha kandidaadi
aktiivsust edasi kinnitada ja viimistleda bioanalüüsidega, mida kasutatakse suunatud
bioloogiliste aktiivsuste testimiseks. Alternatiivselt võib bioanalüüse kasutada kandidaatide
vahetuks skriinimiseks. Näiteks soodustab CGRP mitmeid mõõdetavaid muudatusi
reageerivates rakkudes. Nende hulka kuulub mittepiiravalt cAMP stimuleerimine rakus 10
(näiteks SK-N-MC rakkudes). Antagonisti aktiivsuse mõõtmiseks võib samuti kasutada
loommudeleid, nagu näiteks roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha
vasodilatatsiooni mõõtmist. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772–776, 1993. Peavalude
(nagu näiteks migreeni) loommudeleid võib lisaks kasutada antagonist-antikehade või
polüpeptiidide efektiivsuse testimiseks. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl. 3, 15
2000. Osasid meetodeid CGRP-vastase antagonist-antikeha või polüpeptiidi tuvastamiseks
ja iseloomustamiseks on üksikasjalikult kirjeldatud lisatud näidetes.
[0127] CGRP-vastaste antagonist-antikehade iseloomustamiseks võib kasutada tehnika
tasemes hästi tuntud meetodeid. Üks meetod seisneb näiteks epitoobi tuvastamises, millega 20
see seondub, ehk „epitoobi kaardistamises”. Tehnika tasemes tuntakse paljusid meetodeid,
mida kasutatakse valkudel epitoopide asukoha kaardistamiseks ja iseloomustamiseks,
sealhulgas antikeha-antigeeni kompleksi kristallstruktuuri lahendamine,
konkurentsianalüüsid, geenifragmendi ekspressiooni analüüsid ja sünteetilised
peptiidipõhised analüüsid, mida on kirjeldatud näiteks allika Harlow ja Lane, Using 25
Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York, 1999, 11. peatükis. Täiendavas näites võib epitoobi kaardistamist
kasutada järjestuse kindlaks määramiseks, millega CGRP-vastane antagonist-antikeha
seondub. Epitoobi kaardistamine on kaubanduslikult kättesaadav erinevatest allikatest,
näiteks ettevõttest Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Madalmaad). 30
Nimetatud epitoop võib olla lineaarne epitoop, st sisalduda aminohapete ühel sirgel, või
konformatsiooniline epitoop, mis on moodustatud aminohapete kolmemõõtmelise
vastastiktoimega, mis ei pruugi tingimata sisalduda ühel sirgel. Varieeruva pikkusega
46 EE-EP 1 957 106 B2
(näiteks vähemalt 4 kuni 6 aminohappe pikkuseid) peptiide võib isoleerida või sünteesida
(näiteks rekombinantselt) ning kasutada CGRP-vastase antagonist-antikehaga teostatavate
seondumisanalüüside jaoks. Teises näites võib epitoobi, millega CGRP-vastane antagonist-
antikeha seondub, kindlaks määrata süstemaatilise skriinimise teel, kasutades CGRP
järjestusest saadud kattuvaid peptiide ja määrates seondumise CGRP-vastase antagonist-5
antikeha poolt. Vastavalt geenifragmendi ekspresseerimise analüüsile fragmenteeritakse
CGRPd kodeeriv avatud lugemisraam kas juhuslikult või spetsiifiliste geneetiliste
konstruktsioonidega ning määratakse kindlaks CGRP ekspresseeritud fragmentide
reaktiivsus testitava antikehaga. Need geenifragmendid võivad näiteks olla toodetud
PCRiga ning seejärel transkribeeritud ja transleeritud valguks in vitro radioaktiivsete 10
aminohapete juuresolekul. Seejärel määratakse antikeha seondumine radioaktiivselt
märgistatud CGRP fragmentidega kindlaks immunosadestamise ja geelelektroforeesi teel.
Teatavate epitoopide kindaks määramiseks võib kasutada ka faagiosakeste pinnal
kuvatavate juhuslike suuri peptiidijärjestuste panku (faagipanku). Alternatiivselt võib
kattuvate peptiidifragmentide määratletud panka testida testitava antikehaga seondumise 15
osas lihtsa seondumisanalüüsiga. Täiendavas näites võib teostada antigeeni siduva domeeni
mutageneesi, domeenide vahetamise katseid ja alaniini skaneerimise mutageneesi, et
tuvastada jäägid, mis on epitoobi sidumiseks nõutavad, piisavad ja/või vajalikud. Näiteks
võib domeenide vahetamise katsete teostamiseks kasutada mutant-CGRPd, kus CGRP
polüpeptiidi erinevad fragmendid on asendatud (vahetatud) lähedases suguluses, kuid 20
antigeeniliselt erinevast valgust (nagu näiteks neurotrofiini valguperekonna teiselt liikmelt)
pärit järjestustega. Antikeha mutant-CGRPga seondumise hindamisel võib hinnata
konkreetse CGRP fragmendi olulisust antikeha seondumise jaoks.
[0128] Veel üks meetod, mida võib kasutada CGRP-vastase antagonist-antikeha 25
iseloomustamiseks, seisneb konkurentsianalüüside kasutamises teiste antikehadega, mis
teadaolevalt seonduvad sama antigeeniga, st erinevad fragmendid CGRPl, et määrata
kindlaks, kas CGRP-vastane antagonist-antikeha seondub sama epitoobiga kui teised
antikehad. Konkurentsianalüüsid on antud valdkonna asjatundjatele hästi tuntud.
30
[0129] Ekspressioonivektorit võib kasutada CGRP-vastase antagonist-antikeha vahetuks
ekspresseerimiseks. Antud valdkonna asjatundjale on ekspressioonivektorite manustamine
tuttav, et saavutada eksogeense valgu ekspresseerimine in vivo. Vt näiteks USA patendid nr
47 EE-EP 1 957 106 B2
6 436 908; 6 413 942; ja 6 376 471. Ekspressioonivektorite manustamine hõlmab paikset
või süsteemset manustamist, sealhulgas süstimist, suukaudset manustamist, osakeste
püstolit või kateetri abil manustamine, ning topikaalne manustamine. Veel ühes teostuses
manustatakse ekspressioonivektorit vahetult sümpateetilisse tüvesse või närvikeskusesse
või pärgarterisse, kojasse, vatsakesse või perikardi (südamepauna). 5
[0130] Samuti võib kasutada ekspressioonivektorit sisaldavate terapeutiliste koostiste või
subgenoomsete polünukleotiidide suunatud sisestamist. Retseptori vahendatud DNA
sisestamise tehnikaid on kirjeldatud näiteks allikates Findeis et al., Trends Biotechnol.
(1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene 10
Transfer (J.A. Wolff, toim.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J.
Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu
et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338. Polünukleotiidi sisaldavaid terapeutilisi koostisi
manustatakse koguses, mis jääb geeniteraapia protokollis lokaalsel manustamisel 100 ng
kuni ligikaudu 200 mg DNA vahele. Geeniteraapia protokolli ajal võib kasutada ka DNA 15
kontsentratsioone, mis on ligikaudu 500 ng kuni ligikaudu 50 mg, ligikaudu 1 µg kuni
ligikaudu 2 mg, ligikaudu 5 µg kuni ligikaudu 500 µg ja ligikaudu 20 µg kuni ligikaudu 100
µg. Terapeutiliste polünukleotiidide ja polüpeptiidide sisestamiseks võib kasutada geeni
sisestamise vehiikuleid. Geeni sisestamise vehiikul võib olla viiruse või mitteviiruse
päritolu (vt üldiselt publikatsioone Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, 20
Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; ja
Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). Selliste kodeerimisjärjestuste ekspresseerimise
esile kutsumiseks võib kasutada endogeenseid imetaja või heteroloogilisi promootoreid.
Kodeerimisjärjestuse ekspresseerimine võib olla konstitutiivne või reguleeritud.
25
[0131] Viirusel põhinevad vektorid soovitud polünukleotiidi sisestamiseks ja
ekspresseerimiseks soovitud rakus on tehnika tasemes hästi tuntud. Viirustel põhinevate
vehiikulite näidete hulka kuuluvad rekombinantsed retroviirused (vt näiteks PCT
publikatsioone nr WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO
93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; USA patente nr 5 219 740 ja 4 777 127; GB 30
patenti nr 2 200 651; ja EP patenti nr 0 345 242), alfaviirusel põhinevaid vektoreid (näiteks
Sindbis viiruse vektorid, Semiliki Forest viiruse (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), Ross
River viiruse (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) ja Venezuela Hobuste Entsefaliidi viiruse
48 EE-EP 1 957 106 B2
(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) ja adeno-seotud
viiruse (AAV) vektorid (vt näiteks PCT publikatsioone nr WO 94/12649, WO 93/03769;
WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 ja WO 95/00655). Samuti võib kasutada
surmatud adenoviirusega seotud DNA manustamist, mida on kirjeldatud allikas Curiel,
Hum. Gene Ther. (1992) 3:147. 5
[0132] Samuti võib kasutada viirusega mitteseotud sisestamisvehiikuleid ja meetodeid,
sealhulgas mittepiiravalt polükatioonilist kondenseeritud DNA-d, mis on seotud või ei ole
seotud surmatud adenoviirusega (vt näiteks Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147);
ligandiga seotud DNAd (vt näiteks Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); eukarüootseid 10
sisestamisvehiikuleid-rakke (vt näiteks USA patenditaotlust nr 5 814 482; PCT
publikatsioone nr WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; ja WO 97/42338) ja
nukleiinse laengu neutraliseerimist või ühendamist rakumembraanidega. Samuti võib
kasutada nn paljast DNAd. Palja DNA sisestamismeetodeid on kirjeldatud PCT
publikatsioonis nr WO 90/11092 ja USA patendis nr 5 580 859. Liposoome, mis võivad 15
toimida geeni sisestamise vehiikulitena, on kirjeldatud USA patendis nr 5 422 120; PCT
publikatsioonides nr WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; ja EP 0524968.
Täiendavaid lähenemisviise on kirjeldatud allikates Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411
ja Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581.
20
C. Antikeha G1 ning seotud antikehad, polüpeptiidid, polünukleotiidid, vektorid ja
peremeesrakud
[0133] Leiutis võib kasutada kompositsioone, sealhulgas farmatseutilisi koostisi, mis
sisaldavad antikeha G1 ja selle tabelis 6 välja toodud variante või antikehast G1 või selle 25
tabelis 6 välja toodud variantidest tuletatud polüpeptiidi; ning G1 või selle variante või
polüpeptiidi kodeerivaid järjestusi sisaldavaid polünukleotiide. Käesolevas sisaldavad
koostised ühte või mitut antikeha või polüpeptiidi (mis võib olla antikeha, kuid ei pruugi),
mis seonduvad CGRPga ja/või ühte või mitut polünukleotiidi, mis sisaldavad ühte või mitut
antikeha või polüpeptiidi, mis seonduvad CGRPga, kodeerivaid järjestusi. Need koostised 30
võivad lisaks sisaldada sobivaid abiaineid, nagu näiteks farmatseutiliselt aktsepteeritavaid
abiaineid, sealhulgas puhvreid, mis on tehnika tasemes hästi tuntud.
49 EE-EP 1 957 106 B2
[0134] Leiutisekohastel CGRP-vastastel antagonistlikel antikehadel võib olla üks või enam
järgmistest tunnustest: (a) seondub CGRPga; (b) blokeerib CGRP seondumist selle
retseptori(te)ga; (c) blokeerib või vähendab CGRP retseptori aktiveerimist (sealhulgas
cAMP aktiveerimist); (d) inhibeerib CGRP bioloogilist aktiivsust või CGRP
signaliseerimisega vahendatud pärisuunalisi radasid; (e) ennetab, leevendab või ravib mis 5
tahes peavalu aspekti (näiteks migreeni); (f) suurendab CGRP kõrvaldamist; ja (g)
inhibeerib (vähendab) CGRP sünteesimist, tootmist või vabanemist.
[0135] Sellest tulenevalt pakub käesolev leiutiskirjeldus mis tahes alljärgnevatest või
koostisi (sealhulgas farmatseutilisi koostisi), mis sisaldavad mis tahes alljärgnevatest: (a) 10
antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variandid; (b) antikeha G1 või selle tabelis 6
välja toodud variantide fragment või piirkond; (c) antikeha G1 või selle tabelis 6 välja
toodud variantide kerge ahel; (d) antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide
raske ahel; (e) üks või mitu varieeruvat piirkonda antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud
variantide kergest ahelast ja/või raskest ahelast; (f) antikeha G1 või selle tabelis 6 välja 15
toodud variantide üks või mitu CDRi (üks, kaks, kolm, neli, viis või kuus CDRi); (g) CDR
H3 antikeha G1 raskest ahelast; (h) CDR L3 antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud
variantide kergest ahelast; (i) kolm CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud
variantide kergest ahelast; (j) kolm CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud
variantide raskest ahelast; (k) kolm CDRi antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud 20
variantide kergest ahelast ja kolm CDRi raskest ahelast; ning (l) antikeha, mis sisaldab mis
tahes ühte punktidest (b) kuni (k). Käesolev leiutis pakub ka polüpeptiide, mis sisaldavad
mis tahes ühte või mitut eespool nimetatutest.
[0136] Antikeha G1 CDRi osi (sealhulgas Chothia ja Kabati CDRid) on skemaatiliselt 25
kujutatud joonisel FIG 5. CDR-piirkondade kindlaks määramine kuulub tehnika tasemesse.
Siinkohal on selge, et osades teostustes võivad CDRid olla Kabati ja Chothia CDRide
kombinatsioon (tähistatakse ka nimetusega „kombineeritud CDRid” või „laiendatud
CDRid”). Osades teostustes on CDRid Kabati CDRid. Osades teostustes on CDRid Chothia
CDRid. Teisisõnu võivad CDRid teostuse puhul, mis sisaldavad rohkem kui ühte CDRi, 30
olla mis tahes Kabati, Chothia, kombineeritud CDRid või nende kombinatsioonid.
50 EE-EP 1 957 106 B2
[0137] Osades teostustes pakub käesolev leiutiskirjeldus polüpeptiidi (mis võib olla
antikeha, kuid ei pruugi), mis sisaldab vähemalt ühte CDRi, vähemalt kahte, vähemalt
kolme, või vähemalt nelja, vähemalt viit või kõiki kuut CDRi, mis on sisuliselt identsed
vähemalt ühe G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide CDRiga, vähemalt kahe,
vähemalt kolme, vähemalt nelja, vähemalt viie või kõigi kuue CDRiga. Teised teostused 5
hõlmavad antikehasid, millel on vähemalt kaks, kolm, neli, viis või kuus CDRi, mis on
sisuliselt identsed vähemalt kahe, kolme, nelja, viie või kuue G1 või G1st tuletatud CDRiga.
Osades teostustes on vähemalt üks, kaks, kolm, neli, viis või kuus CDRi vähemalt ligikaudu
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% või 99% ulatuses identsed
vähemalt ühe, kahe, kolme, nelja, viie või kuue G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide 10
CDRiga. Siinkohal tuleb mõista, et käesoleva leiutise mõistes säilitatakse üldiselt
seondumisspetsiifilisust ja/või üldist aktiivsust, kuigi aktiivsuse ulatus võib varieeruda
võrreldes G1 ja selle tabelis 6 välja toodud variantidega (võib olla suurem või väiksem).
[0138] Käesolevas leiutises pakutakse ka polüpeptiidi (mis võib olla antikeha, aga ei 15
pruugi), mis sisaldab G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide aminohappejärjestust,
millel on mis tahes alljärgnevatest: vähemalt 5 järjestikust aminohapet, vähemalt 8
järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu 10 järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu
15 järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu 20 järjestikust aminohapet, vähemalt
ligikaudu 25 järjestikust aminohapet, vähemalt ligikaudu 30 järjestikust aminohapet G1 või 20
selle tabelis 6 välja toodud variantide järjestusest, kus vähemalt 3 aminohapet on G1 (joonis
FIG 5) või selle tabelis 6 välja toodud variantide varieeruvast piirkonnast. Ühes teostuses
on varieeruv piirkond pärit G1 kergest ahelast. Veel ühes teostuses on varieeruv piirkond
pärit G1 raskest ahelast. Näitlikul polüpeptiidil on järjestikune aminohape (eespool
kirjeldatud pikkused) G1 raske ja kerge ahela varieeruvatest piirkondadest. Teises teostuses 25
on 5 (või rohkem) järjestikust aminohapet joonisel FIG 5 kujutatud G1 komplementaarsust
määravast piirkonnast (CDRist). Osades teostustes on järjestikused aminohapped G1
varieeruvast piirkonnast.
[0139] Käesolev leiutiskirjeldus pakub ka mis tahes selliste antikehade või polüpeptiidide 30
valmistamise meetodeid. Käesoleva leiutise kohaseid antikehasid võib valmistada tehnika
tasemes tuntud protseduuridega. Polüpeptiide võib valmistada antikehade proteolüütilise
või muu degradatsiooniga, rekombinantsete meetoditega (st üksikud või liitpolüpeptiidid)
51 EE-EP 1 957 106 B2
vastavalt eespool kirjeldatule või keemilise sünteesiga. Antikehade polüpeptiide, eelkõige
lühemaid, kuni 50 aminohapet sisaldavaid polüpeptiide saab sobivalt valmistada keemilise
sünteesi teel. Keemilise sünteesi meetodid on tehnika tasemes tuntud ning need on
kaubanduslikult kättesaadavad. Näiteks võib antikeha toota automatiseeritud polüpeptiidi
sünteesijaga, mis kasutab tahke faasi meetodit. Vt ka USA patente nr 5 807 715; 4 816 567; 5
ja 6 331 415.
[0140] Alternatiivis võib antikehasid valmistada rekombinantselt tehnika tasemes tuntud
protseduure kasutades. Ühes teostuses sisaldab polünukleotiid antikeha G1 raske ahela
ja/või kerge ahela varieeruvaid piirkondi kodeerivat järjestust, mis on esitatud järjestustega 10
SEQ ID NO:9 ja SEQ ID NO:10. Veel ühes teostuses sisaldab polünukleotiid järjestust, mis
on esitatud järjestustega SEQ ID NO:9 ja SEQ ID NO:10, mis on kloonitud ühte või
mitmesse vektorisse ekspresseerimiseks või levitamiseks. Huvipakkuvat antikeha
kodeerivat järjestust võib säilitada peremeesrakus sisalduvas vektoris ning seda
peremeesrakku võib seejärel laiendada ja külmutada tulevaseks kasutamiseks. Vektoreid 15
(sealhulgas ekspressioonivektoreid) ja peremeesrakke on siin edaspidi kirjeldatud.
[0141] Näiteks võib bispetsiifiliste antikehade (monoklonaalsed antikehad, millel on
seondumisspetsiifilisused vähemalt kahe erineva antigeeni suhtes) valmistamiseks kasutada
siin kirjeldatud antikehi. Meetodid bispetsiifiliste antikehade valmistamiseks on tehnika 20
tasemes tuntud (vt näiteks Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210).
Traditsiooniliselt põhines bispetsiifiliste antikehade rekombinantne tootmine kahe
immunoglobuliini raske ahela-kerge ahela paari samaaegsel ekspresseerimisel, kus
nimetatud kahel raskel ahelal olid erinevad spetsiifilisused (Millstein ja Cuello, 1983,
Nature 305, 537–539). 25
[0142] Vastavalt ühele bispetsiifiliste antikehade valmistamise lähenemisviisile
ühendatakse antikeha soovitud seondumisspetsiifilisustega varieeruvad domeenid
(antikeha-antigeeni sidumissaidid) immunoglobuliini konstantse domeeni järjestustega.
Ühendamine teostatakse eelistatult immunoglobuliini raske ahela konstantse piirkonnaga, 30
mis sisaldab vähemalt osa liigend-, CH2- ja CH3-piirkonnast. Eelistatud on raske ahela
konstantse piirkonna (CH1), mis sisaldab kerge ahela sidumiseks vajalikku saiti, olemasolu
vähemalt ühes ühendamises. Immunoglobuliini raske ahela ühendamisi ja soovi korral
52 EE-EP 1 957 106 B2
immunoglobuliini kerge ahela ühendamisi kodeerivad DNAd sisestatakse eraldi
ekspressioonivektoritesse ning neid transfekteeritakse samaaegselt sobivasse
peremeesorganismi. See annab suurepärase paindlikkuse kolme polüpeptiidi fragmendi
vastastikuste proportsioonide kohandamisel teostustes, kui kolme konstruktsioonis
kasutatud polüpeptiidahela ebavõrdsed suhtarvud annavad optimaalse saagise. Kuid on 5
võimalik sisestada kahe või kõigi kolme polüpeptiidahela kodeerivad järjestused ühte
ekspressioonivektorisse, kui vähemalt kahe võrdsetes suhtarvudes polüpeptiidahela
ekspresseerimine annab tulemuseks kõrge saagise või kui need suhtarvud ei oma erilist
tähtsust.
10
[0143] Ühes lähenemisviisis koosnevad bispetsiifilised antikehad ühelt poolt esimese
seondumisspetsiifilisusega hübriidse immunoglobuliini raskest ahelast ja teiselt poolt
hübriidse immunoglobuliini raske ahela-kerge ahela paarist (mis pakub teist
seondumisspetsiifilisust). Selline asümmeetriline struktuur, kus immunoglobuliini kerge
ahel on ainult bispetsiifilise molekuli ühes pooles, lihtsustab soovitud bispetsiifilise ühendi 15
eraldamist soovimatutest immunoglobuliini ahela kombinatsioonidest. Seda lähenemisviisi
on kirjeldatud PCT publikatsioonis nr WO 94/04690, mis avaldati 3. märtsil 1994.
[0144] Käesoleva leiutise ulatusse kuuluvad ka heterokonjugaat-antikehad, mis sisaldavad
kahte kovalentselt ühendatud antikeha. Selliseid antikehasid on kasutatud immuunsüsteemi 20
rakkude suunamiseks soovimatute rakkude vastu (USA patent nr 4 676 980), ja HIV-
infektsiooni ravimiseks (PCT patenditaotluse publikatsioonid nr WO 91/00360 ja WO
92/200373; EP 03089). Heterokonjugaat-antikehade valmistamiseks võib kasutada mis
tahes tavapäraseid ristsidumise meetodeid. Sobivad ristsidumisagendid ja -tehnikad on
tehnika tasemes hästi tuntud ning neid on kirjeldatud USA patendis nr 4 676 980. 25
[0145] Kimäärseid või hübriidseid antikehi saab samuti valmistada in vitro, kasutades
selleks tuntud sünteetilise valgukeemia meetodeid, sealhulgas selliseid, mis hõlmavad
ristsidumise agente. Näiteks võib immunotoksiinide konstrueerimiseks kasutada
disulfiidsideme vahetamise reaktsiooni või tioeetersideme moodustamist. Selleks 30
eesmärgiks sobivate reagentide näidete hulka kuuluvad iminotiolaat ja metüül-4-
merkaptobutüürimidaat.
53 EE-EP 1 957 106 B2
[0146] Humaniseeritud antikeha valmistamiseks, mis sisaldab ühte või mitut antikeha G1
või selle tabelis 6 välja toodud variandi CDRi või ühte või mitut CDRi, mis on tuletatud
antikehast G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantidest, võib kasutada mis tahes tehnika
tasemes tuntud meetodit. Näiteks võib monoklonaalse antikeha humaniseerimiseks
kasutada nelja üldist etappi. 5
[0147] Käesolev leiutis hõlmab antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide
modifikatsioone, sealhulgas funktsionaalselt ekvivalentseid antikehi, mis ei mõjuta
märkimisväärselt nende omadusi, ning variante, millel on parandatud või vähendatud
aktiivsus ja/või afiinsus. Näiteks võib antikeha G1 või selle tabelis 6 välja toodud variantide 10
aminohappejärjestust muteerida, et saada antikeha, millel on soovitud seondumisafiinsus
CGRP suhtes. Polüpeptiidide modifitseerimine on tehnika tasemes rutiinne praktika ning
seda ei ole vaja siin üksikasjalikult kirjeldada. Polüpeptiidide modifitseerimise näited on
esitatud lisatud näidetes. Modifitseeritud polüpeptiidide näidete hulka kuuluvad
polüpeptiidid, mis hõlmavad aminohappejääkide konservatiivseid asendusi, aminohapete 15
ühte või mitut deletsiooni või lisandust, mis ei muuda märkimisväärselt kahjulikult
funktsionaalset aktiivsust, või keemiliste analoogide kasutamist.
[0148] Aminohappejärjestuse insertsioonide hulka kuuluvad amino- ja/või karboksüülotsa
ühendamised, mis ulatuvad pikkuse poolest ühest jäägist kuni sadat või enamat jääki 20
sisaldavate polüpeptiidideni, ning samuti ühe või mitme aminohappejäägi järjestusesisesed
insertsioonid. Otste insertsioonide näidete hulka kuuluvad N-otsa metionüüli jäägiga
antikeha või epitoobi märgisega ühendatud antikeha. Antikeha molekuli teiste insertsiooni
variantide hulka kuuluvad ensüümi ühendamine antikeha N- või C-otsaga või polüpeptiid,
mis suurendab antikeha seerumi pooleluiga. 25
[0149] Asendatud variantides on antikeha molekulist eemaldatud vähemalt üks
aminohappejääk ja selle asemele on sisestatud teistsugune jääk. Asendusliku mutageneesi
osas suurimat huvi pakkuvate saitide hulka kuuluvad hüpervarieeruvad piirkonnad, kuid
samuti kaalutakse FR muutmisi. Konservatiivsed asendused on välja toodud tabelis 1 tulbas 30
„Konservatiivsed asendused”. Kui selliste asenduste tulemuseks on muutus bioloogilises
aktiivsuses, siis võib teha veelgi olulisemaid muudatusi, mis on esitatud tabelis 1 tulbas
54 EE-EP 1 957 106 B2
„Näitlikud asendused”, või vastavalt edaspidi allpool kirjeldatule viitega aminohapete
klassidele, ning neid produkte võib skriinida.
Tabel 1. Aminohappe asendused
Algne jääk Konservatiivsed asendused Näitlikud asendused
Ala (A) Val Val; Leu; Ile
Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg
Asp (D) Glu Glu; Asn
Cys (C) Ser Ser; Ala
Gln (Q) Asn Asn; Glu
Glu (E) Asp Asp; Gin
Gly (G) Ala Ala
His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg
Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleutsiin
Leu (L) Ile Norleutsiin; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr; Phe
Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleutsiin
5
55 EE-EP 1 957 106 B2
[0150] Antikeha bioloogiliste omaduste oluliseks modifitseerimiseks selekteeritakse
asendused, mis erinevad märkimisväärselt oma toime poolest (a) polüpeptiidi karkassi
struktuuri säilitamisele asenduse piirkonnas, näiteks lehe- või vedrukujulise
konformatsioonina, (b) molekuli laengu või hüdrofoobsuse säilitamisele märklaud-saidi
juures, või (c) külgahela mahu säilitamisele. Looduslikult esinevad jäägid jagatakse 5
rühmadesse külgahelate tavaliste omaduste alusel:
(1) mittepolaarsed jäägid: norleutsiin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) laenguta polaarsed jäägid: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) happelised (negatiivselt laetud) jäägid: Asp, Glu;
(4) aluselised (positiivselt laetud) jäägid: Lys, Arg; 10
(5) ahela suundumust mõjutavad jäägid: Gly, Pro; ja
(6) aromaatsed jäägid: Trp, Tyr, Phe, His.
[0151] Mittekonservatiivsete asenduste tegemiseks vahetatakse ühe nimetatud klassi liige
teise klassi liikme vastu. 15
[0152] Samuti võib asendada mis tahes tsüsteiinijäägi, mis ei osale antikeha nõuetekohase
konformatsiooni säilitamises, üldiselt seriiniga, et parandada molekuli
oksüdatsioonistabiilsust ja vältida ebatüüpilist ristsidumist. Teisest küljest võib antikehale
lisada tsüsteiini sideme(id), et parandada selle stabiilsust, eelkõige sellisel juhul, kui 20
antikeha on antikeha fragment, nagu näiteks Fv fragment.
[0153] Aminohappe modifikatsioonid võivad ulatuda ühe või enama aminohappe
muutmisest või modifitseerimisest kuni piirkonna, nagu näiteks varieeruva piirkonna
täieliku ümberkujundamiseni. Varieeruvas piirkonnas tehtavad muudatused võivad muuta 25
seondumisafiinsust ja/või spetsiifilisust. Osades teostustes tehakse CDR domeenis mitte
rohkem kui üks kuni viis konservatiivset aminohappe asendust. Teistes teostustes tehakse
CDR domeenis mitte rohkem kui üks kuni kolm konservatiivset aminohappe asendust. Veel
osades teistes teostustes on CDR domeen CDR H3 ja/või CDR L3.
30
[0154] Modifikatsioonide hulka kuuluvad ka glükosüleeritud ja mitteglükosüleeritud
polüpeptiidid, samuti muude translatsioonijärgsete modifikatsioonidega polüpeptiidid, nagu
näiteks erinevate suhkrutega glükosüleerimine, atsetüülimine ja fosforüülimine.
56 EE-EP 1 957 106 B2
Antikehasid glükosüleeritakse konserveerunud positsioonidel nende konstantsetes
piirkondades (Jefferis ja Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111–128; Wright ja Morrison,
1997, TibTECH 15:26–32). Immunoglobuliinide oligosahhariidi külgahelad mõjutavad
valgu funktsiooni (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311–1318; Wittwe ja Howard,
1990, Biochem. 29:4175–4180) ning glükovalgu osade molekulisisest vastastiktoimet, mis 5
võib avaldada mõju konformatsiooni ja olla esitatud glükovalgu kolmemõõtmelisel pinnal
(Hefferis ja Lund, supra; Wyss ja Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409–416).
Oligosahhariidide ülesandeks võib olla ka suunata antud glükovalku konkreetsete
äratundmise struktuuride alusel teatavate molekulide vastu. Antikehade glükosüleerimine
mõjutab teadaolevalt ka antikehast sõltuvat rakulist tsütotoksilisust (ADCC). Eelkõige on 10
teatatud, et β(1,4)-N-atsetüülglükosaminüültransferaas III (GnTIII) (GlcNAc poolitamist
katalüseeriv glükosüültransferaas) tetratsükliini-reguleeritud ekspressiooniga CHO
rakkudel on paranenud ADCC toime (Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176–180).
[0155] Antikehade glükosüleerimine on tüüpiliselt ka N-seotud või O-seotud. N-seotud 15
glükosüleerimine osutab süsivesikufragmendi kinnitamisele aspargiinijäägi külgahela
külge. Äratundmisjärjestused süsivesikufragmendi ensümaatiliseks kinnitamiseks
aspargiini külgahela külge on tripeptiidijärjestused aspargiin-X-seriin, aspargiin-X-treoniin
ja aspargiin-X-tsüsteiin, kus X on mis tahes aminohape (v.a proliin). Seega loob ükskõik
millise nimetatud tripeptiidijärjestuse olemasolu polüpeptiidis potentsiaalse 20
glükosüleerimissaidi. O-seotud glükosüleerimine osutab ühe N-atsetüülgalaktoosamiini
suhkru (galaktoosi või ksüloosi) kinnitamisele hüdroksüaminohappe külge, milleks on
kõige tavalisemalt seriin või treoniin, kuigi kasutada võib ka 5-hüdroksüproliini või 5-
hüdroksülüsiini.
25
[0156] Antikehale glükosüleerimissaitide lisamine saavutatakse sobivalt
aminohappejärjestuse muutmise teel selliselt, et see sisaldab ühte või mitut eespool
kirjeldatud tripeptiidijärjestust (N-seotud glükosüleerimissaitide jaoks). Muudatusi on
võimalik teha ka ühe või mitme seriini- või treoniinijäägi lisamisega algsele antikeha
järjestusele või nendega asendamise teel (O-seotud glükosüleerimissaitide jaoks). 30
[0157] Antikehade glükosüleerimismustrit võib muuta ka selliselt, et seeläbi ei muudeta
nende aluseks olevat nukleotiidijärjestust. Glükosüleerimine sõltub üsna suurel määral
57 EE-EP 1 957 106 B2
antikeha ekspresseerimiseks kasutatud peremeesrakust. Kuna rakutüüp, mida kasutatakse
rekombinantsete glükovalkude, näiteks antikehade ekspresseerimiseks potentsiaalsete
ravimitena, on harva looduslik rakk, siis võib eeldada variatsioone antikehade
glükosüleerimismustris (vt näiteks Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062–9070).
5
[0158] Lisaks peremeesrakkude valikule kuuluvad antikehade rekombinantse tootmise ajal
toimuvat glükosüleerimist mõjutavate tegurite hulka kasvurežiim, söötme formulatsioon,
kultuuri tihedus, oksügenisatsioon, pH, puhastamisskeemid jms. Konkreetses
peremeesorganismis saavutatud glükosüleerimismustri muutmiseks on välja pakutud
erinevaid meetodeid, sealhulgas teatavate oligosahhariidide tootmises osalevate ensüümide 10
sisestamist või üleekspresseerimist (USA patendid nr 5 047 335; 5 510 261 ja 5 278 299).
Glükosüleerimist või teatavaid glükosüleerimise tüüpe saab glükovalgust ensümaatiliselt
eemaldada, kasutades selleks näiteks endoglükosidaasi H (Endo H), N-glükosidaasi F,
endoglükosidaasi F1, endoglükosidaasi F2, endoglükosidaasi F3. Lisaks saab rekombinatset
peremeesrakku geneetiliselt töödelda, et see oleks teatavat tüüpi polüsahhariidide töötlemise 15
suhtes puudulik. Need ja sarnased tehnikad on tehnika tasemes hästi tuntud.
[0159] Muude modifitseerimismeetodite hulka kuuluvad tehnika tasemes tuntud
ühendamistehnikad, sealhulgas mittepiiravalt ensümaatilised vahendid, oksüdatiivne
asendamine ja kelaatimine. Modifikatsioone võib kasutada näiteks immunoanalüüsi jaoks 20
märgiste kinnitamiseks. Modifitseeritud G1 polüpeptiidide valmistamiseks kasutatakse
tehnika tasemes väljakujunenud protseduure ning nende skriinimiseks võib kasutada
tehnika tasemes tuntud standardseid analüüsimeetodeid, millest osasid on kirjeldatud
allpool ja lisatud näidetes.
25
[0160] Osades teostustes sisaldab antikeha modifitseeritud konstantset piirkonda, nagu
näiteks konstantset piirkonda, mis on immunoloogiliselt inertne või osaliselt inertne, näiteks
ei käivita komplemendi vahendatud lüüsi, ei stimuleeri antikehast sõltuvat rakulist
tsütotoksilisust (ADCC) või ei aktiveeri mikrogliiat; või sellel on vähenenud toimed
(võrreldes modifitseerimata antikehaga) ühes või mitmes alljärgnevas valdkonnas: 30
komplemendi vahendatud lüüsi käivitamine, antikehast sõltuva rakulise tsütotoksilisuse
(ADCC) stimuleerimine või mikrogliia aktiveerimine. Konstantse piirkonna erinevaid
modifikatsioone võib kasutada efektorfunktsioonide optimaalse taseme saavutamiseks
58 EE-EP 1 957 106 B2
ja/või kombineerimiseks. Vt näiteks Morgan et al., Immunology 86:319–324 (1995); Lund
et al., J. Immunology 157:4963–9 157:4963–4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology
164:4178–4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595–2601 (1989); ja Jefferis et al.,
Immunological Reviews 163:59–76 (1998). Osades teostustes on konstantset piirkonda
modifitseeritud viisil, mida on kirjeldatud allikates Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624; 5
PCT patenditaotlus nr PCT/GB99/01441; ja/või Ühendkuningriigi patenditaotluses nr
9809951.8. Teistes teostustes sisaldab antikeha inimese raske ahela IgG2 konstantset
piirkonda, mis sisaldab alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 on muudetud S330S331-ks
(aminohapete loend viitega looduslikule IgG2 järjestusele). Eur. J. Immunol. (1999)
29:2613–2624. Veel osades teistes teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud 10
glükosüleerimise jaoks. Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud
glükosüleerimise jaoks glükosüülitud aminohappejäägi või flankeerivate jääkide
muteerimise teel, mis on N-glükosüleerimist ära tundva järjestuse osa konstantses
piirkonnas. Näiteks võib N-glükosüleerimissaidi N297 muteerida A-ks, Q-ks, K-ks või H-
ks. Vt Tao et al., J. Immunology 143: 2595–2601 (1989); ja Jefferis et al., Immunological 15
Reviews 163:59–76 (1998). Osades teostustes aglükosüleeritakse pidev piirkond N-seotud
glükosüleerimise jaoks. Konstantset piirkonda võib aglükosüleerida N-seotud
glükosüleerimise jaoks ensümaatiliselt (nagu näiteks eemaldades süsivesiku ensüümi
PNGaasiga) või ekspresseerimise kaudu glükosüleerimise puudulikkusega peremeesrakus.
20
[0161] Teiste antikeha modifikatsioonide hulka kuuluvad antikehad, mida on
modifitseeritud vastavalt sellele, mida on kirjeldatud PCT publikatsioonis nr WO 99/58572,
avaldatud 18. novembril 1999. Need antikehad sisaldavad lisaks märklaud-molekulile
suunatud sidumisdomeenile efektordomeeni, mille aminohappejärjestus on sisuliselt
homoloogne kogu või osa inimese immunoglobuliini raske ahela konstantse piirkonna 25
suhtes. Need antikehad suudavad siduda märklaud-molekuli, käivitamata seejuures
märkimisväärset komplemendist sõltuvat lüüsi või märklaua rakulist hävitamist. Osades
teostustes suudab efektordomeen spetsiifiliselt siduda FcRn-i ja/või FcγRIIb-d. Need
põhinevad tüüpiliselt kimäärsetel domeenidel, mis on tuletatud kahest või enamast inimese
immunoglobuliini CH2 domeenist. Sellisel viisil modifitseeritud antikehad on eriti sobivad 30
kroonilise antikeha ravis kasutamiseks, et vältida põletiku teket või teisi kahjulikke
reaktsioone tavapärase antikehateraapia suhtes.
59 EE-EP 1 957 106 B2
[0162] Käesolev leiutis hõlmab küpse afiinsusega teostusi. Näiteks võib küpse afiinsusega
antikehasid toota tehnika tasemes tuntud protseduuridega (Marks et al., 1992,
Bio/Technology, 10:779–783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809–3813;
Schier et al., 1995, Gene, 169:147–155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994–2004;
Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310–9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 5
226:889–896; ja W02004/058184).
[0163] Alljärgnevaid meetodeid võib kasutada antikeha afiinsuse kohandamiseks või CDRi
iseloomustamiseks. Ühte viis antikeha CDRi iseloomustamiseks ja/või polüpeptiidi, nagu
näiteks antikeha seondumisafiinsuse muutmiseks (näiteks parandamiseks), nimetatakse 10
„skaneeritava panga mutageneesiks” („library scanning mutagenesis”). Üldiselt toimib
skaneeritava panga mutagenees alljärgneval viisil. Üks või mitu aminohappe positsiooni
CDRis asendatakse kahe või enama (nagu näiteks 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19 või 20) aminohappega, kasutades selleks tehnika tasemes tunnustatud
meetodeid. Selle tulemusel genereeritakse väike kloonide pank (osades teostustes 15
moodustatakse üks selline pank iga analüüsitud aminohappe positsiooni kohta), millest
igaüks on kahe või enama liikme keerukusega (kui igas positsioonis asendatakse kaks või
enam aminohapet). Üldiselt sisaldab selline pank ka klooni, mis sisaldab looduslikku
(asendamata) aminohapet. Väikest hulka kloone, näiteks ligikaudu 20–80 klooni (olenevalt
panga keerukusest) igast pangast skriinitakse seondumisafiinsuse osas märklaud-20
polüpeptiidi (või mõne muu sidumismärklaua) suhtes ning tehakse kindlaks suurenenud,
samasuguse või vähenenud seondumisafiinsusega või seondumisafiinsuseta kandidaadid.
Meetodid seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks on tehnika tasemes hästi tuntud.
Seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks võib kasutada Biacore'i pinna
plasmonresonantsi analüüsi, mis tuvastab erinevused seondumisafiinsuses, mis on ligikaudu 25
2 korda või rohkem kordi suuremad. Biacore on eriti kasulik siis, kui lähteantikeha seondub
juba suhteliselt kõrge afiinsusega, näiteks on selle KD ligikaudu 10 nM või madalam.
Skriinimist, mille puhul kasutatakse Biacore'i pinna plasmonresonantsi, on kirjeldatud siin
näidetes.
30
[0164] Seondumisafiinsuse kindlaks määramiseks võib kasutada Kinexa Biocensor'it,
stsintsillatsiooni lähedusanalüüse, ELISAt, ORIGEN immunoanalüüsi (IGEN),
60 EE-EP 1 957 106 B2
fluorestsentsi kustutamist, fluorestsentsi ülekannet ja/või pärmidisplei meetodit.
Seondumisafiinsuse skriinimiseks võib kasutada ka sobivat bioanalüüsi.
[0165] Osades teostustes on iga aminohappe positsioon CDRis asendatud (osades
teostustes ühekaupa) kõigi 20 loodusliku aminohappega, kasutades selleks tehnika tasemes 5
tunnustatud mutageneesi meetodeid (millest osasid on siin kirjeldatud). Selle tulemusel
genereeritakse väike kloonide pank (osades teostustes moodustatakse üks selline pank iga
analüüsitud aminohappe positsiooni kohta), millest igaüks on 20 liikme keerukusega (kui
igas positsioonis asendatakse kõik 20 aminohapet).
10
[0166] Osades teostustes sisaldab skriinitav pank asendusi kahes või enamas positsioonis,
mis võivad olla samas CDRis või kahes või enamas CDRis. Seega võib pank sisaldada
asendusi kahes või enamas positsioonis ühes CDRis. Pank võib sisaldada asendust kahes
või enamas positsioonis kahes või enamas CDRis. Pank võib sisaldada asendust 3, 4, 5 või
enamas positsioonis, kus nimetatud positsioonid asuvad kahes, kolmes, neljas, viies või 15
kuues CDRis. Asenduste valmistamiseks võib kasutada madala liiasusega koodoneid. Vt
näiteks tabelit 2 publikatsioonis Balint et al., (1993) Gene 137(1):109–18).
[0167] CDR võib olla CDRH3 ja/või CDRL3. CDR võib olla üks või mitu CDRL1,
CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 ja/või CDRH3. CDR võib olla Kabati CDR, Chothia 20
CDR või laiendatud CDR.
[0168] Parandatud seondumisega kandidaadid võib järjestada, tuvastades seeläbi asendatud
CDRiga mutandi, mille tulemuseks on paranenud afiinsus (nimetatakse ka „parandatud”
asendamiseks). Kandidaadid, mis seonduvad, võib samuti järjestada, tuvastades seeläbi 25
CDRi asenduse, mis säilitab seondumise.
[0169] Skriinimist võib läbi viia mitu korda. Näiteks on parandatud seondumisega
kandidaadid (millest igaüks sisaldab aminohappe asendust ühe või mitme CDRi ühes või
mitmes positsioonis) samuti kasulikud teise panga disainimiseks, mis sisaldab igas 30
parandatud CDRi positsioonis vähemalt algset ja asendatud aminohapet (st aminohappe
positsioonis CDRis, kus asendatud mutandi seondumine oli paranenud). Sellise panga
valmistamist ning skriinimist või selekteerimist on allpool üksikasjalikumalt kirjeldatud.
61 EE-EP 1 957 106 B2
[0170] Skaneeritava panga mutagenees pakub ka vahendit CDRi iseloomustamiseks
sellises ulatuses, et parandatud seondumise, samasuguse seondumise, vähenenud
seondumise või seondumiseta kloonide sagedus annab samuti teavet iga aminohappe
positsiooni tähtsuse kohta antikeha-antigeeni kompleksi stabiilsuse jaoks. Näiteks kui CDRi
positsioon säilitab seondumise ka pärast kõigi 20 aminohappe muutmist, siis tuvastatakse 5
see positsioon positsioonina, mida tõenäoliselt ei ole antigeeni sidumiseks vaja. Kui aga
CDRi positsioon säilitab seondumise üksnes asenduste väga väikese osakaalu korral, siis
tuvastatakse see positsioon positsioonina, mis on CDRi funktsiooni jaoks oluline. Seega
annavad skaneeritava panga mutageneesi meetodid teavet CDRis asuvate positsioonide
kohta, mida võib vahetada paljude erinevate aminohapete vastu (sealhulgas kõigi 20 10
aminohappe vastu) ning CDRi positsioonide kohta, mida ei saa vahetada või mida saab
vahetada üksnes väga väheste aminohapete vastu.
[0171] Parandatud afiinsusega kandidaate võib kombineerida teiseks pangaks, mis hõlmab
parandatud aminohapet, algset aminohapet selles positsioonis, ning võib lisaks selles 15
positsioonis hõlmata täiendavaid asendusi, olenevalt panga keerukusest, mis on soovitud
või mida on võimaldanud soovitud skriinimis- või selekteerimismeetodi kasutamine. Lisaks
võib soovi korral randomiseerida külgnevaid aminohappe positsioone vähemalt kahe või
enama aminohappe suhtes. Külgnevate aminohapete randomiseerimine võib anda täiendava
konformatsioonilise pandlikkuse mutant-CDRis, mis omakorda võib võimaldada või 20
lihtsustada suurema hulga täiustavate mutatsioonide sisestamist. Pank võib sisaldada ka
asendust positsioonides, mis ei näidanud täiustatud afiinsus esimese skriinimise ajal.
[0172] Teist panka skriinitakse või selekteeritakse täiustatud ja/või muudetud
seondumisafiinsusega panga liikmete leidmiseks, kasutades selleks mis tahes tehnika 25
tasemes tuntud meetodit, sealhulgas skriinimist Biacore'i pinna plasmonresonantsi
analüüsiga ning selekteerimist, mille puhul kasutatakse mis tahes tehnika tasemes tuntud
selekteerimiseks kasutatavat meetodit, sealhulgas faagidispleid, pärmidispleid ja
ribosoomidispleid.
30
[0173] Käesoleva antikeha võib siduda märgistava ainega (mida alternatiivselt nimetatakse
„märgiseks”), nagu näiteks fluorestseeruva molekuli, radioaktiivse molekuli või mis tahes
62 EE-EP 1 957 106 B2
muude tehnika tasemes tuntud märgistega. Tehnika tasemes on tuntud märgised, mis
üldiselt annavad (otsese või kaudse signaali).
[0174] Kahte polünukleotiidi- või polüpeptiidijärjestust nimetatakse „identseteks”, kui
nukleotiidide või aminohapete järjestus nendes kahes järjestuses on ühesugune, kui need 5
joondatakse maksimaalse vastavuse määramiseks vastavalt allpool kirjeldatule. Võrdlusi
kahe järjestuse vahel teostatakse tüüpiliselt järjestuste võrdlemise teel võrdlusakna kohal,
et tuvastada ja võrrelda järjestuste lokaalsete piirkondade sarnasust. „Võrdlusaken”
tähendab siin segmenti, mis koosneb vähemalt ligikaudu 20 järjestikusest positsioonist,
tavaliselt 30 kuni ligikaudu 75, 40 kuni ligikaudu 50 järjestikusest positsioonist, mille 10
järjestust saab võrrelda sama arvu järjestikuste positsioonidega viitejärjestusega pärast
nende kahe järjestuse optimaalset joondamist.
[0175] Võrdluse läbiviimiseks järjestuste optimaalseks joondamiseks võib kasutada
Lasergene bioinformaatika tarkvara komplekti kuuluvat programmi Megalign 15
(DNASTAR, Inc., Madison, WI), kasutades vaikeparameetreid. See programm hõlmab
mitmeid joondamisskeeme, mida on kirjeldatud alljärgnevates viiteallikates: Dayhoff, M.O.
(1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant
relationships. Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National
Biomedical Research Foundation, Washington DC, 5. väljaanne Suppl. 3, lk 345–358; Hein 20
J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes, lk 626–645, Methods in
Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. ja Sharp, P.M.,
1989, CABIOS 5:151–153; Myers, E.W. ja Muller W., 1988, CABIOS 4:11–17; Robinson,
E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406–425;
Sneath, P.H.A. ja Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of 25
Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. ja Lipman, D.J.,
1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726–730.
[0176] Eelistatult määratakse „järjestuse identsuse määr” kindlaks kahe optimaalselt
joondatud järjestuse võrdlemise teel vähemalt 20 positsioonist koosneva võrdlusakna kohal, 30
kus polünukleotiidi- või polüpeptiidijärjestuse osa võrdlusaknas võib sisaldada lisandusi või
deletsioone (st tühimikke) 20 protsendi ulatuses või vähem, tavaliselt 5 kuni 15 protsendi
ulatuses või 10 kuni 12 protsendi ulatuses võrreldes viitejärjestustega (mis ei sisalda
63 EE-EP 1 957 106 B2
lisandusi või deletsioone) nende kahe järjestuse optimaalseks joondamiseks. Osakaalu
arvutamiseks määratakse kindlaks positsioonide arv, mille juures asuvad identsed
nukleiinhappe alused või aminohappejäägid mõlemas järjestuses, et saada kattuvate
positsioonide arv; seejärel jagatakse kattuvate positsioonide arv viitejärjestuses olevate
positsioonide koguarvuga (st akna suurusega) ning tulemused korrutatakse 100ga, et saada 5
järjestuse identsuse osakaal.
[0177] Variandid võivad olla või alternatiivselt olla sisuliselt homoloogsed loodusliku
geeniga või selle osa või komplemendiga. Sellised polünukleotiidi variandid on suutelised
hübridiseeruma mõõdukalt rangetes tingimustes looduslikult esinevaks DNA-järjestuseks, 10
mis kodeerib looduslikku antikeha (või komplementaarset järjestust).
[0178] Sobivalt hõlmavad „mõõdukalt ranged tingimused” eelpesu lahuses, mis hõlmab
5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hübridiseerimist 50 °C–65 °C juures, 5 ×
SSC, öö läbi; millele järgneb kaks korda pesemist 65 °C juures 20 minutit igaühega 2×, 0,5× 15
ja 0,2× SSC, mis sisaldavad 0, 1% SDS-i.
[0179] Käesolevas on „ülimalt ranged tingimused” või „ülima rangusega tingimused”
alljärgnevad: (1) pesemiseks kasutatakse madalat ioonset tugevust ja kõrget temperatuuri,
näiteks 0,015 M naatriumkloriid/0,0015 M naatriumtsitraat/0,1% naatriumdodetsüülatsetaat 20
50 °C juures; (2) hübridiseerimise ajal kasutatakse denatureerivat ainet, nagu näiteks
formamiidi, näiteks 50% (v/v) formamiidi 0,1% veise seerumi albumiini/0,1% Ficolli/0,1%
polüvinüülpürrolidiini/50mM naatriumfosfaadi puhvriga pH väärtuse 6,5 juures 750 mM
naatriumkloriidi, 75 mM naatriumtsitraadiga 42 °C juures; või (3) kasutada 50%
formamiidi, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M naatriumtsitraat), 50 mM naatriumfosfaati (pH 25
6,8), 0,1% naatriumpürofosfaati, 5 × Denhardt'i lahust, sonikeeritud lõhe sperma DNAd (50
µg/ml), 0,1% SDS-i ja 10% dekstraansulfaati 42 °C juures koos pesemisega 42 °C juures
0,2 × SSC-is (naatriumkloriid/naatriumtsitraat) ja 50% formamiidis 55 °C juures, millele
järgneb pesu ülimalt rangetes tingimustes, mis hõlmab 0,1 × SSCd, mis sisaldab EDTAd,
55 °C juures. Antud valdkonna asjatundja teab, kuidas kohandada temperatuuri, ioonset 30
tugevust jne, mis on vajalik erinevatele teguritele, nagu näiteks proovi pikkusele jms
kohandumiseks.
64 EE-EP 1 957 106 B2
[0180] Antud valdkonna asjatundjad mõistavad, et geneetilise koodi degeneratiivsuse
tagajärjel on terve hulk nukleotiidijärjestusi, mis kodeerivad siin kirjeldatud polüpeptiidi.
Osad nendest polünukleotiididest kannavad mis tahes loodusliku geeni nukleotiidijärjestuse
suhtes minimaalset homoloogiat. Sellest hoolimata peetakse käesolevas leiutises
spetsiifiliselt võimalikuks polünukleotiide, mis varieeruvad erinevuste tõttu koodoni 5
kasutamises. Lisaks on siin välja pakutud polünukleotiidi järjestusi sisaldavad geenide
alleelid käesoleva leiutise ulatuses. Alleelid on endogeensed geenid, mida on muudetud ühe
või mitme mutatsiooni, nagu näiteks nukleotiidide deletsioonide, lisanduste ja/või asenduste
tulemusel. Tulemuseks saadud mRNAl ja valgul võib, kuid ei pruugi olla muutunud
struktuur või funktsioon. Alleelide tuvastamiseks võib kasutada standardseid tehnikaid 10
(nagu näiteks hübridiseerimist, laiendamist ja/või andmebaasi järjestuse võrdlust).
[0181] Polünukleotiidide saamiseks võib kasutada keemilist sünteesi, rekombinantseid
meetodeid või PCRi. Polünukleotiidi keemilise sünteesi meetodid on tehnika tasemes hästi
tuntud ning neid ei ole vaja siin üksikasjalikult kirjeldada. Antud valdkonna asjatundja võib 15
soovitud DNA järjestuse tootmiseks kasutada siin välja pakutud järjestusi ja
kaubanduslikult kättesaadavat DNA sünteesijat.
[0182] Polünukleotiidide valmistamiseks rekombinantseid meetodeid kasutades võib
soovitud järjestust sisaldava polünukleotiidi sisestada sobivasse vektorisse ning selle 20
vektori võib omakorda sisestada sobivasse peremeesrakku replitseerimiseks ja
laiendamiseks vastavalt siin edaspidi kirjeldatule. Polünukleotiide võib
peremeesrakkudesse sisestada mis tahes tehnika tasemes tuntud meetodeid kasutades.
Rakud kujundatakse ümber eksogeense polünukleotiidi sisestamisega otsese omastamise,
endotsütoosi, transfektsiooni, F-paaritamise või elektroporatsiooni teel. Kui eksogeenne 25
polünukleotiid on rakku sisestatud, siis võib seda seal säilitada integreerimata vektorina
(nagu näiteks plasmiidina) või selle võib integreerida peremeesraku genoomi. Sellisel viisil
laiendatud polünukleotiidi saab peremeesrakust isoleerida tehnika tasemes hästi tuntud
meetoditega. Vt näiteks Sambrook et al. (1989).
30
[0183] Alternatiivselt võimaldab PCR DN- järjestusi reprodutseerida. PCR-tehnoloogia on
tehnika tasemes hästi tuntud ning seda on kirjeldatud USA patentides nr 4 683 195,
65 EE-EP 1 957 106 B2
4 800 159, 4 754 065 ja 4 683 202 ning samuti allikas PCR: The Polymerase Chain
Reaction, Mullis et al. (toim.), Birkauswer Press, Boston (1994).
[0184] RNA saamiseks võib kasutada asjakohases vektoris isoleeritud DNAd, mis
sisestatakse sobivasse peremeesrakku. Kui rakk paljuneb ning DNA transkribeeritakse 5
RNAks, võib RNA seejärel isoleerida, kasutades selleks antud valdkonna asjatundjatele
hästi tuntud meetodeid, mis on kirjeldanud näiteks Sambrook et al., (1989).
[0185] Sobivad kloonimisvektorid võib konstrueerida vastavalt standardsetele tehnikatele
või need võib valida suure hulga kloonimisvektorite hulgast, mis on tehnika tasemes 10
kättesaadavad. Samal ajal kui valitud kloonimisvektor võib varieeruda vastavalt
peremeesrakule, mida kavatsetakse kasutada, on kasulikel kloonimisvektoritel üldiselt
võime replitseeruda, neil võib olla üks märklaud konkreetse restriktsiooni endonukleaasi
jaoks ja/või nad võivad kanda geene markeri jaoks, mida võib kasutada vektorit sisaldavate
kloonide valimisel. Sobivate näidete hulka kuuluvad plasmiidid ja bakteriaalsed viirused, 15
näiteks pUC18, pUC19, Bluescript (näiteks pBS SK+) ja selle derivaadid, mp18, mp19,
pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, faagi DNAd ning ülekandevektorid, nagu näiteks
pSA3 ja pAT28. Need ja paljud teised kloonimisvektorid on kättesaadavad kaubanduslikelt
edasimüüjatelt, nagu näiteks ettevõtetelt BioRad, Strategene ja Invitrogen.
20
[0186] Ekspressioonivektorid on üldiselt replitseeritavad polünukleotiidi konstruktid, mis
sisaldavad polünukleotiidi. Eeldatakse, et ekspressioonivektor peab olema peremeesrakus
replitseeritav kas episoomidena või kromosomaalse DNA integraalse osana. Sobivate
ekspressioonivektorite hulka kuuluvad mittepiiravalt plasmiidid, viirusvektorid, sealhulgas
adenoviirused, adeno-seotud viirused, retroviirused, kosmiidid ning 25
ekspressioonivektor(id), mida on kirjeldatud PCT publikatsioonis nr WO 87/04462. Vektori
komponentide hulka võivad üldiselt mittepiiravalt kuuluda üks või mitu alljärgnevatest:
signaaljärjestus; replikatsiooni alguspunkt; üks või mitu markergeeni; sobivad
transkriptsiooni kontrollivad elemendid (nagu näiteks promootorid, enhanserid ja
terminaator). Ekspresseerimiseks (st translatsiooniks) on tavaliselt vaja ühte või mitut 30
translatsiooni kontrollivat elementi, nagu näiteks ribosoomi sidumissaite, translatsiooni
käivitussaite ja stoppkoodoneid.
66 EE-EP 1 957 106 B2
[0187] Huvipakkuvaid polünukleotiide sisaldavaid vektoreid võib sisestada peremeesrakku
mis tahes erinevate asjakohaste vahenditega, sealhulgas elektroporatsiooniga,
transfektsiooniga, kus kasutatakse kaltsiumkloriidi, rubiidiumkloriidi, kaltsiumfosfaati,
DEAE-dekstraani või teisi aineid; mikrokerakeste pommitamisega; lipofektsiooniga; ja
infektsiooniga (näiteks kui vektor on nakkav aine, nagu näiteks vaktsiinia viirus). 5
Sisestatavate vektorite või polünukleotiidide valik sõltub sageli peremeesraku omadustest.
[0188] Käesolev leiutiskirjeldus pakub ka peremeesrakke, mis sisaldavad mis tahes siin
kirjeldatud polünukleotiide. Huvipakkuvat antikeha, polüpeptiidi või valku kodeerivate
geenide isoleerimise eesmärgil võib kasutada mis tahes peremeesrakke, mis suudavad 10
üleekspresseerida heteroloogilisi DNAsid. Imetaja peremeesrakkude mittepiiravate näidete
hulka kuuluvad COS, HeLa ja CHO-rakud. Vt ka PCT publikatsiooni nr WO 87/04462.
Sobivate mitteimetaja peremeesrakkude hulka kuuluvad prokarüoodid (nagu näiteks E. coli
või B. subtillis) ja pärm (nagu näiteks S. cerevisae, S. pombe; või K. lactis). Eelistatult
ekspresseerivad peremeesrakud cDNAsid tasemel, mis on ligikaudu 5 korda kõrgem, enam 15
eelistatult 10 korda kõrgem, veelgi enam eelistatult 20 korda kõrgem vastava huvipakkuva
endogeense antikeha või valgu tasemest peremeesrakkudes (kui see on seal olemas).
Huvipakkuvat antikeha või valku üleekspresseerivat rakku on võimalik tuvastada.
D. Koostised 20
[0189] Leiutisekohased kompositsioonid sisaldavad tõhusat kogust siin kirjeldatud CGRP-
vastast antagonistlikku antikeha. Selliste koostiste näiteid ning nende formuleerimist on
kirjeldatud nii ees- kui allpool. Ühes teostuses sisaldab koostis lisaks CGRP antagonisti.
Veel ühes teostuses sisaldab koostis ühte või mitut CGRP-vastast antagonist-antikeha. 25
Teistes teostustes tunneb CGRP-vastane antagonist-antikeha ära inimese CGRP. Veel
osades teistes teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha humaniseeritud antikeha.
Veel ühes teostuses sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha konstantset piirkonda, mis
ei käivita soovimatut immuunvastust, nagu näiteks antikeha vahendatud lüüsi või ADCC-d.
Teistes teostustes sisaldab CGRP-vastane antagonist-antikeha antikeha G1 ühte või mitut 30
CDRi (nagu näiteks ühte, kahte, kolme, nelja, viit või osades teostustes kõiki kuut CDRi
antikehast G1). Osades teostustes on CGRP-vastane antagonist-antikeha inimese antikeha.
67 EE-EP 1 957 106 B2
[0190] Siinkohal on selge, et nimetatud koostised võivad sisaldada rohkem kui ühte CGRP-
vastast antagonist-antikeha (näiteks CGRP-vastaste antagonist-antikehade segu, mis
tunnevad ära erinevaid CGRP epitoope). Teised näitlikud koostised sisaldavad rohkem kui
ühte CGRP-vastast antagonist-antikeha, mis tunnevad ära sama epitoopi (samu epitoope),
või erinevate liikide CGRP-vastaseid antagonist-antikehi, mis seonduvad erinevate CGRP 5
epitoopidega.
[0191] Käesolevas leiutises kasutatud koostis võib lisaks sisaldada farmatseutiliselt
aktsepteeritavaid tugiaineid, abiaineid või stabilisaatoreid (Remington: The Science and
practice of Pharmacy, 20. väljaanne, (2000) Lippincott Williams ja Wilkins, toim. K. E. 10
Hoover.) lüofiliseeritud formulatsioonide või vesilahuste kujul. Aktsepteeritavad tugiained,
abiained või stabilisaatorid on vastuvõtjatele kasutatud annustes ja kontsentratsioonides
mittetoksilised ning nende hulka võivad kuuluda puhvrid, nagu näiteks fosfaat, titraat ja
teised orgaanilised happed; antioksüdandid, nagu näiteks askorbiinhape ja metioniin;
säilitusained (nagu näiteks oktadetsüüldimetüülbensüül-ammooniumkloriid; 15
heksametooniumkloriid; bensalkooniumkloriid, bensetooniumkloriid; fenool-, butüül- või
bensüülalkohol; alküülparabeenid, nagu näiteks metüül- või propüülparabeen; katekool;
resortsinool; tsükloheksanool; 3-pentanool; ja m-kresool); madala molekulmassiga (vähem
kui ligikaudu 10 jääki) polüpeptiidid; valgud, nagu näiteks seerumi albumiin, želatiin või
immunoglobuliinid; hüdrofiilsed polümeerid, nagu näiteks polüvinüülpürrolidoon; 20
aminohapped, nagu näiteks glütsiin, glutamiin, asparagiin, histidiin, arginiin või lüsiin;
monosahhariidid, disahhariidid ja muud süsivesikud, sealhulgas glükoos, mannoos või
dekstraanid; kelaativad ained, nagu näiteks EDTA; suhkrud, nagu näiteks sahharoos,
mannitool, trehaloos või sorbitool; sooli moodustavad vastasioonid, nagu näiteks naatrium;
metallikompleksid (näiteks Zn-valgu kompleksid); ja/või mitteioonsed pindaktiivsed ained, 25
nagu näiteks TWEEN™, PLURONICS™ või polüetüleenglükool (PEG). Farmatseutiliselt
aktsepteeritavaid abiaineid on siin edaspidi kirjeldatud.
[0192] CGRP-vastast antagonist-antikeha ja selle koostisi võib kasutada ka koos muude
toimeainetega, mille eesmärgiks on parandada ja/või täiendada nende toimeainete tõhusust. 30
[0193] Alljärgnevad näited on pakutud käesoleva leiutise illustreerimiseks, kuid mitte selle
piiramiseks.
68 EE-EP 1 957 106 B2
Näited
Näide 1: CGRP-vastaste monoklonaalsete antikehade genereerimine ja
iseloomustamine
5
[0194] GCRP-vastaste antikehade genereerimine. CGRP-vastaste antikehade
genereerimiseks, millel on liikide ristreaktiivsus roti ja inimese CGRP puhul, immuniseeriti
hiired 25–100 µg inimese α-CGRP või β-CGRPga, mis oli konjugeeritud KLHga adjuvandis
(50 µl jalatalla kohta, kokku 100 µl hiire kohta) erinevate intervallidega. Immuniseerimist
teostati üldiselt viisil, mida on kirjeldatud allikates Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. 10
Methods 124:95–102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121:157–166; ja Wicher
K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128–135. Hiired immuniseeriti
kõigepealt 50 µg inimese α-CGRP või β-CGRPga, mis oli konjugeeritud KLHga CFAs
(complete Freund's adjuvant, täielik Freundi adjuvant). 21 päeva pärast immuniseeriti hiiri
teist korda 25 µg inimese β-CGRPga (hiirte puhul, keda esimesel korral immuniseeriti 15
inimese α-CGRPga) või -CGRPga (hiirte puhul, keda esimesel korral immuniseeriti inimese
β-CGRPga), mis oli konjugeeritud KLHga IFAs (incomplete Freund's adjuvant, mittetäielik
Freundi adjuvant). Kakskümmend kolm päeva pärast teist immuniseerimist teostati kolmas
immuniseerimine 25 µg roti α-CGRPga, mis oli konjugeeritud KLHga IFAs. Kümme päeva
hiljem testiti antikeha tiitreid ELISA analüüsi kasutades. Neljas immuniseerimine teostati 20
25 µg peptiidiga (roti α-CGRP-KLH) IFAs 34 päeva pärast kolmandat immuniseerimist.
Viimane võimendus teostati 100 µg lahustuva peptiidiga (roti α-CGRP) 32 päeva pärast
neljandat immuniseerimist.
[0195] Immuniseeritud hiirtelt saadi splenotsüüdid ning need ühendati NSO müeloomi 25
rakkudega vahekorras 10:1 polüetüleenglükooliga 1500. Hübriidid kanti 96 süvendiga
plaatidele DMEM-i, mis sisaldas 20% hobuse seerumit ja
2-oksaloatsetaat/püruvaat/insuliini (Sigma), ning seejärel alustati
hüpoksantiini/aminopteriini/tümidiini selekteerimist. 8. päeval lisati kõikidesse
süvenditesse 100 µl DMEM-i, mis sisaldas 20% hobuse seerumit. Hübriidide supernatantide 30
skriinimiseks kasutati antikeha püüdmise immunoanalüüsi. Antikeha klass määrati kindlaks
klassispetsiifiliste teiste antikehadega.
69 EE-EP 1 957 106 B2
[0196] Monoklonaalset antikeha tootvate rakuliinide paneel selekteeriti edasiseks
iseloomustamiseks nende inimese ja roti CGRPga seondumise alusel. Need antikehad ja
omadused on välja toodud allpool tabelites 2 ja 3.
[0197] Puhastamine ja Fab fragmendi valmistamine. Edasiseks iseloomustamiseks 5
selekteeritud monoklonaalsed antikehad puhastati hübridoomi kultuuride supernatantidest,
kasutades selleks valgu A afiinsuskromatograafiat. Supernatantide pH tasakaalustati
väärtusele 8. Seejärel laeti supernatandid valgu A kolonnile MabSelect (Amersham
Biosciences nr 17-5199-02), mille pH tasakaalustati PBSiga väärtusele 8. Kolonn pesti 5
kolonni mahuga PBSiga (pH 8). Antikehad elueeriti 50 mM tsitraat-fosfaatpuhvriga (pH 3). 10
Elueeritud antikehad neutraliseeriti 1M fosfaatpuhvriga (pH 8). Puhastatud antikehad
dialüüsiti PBSiga (pH 7,4). Antikeha kontsentratsioonid määrati kindlaks SDS-PAGE’iga,
kasutades närilise monoklonaalse antikeha standardkõverat.
[0198] Fabid valmistati täielike antikehade papaiini proteolüüsiga, kasutades selleks 15
Immunopure Fab komplekti (Pierce nr 44885), ning puhastati vooluga läbi valgu A
kromatograafia tootjapoolseid juhiseid järgides. Kontsentratsioonid määrati kindlaks
ELISA analüüsiga ja/või SDS-PAGE elektroforeesiga, kasutades standardsete Fabide
teadaolevaid kontsentratsioone (määrati kindlaks aminohappe analüüsiga), ning A280ga,
kasutades 10D=0,6 mg/ml (ehk teoreetilist ekvivalenti, mis põhineb aminohappe 20
järjestusel).
[0199] Fabide afiinsuse kindlaks määramine. CGRP-vastaste antagonist-antikehade
afiinsus määrati kindlaks kas 25 °C või 37 °C juures, kasutades Biacore3000™ pinna
plasmonresonantsi (SPR) süsteemi (Biacore, INC, Piscataway NJ) koos tootja enda voolu 25
puhvriga, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v
polüsorbaat P20). Afiinsus määrati kindlaks N-otsast biotinüülitud CGRP peptiidide
püüdmisega (eritellimus ettevõttelt GenScript Corporation, New Jersey või Global Peptide
Services, Colorado) eelnevalt SA kiibile immobiliseeritud streptavidiini kaudu ning mõõtes
Fab-titreeritud antikeha seondumiskineetikat üle CGRP pinna. Biotinüülitud CGRP 30
lahjendati HSB-EPsse ning pritsiti üle kiibi kontsentratsiooni juures, mis oli väiksem kui
0,001 mg/ml. Individuaalsete kiibi kanalite kohal varieeruvat vooluaega kasutades saavutati
kaks antigeeni tiheduse vahemikku: <50 vastuseühikut (RU) üksikasjalike kineetiliste
70 EE-EP 1 957 106 B2
uuringute jaoks ning ligikaudu 800 RU kontsentratsiooniuuringute ja skriinimise jaoks.
Kahe- või kolmekordsed seerialahjendused, mis olid tüüpiliselt puhastatud Fab-fragmentide
kontsentratsioonides vahemikus 1 µM – 0.1 nM (eesmärgiks oli 0,1–10 × prognoositavast
KD-st), pritsiti 1 minutiks kontsentratsioonis 100 µl/min ning seejuures võimaldati 10-
minutilisi dissotsiatsiooniaegu. Iga seondumistsükli järel regenereeriti pinnad 25 mM 5
NaOHga 25% v/v etanoolis, mis pidas vastu rohkem kui sadadele tsüklitele. Kineetiline
assotsiatsioonikiirus (kon) ja dissotsiatsioonikiirus (koff) saadi samaaegselt andmete
sobitamisel 1:1 Langmuiri seondumismudelisse (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L.
Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99–110), kasutades programmi BIA
Evaluation. Dissotsiatsioonikonstantide (KD) ehk „afiinsuste” üldine tasakaal arvutati 10
suhtarvust KD = koff/kon. Närilise Fab-fragmentide afiinsused on välja toodud tabelites 2 ja 3.
[0200] Närilise CGRP-vastaste antikehade epitoobi kaardistamine. Epitoobi kindlaks
määramiseks, mille juures CGRP antikehad seonduvad inimese α-CGRPle, mõõdeti Fab-
fragmentide seondumisafiinsusi erinevate CGRP fragmentide suhtes vastavalt eespool 15
kirjeldatule, püüdes N-otsast biotinüülitud CGRP fragmendid aminohapped 19–37 ja
aminohapped 25–37 SA sensorkiibile. Joonisel FIG 1 on kujutatud nende
seondumisafiinsused 25 °C juures mõõdetuna. Vastavalt joonisel FIG 1 näidatule
seonduvad kõik antikehad, välja arvatud antikeha 4901, inimese α-CGRP fragmentidega
19–37 ja 25–37 afiinsusega, mis sarnaneb nende seondumisafiinsusega täispikkuses inimese 20
α-CGRP (1–37) suhtes. Antikeha 4901 seondub inimese α-CGRP fragmendiga 25–37 kuus
korda madalama afiinsusega, kui see seondub täispikkuses inimese α-CGRP fragmendiga
ning seda peamiselt off-kiiruse vähenemise tõttu. Need andmed näitavad, et need CGRP-
vastased antikehad seonduvad üldiselt CGRP C-otsaga.
25
[0201] inimese α-CGRPs sisalduvate aminohapete, mis on seotud CGRP-vastaste
antikehade sidumisega, täiendavaks iseloomustamiseks viidi läbi alaniini skannimine.
Üksikute alaniini asendustega inimese α-CGRP erinevad variandid genereeriti
peptiidsünteesiga. Nende aminohappejärjestused on välja toodud tabelis 4 koos kõikide
teiste peptiididega, mida kasutati Biacore'i analüüsis. CGRP-vastaste antikehade Fab-30
fragmentide afiinsuste kindlaks määramiseks nende variantide suhtes kasutati Biacore'i
analüüsi vastavalt eespool kirjeldatule. Vastavalt joonisel FIG 1 näidatule on kõigi 12
antikeha märklauaks C-otsa epitoop, kus aminohape F37 on kõige olulisem jääk. F37
71 EE-EP 1 957 106 B2
muteerimine alaniiniks alandas afiinsust või lülitas CGRP-vastaste antikehade seondumise
peptiidiga täielikult välja. Olulisuselt järgmine aminohappejääk on G33, kuid alaniiniga
asendamine selles positsioonis avaldas mõju ainult kõrge afiinsusega antikehadele (7E9,
8B6, 10A8 ja 7D11). Aminohappejäägil S34 on samuti märkimisväärne, kuid väiksem roll
nende nelja kõrge afiinsusega antikeha seondumises. 5
Tabel 2. CGRP-vastaste monoklonaalsete antikehade inimese α-CGRPga seondumise
omadused ja nende antagonistlik toime
Antikehad KD
inimese
α-CGRP
suhtes 25
°C juures
(nM)
KD
inimese
α-CGRP
suhtes 37
°C juures
(nM)
Inimese α-CGRP
seondumise rakupõhine
blokeerimine selle
retseptoriga 25 °C juures
(cAMP aktiveerimisega
mõõdetuna)
IC50 (nM sidumis-
saidid) 25 °C juures
(toatemperatuuril)
radioligandi
seondumisanalüüsis
mõõdetuna
7E9 1,0 0,9 Jah 2,5
8B6 1,1 1,2 Jah 4,0
10A8 2,1 3,0 Jah n.d.
7D11 4,4 5,4 Jah n.d.
6H2 9,3 42 Jah 12,9
4901 61 139 Jah 58
14E10 80 179 Jah n.d.
9B8 85 183 Ei n.d.
13C2 94 379 Ei n.d.
14A9 148 581 Ei n.d.
6D5 210 647 Ei n.d.
1C5 296 652 Ei n.d.
NB: Antikeha 4901 on kaubanduslikult kättesaadav (Sigma, toode nr C7113).
72 EE-EP 1 957 106 B2
Antikehad KD
inimese
α-CGRP
suhtes 25
°C juures
(nM)
KD
inimese
α-CGRP
suhtes 37
°C juures
(nM)
Inimese α-CGRP
seondumise rakupõhine
blokeerimine selle
retseptoriga 25 °C juures
(cAMP aktiveerimisega
mõõdetuna)
IC50 (nM sidumis-
saidid) 25 °C juures
(toatemperatuuril)
radioligandi
seondumisanalüüsis
mõõdetuna
n.d. = kindlaks määramata
Tabel 3. CGRP-vastaste monoklonaalsete antikehade roti α-CGRPga seondumise omadused
ja nende antagonistlik toime
Antikehad KD roti α-
CGRP suhtes
37 °C juures
(nM)
Roti α-CGRP seondumise rakupõhine
blokeerimine selle retseptoriga 25 °C juures
(cAMP aktiveerimisega mõõdetuna)
In vivo
blokeerimine
jäsemenärvi
analüüsis
4901 3,4 Jah Jah
7E9 47 Jah Jah
6H2 54 Ei Ei
8B6 75 Jah Jah
7D11 218 Jah Jah
10A8 451 Ei n.d.
9B8 876 Ei n.d.
14E10 922 Ei n.d.
13C2 > 1000 Ei n.d.
14A9 > 1000 Ei n.d.
6D5 > 1000 Ei n.d.
1C5 > 1000 Ei n.d.
„n.d.” näitab, et antud antikeha suhtes testi ei teostatud.
73 EE-EP 1 957 106 B2
Tabel 4. Inimese α-CGRP fragmentide (SEQ ID NO:15–40) ja seotud peptiidide (SEQ ID
NOS:41–47) aminohappejärjestused. Kõik peptiidid on N-otsast amideeritud, välja arvatud
järjestused SEQ ID NO:36–40. Paksus kirjas jäägid tähistavad punktmutatsioone.
CGRP Aminohappejärjestus SEQ
ID
NO
1–37 (WT) ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 15
8–37 VTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF 16
19–37 SGGVVKNNFVPTNVGSKAF 17
P29A (19–37) SGGVVKNNFVATNVGSKAF 18
K35A (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSAAF 19
K35E (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSEAF 20
K35M (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSMAF 21
K35Q (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSQAF 22
F37A (19–37) SGGVVKNNFVPTNVGSKAA 23
25–38A NNFVPTNVGSKAFA 24
25–37 NNFVPTNVGSKAF 25
F27A (25–37) NNAVPTNVGSKAF 26
V28A (25–37) NNFAPTNVGSKAF 27
P29A (25–37) NNFVATNVGSKAF 28
T30A (25–37) NNFVPANVGSKAF 29
N31A (25–37) NNFVPTAVGSKAF 30
V32A (25–37) NNFVPTNAGSKAF 31
G33A (25–37) NNFVPTNVASKAF 32
S34A (25–37) NNFVPTNVGAKAF 33
F37A (25–37) NNFVPTNVGSKAA 34
74 EE-EP 1 957 106 B2
CGRP Aminohappejärjestus SEQ
ID
NO
26–37 NFVPTNVGSKAF 35
19–37-COOH SGGVVKNNFVPTNVGSKAF 36
19–36-COOH SGGVVKNNFVPTNVGSKA 37
1–36-COOH ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKA 38
1–19-COOH ACDTATCVTHRLAGLLSRS 39
1–13-COOH ACDTATCVTHRLA 40
roti α (1–37) SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF 41
roti α (19–37) SGGVVKDNFVPTNVGSEAF 42
inimese β (1–
37)
ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF 43
roti β (1–37) SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF 44
Inimese
kaltsitoniin (1–
32)
CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 45
Inimese amüliin
(1–37)
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY 46
Inimese
adrenomedulliin
(1–52)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDK
DKDNVAPRSKISPQGY
47
Näide 2: CGRP-vastaste antagonist-antikehade skriinimine in vitro analüüsimeetodeid
kasutades.
[0202] Närilise CGRP-vastaseid antikehi skriiniti täiendavalt antagonisti aktiivsuse in vitro 5
kindlaks tegemiseks, kasutades selleks rakupõhist cAMP aktiveerimise analüüsi ja
seondumisanalüüsi.
75 EE-EP 1 957 106 B2
[0203] Antagonisti aktiivsust mõõdeti cAMP analüüsiga. Viis mikroliitrit inimese või roti
α-CGRPd (lõppkontsentratsioon 50 nM) CGRP-vastase antikeha juuresolekul või
puudumisel (lõppkontsentratsioon 1–3000 nM), või roti α-CGRP või inimese α-CGRPd
(lõppkontsentratsioon 0,1 nM-10 µM; c-AMP aktiveerimise positiivse kontrollina) doseeriti
384 süvendiga plaadile (Nunc, kat. nr 264657). Plaadi süvenditesse lisati kümme mikroliitrit 5
rakke (inimese SK-N-MC inimese α-CGRP kasutamise korral või roti L6 ATCCst roti
α-CGRP kasutamise korral) stimulatsioonipuhvris (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl,
5 mM KCI, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 ja 500 uM 3-isobutüül-1-metüülksantiin (IBMX)).
Plaati inkubeeriti toatemperatuuril 30 minutit.
10
[0204] Pärast inkubeerimist kasutati cAMP aktiveerimiseks HitHunter™ ensüümi-
fragmendi komplementeerimise analüüsi (Applied Biosystems), järgides tootjapoolseid
juhiseid. See analüüsimeetod põhineb geneetiliselt töödeldud β-galaktosidaasi ensüümil,
mis koosneb kahest fragmendist – ensüümi aktseptorist (enzyme acceptor, EA) ja ensüümi
doonorist (enzyme donor, ED). Kui need kaks fragmenti lahutatakse, siis on ensüüm 15
mitteaktiivne. Kui need fragmendid on koos, siis võivad nad spontaanselt ümber
kombineeruda aktiivse ensüümi moodustamiseks protsessi teel, mida nimetatakse
komplementeerimiseks. EFC analüüsi platvorm kasutab ED-cAMP peptiidi konjugaati,
milles cAMPi tunneb ära cAMPi vastane antikeha. ED-fragment on suuteline EAga uuesti
ühinema aktiivse ensüümi moodustamiseks. Selles analüüsis titreeritakse cAMP vastast 20
antikeha optimaalselt ED-cAMPi konjugaadiga seondumiseks ja ensüümi moodustamise
inhibeerimiseks. cAMP tasemed rakulüsaadi proovides konkureerivad ED-cAMPi
konjugaadiga cAMP vastase antikehaga seondumise osas. Vaba ED konjugaadi kogus
analüüsis on proportsionaalne cAMP kontsentratsiooniga. Seega mõõdetakse cAMPi
aktiivse ensüümi moodustamisega, mida kvantifitseeritakse β-galaktosidaasi 25
luminestseeruva substraadi ümberpöördumisega. cAMP aktiveerimisanalüüsi teostamiseks
lisati 10 µl lüüsi puhvrit ja cAMP vastast antikeha (vahekorras 1:1), millele järgnes
inkubeerimine toatemperatuuril 60 minutit. Seejärel lisati igasse süvendisse 10 µl ED-
cAMPi reagenti ning inkubeeriti toatemperatuuril 60 minutit. Pärast inkubeerimist lisati
igasse süvendisse 20 µl EA reagenti ja CL segu (sisaldas substraati) (vahekorras 1:1) ning 30
inkubeeriti 1 kuni 3 tundi või öö läbi toatemperatuuril. Plaati loeti kiirusel 1 sekund süvendi
kohta PMT instrumendil või kiirusel 30 sekundit plaadi kohta kujutise formeerijal.
Antikehad, mis inhibeerivad cAMPi aktiveerimist α-CGRPi poolt, tuvastati (tähistatud
76 EE-EP 1 957 106 B2
vastusega „jah”) eespool tabelites 2 ja 3. Tabelites 2 ja 3 esitatud andmed näitavad, et
antikehadel, mis demonstreerisid analüüsis agonistlikku toimet, on üldiselt kõrge afiinsus.
Näiteks antikehad, millel on KD (kindlaks määratud 25 °C juures), mis on ligikaudu 80 nM
või väiksem inimese α-CGRP suhtes, või millel on KD (kindlaks määratud 37 °C juures),
mis on ligikaudu 47 nM või väiksem roti α-CGRP, näitasid käesolevas analüüsis 5
antagonistlikku toimet.
[0205] Radioligandi seondumise analüüs. Seondumisanalüüs teostati CGRP-vastase
antikeha IC50 mõõtmiseks CGRP retseptoriga seondumise blokeerimisel vastavalt
varasemalt kirjeldatule. Zimmermann et al., Peptides 16:421–4, 1995; Mallee et al., J. Biol. 10
Chem. 277:14294–8, 2002. SK-N-MC rakkudest saadud membraane (25 µg) inkubeeriti 90
minutit toatemperatuuril inkubatsioonipuhvris (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCL2,
0,1% BSA), mis sisaldas 10 pM 125I-inimese α-CGRPd kogumahus 1 ml.
Inhibeerimiskontsentratsioonide (IC50) kindlaks määramiseks lahustati antikehad või
märgistamata CGRP (kontrollina), mis saadi ligikaudu 100 korda kõrgemast lähtelahusest, 15
varieeruvate kontsentratsioonide juures inkubatsioonipuhvris ning inkubeeriti samaaegselt
membraanide ja 10 pM 125I-inimese α-CGRPga. Inkubeerimine lõpetati filtreerimisega läbi
klaasist mikrokiudfiltri (GF/B, 1µm), mida oli blokeeritud 0,5% polüetüleenimiiniga.
Annuse vastuse kõverad joonestati ning Ki väärtuste kindlaks määramiseks kasutati
alljärgnevat valemit: Ki=IC50/(1+([ligand]/KD); kus dissotsiatsiooni tasakaalukonstant KD = 20
8 pM inimese α-CGRP puhul CGRP1 retseptori suhtes vastavalt SK-N-MC rakkudes
esitatule, ning Bmax = 0,025 pmol mg valgu kohta. Teatatud IC50 väärtus (seoses IgG
molekulidega) teisendati sidumissaitideks (korrutades selle kahega), nii et seda saaks
võrrelda afiinsustega (KD), mis määrati kindlaks Biacore'i analüüsis (vt tabelit 2).
25
[0206] Tabelis 2 on välja toodud närilise antikehade 7E9, 8B6, 6H2 ja 4901 IC50 väärtused.
Need andmed näitavad, et antikeha afiinsus on IC50 väärtusega üldiselt korrelatsioonis:
kõrgema afiinsusega (madalamate KD väärtustega) antikehadel on madalam IC50
radioligandi seondumisanalüüsis.
30
Näide 3: CGRP-vastaste antagonist-antikehade mõju roti jäsemenärvi
stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile
77 EE-EP 1 957 106 B2
[0207] CGRP-vastaste antikehade antagonistliku toime testimiseks testiti nende antikehade
mõju roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile, kasutades
selleks varasemalt kirjeldatud rotimudelit. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772–776,
1993. Selles rotimudelis kutsub jäsemenärvi elektriline stimuleerimine esile CGRP
vabanemise närvilõpmetest, andes tulemuseks naha verevoolu suurenemise. Verevoolu 5
isaste Sprague Dwaley rottide (170–300 g, Charles River Hollister) jäseme nahas mõõdeti
pärast jäsemenärvi stimuleerimist. Rotte hoiti anesteesia all 2% isofluraaniga. Katse alguses
anti bretüüliumtosülaati (30 mg/kg, manustati intravenoosselt), et viia jäsemenärvi
sümpateetiliste kiudude samaaegsest stimuleerimisest tingitud vasokonstriktsioon
miinimumini. Kehatemperatuuri hoiti 37 °C juures rektaalse indikaatori kasutamisega, mis 10
oli termostaatiliselt ühendatud kontrollitud temperatuuriga soojendusalusega. Ühendid,
sealhulgas antikehad, positiivne kontroll (CGRP 8–37) ja vehiikul (PBS, 0,01% Tween 20)
manustati intravenoosselt parempoolse reiearteri kaudu, välja arvatud joonisel FIG 3
kujutatud katse puhul, kus testühend ja kontroll süstiti sabaveeni kaudu, ning joonistel FIG
2A ja FIG 2B kujutatud katsete puhul, kus antikehad 4901 ja 7D11 süstiti 15
intraperitoneaalselt (IP). Positiivne kontrollühend CGRP 8–37 (vasodilatatsiooni
antagonist) manustati selle lühikese pooleluea tõttu 3–5 minutit enne närvi stimuleerimist
kontsentratsioonis 400 nmol/kg (200 µl). Tan et al., Clin. Sci. 89:656–73, 1995. Antikehasid
manustati erinevates annustes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ja 25 mg/kg).
20
[0208] Joonistel FIG 2A ja FIG 2B kujutatud katsete puhul manustati antikeha 4901
(25 mg/kg), antikeha 7D11 (25 mg/kg) või vehiikuli kontroll (PBS koos 0,01% Tween
20ga) intraperitoneaalselt (IP) 72 tundi enne elektriimpulsiga stimuleerimist. Joonisel FIG
3 kujutatud katse puhul manustati antikeha 4901 (1 mg/kg, 2,5 mg/kg või 25 mg/kg) või
vehiikuli kontroll (PBS koos 0,01% Tween 20ga) intravenoosselt 24 tundi enne 25
elektriimpulsiga stimuleerimist. Pärast antikehade või vehiikuli kontrolli manustamist
paljastati parempoolse tagajäseme jäsemenärv kirurgiliselt, lõigati proksimaalselt ning kaeti
kuivamise vältimiseks plastmähisega. Tagumise käpa naha mediodorsaalse külje kohale
paigutati Doppleri laserindikaator, kuna jäsemenärv ergutab selle piirkonna tegevust. Naha
verevoolu, mida mõõdeti vererakkude vooluna, jälgiti Doppleri laser-voolumeetriga. Kui 30
stabiilne baastaseme vool (vähem kui 5% varieerumist) saavutati vähemalt 5 minutiks, siis
asetati närv plaatinast bipolaarsetele elektroodidele ning seda stimuleeriti elektriliselt 60
impulsiga (2 Hz, 10 V, 1 ms, 30 sekundit) ning seejärel uuesti 20 minuti pärast.
78 EE-EP 1 957 106 B2
Kumulatiivset muutust naha verevoolus hinnati voolu-aja kõvera aluse pindalaga (AUC,
mis on võrdne muutusega voolus, mida on korrutatud muutusega ajas) iga voolu reaktsiooni
puhul elektriimpulsiga stimuleerimisele. Võeti keskmine verevoolu reaktsioon kahele
stimuleerimisele. Loomi hoiti anesteesia all üks kuni kolm tundi.
5
[0209] Vastavalt joonisel FIG 2A ja FIG 2B näidatule inhibeeris jäsemenärvile
elektriimpulsside rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist CGRP 8–37
(400 nmol/kg, manustatud intravenoosselt), antikeha 4901 (25 mg/kg, manustatud
intraperitoneaalselt) või antikeha 7D11 (25 mg/kg, manustatud intraperitoneaalselt)
olemasolu kontrolliga võrreldes. CGRP 8–37 manustati 3 kuni 5 minutit enne jäsemenärvi 10
stimuleerimist; ning antikehasid manustati 72 tundi enne jäsemenärvi stimuleerimist.
Vastavalt joonisel FIG 3 näidatule inhibeeris jäsemenärvile elektriimpulsside
rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist antikeha 4901 olemasolu erinevates
annustes (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ja 25 mg/kg), mida manustati intravenoosselt 24
tundi enne jäsemenärvi stimuleerimist. 15
[0210] Joonistel FIG 4A ja FIG 4B kujutatud katsete puhul paljastati jäsemenärv
kirurgiliselt enne antikeha manustamist. Parempoolse tagajäseme jäsemenärv paljastati
kirurgiliselt, lõigati proksimaalselt ning kaeti kuivamise vältimiseks plastmähisega.
Tagumise käpa naha mediodorsaalse külje kohale paigutati Doppleri laserindikaator, kuna 20
jäsemenärv ergutab selle piirkonna tegevust. Naha verevoolu, mida mõõdeti vererakkude
vooluna, jälgiti Doppleri laser-voolumeetriga. Kolmkümmend kuni nelikümmend viis
minutit pärast bretüüliumtosülaadi süstimist, kui stabiilne baastaseme vool (vähem kui 5%
varieerumist) oli saavutatud vähemalt 5 minutiks, asetati närv plaatinast bipolaarsetele
elektroodidele ning seda stimuleeriti elektriliselt (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sekundit) ning seejärel 25
uuesti 20 minuti pärast. Keskmist verevoolu reaktsiooni nende kahe stimuleerimise suhtes
kasutati baastaseme reaktsiooni (aeg 0) tuvastamiseks elektrilise stimuleerimise suhtes.
Seejärel manustati intravenoosselt antikeha 4901 (1 mg/kg või 10 mg/kg), antikeha 7E9 (10
mg/kg), antikeha 8B6 (10 mg/kg) või vehiikulit (PBS koos 0,01% Tween 20ga). Seejärel
stimuleeriti närvi (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sekundit) 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 30
minutit pärast antikeha või vehiikuli manustamist. Loomi hoiti anesteesia all ligikaudu kolm
tundi. Kumulatiivset muutust naha verevoolus hinnati voolu-aja kõvera aluse pindalaga
79 EE-EP 1 957 106 B2
(AUC, mis on võrdne muutusega voolus, mida on korrutatud muutusega ajas) iga voolu
reaktsiooni puhul elektriimpulsiga stimuleerimistele.
[0211] Vastavalt joonisel FIG 4A näidatule inhibeeris jäsemenärvile elektriimpulsside
rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist antikeha 4901 olemasolu, mida 5
manustati intravenoosselt annuses 1 mg/kg, kui elektriimpulsiga stimuleerimist rakendati
60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha manustamist, ning jäsemenärvile
elektriimpulsside rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist inhibeeris antikeha
4901 olemasolu, mida manustati intravenoosselt annuses 10 mg/kg, kui elektriimpulsiga
stimuleerimist rakendati 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha 10
manustamist. Joonisel FIG 4 näha, et jäsemenärvile elektriimpulsside rakendamisega
stimuleeritud verevoolu suurenemist inhibeeris antikeha 7E9 (10 mg/kg, manustatud
intravenoosselt) olemasolu, kui elektriimpulsiga stimuleerimist rakendati 30 minutit, 60
minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha manustamist, ning antikeha 8B6 (10
mg/kg, manustatud intravenoosselt) olemasolu, kui elektriimpulsiga stimuleerimist 15
rakendati 30 minutit pärast antikeha manustamist.
[0212] Need andmed näitavad, et antikehad 4901, 7E9, 7D11 ja 8B6 on tõhusad CGRP
aktiivsuse blokeerimisel vastavalt roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha
vasodilatatsiooniga mõõdetule. 20
Näide 4. CGRP-vastase antikeha G1 ja selle variantide iseloomustamine
[0213] CGRP-vastase antikeha G1 raske ahela varieeruva piirkonna ja kerge ahela
varieeruva piirkonna aminohappejärjestused on välja toodud joonisel FIG 5. Antikeha ja 25
selle variantide ekspresseerimiseks ja iseloomustamiseks kasutati alljärgnevaid meetodeid.
[0214] Kasutatud ekspressioonivektor. Antikehade Fab-fragmendi ekspresseerimine oli
IPTG esile kutsutava lacZ promootori kontrolli all, mis sarnaneb sellega, mida on
kirjeldatud allikas Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, 30
NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. vektor pComb3X), kuid
modifikatsioonid hõlmasid alljärgnevate täiendavate domeenide lisamist ja
ekspresseerimist: inimese kapa kerge ahela pidev domeen ja IgG2 inimese
80 EE-EP 1 957 106 B2
immunoglobuliini CH1 pidev domeen, Ig gamma-2 ahela C-piirkond, valk
deponeerimisnumbriga P01859; immunoglobuliin-kapa kerge ahel (Homo Sapiens), valk
deponeerimisnumbriga CAA09181.
[0215] Fabi väikesemahuline valmistamine. Bakterist E. Coli, mida muundati (kasutades 5
elektroporatsioon-pädevaid TG1 rakke või keemiliselt pädevaid Top 10 rakke) Fab
pangaga, kasutati üksikuid kolooniaid nii põhiplaadi (agar LB + karbenitsilliin (50 μg/ml)
+ 2% glükoos) ja tööplaadi (2 ml süvendi kohta, 96 süvendit plaadi kohta) inokuleerimiseks,
kus iga auk sisaldas 1,5 ml LB + karbenitsilliin (50 μg/ml) + 2% glükoos. Plaat kaeti gaasi
läbilaskva kattega (ABgene, Surrey, UK). Mõlemaid plaate inkubeeriti 30 °C juures 12 kuni 10
16 tundi; tööplaati raputati tugevalt. Põhiplaati säilitati 4 °C juures kuni selle kasutamiseni,
samas kui tööplaadilt saadud rakud vormiti sadestati (4000 pööret minutis, 4 °C, 20 minutit)
ning need resuspendeeriti 1,0 ml LB + karbenitsilliin (50 μg/ml) + 0,5 mM IPTG-s, et
kutsuda esile Fabide ekspresseerimist, raputades neid tugevalt 5 tundi 30 °C juures.
Indutseeritud rakke tsentrifuugiti kiirusega 4000 pööret minutis 4 °C juures 20 minutit ning 15
resuspendeeriti 0,6 mL Biacore HB-SEP puhvris (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3
mM EDTA, 0,005% v/v P20). HB-SEP-is resuspendeeritud rakkude lüüs saavutati
külmutamise teel (-80 °C) ning seejärel sulatati need 37 °C juures. Rakulüsaate tsentrifuugiti
kiirusega 4000 pööret minutis 4 °C juures 1 tund, et eraldada Fabi sisaldavatest
supernatantidest praht, mis seejärel filtreeriti (0,2 um), kasutades Millipore MultiScreen 20
analüüsisüsteemi 96 süvendiga filtreerimisplaati ja vaakumkollektorit. Filtreeritud
supernatantide analüüsimiseks kasutati Biacore'i analüüsi, pritsides need sensorkiibil
asuvatele CGRPdele. Fabe ekspresseerivad afiinsus-selekteeritud kloonid päästeti
põhiplaadilt ning neid kasutati DNA mallina PCRi, järjestamise ja plasmiidi valmistamise
jaoks. 25
[0216] Fabi suuremahuline valmistamine. Kineetiliste parameetrite saamiseks
ekspresseeriti Fabe suuremas mahus alljärgneval viisil. Erlenmeyeri kolbe, mis sisaldasid
150 mL LB + karbenitsilliini (50 μg/ml) + 2% glükoosi, inokuleeriti 1 mL öö läbi hoitud
lähtekultuuriga üksnes afiinsus-selekteeritud Fabi ekspresseerivast E. Colist. Ülejäänud osa 30
lähtekultuurist (∼3 ml) kasutati plasmiidi DNA (QIAprep mini-prep, Qiagen komplekt)
valmistamiseks, mida kasutati järjestamiseks ja edasiseks manipuleerimiseks. Suuremat
kultuuri inkubeeriti 30 °C juures tugeva raputamisega, kuni OD600nm 1,0 saavutamiseni
81 EE-EP 1 957 106 B2
(tüüpiliselt 12 kuni 16 tundi). Rakkudest moodustati pelletid tsentrifuugimise teel kiirusega
4000 pööret minutis 4°C juures 20 minutit ning resuspendeeriti 150 mL LB + karbenitsilliin
(50 μg/ml) + 0,5 mM IPTGs. Pärast 5-tunnist ekspresseerimist 30 °C juures sadestati rakud
tsentrifuugimise teel kiirusega 4000 pööret minutis 4°C juures 20 minuti jooksul,
resuspendeeriti 10 mL Biacore HBS-EP puhvris ning lüüsiti, kasutades selleks ühekordset 5
külmutamise (-80°C)/sulatamise (37 °C) tsüklit. Rakulüsaadid sadestati tsentrifuugimise
teel kiirusega 4000 pööret minutis 4 °C juures 1 tunni vältel ning supernatant koguti kokku
ja filtreeriti (0,2 μm). Filtreeritud supernatandid laeti Ni-NTA supervoolu sefaroosi (Qiagen,
Valencia, CA) kolonnidele, mis tasakaalustati PBS-iga (pH 8), seejärel pesti need viie
kolonni mahuga PBS-iga (pH 8). Individuaalsed Fabid elueeriti erinevates osades PBS-iga 10
(pH 8) + 300 mM imidasooliga. Fabe sisaldavad osad koguti kokku ning dialüüsiti PBS-is,
seejärel kvantifitseeriti ELISA analüüsiga enne afiinsuse iseloomustamist.
[0217] Tervikliku antikeha valmistamine. Terviklike antikehade ekspresseerimiseks
klooniti raske ja kerge ahela varieeruvad piirkonnad imetaja ekspressioonivektoritesse ning 15
transfekteeriti lipofektamiini kasutades HEK 293 rakkudesse lühiajaliseks
ekspresseerimiseks. Antikehad puhastati valku A kasutades, järgides standardmeetodeid.
[0218] Vektor pDb.CGRP.hFcGI on ekspressioonivektor, mis sisaldab G1 antikeha rasket
ahelat ning sobib raske ahela lühiajaliseks või stabiilseks ekspresseerimiseks. Vektoril 20
pDb.CGRP.hFcGI on nukleotiidijärjestused, mis vastavad järgmistele piirkondadele:
närilise tsütomegaloviiruse promootorpiirkond (nukleotiidid 7–612); sünteetiline intron
(nukleotiidid 613–1679); DHFR-i kodeeriv piirkond (nukleotiidid 688–1253); inimese
kasvuhormooni signaalpeptiid (nukleotiidid 1899–1976); G1 raske ahela varieeruv piirkond
(nukleotiidid 1977–2621); inimese raske ahela IgG2 pidev piirkond, mis sisaldab 25
alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 on muudetud S330S331-ks (aminohapete loend
viitega looduslikule IgG2 järjestusele; vt Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624). Vektor
pDb.CGRP.hFcGI deponeeriti ATCCs 15. juulil 2005 ning see tähistati ATCC
deponeerimisnumbriga PTA-6867.
30
[0219] Vektor pEb.CGRP.hKGI on ekspressioonivektor, mis sisaldab G1 antikeha kerget
ahelat ning sobib kerge ahela lühiajaliseks ekspresseerimiseks. Vektoril pEb.CGRP.hKGI
on nukleotiidijärjestused, mis vastavad järgmistele piirkondadele: närilise
82 EE-EP 1 957 106 B2
tsütomegaloviiruse promootorpiirkond (nukleotiidid 2–613); inimese EF-1 intron
(nukleotiidid 614–1149); inimese kasvuhormooni signaalpeptiid (nukleotiidid 1160–1237);
antikeha G1 kerge ahela varieeruv piirkond (nukleotiidid 1238–1558); inimese kapa ahela
pidev piirkond (nukleotiidid 1559–1882). Vektor pEb.CGRP.hKGI deponeeriti ATCCs
15. juulil 2005 ning see tähistati ATCC deponeerimisnumbriga PTA-6866. 5
[0220] Biacore'i analüüs afiinsuse kindlaks määramiseks. G1 monoklonaalse antikeha või
selle variantide afiinsused määrati kindlaks kas 25 °C või 37 °C juures, kasutades selleks
Biacore3000™ pinna plasmonresonantsi (SPR) süsteemi (Biacore, INC, Piscataway NJ).
Afiinsuse kindlaks määramiseks püüti N-otsast biotinüülitud CGRP või selle fragmendid 10
kinni eelnevalt immobiliseeritud streptavidiini kaudu (SA sensorkiibil) ning mõõdeti
antikeha G1 fragmentide või variantide seondumiskineetikat, mida titreeriti kiibil asuva
CGRP või selle fragmendi kohal. Kõik Biacore'i analüüsid teostati HBS-EP voolavas
puhvris (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polüsorbaat
P20). CGRP pindade ettevalmistamiseks lahjendati N-biotinüülitud CGRP 15
kontsentratsioonini, mis oli väiksem kui 0,001 mg/mL, HBS-EP puhvrisse ning see pritsiti
erinevaid kokkupuuteaegu kasutades üle SA sensorkiibi. Madala suutlikkusega pindu, mis
vastavad püüdmistasemetele <50 vastusühikut (RU), kasutati kõrge resolutsiooniga
kineetilisteks uuringuteks, samas kui kõrge suutlikkusega pindu (ligikaudu 800 RU
kinnipüütud CGRPsid) kasutati kontsentratsiooniuuringuteks, skriinimiseks ning lahuse 20
afiinsuse kindlaks määramiseks. Kineetilised andmed saadi antikeha G1 Fabi
seerialahjendamisest kahe-või kolmekordsetes inkrementides, mille tulemusel saadi
kontsentratsioonid vahemikus 1uM-0.1nM (eesmärgiks oli 0,1–10 x prognoositud KD-st).
Proove pritsiti tüüpiliselt 1 minutiks kontsentratsioonis 100 µL/min ning seejuures
võimaldati vähemalt 10-minutilisi dissotsiatsiooniaegu. Iga seondumistsükli järel 25
regenereeriti pinnad 25 mM NaOHga 25% v/v etanoolis, mis pidas vastu rohkem kui
sadadele tsüklitele. Kõik titreerimise seeriad (mis tüüpiliselt genereeriti kahes eksemplaris)
sobisid üldiselt 1:1 Langmuiri seondumismudelisse, kus kasutati BIAevaluation
programmi. See andis tulemuseks ainulaadse kineetilise suhtarvu assotsiatsiooni- ja
dissotsiatsioonikonstantide paari (vastavalt kon ja koff) iga seondumise interaktsiooni jaoks, 30
mille suhtarv andis dissotsiatsiooni tasakaalukonstandi (KD = koff/kon). Sellisel viisil
kindlaks määratud afiinsused (KD väärtused) on loetletud tabelites 6 ja 7.
83 EE-EP 1 957 106 B2
[0221] Äärmiselt madalate off-kiirustega seondumise interaktsioonide kõrge
resolutsiooniga analüüs. Äärmiselt madalate off-kiirustega interaktsioonide puhul (eelkõige
antikeha G1 Fabi seondumine inimese □-CGRPga kiibil 25 °C juures) saadi afiinsused
kaheosalises katses. Eespool kirjeldatud protokolli kasutati alljärgnevate
modifikatsioonidega. Assotsiatsioonikiiruse konstant (kon) määrati kindlaks 2-kordse 5
titreerimisseeria pritsimisega (kahes eksemplaris), mis oli vahemikus 550 nM-1 nM, 30
sekundiks kontsentratsioonis 100 μl/min ning võimaldades seejuures üksnes 30-sekundilist
dissotsiatsioonifaasi. Dissotsiatsioonikiiruse konstant (koff) määrati kindlaks sama
titreerimisseeria (kahes eksemplaris) kolme kontsentratsiooni (kõrge, keskmise ja madala)
pritsimisega 30 sekundiks ning võimaldades seejuures 2-tunnist dissotsiatsioonifaasi. Iga 10
interaktsiooni afiinsus (KD) saadi mõlemat tüüpi katsetest saadud kon ja koff väärtuste
kombineerimise teel, nagu on näidatud tabelis 5.
[0222] Lahuse afiinsuse kindlaks määramine Biacore'iga. Antikeha G1 lahuse afiinsust roti
α-CGRP ja F37A (19–37) inimese α-CGRP suhtes mõõdeti Biacore'iga 37 °C juures. 15
Kasutati kõrge suutlikkusega CGRP kiibi pinda (tuvastamise eesmärkidel valiti kõrge
afiinsusega α-CGRP) ning HBS-EP voolaval puhvril lasti voolata kiirusega 5 μl/min.
Antikeha G1 Fab fragmenti püsiva kontsentratsiooni 5 nM juures (eesmärgiks oli lahusel
põhineva interaktsiooni prognoositud KD tase või alla selle) inkubeeriti konkureeriva
peptiidiga, milleks oli kas roti α-CGRP või F37A (19–37) inimese α-CGRP, 20
lõppkontsentratsiooniga vahemikus 1 nM kuni 1 μM 3-kordsetes seerialahjendustes.
Antikeha G1 Fab lahused pritsiti lahusel põhineva konkureeriva peptiidi juuresolekul või
selle puudumisel kiibil olevale CGRPle ning jälgiti lahuse konkurentsi tagajärjel kiibil
tuvastatud seondumisreaktsioonide ammendumist. Need seondumisreaktsioonid teisendati
„vaba Fabi kontsentratsioonideks” kalibreerimiskõverat kasutades, mis konstrueeriti üksnes 25
titreeriva antikeha G1 Fabi poolt (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 ja 0 nM) üle kiibil asuva CGRP.
„Vaba Fabi kontsentratsioonid” kavandati konkureeriva lahusel põhineva peptiidi
kontsentratsiooni suhtes, mida kasutati iga andmepunkti genereerimiseks ning sobitati
lahustumisafiinsuse mudelisse BIAevaluation tarkvara kasutades. Lahustumisafiinsused,
mis sellisel viisil (kaudselt) kindlaks määrati, on välja toodud tabelites 5 ja 7 ning neid 30
kasutati afiinsuste valideerimiseks, mis saadi siis, kui Fabid pritsiti vahetult üle kiibil
asuvate N-biotinüülitud CGRPde. Tihe kokkulepe afiinsuste vahel, mis nende kahe
84 EE-EP 1 957 106 B2
meetodiga kindlaks määrati, kinnitab, et CGRP N-biotinüülitud versiooni kinnitamine
kiibile ei muuda selle loomulikku lahuse seaondumisaktiivsust.
[0223] Alljärgnevas tabelis 5 on välja toodud antikeha G1 seondumisafiinsused inimese α-
CGRP, inimese β-CGRP, roti α-CGRP ja roti β-CGRP suhtes, mis määrati kindlaks 5
Biacore'i analüüsiga, lastes Fab-fragmentidel voolata üle SA kiibil asuvate N-biotinüülitud
CGRPde. Äärmiselt madalate off-kiirustega interaktsioonide seondumisafiinsuste paremaks
lahendamiseks määrati afiinsused kindlaks ka kaheosalises katses, et täiendada käesoleva
analüüsi suundumust, ning samuti määrati kindlaks roti α-CGRP interaktsiooni
lahustumisafiinsus (vastavalt eespool kirjeldatule). Mõlemas analüüsi suundumuses 10
mõõdetud afiinsuste tihe kokkulepe kinnitab, et loodusliku roti α-CGRP seondumisafiinsus
lahuses ei muutu, kui see N-biotinüülitakse ja kinnitatakse SA kiibile.
Tabel 5. Üle kiibil asuvate CGRPde titreeritud antikeha G1 Fabide seondumisafiinsused
15
CGRP kiibil Tempera-
tuur (°C)
kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)
Inimese α-CGRP 25 1,86 × 105 7,80 × 10-6 0,042 (7%, n=4)*
Inimese α-CGRP 37 5,78 × 105 3,63 × 10-5 0,063 (4%, n=2)*
Inimese β-CGRP 37 4,51 × 105 6,98 × 10-5 0,155
Roti α-CGRP 25 5,08 × 104 6,18 × 10-5 1,22 (12%, n=2)*
Roti α-CGRP 37 1,55 × 105 3,99 × 10-4 2,57* (lahus KD=10 (50%,
n=4)**
Roti β-CGRP 37 5,16 × 105 7,85 × 10-5 0,152
* α-CGRPde (roti ja inimese) afiinsused määrati kindlaks kõrge resolutsiooniga
kaheosaleses katses, kus dissotsiatsioonifaasi jälgiti 2 tundi (kon, koff ja KD väärtused
tähistavad n replitseerimiskatsete keskmist standardhälbega, mida ekspresseeriti
protsentuaalse variatsioonina). β-CGRPde (roti ja inimese) afiinsused määrati kindlaks
üldise analüüsiga, kasutades ainult 20-minutilist dissotsiatsioonifaasi, mis ei olnud
piisavalt täpne nende päris off-kiiruste määramiseks (nende off-kiirused on tõenäoliselt
85 EE-EP 1 957 106 B2
CGRP kiibil Tempera-
tuur (°C)
kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)
aeglasemad, kui siin esitatud, ning seetõttu on nende afiinsused tõenäoliselt isegi
kõrgemad). Antikeha G1 Fab eraldus ülimalt aeglaselt kõikidest CGRPdest (välja
arvatud roti α-CGRPst) off-kiirustega, mis lähenesid Biacore'i analüüsi resolutsiooni
piirile (eelkõige 25°C juures).
**Lahustumisafiinsused määrati kindlaks seondumisreaktsioonide ammendumise
mõõtmisega, mis tuvastati kiibil oleva CGRP juures antikeha G1 Fabi puhul, mida oli
eelnevalt inkubeeritud lahusel põhineva roti α-CGRP konkurendiga.
[0224] Alljärgnevas tabelis 6 on välja toodud antikehad, millel on aminohappejärjestuse
variatsioonid võrreldes antikehaga G1, ning nende afiinsused roti α-CGRP ja inimese α-
CGRP suhtes. Kõiki tabelis 6 välja toodud variantide aminohappe asendusi kirjeldatakse G1
järjestuse suhtes. Fab-fragmentide seondumisafiinsused määrati kindlaks Biacore'i 5
analüüsiga, lastes neil voolata üle SA kiibil olevate CGRPde.
Tabel 6. Aminohappejärjestused ja seondumisafiinsuse andmed antikeha G1 variantide
kohta, mis määrati kindlaks 37 °C juures Biacore'i analüüsiga.
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
G1 3,91×10-4 2,57 3,63×10-5 0,063
M1 A100L 1,10×10-3 1,73×10-4
M2 L99A 2,6×10-3 58 3,1×10-4 3
A100R
M3 L99A 2,0×10-3 61 2,1×10-4 1,7
A100S
M4 L99A 1,52×10-3 84,4 6,95×10-5 0,43
A100V
M5 L99A 7,35×10-4 40,8 3,22×10-5 0,20
86 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
A100Y
M6 L99N 7,84×10-4 43,6 1,33×10-4 0,83
M7 L99N 9,18×10-4 51,0 2,43×10-4 1,52
A100C
M8 L99N 7,45×10-4 41,4 9,20×10-5 0,58
A100G
M9 L99N n,d, n,d, 1,00×10-5 0,06
A100Y
M10 L99S 1,51×10-3 83,9 1,73×10-4 1,08
A100S
M11 L99S 4,83×10-3 268,3 2,83×10-4 1,77
A100T
M12 L99S 1,94×10-3 107,8 1,01×10-4 0,63
A100V
M13 L99T 1,84×10-3 102,2 1,86×10-4 1,16
A100G
M14 L99T n,d, n,d, 1,00×10-5 0,06
A100K
M15 L99T 1,15×10-3 63,9 1,58×10-5 0,10
A100P
M16 L99T 9,96×10-4 55,3 1,65×10-4 1,03
A100S
M17 L99T 2,06×10-3 114,4 1,85×10-4 1,16
87 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
A100V
M18 L99V 1,22×10-3 67,8 7,03×10-5 0,44
A100G
M19 L99V n,d, n,d, 1,00×10-5 0,06
A100R
M20 R28W L99R 1,44×10-3 80,0 1,36x10-4 0,85
A100L
M21 R28W L99S 6,95×10-4 15,2 1,42×10-4 1,23
M22 R28W L99T 1,10×10-3 61,1 1,16×10-4 0,73
M23 R28G L99T 7,99×10-4 44,4 1,30×10-4 0,81
A100V
M24 R28L L99T 1,04×10-3 57,8 1,48×10-4 0,93
A100V
M25 R28N L99T 1,4×10-3 76 1,4×10-4 1,3
A100V
M26 R28N A57G L99T 9,24×10-4 51,3 1,48×10-4 0,93
A100V
M27 R28N L99T 3,41×10-3 189,4 3,57×10-4 2,23
T30A A100V
M28 R28N E54R L99T 1,25×10-3 69,4 9,96×10-5 0,62
T30D A57N A100V
M29 R28N L99T 3,59×10-3 199,4 3,80×10-4 2,38
T30G A100V
88 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
M30 R28N E54K L99T 6,38×10-3 354,4 5,90×10-4 3,69
T30G A57E A100V
M31 R28N E54K L99T 3,61×10-3 200,6 3,47×10-4 2,17
T30G A57G A100V
M32 R28N E54K L99T 2,96×10-3 164,4 2,71×10-4 1,69
T30G A57H A100V
M33 R28N E54K L99T 9,22×10-3 512,2 7,50×10-4 4,69
T30G A57N A100V
S58G
M34 R28N E54K L99T 2,17×10-3 120,6 6,46×10-4 4,04
T30G A57N A100V
S58T
M35 R28N E54K L99T 3,99×10-3 221,7 3,39×10-4 2,12
T30G A57S A100V
M36 R28N L99T 4,79×10-3 266,1 2,39×10-4 1,49
T30R A100V
M37 R28N A57G L99T 1,45×10-3 80,6 2,26×10-4 1,41
T30S A100V
M38 R28N L99T 5,11×10-3 283,9 2,18×10-4 1,36
T30W A100V
M39 R28N G50A A57N L99T 9,95×10-3 552,8 4,25×10-4 2,66
L56T S58Y A100V
M40 R28N G50A E54K L99T 0,36 20000,0 1,28×10-3 8,00
89 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
L56T A57L A100V
M41 R28N G50A E54K L99T 4,53×10-3 251,7 2,10×10-4 1,31
L56T A57N A100V
E64D
M42 R28N G50A E54K L99T 7,52×10-3 417,8 4,17×10-4 2,61
L56T A57N A100V
H61F
M43 R28N G50A E54K L99T 4,53×10-3 251,7 2,63×10-4 1,64
L56T A57N A100V
S58C
M44 R28N G50A E54K L99T 6,13×10-3 443 2,10×10-4 2,05
L56T A57N A100V
S58E
M45 R28N G50A E54K L99T 5,58×10-3 259 2,11×10-4 1,85
L56T A57N A100V
S58E
E64D
M46 R28N G50A E54K L99T 2,94×10-3 163,3 5,39×10-4 3,37
L56T A57N A100V
S58E
H61F
M47 R28N G50A E54K L99T 8,23×10-3 457,2 3,32×10-4 2,08
L56T A57N A100V
90 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
S58G
M48 R28N G50A E54K L99T 0,0343 1905,6 8,42×10-4 5,26
L56T A57N A100V
S58L
M49 R28N G50A E54K L99T 0,0148 822,2 5,95×10-4 3,72
L56T A57N A100V
S58Y
H61F
M50 R28N G50A E54K L99T 5,30×10-3 294,4 4,06×10-4 2,54
L56T A57R A100V
M51 R28N L56I E54K L99T 1,18×10-3 65,6 1,31×10-4 0,82
A57G A100V
M52 R28N L56I E54K L99T 2,29×10-3 127,2 2,81×10-4 1,76
A57N A100V
S58A
M53 R28N L56I E54K L99T 1,91×10-3 106,1 3,74×10-4 2,34
A57N A100V
S58G
M54 R28N G50A E54K L99T 2,16×10-3 120,0 1,79×10-3 11,19
T30A A57N A100V
S58P
M55 R28N L56S E54K L99T 5,85×10-3 325,0 4,78×10-4 2,99
T30A A57N A100V
91 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
S58E
E64D
M56 R28N L56S E54K L99T 9,35×10-3 519,4 4,79×10-4 2,99
T30D A57N A100V
H61F
M57 R28N L56S E54K L99T 0,0104 1,200 3,22×10-4 3,08
T30D A57N A100V
S58E
M58 R28N L56S E54K L99T No binding n,d, 1,95×10-3 12,19
T30D A57N A100V
S58I
H61F
M59 R28N L56S E54K L99T 0,0123 683,3 5,24×10-4 3,28
T30D A57N A100V
S58N
H61F
M60 R28N L56S E54K L99T 0,0272 1511,1 9,11×10-4 5,69
T30D A57N A100V
S58R
H61F
M61 R28N A51H E54Q L99T 5,21×10-3 289,4 4,59×10-4 2,87
T30G A57N A100V
H61F
92 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
M62 R28N A51H E54K L99T 5,75×10-3 242 5,57×10-4 5,86
T30G L56T A57N A100V
S58E
M63 R28N G50A E54K L99T 2,65×10-3 147,2 1,50×10-3 9,38
T30G A57N A100V
S58T
M64 R28N G50A E54K L99T 0,0234 1300,0 1,32×10-3 8,25
T30G A57N A100V
S58V
M65 R28N G50A E54K L99T 4,07×10-3 226,1 8,03×10-4 5,02
T30G L56I A57C A100V
M66 R28N L56I E54K L99T 5,11×10-3 283,9 5,20×10-4 3,25
T30G A57E A100V
M67 R28N L56I E54K L99T 1,71×10-3 95,0 8,20×10-4 5,13
T30G A57F A100V
M68 R28N L56I E54K L99T 6,76×10-3 375,6 4,28×10-4 2,68
T30G A57N A100V
S58D
E64D
M69 R28N L56I E54K L99T 1,81×10-3 100,6 7,33×10-4 4,58
T30G A57N A100V
S58E
M70 R28N L56I E54K L99T 6,07×10-3 337,2 5,59×10-4 3,49
93 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
T30G A57S A100V
M71 R28N L56I E54K L99T 2,12×10-3 117,8 1,28×10-3 8,00
T30G A57Y A100V
M72 R28N L56S E54K L99T 3,95×10-3 219,4 4,00×10-4 2,50
T30G A100V
M73 R28N L56S E54K L99T 3,00×10-3 166,7 2,55×10-4 1,59
T30G A57N A100V
S58Y
E64D
M74 R28N L56S E54K L99T 6,03×10-3 335,0 5,97×10-4 3,73
T30G A57S A100V
M75 R28N L56S E54K L99T 1,87×10-2 1038,9 1,16×10-3 7,25
T30G A57V A100V
M76 R28N G50A A57G L99T 1,16×10-3 64,4 3,64×10-4 2,28
T30S L56T A100V
M77 R28N G50A E54K L99T 0,0143 794,4 4,77×10-4 2,98
T30S L56T A57D A100V
M78 R28N G50A E54K L99T 0,167 9277,8 1,31×10-3 8,19
T30S L56T A57N A100V
S58T
M79 R28N G50A E54K L99T 0,19 10555,6 1,29×10-3 8,06
T30S L56T A57P A100V
M80 R28N L56I E54K L99T 0,0993 5516,7 2,09×10-3 13,06
94 EE-EP 1 957 106 B2
Kloon L1 L2 H2 HC-FW3 α-rott α-rott α-inimene α-inimene
koff (1/s) KD (nM) koff (1/s) KD (nM)
T30S A57N A100V
S58V
M81 R28N L56S E54K L99T 4,29×10-3 238,3 4,90×10-4 3,06
T30S A57N A100V
S58E
M82 R28N A51H A57N L99T 6,99×10-3 388,3 8,77×10-4 5,48
T30V L56T A100V
M83 R28N A51H E54K L99T No binding n,d, 9,33×10-4 5,83
T30V L56T A57N A100V
S58M
H61F
M84 R28N A51H E54N L99T 1,76×10-2 977,8 1,08×10-3 6,75
T30V L56T A57N A100V
Kõik CDRid hõlmavad nii Kabati kui ka Chothia CDRe. Aminohappejäägid on
nummerdatud järjestikku (vt joonist FIG 5). Kõikide kloonide L3+H1+H3 järjestused on
G1ga identsed.
KD = koff/kon. Kõik koff väärtused määrati kindlaks skriinimisrežiimis, välja arvatud need,
mis on alla joonitud, mis saadi Fabi kontsentratsiooniseeria üldise analüüsiga (G1
analüüsiti kõrge resolutsiooniga režiimis). Allajoonitud KD väärtused määrati seega
kindlaks katseliselt kon mõõtmisega. Teised kon väärtused on hinnanguliselt samad nagu
M25 puhul.
n.d. = kindlaks määramata
[0225] Epitoobi kindlaks määramiseks inimese α-CGRPl, mille tunneb ära antikeha G1,
kasutati eespool kirjeldatud Biacore'i analüüse. Inimese α-CGRP osteti N-biotinüülitud
versioonina, et võimaldada selle kõrge afiinsusega püüdmist SA sensorkiipide kaudu. G1
95 EE-EP 1 957 106 B2
Fab-fragmendi seondumine inimese α-CGRPga määrati kindlaks kiibil CGRP peptiidi
puudumisel või juuresolekul. Tüüpiliselt pritsiti üle kiibil oleva inimese α-CGRP 2000:1
mol peptiid/Fab lahust (näiteks 10 μM peptiidi 50 nM G1 Fabis). Joonisel FIG 6 on välja
toodud konkureeriva peptiidi poolt blokeeritud seondumise määr. Joonisel FIG 6 välja
toodud andmed näitavad, et peptiidid, mis blokeerivad G1 Fabi seondumist inimese 5
α-CGRP 100% ulatuses, on inimese α-CGRP 1–37 (WT), 8–37, 26–37, P29A (19–37),
K35A (19–37), K35E (19–37) ja K35M (19–37); β-CGRP 1–37 (WT); roti α-CGRP 1-37
(WT); ja roti β-CGRP 1–37 (WT). Kõik need peptiidid on C-otste juurest amideeritud.
Inimese α-CGRP peptiidid F37A (19–37) ja 19–37 (viimane ei ole C-otstest amideeritud)
blokeerisid G1 Fabi seondumist inimese α-CGRPga samuti 80% kuni 90% ulatuses. Inimese 10
α-CGRP peptiid 1–36 (ei ole C-otstest amideeritud) blokeeris G1 Fabi seondumist inimese
α-CGRPga ligikaudu 40% ulatuses. Inimese α-CGRP peptiidi fragment 19–36 (C-otstest
amideeritud); inimese α-CGRP peptiidi fragmendid 1–13 ja 1–19 (kumbki ei ole C-otstest
amideeritud); ning inimese amüliin, kaltsitoniin ja adrenomedulliin (kõik C-otstest
amideeritud) ei konkureerinud kiibil G1 Fabi inimese α-CGRPga seondumise pärast. Need 15
andmed näitavad, et G1 on suunatud CGRP C-otsa epitoobile ning et nii kõige otsmise jäägi
(F37) identsus kui ka selle amidatsioon on seondumise jaoks olulised.
[0226] Samuti määrati kindlaks G1 Fabi seondumisafiinsused inimese α-CGRP variantide
suhtes (37 °C juures). Alljärgnevas tabelis 7 on välja toodud afiinsused, mis on mõõdetud 20
vahetult G1 Fabi titreerimise teel üle kiibil asutavate N-biotinüülitud inimese α-CGRP ja
selle variantide. Tabelis 7 esitatud andmed näitavad, et antikeha G1 seondub C-otsa
epitoobiga ning et F37 ja G33 on kõige olulisemad jäägid. G1 ei seondu CGRPga, kui C-
otsale (mis on amideeritud) lisatakse täiendav aminohappejääk (alaniin).
25
Tabel 7. G1 Fabi seondumisafiinsused inimese α-CGRP suhtes ja selle variandid 37 °C
juures mõõdetuna (nende aminohappejärjestusi vt tabelist 4)
CGRP kiibil kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)
1–37 (WT) 4,68×105 7,63×10-5 0,16 (kõrge resolutsioon KD = 0,06)
19–37 4,60×105 7,30×10-5 0,16
25–37 3,10×105 8,80×10-5 0,28
96 EE-EP 1 957 106 B2
CGRP kiibil kon (1/Ms) koff (1/s) KD (nM)
F27A (25–37) 3,25×105 1,24×10-4 0,38
V28A (25–37) 3,32×105 9,38×10-5 0,28
P29A (25–37) 2,26×105 1,78×10-4 0,79
T30A (25–37) 1,79×105 8,41×10-5 0,47
N31A (25–37) 2,17×105 1,14×10-4 0,53
V32A (25–37) 2,02×105 3,46×10-4 1,71
G33A (25–37) 2,07×105 0,0291 141
S34A (25–37) 2,51×105 7,64×10-4 3,04
K35A (19–37) 2,23×105 2,97×10-4 1,33
K35E (19–37) 5,95×104 5,79×10-4 9,73
K35M (19–37) 2,63×105 1,34×10-4 0,51
K35Q (19–37) 1,95×105 2,70×10-4 1,38
F37A (25–37) 8,90×104 8,48×10-3 95 (lahus KD = 172 nM)
38A (25–38A) - - Seondumist ei tuvastatud
[0227] Eespool välja toodud andmed näitavad, et epitoop, millega antikeha G1 seondub,
asub inimese α-CGRP C-otsa lõpus ning et aminohapped 33 ja 37 inimese α-CGRPl on
olulised antikeha G1 seondumise jaoks. Samuti on seondumise jaoks oluline jäägi F37
amidatsioon. 5
Näide 5: CGRP-vastase antagonist-antikeha G1 mõju roti jäsemenärvi
stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile
[0228] CGRP-vastaste antikeha G1 antagonistliku toime testimiseks testiti selle antikeha 10
mõju roti jäsemenärvi stimuleerimisega esile kutsutud naha vasodilatatsioonile, kasutades
selleks näites 3 kirjeldatud rotimudelit. Lühidalt öeldes hoiti rotte anesteesia all 2%
isofluraaniga. Katse alguses anti bretüüliumtosülaati (30 mg/kg, manustati intravenoosselt),
97 EE-EP 1 957 106 B2
et viia jäsemenärvi sümpateetiliste kiudude samaaegsest stimuleerimisest tingitud
vasokonstriktsioon miinimumini. Kehatemperatuuri hoiti 37 °C juures rektaalse indikaatori
kasutamisega, mis oli termostaatiliselt ühendatud kontrollitud temperatuuriga
soojendustekiga. Parempoolse tagajäseme jäsemenärv paljastati kirurgiliselt, lõigati
proksimaalselt ning kaeti kuivamise vältimiseks plastmähisega. Tagumise käpa naha 5
mediodorsaalse külje kohale paigutati Doppleri laserindikaator, kuna jäsemenärv ergutab
selle piirkonna tegevust. Naha verevoolu, mida mõõdeti vererakkude vooluna, jälgiti
Doppleri laser-voolumeetriga. Katsetes, mis teostati antikeha mõjude kindlaks määramiseks
kahe tunni jooksul pärast süstimist ja kolmkümmend kuni nelikümmend viis minutit pärast
bretüüliumtosülaadi süstimist, kui stabiilne baastaseme vool (vähem kui 5% varieerumist) 10
oli saavutatud vähemalt 5 minutiks, asetati närv plaatinast bipolaarsetele elektroodidele
ning seda stimuleeriti elektriliselt (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sekundit) ning seejärel uuesti 20
minuti pärast. Keskmist verevoolu reaktsiooni nende kahe stimuleerimise suhtes kasutati
baastaseme reaktsiooni (aeg 0) tuvastamiseks elektrilise stimuleerimise suhtes. Seejärel
manustati antikeha G1 (1 mg/kg või 10 mg/kg) või vehiikulit (PBS koos 0,01% Tween 20ga 15
võrdses mahus 10 mg/kg G1ga) intravenoosselt (IV). Seejärel stimuleeriti närvi (2 Hz, 10V,
1 ms, 30 sekundit) 30 minutit, 60 minutit, 90 minutit ja 120 minutit pärast antikeha
manustamist. Loomi hoiti anesteesia all ligikaudu kolm tundi. Kumulatiivset muutust naha
verevoolus hinnati voolu-aja kõvera aluse pindalaga (AUC, mis on võrdne muutusega
voolus, mida on korrutatud muutusega ajas) iga voolu reaktsiooni puhul elektriimpulsiga 20
stimuleerimistele.
[0229] Nagu joonisel FIG 7 näha, inhibeeris jäsemenärvile elektriimpulsside
rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist antikeha G1 olemasolu
kontsentratsioonis 1 mg/kg (manustatud intravenoosselt) võrreldes vehiikuliga, kui 25
jäsemenärvi stimuleeriti elektriliselt 90 minutit pärast antikeha manustamist. Jäsemenärvile
elektriimpulsside rakendamisega stimuleeritud verevoolu suurenemist inhibeeris antikeha
G1 olemasolu kontsentratsioonis 10 mg/kg (manustatud intravenoosselt) võrreldes
vehiikuliga, kui jäsemenärvi stimuleeriti elektriliselt 90 minutit ja 120 minutit pärast
antikeha manustamist. 30
[0230] Katsetes, mille eesmärgiks oli jäsemenärvi analüüsis kindlaks määrata antikehade
mõjud pikema aja jooksul, süstiti rottidele intravenoosselt näidustatud annustes antikeha 24
98 EE-EP 1 957 106 B2
tundi või 7 päeva enne loomade ettevalmistamist jäsemenärvi stimuleerimiseks vastavalt
eespool kirjeldatule. Nendes katsetes oli baastaseme reaktsiooni individuaalsetes rottides
elektriimpulsiga stimuleerimise suhtes enne annustamist võimatu kindlaks määrata, seetõttu
võrreldi töödeldud rühmi loomadega, kellele annustati vehiikulit (PBS, 0,01% Tween 20)
24 tundi või 7 päeva varem. 5
[0231] Nagu joonistel FIG 8A ja FIG 8B näha, oli jäsemenärvi stimuleerimisega esile
kutsutud verevoolu suurenemised dorsomediaalse tagajäseme nahas märkimisväärselt
inhibeeritud loomade rühmades, kellele annustati 10 mg/kg või 3 mg/kg G1 kas 24 tundi
või 7 päeva enne stimuleerimist võrreldes samadel ajahetkedel vehiikulit saanud 10
rühmadega.
[0232] Joonisel FIG 8C on kujutatud joonistel FIG 8A ja FIG 8B esitatud annuse-
reaktsiooni andmete lähendusanalüüsi tulemusi, et määrata kindlaks annus, mis on vajalik
maksimaalsest mõjust 50% saavutamiseks (EC50). EC50 24 tunni juures on 1,3 mg/kg ja 15
EC50 7 päeva juures on pisut madalam (0,8 mg/kg).
Näide 6: CGRP-vastase antagonist-antikeha mu7E9 akuutne mõju sääremarja arteri
(suletud kraniaalse akna) analüüsis
20
[0233] Suletud kraniaalse akna mudel: Käesoleva katse eesmärgiks oli kindlaks määrata
CGRP-vastaste antagonist-antikehade akuutne mõju ning võrrelda seda CGRP retseptori
antagonisti BIBN4096BS akuutse mõjuga. Katsed teostati vastavalt varasemalt kirjeldatule
(Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518–24 (1997)), millesse olid tehtud alljärgnevad
modifikatsioonid. Sprague Dawley rotid (300–400 g) anesteseeriti intraperitoneaalselt 70 25
mg/kg pentobarbitaaliga. Anesteesiat säilitati intravenoosselt 20 mg/kg/h pentobarbitaaliga.
Rotid kanüüliti kägiveeni kaudu kõikide ravimite manustamiseks. Vererõhku jälgiti
indikaatoriga (mikrootsaga kateeder, Millar Instruments), mis suunati reiearteri kaudu
kõhuaorti. Rotid trahheostomeeriti ning hingamise kiirust säilitati 75 hingetõmbe juures
minutis mahus 3,5 ml. Pärast pea fikseerimist stereotaktilises instrumendis ja peanaha 30
eemaldamist tehti vasakpoolse kiiruluu piirkonda vahetult sagitaalse lahi küljele 2×6 mm
suurune ava luu õhendamisega hambapuuri abil. Mikromanipulaatorit kasutades langetati
pinnale plaatinast bipolaarne elektrood ning kaeti raske mineraalõliga. Elektroodi akna
99 EE-EP 1 957 106 B2
küljele tehti veel üks 5×6 mm suurune ava ning see täideti raske mineraalõliga, mille kaudu
jälgiti keskmise meningeaalse arteri (MMA) haru läbimõõtu pidevalt CCD kaamera ja video
dimensiooni analüsaatoriga (Living Systems). Rotid pandi puhkama mitte vähem kui 45
minutiks pärast ettevalmistust. Baastaseme reaktsioon elektriimpulsile tuvastati (15 V, 10
Hz, 0,5 ms impulsid, 30 sekundit) ning seejärel annustati rottidele intraperitoneaalselt katses 5
kasutatud ühendit (10 mg/kg mu7E9, 300 µg/kg BIBN4096BS või PBS 0,01% Tween 20).
Täiendavad elektristimulatsioonid teostati 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 ja 120 minutit pärast
annustamist. Kõik andmed salvestati Chart tarkvara kasutades (ADInstruments).
[0234] Nagu joonisel FIG 9 näha, blokeerib mu7E9 kontsentratsioonis 10 mg/kg 10
märkimisväärselt elektriväljaga stimuleerimisega esile kutsutud MMA dilatatsiooni
60 minuti jooksul pärast annustamist ning säilitab selle mõju kogu analüüsi kestuse jooksul
(120 minutit). Võrdluseks – BIBN4096BS blokeerib MMA dilatatsiooni 5 minuti jooksul
pärast annustamist, kuid see mõju on täielikult kadunud 90 minutiga. Blokeerimise
suurusjärk BIBN4096BS ja mu7E9 vahel on võrreldavad. 15
Näide 7: CGRP-vastase antagonist-antikeha G1 krooniline mõju sääremarja arteri
(suletud kraniaalse akna) analüüsis
[0235] Käesoleva katse eesmärgiks oli kindlaks määrata, kas CGRP-vastane antikeha 20
suudab 7 päeva pärast annustamist endiselt blokeerida elektriliselt stimuleeritud MMA
dilatatsiooni. Rotid valmistati ette täpselt samamoodi nagu eespool kirjeldatud akuutse katse
puhul (näide 6), kuid alljärgnevate eranditega. Rotte süstiti intravenoosselt (10 mg/kg, 3
mg/kg või 1 mg/kg G1) 7 päeva enne ettevalmistava suletud kraniaalse akna tegemist ja
stimuleerimist. Erinevalt akuutsest katsest oli selle katse puhul võimatu tuvastada 25
baastaseme dilatatsiooni reaktsiooni elektrilise stimulatsiooni suhtes enne annustamist,
mistõttu võrreldi antikeha rühmi vehiikulit (PBS, 0,01% Tween 20) saanud kontrollrühma
MMA dilatatsiooni suhtes. Pärast seda, kui rottidel lasti puhata mitte vähem kui 45 minutit,
stimuleeriti jäsemenärve elektriliselt 30-minutiliste intervallide järel. Stimulatsioonid
teostati 2,5 V, 5 V, 10 V, 15 V ja 20 V, kõik 10 Hz juures, 0,5 ms impulssidega 30 sekundi 30
jooksul.
100 EE-EP 1 957 106 B2
[0236] Nagu joonisel FIG 10 näha, blokeeris G1 kontsentratsioonides 10 mg/kg ja 3 mg/kg
märkimisväärselt elektrilise stimulatsiooniga vahemikus 10 kuni 20 volti esile kutsutud
MMA dilatatsiooni. Need andmed näitavad, et G1 suudab blokeerida elektriliselt
stimuleeritud MMA dilatatsiooni kuni 7 päeva pärast annustamist.
5
Näide 8: Morfiinivõõrutuse nn hot-flush-mudel (võrdlusnäide)
[0237] Morfiinivõõrutuse rotimudel on väljakujunenud närilise mudel menopausiga
kaasnevate kuumahoogude mehhanismide jaoks (Sipe et al., Brain Res. 1028(2):191–202
(2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307–316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 10
494:85–94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957–1966 (1983)). Põhimõtteliselt on
rottidest tehtud morfiinisõltlased naha alla morfiinigraanulite siirdamisega. Sõltuvuse ajal
süstiti loomadele naloksooni (opioidi antagonist), mis kutsub viivitamatult esile
võõrutusnähud. Võõrutusega kaasneb nahatemperatuuri suurenemine, sisetemperatuuri
langemine, pulsi suurenemise ja seerumi luteiniseeriva hormooni suurenemise. Kõik need 15
nähud sarnanevad oma suurusjärgu ja ajastuse poolest sellele, mis toimub inimeses
kuumahoogude ajal (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957–1966 (1983)). Lisaks, kui rotte
töödeldi enne võõrutusnähtude esile kutsumist östradiooliga, olid kuumahoogude
sümptomid väiksemad (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307–316 (1998)). Just seetõttu
arvataksegi, et morfiinivõõrutuse mudel matkib kliinilisi kuumahoogusid. 20
[0238] Ettevõttelt Charles River Laboratories telliti ovariektoomia läbinud rotid. Rottides
tekitati mitte vähem kui 7 päeva pärast ovariektoomia teostamist morfiinisõltuvus
morfiinigraanuli (75 mg morfiini) subkutaanse siirdamise teel. Kaks päeva hiljem siirdati
veel 2 graanulit. Järgmisel päeval süstiti rottidele intravenoosselt 10 mg/kg 4901 [**] või 25
vehiikulit (PBS, 0,01% Tween). Kaks päeva pärast teist graanulite siirdamist anesteseeriti
rotid ketamiiniga (90 mg/kg) ja hoiti kergelt vaos. Pinnatemperatuuri termoelement kinnitati
teibiga saba alla ning sisetemperatuuri mõõtmiseks kasutati rektaalset termoelementi.
Andmete salvestamiseks kasutati Chart tarkvara (ADInstruments). Pärast stabiilse
baastaseme temperatuuri salvestamist 15 minuti jooksul süstiti subkutaanselt naloksooni (1 30
mg/kg). Temperatuuri salvestati pidevalt järgmise 60 minuti jooksul. Tulemused on välja
toodud joonistel FIG 11A ja FIG 11B.
101 EE-EP 1 957 106 B2
Bioloogilise materjali deponeerimine
[0239] Alljärgnevad materjalid deponeeriti Ameerika tüübikultuuri kollektsiooniga
(American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110–2209, USA (ATCC): 5
Materjal Antikeha nr ATCC nr Deponeerimise kuupäev
pDb.CGRP.hFcGI G1 raske ahel PTA-6867 15. juuli 2005
pEb.CGRP.hKGI G1 kerge ahel PTA-6866 15. juuli 2005
[0240] Vektor pEb.CGRP.hKGI on polünukleotiid, mis kodeerib G1 kerge ahela
varieeruvat piirkonda ja kerge ahela kapa konstantset piirkonda; ning vektor
pDb.CGRP.hFcGI on polünukleotiid, mis kodeerib G1 raske ahela varieeruvat piirkonda ja
raske ahela IgG2 konstantset piirkonda, mis hõlmab alljärgnevaid mutatsioone: A330P331 10
on muudetud S330S331-ks (aminohapete loend viitega looduslikule IgG2 järjestusele; vt
Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613–2624).
[0241] Need deponeeringud tehti vastavalt mikroorganismide patendiekspertiisiks
deponeerimise rahvusvahelise tunnustamise Budapesti lepingu (Budapesti leping) ja sellega 15
kaasnevate määruste sätetele. See tagab deposiidi elujõulise kultuuri säilimise 30 aastaks
alates deponeerimise kuupäevast. Deposiidid tehakse kättesaadavaks ATCC poolt vastavalt
Budapesti lepingu tingimustele ning kokkuleppele Rinat Neuroscience Corp. ja ATCC
vahel, mis tagab hoiustatud kultuuri järglaskonna püsiva ja piiramatu kättesaadavuse
avalikkusele asjakohase USA patendi väljastamisel või mistahes USA või välismaise 20
patenditaotluse avaldamisel, ükskõik kumb juhtub esimesena, ning mis tagab järglaskonna
kättesaadavuse USA patentide ja kaubamärkide komisjoni liikme poolt määratud isikule,
kes omab sellist õigust vastavalt 35 USC § 122 ja sellega kooskõlas olevatele eeskirjadele
komisjoni liikmete jaoks (sealhulgas 37 CFR § 1.14 konkreetse viitega 886 OG 638).
25
[0242] Patenditaotluse volitatud isik nõustub sellega, et kui deponeeritud materjalide
kultuur, mida kultiveeritakse sobivates tingimustes, sureb või läheb kaduma või hävineb,
asendatakse vastava teate esitamisel see kohe teise samasugusega. Deponeeritud materjali
102 EE-EP 1 957 106 B2
kättesaadavust ei tõlgendata kui luba leiutise praktikas kasutamiseks vastuolus õigustega,
mis on tagatud vastavuses patendiõigusega ja kooskõlas mistahes valitsuse lubadega.
Antikeha järjestused
5
[0243]
G1 raske ahela varieeruva piirkonna aminohappejärjestus (SEQ ID NO:1)
G1 kerge ahela varieeruva piirkonna aminohappejärjestus (SEQ ID NO:2)
10
G1 CDR H1 (laiendatud CDR) (SEQ ID NO:3)
GFTFSNYWIS
G1 CDR H2 (laiendatud CDR) (SEQ ID NO:4)
EIRSESDASATHYAEAVKG
G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5) 15
YFDYGLAIQNY
G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6)
KASKRVTTYVS
G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7)
GASNRYL 20
G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8)
SQSYNYPYT
G1 raske ahela varieeruva piirkonna nukleotiidijärjestus (SEQ ID NO:9)
G1 kerge ahela varieeruva piirkonna nukleotiidijärjestus (SEQ ID NO:10) 25
103 EE-EP 1 957 106 B2
G1 raske ahela tervikliku antikeha aminohappejärjestus (sealhulgas modifitseeritud IgG2
vastavalt siin kirjeldatule) (SEQ ID NO:11)
G1 kerge ahela tervikliku antikeha aminohappejärjestus (SEQ ID NO:12) 5
G1 raske ahela tervikliku antikeha nukleotiidijärjestus (sealhulgas modifitseeritud IgG2
vastavalt siin kirjeldatule) (SEQ ID NO:13)
G1 kerge ahela tervikliku antikeha nukleotiidijärjestus (SEQ ID NO:14) 10
104 EE-EP 1 957 106 B2
[0244] Inimese ja roti CGRP (inimese α-CGRP (SEQ ID NO:15); inimese β-CGRP (SEQ
ID NO:43); roti α-CGRP (SEQ ID NO:41); ja roti β-CGRP (SEQ ID NO:44))
aminohappejärjestuste võrdlus: 5
NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (inimese
α-CGRP) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2
(inimese β-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-
CONH2 (roti α-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-
CONH2 (roti β-CGRP). 10
105 EE-EP 1 957 106 B2
Patendinõudlus
1. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks indiviidil peavalu ravis või
ärahoidmisel, kusjuures CGRP-vastane antagonistlik antikeha on inimese antikeha või
humaniseeritud antikeha, mille seondumisafiinsus (KD) inimese α-CGRP suhtes on 50 nM 5
või väiksem mõõdetuna pinnaplasmonresonantsiga temperatuuril 37 °C.
2. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 1, mille
korral CGRP-vastane antagonistlik antikeha seob C-terminaalset fragmenti, mis sisaldab
CGRP aminohappeid 25–37. 10
3. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 2, mille
korral CGRP-vastane antagonistlik antikeha seob C-terminaalset fragmenti CGRP
aminohapete 25–37 ulatuses.
15
4. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes nõudluspunktile 1 kuni 3, mis sisaldab:
a. VH CDR3 järjestusega SEQ ID NO: 5 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ
ID NO: 5 1 või 2 konservatiivse aminohappeasenduse poolest; ja
b. VL CDR3 järjestusega SEQ ID NO: 8 või järjestusega, mis erineb järjestusest SEQ
ID NO: 8 1 või 2 konservatiivse aminohappeasenduse poolest. 20
5. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis sisaldab VH-
domeeni, mille aminohappejärjestus on vähemalt 90% identne järjestusega SEQ ID NO: 1,
ja VL-domeeni, mille aminohappejärjestus on vähemalt 90% identne järjestusega SEQ ID
NO: 2. 25
6. Antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 5, kus aminohappejääk SEQ ID NO: 1
positsioonis 99 on L või asendatud A, N-i, S-i, T, V või R-iga ning kus aminohappejääk
SEQ ID NO: 1 positsioonis 100 on A või asendatud L-i, R-i, S-i, V, Y-i, C G, T, K või P-
ga. 30
7. Antikeha kasutamiseks vastavalt nõudluspunktile 1, mis sisaldab VH-domeeni, mis
sisaldab SEQ ID NO: 1, ja VL-domeeni, mis sisaldab SEQ ID NO: 2.
106 EE-EP 1 957 106 B2
8. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, kus antikeha on
IgG-, IgM-, IgE-, IgA- või IgD-molekul või neist tuletatud.
9. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis sisaldab rasket 5
ahelat, mis on saadud ekspressioonivektoriga ATCC registrinumbriga PTA-6867.
10. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis sisaldab
kerget ahelat, mis on saadud ekspressioonivektoriga ATCC registrinumbriga PTA-6866.
10
11. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, mis koosneb SEQ
ID NO. 11 kohasest raske ahela järjestusest ja SEQ ID No. 12 kohasest kerge ahela
järjestusest.
12. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes nõudluspunktile 15
1–11, mis sisaldab häiritud efektorfunktsiooniga Fc-piirkonda.
13. CGRP-vastane antagonistlik antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale
nõudluspunktile, kusjuures antikeha on humaniseeritud antikeha.
20
14. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes eelnevale nõudluspunktile, kus nimetatud
vasomotoorne sümptom on auraga või aurata migreen, hemipleegiline migreen,
kobarpeavalu, migreenne neuralgia, krooniline peavalu või pingepeavalu.
15. Antikeha kasutamiseks vastavalt mis tahes nõudluspunktile 1 kuni 13, kus antikeha on 25
formuleeritud süsteemseks manustamiseks.
EE-EP 1 957 106 B2
1/10
EE-EP 1 957 106 B2
2/10
EE-EP 1 957 106 B2
3/10
EE-EP 1 957 106 B2
4/10
EE-EP 1 957 106 B2
5/10
EE-EP 1 957 106 B2
6/10
EE-EP 1 957 106 B2
7/10
EE-EP 1 957 106 B2
8/10
EE-EP 1 957 106 B2
9/10
EE-EP 1 957 106 B2
10/10
EE-EP 1 957 106 B2
JÄRJESTUSTE LOETELU
[0245]
<110> Rinat Neuroscience Corp. Zeller, Joerg Poulsen, Kristian Abdiche, Yasmin Pons,
Jaume Sierra, Jones Rosenthal, Arnon 5
<120> Kaltsitoniini geeniga seotud peptiidi vastane antagonist-antikeha ja meetodid selle
kasutamiseks
<130> PC19499A
<160> 47
<170> PatentIn versioon 3.3 10
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220> 15
<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela variaabel regioon
<400> 1
<210> 2
<211> 107 20
<212> PRT
2
EE-EP 1 957 106 B2
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela variaabel regioon
<400> 2
5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220> 10
<223> Humaniseeritud antikeha CDR H1
<400> 3
<210> 4
<211> 19 15
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha CDR H2
<400> 4 20
3
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220> 5
<223> Humaniseeritud antikeha CDR H3
<400> 5
<210> 6
<211> 11 10
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha CDR L1
<400> 6 15
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 20
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha CDR L2
<400> 7
<210> 8 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha CDR L3 30
<400> 8
4
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 9
<211> 366
<212> DNA
<213> Sünteetiline järjestus
<220> 5
<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela variaabel regioon
<400> 9
<210> 10 10
<211> 321
<212> DNA
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela variaabel regioon 15
<400> 10
<210> 11
<211> 448
<212> PRT 20
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela täispikkus
<400> 11
5
EE-EP 1 957 106 B2
6
EE-EP 1 957 106 B2
7
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 5
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela täispikkus
<400> 12
8
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 13
<211> 1347
<212> DNA
<213> Sünteetiline järjestus 5
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha raske ahela täispikkus
<400> 13
9
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 14
<211> 645
<212> DNA
<213> Sünteetiline järjestus 5
<220>
<223> Humaniseeritud antikeha kerge ahela täispikkus
<400> 14
<210> 15 10
<211> 37
<212> PRT
<213> inimene
<400> 15
15
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> inimene
<400> 16 20
10
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 17
<211> 19
<212> PRT 5
<213> inimene
<400> 17
<210> 18
<211> 19 10
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> inimese alfa-CGRP fragmendi variant
<400> 18 15
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 20
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 19
<210> 20 25
<211> 19
<212> PRT
11
EE-EP 1 957 106 B2
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 20
5
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220> 10
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 21
<210> 22
<211> 19 15
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 22 20
<210> 23
<211> 19
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 25
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 23
12
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 5
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 24
<210> 25 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP fragment 15
<400> 25
<210> 26
<211> 13
<212> PRT 20
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 26
25
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220> 30
13
EE-EP 1 957 106 B2
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 27
<210> 28
<211> 13 5
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 28 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 15
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 29
<210> 30 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment 25
<400> 30
<210> 31
<211> 13
<212> PRT 30
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
14
EE-EP 1 957 106 B2
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 31
<210> 32
<211> 13 5
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 32 10
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 15
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment
<400> 33
<210> 34 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP variandi fragment 25
<400> 34
<210> 35
<211> 12
<212> PRT 30
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
15
EE-EP 1 957 106 B2
<223> Inimese alfa-CGRP fragment
<400> 35
<210> 36
<211> 19 5
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP fragment
<400> 36 10
<210> 37
<211> 18
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 15
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP fragment
<400> 37
<210> 38 20
<211> 36
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP fragment 25
<400> 38
16
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 39
<211> 19
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus 5
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP fragment
<400> 39
<210> 40 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Inimese alfa-CGRP fragment 15
<400> 40
<210> 41
<211> 37
<212> PRT 20
<213> Rott
<400> 41
<210> 42 25
17
EE-EP 1 957 106 B2
<211> 19
<212> PRT
<213> Sünteetiline järjestus
<220>
<223> Roti alfa-CGRP fragment 5
<400> 42
<210> 43
<211> 37
<212> PRT 10
<213> Inimene
<400> 43
<210> 44
<211> 37 15
<212> PRT
<213> Rott
<400> 44
<210> 45 20
<211> 32
<212> PRT
<213> Inimene
<400> 45
18
EE-EP 1 957 106 B2
<210> 46
<211> 37
<212> PRT
<213> Inimene 5
<400> 46
<210> 47
<211> 52
<212> PRT 10
<213> Inimene
<400> 47