efecto de la comunidad bacteriana en el …biblio.uabcs.mx/tesis/te3423.pdf · dra. sonia quijano...

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS

EFECTO DE LA COMUNIDAD BACTERIANA EN EL DINOFLAGELADO Gymnodinium catenatum (Graham, 1943):

CRECIMIENTO, PERFIL DE PIGMENTOS Y TOXINAS PARALIZANTES

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

BIÓLOGA MARINA

PRESENTA:

DULCE VALERIA RAMÍREZ RODRÍGUEZ

DIRECTOR (A):

DRA. CHRISTINE JOHANNA BAND SCHMIDT

LA PAZ, B.C.S., DICIEMBRE DE 2015.

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo es fruto de mi formación universitaria, por lo que

en primer instancia quiero agradecer a la Universidad Autónoma de Baja California

Sur (UABCS), en especial al Departamento de Biología Marina por fomentar y

fortalecer mi pasión hacia las ciencias marinas, brindándome la oportunidad de

descubrir mi vocación en la investigación científica.

Debo especial gratitud al Centro Interdisciplinario de Ciencias Marinas

(CICIMAR-IPN) por su total apoyo para el uso de sus instalaciones y por ende para la

complementación de mi aprendizaje, además por permitir integrarme al proyecto

institucional SIP20151381. Dentro de esta institución quisiera remarcar mi

agradecimiento hacia el Equipo FAN-CICIMAR y a los integrantes del Laboratorio de

Docencia 1, quienes a lo largo de todo este tiempo se convirtieron en mi familia ya

que el apoyo incondicional, la grata compañía y paciencia durante mi aprendizaje

hicieron más ameno el trayecto. En este sentido, comenzaré agradeciendo a mi Doc

(Dra. Christine J. Band Schmidt), no solo por la apertura de aceptar y apoyar mis

complicadas ideas, sino por darse a la tarea de supervisar, alentar y dirigir mi trabajo

de tesis, siempre con la mejor disposición, además del apoyo cordial, consejos e

importantes observaciones a mi manuscrito. A la Dra. Lorena M. Durán Riveroll, por

quien me incursioné en el mundo de las biotoxinas marinas, por enseñarme el valor

de esforzarse en un trabajo bien hecho, confiar en mis ideas y ayudarme a

encaminarlas hasta obtener el mejor provecho de ellas. A los doctores Ignacio Leyva

Valencia, pero sobre todo a Aldo Aquino Cruz por su invaluable apoyo y disposición,

por sus comentarios alentadores y por las innumerables enseñanzas en el

laboratorio. Además, extiendo mi agradecimiento a todos los miembros de este

maravilloso equipo, a los que van de paso, a los que regresan y a los que nunca se

han ido: Pablo, Nancy, Génesis, Miriam, Tina, Armando y Leyberth, gracias por

contribuir y estar presente en el enriquecimiento de mi trabajo.

Por otra parte, quisiera agradecer al Centro de Investigaciones Biológicas del

Noroeste (CIBNOR) y en especial al Dr. Francisco E. Hernández Sandoval,

responsable del Laboratorio de Ficotoxinas Marinas de esta institución, por su

valiosísima guía y paciencia en la aplicación de las técnicas para la extracción,

identificación y cuantificación de pigmentos y toxinas paralizantes requeridos en este

trabajo. Así mismo, agradezco a la Colección de Dinoflagelados Marinos

(CODIMAR), a la Dra. Lourdes Morquecho Escamilla y a la M. en. C. Amada Reyes

Salinas por proporcionarme algunas de las cepas utilizadas en el presente.

Bajo el mismo concepto, agradezco a la M. en B. Mónica C. Rodríguez Palacio

de la Universidad Autónoma Metropolitana por aportar algunas cepas al trabajo y a la

Dra. Sonia Quijano Scheggia de la Universidad de Colima, quien me dio lo más

valioso de este trabajo: la cepa contaminada con la comunidad bacteriana, además

de mostrar interés e iniciativa en apoyarnos con la parte de biología molecular, que si

bien no se incluye en el presente, no se descarta en un futuro cercano.

Siempre he dicho que un proyecto no es únicamente de quien lo financia, sino

de quien aporta, de manera desinteresada, un granito de arena. Por lo cual, mi total

gratitud a quienes me abrieron un espacio en su sitio de trabajo, me proporcionaron

equipo, material y reactivos para llevar a cabo este proyecto: Dra. Claudia J.

Hernández Guerrero, Dra. Noemí Águila Ramírez, Dra. Griselda M. Rodríguez

Figueroa, Dra. Laura Sánchez Velasco, Dra. Lourdes A. Arriaga Pizano, Dr. Mauricio

Muñoz Ochoa, Dr. Ismael Gárate Lizárraga, Dr. Sergio Hernández Trujillo, Dr.

Rogelio Armas González, Dr. Arturo Cérbulo Vázquez y en especial al Dr. David A.

Siqueiros Beltrones por el microscopio con el que pude evidenciar una parte crucial

de esta investigación.

A lo largo de esta travesía se me permitió participar en diferentes Congresos

Nacionales con un patrocinio inigualable, por lo que solo me resta agradecer al

Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado

del Pacífico (Programa DELFÍN), al CIBNOR con su Programa de Acercamiento de la

Ciencia a la Educación, al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)

por la beca 21751, así como poder integrarme al proyecto SEP-CONACyT 178227 y

finalmente a la Red Temática de Florecimientos Algales Nocivos (RedFAN) por el

apoyo económico para asistir a los diferentes eventos.

Así también, agradezco a mi extraordinario comité revisor: Dr. Sergio F. Flores

Ramírez, Dr. Rafael Riosmena Rodríguez, por sus importantes observaciones y

aportaciones al presente manuscrito. A mí estimado profesor favorito (Dr. Héctor

Reyes Bonilla), gracias por la paciencia, el interés, la preocupación, pero sobre todo

por siempre tener las palabras necesarias para no dejarme claudicar en esto y a mí

querida Dra. Bárbara González Acosta, porque a pesar de estar tan ocupada,

siempre estuvo al pie del cañón, gracias por dejarme pertenecer a su equipo de

trabajo, por el microscopio de epifluorescencia que olvidaba tapar pero sobre todo

por sentir la misma emoción que yo al ver a los bacilos intracelulares.

Sin lugar a dudas mi apoyo más grande ha sido y será siempre mi familia, por

lo que no solo agradezco a todos sino dedico este trabajo a quienes renunciaron a mí

durante este periodo de estudio para que pudiera cumplir con uno de mis más

grandes sueños: ser bióloga marina. Agradezco a mis padres, Antonio y Jasmín,

quienes siempre se han preocupado por mí, me han dado todo de corazón, han sido

un ejemplo intachable, me han formado y enseñado a “esforzarme y ser valiente” y

nunca han dejado de creer en mí. A mis hermanos, Aldo y Liz, espero que la pérdida

de todo aquello importante para ustedes, pueda ser recompensado ahora que

concluí esta tesis. A mis grandes amores, mi abue, mi mana, Chabela, Víctor, mis

bisa, mis primos y tíos, en verdad no me alcanzan las palabras para agradecer todo

lo que significa para mí que me acompañen en este nuevo logro, que sin su apoyo no

hubiera sido posible.

Dicen que lo mejor de la amistad, es que puedes elegir quien va de paso y

quien se convierte en tu familia por elección, así que mil gracias a todos mis amigos,

de aquí y de allá: Brenda, Emmanuel, César, Wanda, Marcelo, Aurora, Rebeca,

Andrea, Andrés, Marijó, Ricardo, pero sobre todo quien fungió no solo como mi mejor

amiga paceña sino como hermana, confidente, porrista, mamá y de todo, gracias

infinitas pequeña Dan.

Finalmente, me gustaría agradecer a la persona que me ha demostrado el

valor de mis ideas y me ha dado fortaleza durante la realización de este trabajo, la

persona que siempre ha estado como mi mejor amigo, quien me dio alas, me enseñó

a volar y ha volado conmigo; quien nunca dejará de ser ese apoyo aún en los

momentos más difíciles, la persona que admiro por su dedicación e iniciativa y con la

que comparto mis días y sueños, de corazón gracias Miguel. Y obviamente y sin

restarle la importancia que merece, a quien soportó mis desvelos, los acompañó,

contrarrestó el estrés con sonrisas y por quien siempre deseo volver a casa, Romeo.

¡A todos, gracias infinitas!

Dedicado con todo mi amor y cariño a:

Jasmín, Hilda, Aldo, Liz y Miguel

Su fuerza y amor me han dirigido por la vida y me han dado las

alas que necesitaba para volar…

¡Gracias!

Página

I. INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 1

II. ANTECEDENTES ......................................................................................... 5

III. JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 8

IV. HIPÓTESIS ............................................................................................... 9

V. OBJETIVOS ............................................................................................ 10

5.1. Objetivo general ................................................................................. 10

5.2. Objetivos específicos ........................................................................ 10

VI. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 11

6.1. Cepas .................................................................................................. 11

6.2. Medio de cultivo ................................................................................. 11

6.3. Condiciones de cultivo ...................................................................... 12

6.4. Aislamiento de la cianobacteria ....................................................... 12

6.5. Curvas de crecimiento de la cianobacteria ..................................... 13

6.5.1. Microscopio óptico ........................................................................ 13

6.5.2. Citometría de flujo ......................................................................... 14

6.5.3. Microscopia de epifluorescencia ................................................... 15

6.6. Curvas de crecimiento de G. catenatum .......................................... 17

6.7. Asociación G. catenatum-comunidad bacteriana ........................... 18

6.7.1. Exposición a filtrados celulares ..................................................... 18

6.7.2. Cultivos con contacto celular ........................................................ 18

6.8. Observaciones morfológicas de las cepas de G. catenatum ......... 19

6.9. Determinación de pigmentos ............................................................ 19

6.10. Determinación del perfil de toxinas paralizantes ........................... 20

6.11. Análisis estadísticos ......................................................................... 21

VII. RESULTADOS ........................................................................................ 22


7.2. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana ...................... 24

7.2.1. Microscopía óptica ........................................................................ 24

7.2.2. Citometría de flujo ......................................................................... 25

7.2.3. Microscopía de epifluorescencia ................................................... 28

ÍNDICE GENERAL


7.4. Formación de cadenas celulares ...................................................... 35




7.6. Curvas de crecimiento ...................................................................... 43

7.7. Biomasa máxima ................................................................................ 47

7.8. Tasa de crecimiento .......................................................................... 48

7.9. Tiempo de generación ....................................................................... 49

7.10. Longitud de cadenas celulares ........................................................ 50

7.11. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana en los cultivos

con contacto celular ............................................................................................ 54

7.12. Cambios morfológicos de Gymnodinium catenatum en presencia

de la comunidad bacteriana ................................................................................ 58

7.13. Perfil de pigmentos ........................................................................ 60

7.13.1. Cianobacteria ................................................................................ 60

7.13.2. Gymnodinium catenatum en presencia/ausencia de la comunidad

bacteriana…....

7.14. Perfil de toxinas paralizantes ........................................................ 64

7.15. Toxicidad......................................................................................... 67

VIII. DISCUSIÓN ............................................................................................ 70


8.2. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana ...................... 71


8.4. Formación de cadenas celulares ...................................................... 75




8.6. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana en los cultivos

con contacto celular ............................................................................................ 81

8.7. Cambios morfológicos de Gymnodinium catenatum en presencia

de la comunidad bacteriana ................................................................................ 83

8.8. Perfil de pigmentos ............................................................................ 85

8.8.1. Cianobacteria ................................................................................ 85


bacteriana …………………………………………………………………………...86

8.9. Perfil de toxinas paralizantes............................................................ 87

8.10. Toxicidad......................................................................................... 89

IX. CONCLUSIÓN ........................................................................................ 90

X. LITERATURA CITADA ........................................................................... 91

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Distribución global de G. catenatum. .................................................. 3

Figura 2. Ciclo de vida de Gymnodinium catenatum. ......................................... 4

Figura 3. Técnicas microbiológicas para el aislamiento de la cianobacteria. ... 13

Figura 4. Curvas de crecimiento de la cianobacteria……. ............................... 23

Figura 5. Curva de crecimiento de la cianobacteria en medio GSe ................. 25

Figura 6. Ubicación de los bacilos intracelulares ............................................. 25

Figura 7. Citograma de la determinación del tamaño celular de la cianobacteria

a través de citometría de flujo. .................................................................................. 27

Figura 8. Citograma de la determinación de la complejidad celular de la

cianobacteria a través de citometría de flujo. ............................................................ 27

Figura 9. Citograma de identificación de las tres poblaciones de

microorganismos pertenecientes a la comunidad bacteriana .................................... 28

Figura 10. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana ....................... 30

Figura 11. Patrones de cambio en la abundancia celular de los

microorganismos pertenecientes a la comunidad bacteriana .................................... 31

Figura 12. Micrografía del tamaño celular de los tres micoorganismos de la

comunidad bacteriana asociada a la cepa G7 de Gymnodinium catenatum. ............ 32

Figura 13. Bacterias intracelulares en Gymnodinium catenatum. ................... 32

Figura 14. Curvas de crecimiento de las cinco cepas de Gymnodinium

catenatum en medio GSe a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. ...................... 34

Figura 15. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de la cepa

GCMV-7 de Gymnodinium catenatum en medio GSe. .............................................. 36


G7 New de Gymnodinium catenatum en medio GSe. ............................................... 37


G7 de Gymnodinium catenatum en medio GSe. ....................................................... 38


GCCV-7 de Gymnodinium catenatum en medio GSe. . ............................................ 39


62L de Gymnodinium catenatum en medio GSe. ...................................................... 40

Figura 20. Curvas de crecimiento de los cultivos de la comunidad bacteriana

con extracto celular de Gymnodinium catenatum .................................................... 41

Figura 21. Curvas de crecimiento de las cuatro cepas de Gymnodinium

catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana ................................................. 43

Figura 22. Curvas de crecimiento de las cuatro cepas de Gymnodinium

catenatum en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana ................................ 46

Figura 23. Biomasa máxima de las cuatro cepas de Gymnodinium catenatum

inoculadas con la comunidad bacteriana. ................................................................. 47

Figura 24. Tasa de crecimiento de las cuatro cepas de Gymnodinium

catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana ................................................. 48

Figura 25. Tiempo de generación de las cuatro cepas de Gymnodinium

catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana. ................................................ 49

Figura 26. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de las cepas

GCMV-7 y G7de Gymnodinium catenatum en presencia/ausencia de la comunidad

bacteriana.................................................................................................................. 52

Figura 27. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de las cepas

GCCV-7 y 62L de Gymnodinium catenatum en presencia/ausencia de la comunidad

bacteriana.................................................................................................................. 53

Figura 28. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana asociada a las

cepas de G. catenatum. ............................................................................................ 56

Figura 29. Tasa de crecimiento de la cianobacteria en los cultivos tratamiento

de G. catenatum ........................................................................................................ 57

Figura 30. Tiempo de generación de la cianobacteria en los cultivos tratamiento

de Gymnodinium catenatum...................................................................................... 57

Figura 31. Cultivos inoculados con la comunidad bacteriana. ......................... 58

Figura 32. Células de G. catenatum en presencia de la comunidad bacteriana.

.................................................................................................................................. 59

Figura 33. Perfil de pigmentos de la cianobacteria asociada a la cepa G7 de

Gymnodinium catenatum. ......................................................................................... 60

Figura 34. Perfil de pigmentos de la cepa GCMV-7 en presencia/ausencia de la

comunidad bacteriana. .............................................................................................. 61

Figura 35. Perfil de pigmentos de la cepa GCCV-7 en presencia/ausencia de la


Figura 36. Perfil de pigmentos de la cepa 62L en presencia/ausencia de la


Figura 37. Perfil de pigmentos de la cepa G7 en presencia/ausencia de la


Figura 38. Perfil de toxinas de la cepa GCMV-7 en presencia/ausencia de la


Figura 39. Perfil de toxinas de la cepa GCCV-7 en presencia/ausencia de la


Figura 40. Perfil de toxinas de la cepa 62L en presencia/ausencia de la


Figura 41. Perfil de toxinas de la cepa G7 en presencia/ausencia de la


Figura 42. Toxicidad (ngSTXeq/cél) de las cepas de G. catenatum en

presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. ...................................................... 69

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla I. Cepas de G. catenatum aisladas de diversas regiones del Pacífico

mexicano y de la cianobacteria. ................................................................................ 11

Tabla II. Datos de crecimiento de la cianobacteria ........................................... 24

Tabla III. Datos promedio del crecimiento de las cinco cepas de G. catenatum

en medio GSe.. ......................................................................................................... 34

Tabla IV. Porcentaje promedio de cadenas celulares en G. catenatum. .......... 35

Tabla V. Datos promedio del crecimiento de la comunidad bacteriana con

extracto celular de Gymnodinium catenatum en medio GSe. ................................... 41

Tabla VI. Datos promedio del crecimiento de las cepas de Gymnodinium

catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana en medio GSe. ........................ 43

RESUMEN

Durante los últimos años, se ha registrado una mayor frecuencia de Florecimientos

Algales Nocivos (FAN), trayendo consigo un incremento en los estudios destinados a

determinar los factores que controlan la dinámica poblacional de las principales

especies formadoras de estos procesos. Sin embargo, un aspecto que ha sido poco

estudiado es la interacción bacteria-microalga, que repercute en diversos aspectos

como el reabastecimiento, síntesis y asimilación de nutrientes, protección ante la

depredación y radiación U.V., en el crecimiento y finalmente en la producción de

toxinas. Gymnodinium catenatum es un dinoflagelado planctónico marino, formador

de cadenas celulares y productor de toxinas paralizantes; es una de las especies

responsables de FAN de las que se tiene mayor información en nuestro país, sin

embargo, poco se conoce sobre las relaciones ecológicas de esta especie con otras

especies de la comunidad bacteriana. Es por ello que el estudio de la interacción

bacteria-microalga proporcionará una mejor comprensión de la influencia de las

bacterias en el crecimiento de G. catenatum. Se trabajó con cinco cepas de G.

catenatum aisladas de Bahía de Santiago, Colima; Lázaro Cárdenas, Michoacán;

Bahía Concepción y Bahía de La Paz, B.C.S., de estas cepas, la de Colima presenta

una asociación simbiótica con una comunidad bacteriana dominada por una

cianobacteria y bacilos, la cianobacteria fue aislada en placas de agar con medio

GSe, a 24°C y con un ciclo de 12:12 horas luz-oscuridad. G. catenatum se cultivó

bajo las mismas condiciones que la cianobacteria y a 34 ups. La interacción entre

microorganismos se evaluó inoculando la comunidad bacteriana en las cepas de G.

catenatum, realizando conteos mediante microscopía de epifluorescencia,

determinándose las tasas y curvas de crecimiento, así como el perfil de pigmentos y

toxinas paralizantes por cromatografía de capa líquida de alta resolución de los

cultivos. La comunidad bacteriana no favoreció el crecimiento de G. catenatum, al

registrarse mayores biomasas y tasas de crecimiento en los monocultivos del

dinoflagelado pero sí repercutió en el perfil de pigmentos al aumentar la

concentración de la clorofila a, peridinina y β-caroteno. En cuanto al perfil de toxinas

paralizantes, no se observaron cambios en el mismo pero sí en la toxicidad celular, la

cual se ve disminuida en presencia de la comunidad bacteriana en tres de las cuatro

cepas, aumentando la concentración de toxinas N-sulfocarbamoil y carbamoil y

disminuyendo la concetración de toxinas carbamatas, por lo que se considera a las

bacterias y a la cianobacteria, agentes estresantes con mecanismos de acción

desconocidos. Con la información obtenida se propone que la interacción entre las

bacterias intracelulares, la cianobacteria extracelular y el dinoflagelado es bimodal:

durante la fase de crecimiento exponencial del cultivo la relación es mutualista al

presentarse un crecimiento óptimo en todos los organismos mientras que al

envejecer el cultivo, esta interacción se vuelve parasitaria, debido a las

modificaciones en el ciclo de vida que presenta G. catenatum, desarrollando quistes

temporales y cambios morfológicos, lo que desencadena una alta mortalidad. Esta

hipótesis nos permitiría explicar la rápida desaparición de los Florecimientos Algales

Nocivos (FAN) en la naturaleza, sin la exclusión de otros factores.

Palabras clave: Gymnodinium catenatum, comunidad bacteriana, crecimiento,

toxinas paralizantes, Pacífico Mexicano.

1

I. INTRODUCCIÓN

El crecimiento del fitoplancton está controlado por una combinación de

factores físicos como la temperatura, salinidad, luz y disposición de nutrientes

esenciales en forma de C, N, P, Si, Fe y diversos metales traza (Rooney-Varga et al.

2005). Aunado a eso, también intervienen factores bióticos como: la alelopatía, la

depredación y/o pastoreo, así como la interacción con una amplia gama de

microorganismos pertenecientes al femto, pico y microplancton, los cuales tienen una

influencia significativa en la regulación del crecimiento de las poblaciones de

fitoplancton (Ferrier et al. 2002).

Durante los últimos años, se ha estudiado la influencia de la comunidad

bacteriana en la dinámica de crecimiento y fisiología de las microalgas,

particularmente el efecto que tienen en la tasa de crecimiento y toxicidad del

fitoplancton nocivo mediante efectos estimulantes o inhibitorios, creándose posibles

asociaciones mutualistas (Doucette y Powell, 1998; Mayali y Azam, 2004).

No obstante, aún se desconocen los mecanismos de acción de la comunidad

bacteriana sobre la microalga, proponiéndose que las bacterias exudan diversos

metabolitos (vitaminas, quelantes orgánicos, formas asimilables de N, nutrientes

inorgánicos) que la microalga puede asimilar. Aunque, también se sabe que las

bacterias tienen una capacidad alguicida que limita el crecimiento de ciertas especies

(Ferrier et al. 2002; Adachi et al. 2003; Croft et al. 2005; Matsumoto, 2011).

De manera específica, los cultivos de dinoflagelados se ven asociados con

comunidades bacterianas inter e intracelulares, representadas por tres phyla:

Alfaproteobacterias, Gamaproteobacterias y Actinobacterias quienes influyen en la

fisiología del dinoflagelado, participan en el proceso del “bucle microbiano” donde

reabastecen y modulan la concentración y aporte de macronutrientes (C, N y P),

vitaminas y hierro, y participan en la producción de citoquininas (Azam, 1998).

Además, por ser organismos fotoheterótrofos aerobios tienen un papel importante en

2

el ciclo del C, lo que en conjunto favorece el crecimiento del dinoflagelado (Adachi et

al. 2001; Hold et al. 2001; Green et al. 2004).

Las bacterias intracelulares participan en la síntesis de nutrientes esenciales y

en la fijación de nitrógeno, mientras que la microalga les provee de un hábitat óptimo

para su crecimiento mediante la producción de compuestos orgánicos y

proporcionando una mayor área de superficie de fijación (Seibold et al. 2001). En

cuanto a las bacterias extracelulares, su colonización en la superficie celular

proporciona un mejor acceso a los nutrientes y en algunos casos ofrece protección

ante la depredación y/o radiación ultravioleta (Dang y Lovell, 2000).

Así, encontramos a Gymnodinium catenatum, dinoflagelado planctónico marino

reportado por primera vez en la primavera de 1939 en el Golfo de California

(Graham, 1943). Esta especie permaneció prácticamente desconocida, siendo

reportada sólo en dos ocasiones entre 1940 y 1967 (Balech, 1964; Hada, 1967).

Posteriormente, no hubo reportes hasta 1976, y de ese año hasta el 2014 se ha

registrado un aumento en su frecuencia, con más de 60 reportes en 23 países:

Australia, Japón, Venezuela, Cuba, Uruguay, Argentina, España, Costa Rica, Egipto,

Portugal, entre otros (Band-Schmidt et al. 2010; Hallegraeff et al. 2011; Quijano-

Scheggia et al. 2012).

En México, su distribución se ha reportado a lo largo de la costa del Pacífico

mexicano (Band-Schmidt et al. 2006; 2010. Fig. 1). Es una especie atecada que

forma cadenas celulares, de las principales productoras de FAN y ha sido muy

estudiada en el país (Blackburn et al. 1989; Band-Schmidt et al. 2010). G. catenatum

tolera un amplio intervalo de temperatura, salinidad y proporciones de N:P lo que

probablemente le permita tener una amplia distribución (Band-Schmidt et al. 2010,

2014).

3

Figura 1. Distribución global de G. catenatum (Durán-Riveroll, 2014).

El dinoflagelado atecado, Gymnodinium catenatum, tiene dos formas de

reproducción, una sexual heterotálica múltiple que se da por fusión de los gametos, y

otra asexual que implica la división vegetativa de las células. Blackburn y

colaboradores (1989) y Figueroa (2005) mostraron que los gametos que se forman

de manera asexual son isogametos, éstos se fusionan y forman un planocigoto

diploide que es biflagelado y mucho más grande en tamaño que las células sexuales

vegetativas.

Eventualmente, el dinoflagelado pierde el flagelo y con ello el planocigoto pierde

su capacidad natatoria, adquiriendo una forma más redondeada con un sulcus y un

cíngulo claramente visibles, que con el paso del tiempo se van desvaneciendo

(Figueroa et al. 2006). En este punto del ciclo de vida existen dos opciones:

enquistarse o dividirse y esto dependerá de las condiciones ambientales. Cuando

son óptimas, el planocigoto se dividirá mediante reproducción sexual, aumentando el

tamaño de la población; pero, si los parámetros ambientales (temperatura, oxígeno,

4

nutrientes, fotoperiodo) no son óptimos, el organismo se enquistará para

transformarse en un hypnocigoto, rodeado por una capa mucilaginosa y con un

cuerpo rojo pigmentado, constituyendo la fase de reposo de su ciclo de vida.

Después de dos semanas de inactividad, el hypnocigoto se puede enquistar,

formando un planomeiocito biflagelado (2n), que después se divide y forma células

vegetativas haploides (Figueroa et al. 2006; 2008; Albinsson, 2011).

La formación de quistes es una estrategia de esta especie ante condiciones

desfavorables y es fundamental en la dinámica de sus eventos de proliferación, ya

que facilita su dispersión, además de promover la recombinación genética. G.

catenatum puede formar, principalmente, dos tipos de quistes: a) de resistencia o

hypnocigotos, formados por reproducción sexual; y b) temporal o pelicicle, a partir de

células móviles cubiertos por una delgada membrana (Bravo, 1986; Anderson y

Garrison, 1997).

Figura 2. Ciclo de vida de Gymnodinium catenatum (Modificado de Albinsson, 2011).

5

El dinoflagelado Gymnodinium catenatum se caracteriza por ser la única

especie marina desnuda productora de toxinas paralizantes (Hallegraeff, 1993).

Estas toxinas pueden acumularse en moluscos bivalvos, caracoles, crustáceos

(Saldate-Castañeda et al. 1991), pulpos (Núñez-Vázquez et al. 2008), peces

planctófagos filtradores (Reis-Costa et al. 2010) y de manera secundaria en el ser

humano. Dado la distribución de G. catenatum, así como el impacto que ocasiona en

la fauna silvestre ha incrementado a nivel mundial, científicos han establecido un

mayor interés en los factores que influyen en el crecimiento y toxicidad de la especie

(Hallegraeff et al. 2011).

Sin embargo, poco se conoce sobre la interacción que existe entre la

comunidad bacteriana y G. catenatum. Reportes recientes demuestran que las

bacterias son esenciales para el crecimiento de esta especie y tienen influencia en su

toxicidad y absorción de nutrientes, pudiendo formar relaciones de mutualismo

mediante mecanismos de acción desconocidos (Amin et al. 2007; Green et al. 2010;

Albinsson, 2011; Bolch et al. 2011; Matsumoto, 2011).

La finalidad de este trabajo es determinar si en presencia de una comunidad

bacteriana asociada a una cepa de G. catenatum aislada de la Bahía de Santiago,

Colima, el dinoflagelado se vea beneficiado en su tasa de crecimiento, en la

formación de cadenas de mayor longitud y en un incremento en su biomasa; además

de determinar los posibles cambios que ocurran en el perfil de toxinas y pigmentos.

II. ANTECEDENTES

Los principales trabajos que se han realizado evaluando la interacción entre

Gymnodinium catenatum y la comunidad bacteriana asociada, se basan en cultivos

experimentales donde se concluye que el dinoflagelado crece en asociación con una

comunidad bacteriana que puede influir en su crecimiento, así como en el contenido

y perfil de toxinas. Específicamente, se ha observado que la influencia bacteriana en

el crecimiento de G. catenatum se da con mayor frecuencia en los quistes de

6

resistencia que en las células vegetativas, mientras que los cambios en el perfil de

toxinas paralizantes (PSP) se atribuyen a tres factores: producción autónoma de

toxinas por las bacterias, modulación de la toxicidad del dinoflagelado por las

bacterias y a través de la biotransformación de los análogos de las toxinas PSP

(Amin et al. 2007; Bolch et al. 2011).

Dichos estudios comenzaron a tener un mayor auge décadas atrás, al evaluar

la influencia de las bacterias en el crecimiento y fisiología del fitoplancton tóxico. De

esta manera encontramos el trabajo de Gallacher y colaboradores (1997), Doucette

y Powell (1998) y Smith y colaboradores (2001) quienes indican que las bacterias

pueden influir en el contenido y producción de toxinas paralizantes, además de

modular la toxicidad del dinoflagelado y la biotransformación de los derivados de las

toxinas.

Uribe y Espejo (2003) tras eliminar la comunidad bacteriana presente en

Alexandrium catenella, observan que en ausencia de la misma, la toxicidad del

dinoflagelado se ve disminuida en una quinta parte, esto tras comparar tres técnicas

diferentes para la cuantificación de las toxinas paralizantes: cromatografía de capa

líquida de alta resolución (HPLC), pruebas electrofisiológicas que miden la inhibición

de la saxitoxina (STX) en los canales de sodio regulados por voltaje y mediante

bioensayos en ratón.

Con la misma temática y llegando a resultados símiles, Maas y colaboradores

(2007), concluyen que la presencia de una comunidad bacteriana asociada a

dinoflagelados productores de toxinas paralizantes es esencial, debido a que su

inhibición con antibióticos refleja un descenso significativo en los niveles de

saxitoxina (STX) y gonyautoxinas (GTX1-3) sin presentarse cambios en la tasa de

crecimiento y en el tiempo de regeneración del dinoflagelado.

Amin y colaboradores (2007) redujeron significativamente la comunidad

bacteriana asociada a cepas aisladas de G. catenatum, percatándose que en

presencia de la comunidad bacteriana se da la formación de sideróforos foto-lábiles,

7

que favorecen la asimilación de Fe en el dinoflagelado a través de pequeños poros

en la membrana celular, incrementando su crecimiento. Se sugiere que la captación

de otros micronutrientes como el boro y selenio pueden mediarse por las bacterias

asociadas y en el caso del selenio, éste puede explicar las pequeñas diferencias

regionales entre cepas debido a que los requerimientos del nutriente no son

generalistas (Amin et al. 2009).

Otro reporte que sustenta lo descrito anteriormente fue el realizado por

Albinsson en 2011, quien mostró una asociación entre la bacteria marina

Marinobacter sp. y una cepa australiana de G. catenatum la cual sobrevivió más de

230 días sin la adición de nutrientes, sugiriendo que era la bacteria quien regulaba la

disponibilidad de los mismos. Además, se demostró que ciertos cambios en la

comunidad bacteriana asociada al dinoflagelado pueden alterar significativamente las

proporciones relativas de toxinas paralizantes producidas por cepas en condiciones

de laboratorio.

En el mismo año, Bolch y colaboradores (2011) reportan que tras inhibir el

crecimiento de las bacterias asociadas a G. catenatum, el dinoflagelado ralentiza su

crecimiento hasta emparejarlo con el de las bacterias, logrando con ello un

crecimiento recíproco. Se ha utilizado el crecimiento bacteriano como variable

determinística del crecimiento del dinoflagelado, estableciendo que la dependencia

bacteria-microalga constituye una relación biológica de mutualismo.

Años después, Albinsson y colaboradores (2014) indican que cepas

australianas de G. catenatum presentan una relación mutualista con dos

proteobacterias marinas: Marinobacter sp. y Alcanivorax sp. En presencia de ambas,

el dinoflagelado tiene un mayor crecimiento, observándose un predominio de toxinas

hidroxibenzoato (GC1/2) y decarbamoil (dcGTX2/3), mientras que en ausencia de las

mismas son las toxinas sulfocarbamoil (C1/2 y C3/4) los análogos dominantes. Esta

observación da la pauta a considerar que las bacterias funcionan como agentes

reguladores de la toxicidad de G. catenatum debido a que la única variable en los

tratamientos fue la presencia/ausencia de ambas bacterias.

8

Cabe destacar que en la mayoría de los casos, se han utilizado antibióticos

para disminuir o eliminar la comunidad bacteriana asociada a cultivos específicos de

microalgas nocivas, comparando los cambios existentes en presencia/ausencia de la

misma y las respuestas observadas en el crecimiento, la fisiología y/o en el nivel de

producción de toxina que han sido atribuidos directa o indirectamente a la comunidad

bacteriana (Maas et al. 2007; Bolch et al. 2011).

Aunque teóricamente parece sencillo, tales experimentos presentan una serie

de dificultades y limitaciones. En primer lugar, la comunidad bacteriana asociada a

los cultivos es compleja, presentan una amplia diversidad filogenética y no se elimina

fácilmente con el uso de uno o varios antibióticos. En segundo lugar, la confirmación

de la ausencia total de una comunidad bacteriana es difícil debido a la existencia de

bacterias intracelulares presentes en la microalga, y en tercer lugar, el dilema

inherente que la prueba de ausencia bacteriana es compleja, laboriosa y necesita de

equipos sofisticados y generalmente costosos (Uribe y Espejo, 2003; Maas et al.

2007).

Por ello, el éxito o fracaso en la obtención de una cepa axénica de microalga

también depende de la respuesta que ésta tenga al tratamiento con el antibiótico,

debido a que en algunos casos no es posible diferenciar entre la toxicidad natural de

la microalga y la ocasionada por el antibiótico (Maas et al. 2007; Matsumoto, 2011).

III. JUSTIFICACIÓN

Los florecimientos de fitoplancton, incluyendo aquellos de especies tóxicas

como Gymnodinium catenatum, son fenómenos frecuentes de las regiones costeras

y de surgencia de los océanos. Dichos eventos, en particular cuando está

involucrada alguna especie nociva, pueden tener efectos negativos en los

ecosistemas marinos, en la salud pública y la economía de la zona (Hallegraeff et al.

1995; Green et al. 2004).

9

Hoy en día, existen reportes que indican que la incidencia de los FAN ha

incrementado (Hallegraeff, 2011) y con ello el interés de estudiar a la comunidad

bacteriana asociada a las microalgas que los producen. Esto debido a que son las

bacterias quienes desempeñan un papel importante en el origen, desarrollo y

duración de los FAN, ya que durante estos eventos es necesaria la presencia de un

agente estimulador del crecimiento celular que promueva la reproducción sexual e

inhiba la formación de quistes. No obstante, los mecanismos implicados en el ciclo

de vida de las diversas especies se desconocen (Albinsson, 2011).

Es por ello que el estudio de la interacción bacteria-microalga proporciona,

como primer paso, una comprensión de la influencia de las bacterias en el

crecimiento de las microalgas, así como brindar información sobre la fisiología y

toxicidad de la especie de interés.

IV. HIPÓTESIS

Se ha observado el crecimiento de una comunidad bacteriana formada

principalmente por bacilos y cianobacterias, en una cepa específica de G. catenatum

en condiciones de laboratorio (Band-Schmidt et al. 2004). La cepa que muestra la

presencia de estos microorganismos, tiene un mayor crecimiento comparado con

otras cepas de la misma especie.

Por lo tanto, se asume que la interacción entre los microorganismos es benéfica

(protocooperación). En presencia de la comunidad bacteriana G. catenatum tendrá

una mayor tasa de crecimiento y biomasa, reflejado en cadenas más largas de

células.

Así mismo, es bien sabido que la comunidad bacteriana asociada a cepas de G.

catenatum desempeña un papel importante en su toxicidad, por lo que, teniendo en

cuenta la estrecha relación entre las bacterias y el dinoflagelado, éstas podrían influir

en la producción y composición de las toxinas y pigmentos de esta especie.

10

V. OBJETIVOS

5.1. Objetivo general

Determinar el tipo de relación existente entre Gymnodinium catenatum

y la comunidad bacteriana asociada a cepas específicas del

dinoflagelado.

5.2. Objetivos específicos

Determinar el perfil de pigmentos de la comunidad bacteriana asociada

a G.catenatum a través de cromatografía de capa líquida de alta

resolución.

Determinar las curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana y del

dinoflagelado en cultivos monoespecíficos, así como en cultivos mixtos

de ambas poblaciones.

Determinar el efecto de la interacción entre la comunidad bacteriana y

G. catenatum, evaluando cambios en la tasa de crecimiento, biomasa,

perfil de pigmentos y toxinas paralizantes del dinoflagelado.

Describir los cambios morfológicos, longitud de cadenas y la producción

de quistes temporales de G. catenatum al interactuar con la comunidad

bacteriana.

11

VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Cepas

Se trabajó con cinco cepas de G. catenatum aisladas de diversas regiones del

Pacífico mexicano, las cuales están registradas con las siguientes claves: GCCV-7,

GCMV-7, 62L, G7 y G7 New (Tabla I).

La comunidad bacteriana fue aislada de la cepa G7 proveniente de Bahía de

Santiago, Colima, México.

Tabla I. Cepas de G. catenatum aisladas de diversas regiones del Pacífico mexicano y de la cianobacteria.

Cepa Lugar y año de aislamiento Aislado por

GCCV-7

GCMV-7

G7; G7 New

62L

Bahía Concepción, B.C.S. 2000

Mazatlán, Sinaloa. 2013

Manzanillo, Colima. 2010

Lázaro Cárdenas, Michoacán. 2005

C. Band-Schmidt

L. Morquecho-Escamilla

S. Quijano-Scheggia

M. Rodríguez-Palacio

6.2. Medio de cultivo

Las cepas se mantuvieron en medio GSe modificado con la adición de extracto

de lombricompostaje (Bustillos-Guzmán et al. 2015). Este medio consiste en una

solución de nutrientes (nitratos y fosfatos), metales traza, vitaminas y selenio,

adicionados en agua de mar previamente filtrada y esterilizada.

En cuanto al aislado de la comunidad bacteriana también, se mantuvo, en los

medios de cultivo, los cuales fueron: ASN-III (Rippka, 1988) con y sin aporte de

nitrógeno y el medio Povasoli´s o ES (Provasoli, 1957) que difieren en la composición

de sales minerales pero ambos aportan los requerimientos necesarios de macro y

micronutrientes en agua de mar previamente filtrada y estéril (Torres-Ariño, 2001).

12

6.3. Condiciones de cultivo

Durante todas las condiciones experimentales, los cultivos se mantuvieron a

una temperatura de 24°C ± 1°C, con una iluminación de 150 µmolm-2s-1 en un ciclo

de luz:oscuridad 12:12 y con una salinidad de 34.

6.4. Aislamiento de la cianobacteria

Se realizaron diversas técnicas microbiológicas con la finalidad de obtener una

cepa lo más pura posible de la cianobacteria (microorganismo dominante de la

comunidad bacteriana asociada a G. catenatum). Para tal fin, se utilizó el

fototactismo, la migración vertical (Ramírez-Gama et al. 2006) y estria cruzada

(Olivas, 2004).

Para la técnica de fototactismo y migración vertical, se vertieron 25 mL de la

cepa G7 en probetas previamente cubiertas de aluminio, dejando la parte superior

descubierta. Los cultivos se revisaron diariamente para evaluar el tipo de respuesta

hacia la luz: positiva o negativa. Posteriormente, de la parte superficial de la probeta,

se tomó una alícuota de la muestra que fue sembrada en medio GSe con agar al 1%

en cajas Petri desarrollando el método de siembra de la estría cruzada en placa,

girando la caja al ir rayando hasta formar un pentágono para que al final las células

quedarán separadas unas de otras (Fig. 3).

Una vez obtenidas las colonias de cianobacterias, se resembraron cada tercer

día con un asa bacteriológica realizando el estriado correspondiente. Teniendo la

cepa pura de la cianobacteria, las colonias se trasfirieron nuevamente a medio GSe

líquido.

13

Figura 3. Técnicas microbiológicas para el aislamiento de la cianobacteria. A) Fototactismo y migración vertical. B) Estriado cruzado en cajas Petri con agar bacteriológico al 1% en medio GSe.

6.5. Curvas de crecimiento de la cianobacteria

6.5.1. Microscopio óptico

Se prepararon tres inóculos provenientes de la cepa pura de la cianobacteria,

con una concentración inicial de 9 000 cél/mL en 150 mL de medio GSe en matraces

de 250 mL. Se tomó un mililitro del cultivo cada segundo día hasta la fase de

decaimiento y fueron fijadas con 50 µL de lugol ácido al 1% (Throndsen, 1979). El

conteo celular se determinó por recuento en una cámara de Neubauer de 0.1 mm

bajo un microscopio óptico compuesto (LABOMED CXRII) y de acuerdo a la

siguiente formula:

cél/mL = C

SP · P · Fd

Dónde: C: Número de células observadas; SP: Superficie contada; P:

Profundidad; Fd: Factor de dilución.

14

6.5.2. Citometría de flujo

Para el conteo directo de la comunidad bacteriana y el análisis por citometría de

flujo, se prepararon tres inóculos del cultivo, teniendo una concentración inicial de 9

000 cél/mL en 150 mL de medio GSe en matraces de 250 mL. Se tomó 1 mL del

cultivo cada séptimo día hasta el día 70, las muestras se diluyeron en una proporción

1:2 con la solución salina amortiguada por fosfatos (PBS 1%). Se fijaron

inmediatamente con formol a una concentración final de 4% y fueron refrigeradas a

4°C en oscuridad hasta su análisis.

Adicionalmente, a cada muestra se le agregaron 10 µL de perlas (microesferas

de poliestireno de 10 µm de diámetro) para usarlas como referencia de tamaño.

El análisis de las muestras se realizó mediante un citómetro de flujo modelo

CyAn ADP BeckmanCoulter® equipado con tres láseres (405 nm, 488 nm y 633 nm).

Se contabilizaron 500, 000 eventos y el tiempo de análisis de cada muestra fue de 3

minutos en promedio. Los resultados se registraron en modo logarítmico,

obteniéndose los datos respectivos al tamaño relativo de cada célula (FSC) y de la

complejidad de la misma (SSC).

El principio de la citometría de flujo se basa en que las células suspendidas en

un líquido pasan individualmente al frente de una fuente de luz (láser) y los datos de

la luz reflejada (número total de eventos), son detectados y organizados en un

archivo (Castillo-Navarrete, 2005). Finalmente, la identificación de las diferentes

poblaciones se realizó con el software Infinicyt V1.8 que organiza la información en

citogramas, teniendo como variables: el tamaño relativo (FSC) de la partícula

determinado como la cantidad de luz trasmitida en un ángulo cónico pequeño (0-10°)

y la complejidad interna (SSC), que es la luz dispersada en ángulo recto y compara

la forma y estructura de las partículas con la de una esfera, indicando también la

estructura interna de las células (Gasol y del Giorgio, 2000).

15

6.5.3. Microscopía de epifluorescencia

Se utilizó el método descrito por Kepner y Pratt (1994) utilizando como

fluorocromo SYBR Gold, que tiene afinidad por los ácidos nucleicos y un microscopio

de fluorescencia marca Olympus, modelo BX60. Las muestras se observaron bajo

emisión de luz azul, con una longitud de onda entre 450 y 490 nm a 1 000 x de

magnificación, en un cuarto oscuro.

Se colectaron alícuotas de 1 mL del cultivo de la cianobacteria por 70 días, las

muestras se diluyeron en una proporción 1:2 con la Solución Salina Amortiguada por

Fosfatos (PBS 1%). Se fijaron inmediatamente con formol a una concentración final

de 4% y fueron refrigeradas a 4°C en oscuridad hasta su análisis. Posteriormente, se

realizó una segunda dilución 1:15 con TE 1% previamente filtrado a través de

membranas de 0.22 µm. Las muestras se filtraron en un sistema de filtración de 15

mL de capacidad a través de una membrana de policarbonato de 25 mm de diámetro

y 0.2 µm de tamaño de poro, previamente humedecida con 1 mL de agua destilada.

La filtración se llevó a cabo con una bomba de vacío.

Posteriormente, se colocaron las membranas ya secas en diversos

cubreobjetos, añadiéndoles 80 µL de SYBR Gold en la parte central y dejándolas

reposar durante 15 minutos en total oscuridad. Después se eliminó el exceso de

colorante, lavando las membranas con 4 mL de TE 1%.

Una vez que la membrana se secó, se colocó sobre un portaobjetos,

agregándole una gota de aceite de baja inmersión y se puso la membrana encima,

luego otra gota de aceite y posteriormente el cubreobjetos, presionando la parte

central para cubrir con aceite toda la membrana e ir eliminando las burbujas. Las

preparaciones fueron analizadas inmediatamente o almacenadas en oscuridad y a

4°C hasta su conteo.

La determinación de la densidad de la comunidad bacteriana se realizó

utilizando una retícula de 10 x 10 µm colocada en el ocular del microscopio y debido

a la presencia de tres organismos dominantes con diferente abundancia se utilizaron

16

tres métodos de conteo, todos con una precisión de ±10% a un 95% de intervalo de

confianza (Mecalco-Hernández, 2010).

Para células filamentosas y la cianobacteria (con forma cocoide), se contó el

número de organismos presentes en un total de 30 retículas por muestra, tal como lo

recomienda Kirchman (1993), sin embargo, para esta última, también se enumeraron

un mínimo de 200 células por muestra en campos elegidos aleatoriamente. Se

consideraron todas las células con morfología bien definida, así como todos los

individuos que quedaron en los bordes de la retícula, siempre y cuando más del 50%

de su estructura se encontrara dentro de la misma (Díaz-Hernández, 1997).

Finalmente, para las células con forma de bacilo se contaron 300 células por

muestra en campos elegidos al azar (Venrick, 1978) y siguiendo el método de conteo

antes descrito.

Para calcular la abundancia se utilizó la siguiente ecuación (Kepner y Pratt,

1994):

cél/mL = N ∙ At

D ∙ Vf ∙ G ∙ Ag

Dónde: N: número de células contadas; At: área efectiva de filtración; D: factor

de dilución; Vf: volumen filtrado; G: número de retículas contadas; Ag: área de la

retícula.

Esta técnica, nos permitió dar un seguimiento fotográfico de los principales

cambios en la abundancia de la comunidad bacteriana, a través de micrografías

tomadas con una cámara semi profesional (Cannon) a un aumento final de 1000 X,

Posteriormente y teniendo como referencia de tamaño, la reglilla del

microscopio a 1000 X, se analizaron las micrografías con el software ImageJ V1.49,

quien al promediar la distancia entre dos puntos, logra medir el tamaño celular

17

6.6. Curvas de crecimiento de G. catenatum

Para determinar las curvas de crecimiento del dinoflagelado, se prepararon

inóculos de cada una de las cepas de G. catenatum, iniciando con una concentración

de 500 cél/mL en 150 mL de medio GSe en matraces de 250 mL, por triplicado. Se

tomaron 2 mL de cultivo cada segundo día hasta la fase de decaimiento, y las

muestras se fijaron con lugol ácido al 1% (Throndsen, 1979). Los conteos se

realizaron en una cámara de Sedgwick-Rafter de 1 mL bajo un microscopio óptico

compuesto (LABOMED CXRII). Se registró el número y largo de las cadenas

celulares.

Para la obtención de las curvas de crecimiento, tanto de la comunidad

bacteriana como de G. catenatum, se calculó el promedio y la desviación estándar de

los conteos. Los promedios de cada conteo fueron graficados para obtener la curva

de crecimiento y determinar las fases de crecimiento de las cepas.

La tasa de crecimiento (K) se determinó para cada una de las cepas a partir de

la fase de crecimiento exponencial, utilizando la siguiente ecuación, de acuerdo a

Guillard (1973):

K = ((Ln(C2) – Ln(C1)) / t2-t1).

Donde C1 es el número de células por mililitro al tiempo uno y C2 es el número

de células por mililitro en el tiempo dos.

Se calculó el tiempo de generación (tg) a partir de la tasa de crecimiento

mediante la ecuación (Guillard, 1973):

tg = 0.301/K

18

6.7. Asociación G. catenatum-comunidad bacteriana

6.7.1. Exposición a filtrados celulares

Para evaluar el efecto de los exudados celulares de G. catenatum sobre la

comunidad bacteriana, se mantuvo al dinoflagelado en un cultivo de lote hasta que

alcanzó la fase exponencial tardía, retirando las células mediante una filtración a

través de membranas de fibra de vidrio de 25 mm GF/F. En matraces de 250 mL se

inocularon 50 mL de cultivo de la comunidad bacteriana, exponiendo a las células a

tres volúmenes diferentes (10, 15 y 20 mL) de los filtrados de medio de cultivo con

exudados celulares de G. catenatum por triplicado, teniendo como control, al cultivo

de la comunidad bacteriana sin extracto bajo las mismas condiciones. Se tomaron

muestras cada siete días para conteos celulares y observaciones.

6.7.2. Cultivos con contacto celular

Se escalaron los cinco cultivos de G. catenatum, inoculando cada cepa a una

densidad inicial de 500 cél/mL del dinoflagelado y con 9 000 cél/mL de la

cianobacteria, en un volumen de 150 mL de medio GSe en matraces de 250 mL por

triplicado.

Se tomó una alícuota de 2 mL de cada matraz, previo a una agitación suave, y

se realizaron conteos cada dos días para G. catenatum, fijando las células con una

solución de lugol ácido al 1% (Throndsen, 1979), utilizando una cámara de

Sedgwick-Rafter de 1 mL y registrando la longitud de las cadenas celulares. La

comunidad bacteriana se contabilizó cada cuatro días, obteniendo alícuotas de 500

µL diluidos en una proporción 1:2 con la solución salina amortiguada por fosfatos

(PBS 1%). Se fijaron con formol a una concentración final de 4% y se mantuvieron a

4°C en oscuridad, para su posterior montaje y análisis por microscopia de

epifluorescencia.

19

6.8. Observaciones morfológicas de las cepas de G. catenatum

Las cepas del dinoflagelado inoculadas con la comunidad bacteriana

presentaron la formación de quistes, células deformadas, lisadas o con pérdida de

movilidad. Dichas observaciones, así como el seguimiento de la interacción de todos

los experimentos se realizó en un microscopio óptico Zeiss Axioscop, tomando

microfotografías con una cámara ScopePhoto (3.0v) a diferentes aumentos.

6.9. Determinación de pigmentos

Para la obtención del perfil de pigmentos de la cianobacteria y de G. catenatum

en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana, los cultivos se agitaron

suavemente antes de tomar la muestra de agua procedente del cultivo. Se filtraron

40 y 25 mL, respectivamente, a través de una membrana de fibra de vidrio de 25 mm

GF/F, se mantuvieron en tubos eppendorf cubiertos de aluminio y se congelaron

inmediatamente a 4°C hasta su análisis en el Laboratorio de Microalgas Nocivas del

Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste (CIBNOR).

Para los cultivos del dinoflagelado en presencia/ausencia de la comunidad

bacteriana, se tomó una alícuota de 2 mL que se preservó con una solución de lugol

ácido al 1% (Throndsen, 1979) para conteos celulares, los cuales se realizaron como

como se describió anteriormente.

El material retenido en cada filtro se utilizó para identificar y cuantificar los

pigmentos fotosintéticos por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), en un

equipo Agilent HP 1100; extrayendo con pinzas cada filtro y colocándolos dentro de

tubos de plástico de 25 mL, donde fueron macerados con una varilla de vidrio para

posteriormente agregarles 1 mL de acetona y dividir el volumen final a la mitad,

colocando 0.5 mL en dos eppendorf (previamente cubiertos de aluminio).

Posteriormente, los eppendorf se colocaron en una centrifuga (Heraeus Biofuge

Fresco) a 3,000 rpm, con una temperatura de 5°C durante 20 minutos. Al finalizar, el

20

sobrenadante se recuperó y se colocó en viales ámbar, específicos para HPLC,

donde se inyectaron 100 µL al sistema, utilizándose dos longitudes de onda distintas:

440 nm y 667 nm (Vidussi et al. 1996).

La cuantificación de los principales pigmentos se basó en el valor del factor de

respuesta de cada pigmento (concentración de pigmento/absorbancia) de acuerdo a

Vidussi y colaboradores (1996) y Montoura y Repeta (1997), considerándose el

tiempo de retención y las características espectrales con estándares comerciales

certificados (Agencia Internacional para determinaciones de 14C, Dinamarca).

6.10. Determinación del perfil de toxinas paralizantes

La extracción de toxinas se realizó durante la fase exponencial tardía de los

cultivos de G. catenatum en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana,

agitando suavemente los matraces antes de tomar la muestra de 50 mL del cultivo

para posteriormente filtrarlos a través de filtros de 25 mm GF/F. A cada filtro,

contenido en un eppendorf individual, se le adicionaron 1.5 mL de ácido acético

(0.03N), sonicando (35 kHz) tres veces por cinco minutos cada muestra en intervalos

de 60 segundos.

El sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa desechable (0.45µm de tamaño

de poro). Se tomó una alícuota de 300 µL del extracto clarificado, que se utilizó para

la hidrólisis con HCl (1M) para transformar a toxinas decarbamatadas (tipo B y C) a

sus análogos. Finalmente, 10 µL de ambos extractos (con y sin hidrólisis) se

inyectaron en el sistema HPLC (HP 1100) (Hummert et al. 1997; Yu et al. 1998).

La cromatografía se llevó a cabo como lo sugerido por Hummert y

colaboradores en 1997 y Yu y colaboradores en 1998, utilizando un gradiente

amortiguado de pares de iones (ion-pair-buffer), compuesto de una solución de ácido

octanosulfónico y fosfato de amonio a un pH de 6.9 y acetonitrilo, para separar las

toxinas paralizantes.

21

Después de una oxidación postcolumna con ácido periódico alcalino, los

productos resultantes se detectaron con un detector de fluorescencia (HP 1116) a

una longitud de onda de 330 nm (excitación) y de 395 nm (emisión).

La identificación de toxinas se llevó a cabo comparando cromatogramas de las

muestras con los de sus respectivos estándares (National Research Council,

Canadá) y la cuantificación se realizó comparando las áreas de los picos de

extractos de estándares con el correspondiente factor de respuesta.

6.11. Análisis estadísticos

Las diferencias en la biomasa máxima de las cepas de G. catenatum, así

como de la cianobacteria en los cuatro medios de cultivo se determinaron con

análisis de varianza unifactorial, probando la normalidad de los datos con la prueba

de Kolmogorov-Smirnof y la homoscedasticidad con la prueba de Levene (Zar, 1999).

Si los datos no fueron normales se realizó estadística no paramétrica (prueba de

Kruskal Wallis) (Zar, 1999).

Las diferencias en la longitud de cadenas celulares, así como en el perfil de

toxinas se evaluaron con la prueba estadística X2 , mientras que las diferencias en el

perfil de pigmentos se evaluaron con la prueba t de student (Zar, 1999).

Cuando se encontraron diferencias significativas, se realizaron pruebas a

posteriori de comparación de medias de Tukey (Day y Quinn, 1989) para grupos

homogéneos.

Los análisis se realizaron utilizando el software Statistica v7.0 (StatSoft, Inc.)

con un nivel de significancia de 0.05.

22

VII. RESULTADOS


Se logró el aislamiento de la cianobacteria mediante las técnicas de

fototactismo y migración vertical ya que de esta manera se eliminó una mayor

cantidad de bacterias heterótrofas asociadas, mientras que el sembrado en placa

resultó efectivo en la limpieza de las cianobacterias, al aislar únicamente las colonias

verdes, con borde circular y aquellas más alejadas a colonias rosadas,

características de bacterias heterótrofas.

A pesar de no registarse diferencias significativas entre la abundancia y el

medio de cultivo, observamos que el medio ASN-III con adición de nitrógeno registró

la mayor abundancia celular (122,222 ± 4,714 cél/mL), seguido del medio GSe. Los

medios ASN-III sin fuentes nitrogenadas y ES tuvieron una abundancia

considerablemente menor, obteniendo, en general, patrones de comportamiento

similares a partir del noveno día en la mayoría de las curvas de crecimiento, no

obstante, únicamente se registraron diferencias significativas en las abundancias

máximas de los medios ASN-III con N2 y ES (H(3, N=12) = 8.4358; p<0.05).

La fase de crecimiento exponencial inició el tercer día en los medios ASN-III con

y sin aporte de N2 y ES, mientras que para GSe dicha fase comenzó hasta el día

nueve. La máxima densidad celular se obtuvo durante la fase exponencial tardía, en

los días 15 (±4.76), 18 (±5.62) y 9 (±3.02) para los medios ASN-III con N2, ASN-III sin

N2 y GSe y finalmente el medio ES, respectivamente (Fig. 4).

23

Figura 4. Curvas de crecimiento de la cianobacteria en cuatro medios de cultivo. Triángulos: ASN-III con N2. Rombos: ASN-III sin N2. Cuadros: ES. Círculos: GSe.

La tasa de crecimiento varió entre 0.05 (±0.002) y 0.108 (±0.01) div/día, con

diferencias significativas (H(3, N=12) = 10.3846; p<0.05) únicamente para GSe y ASN-III

con nitrógeno (Tabla II).

Considerando las densidades máximas y tasas de crecimiento alcanzadas por

la cianobacteria en cada uno de ellos, se eligió al medio GSe como el medio óptimo

para completar el aislamiento e inducir a un mejor crecimiento. Además se determinó

que la cianobacteria es capaz de fijar nitrógeno, al presentar un mayor crecimiento

en medios enriquecidos con N2.

El uso y comparación de medios de cultivo diferentes, nos permitió detectar la

presencia de dos microorganismos dominantes en la cepa de la cianobacteria, los

cuales fueron bacterias heterótrofas con forma filamentosa y de bacilo, quienes a

pesar de tener un ciclo de vida corto, compiten con la cianobacteria.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 3 6 9 12 15 18 21 24

cél/m

L

Día

con N2 sin N2 ES GSe

24

Tabla II. Datos de crecimiento de la cianobacteria en cuatro medios de cultivo. *diferencias significativas (p<0.05).

Medio de cultivo

Inicio de la fase exponencial

(días)

Fin de la fase exponencial

(días)

Tasa de crecimiento

(div/día)

Abundancia máxima (cél/mL)

Tiempo en alcanzar la biomasa máxima

(días)

ASN-III

con N2 3 15 ± 1.29 0.04 ± 0.001* 122,222 ± 4 714 15 ± 4.76

sin N2 6 24 ± 3.02 0.05 ± 0.002 97,777 ± 6 285 18 ± 5.62

ES 3 21 ± 2.92 0.09 ± 0.001 55,000 ± 17 284 9 ± 3.02

Gse 9 24 ± 3.02 0.10 ± 0.01* 107,592 ± 17 638 18 ± 5.62

7.2. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana

El crecimiento de la cianobacteria en medio GSe se evaluó con tres métodos: 1)

microscopía óptica, 2) citometría de flujo y 3) microscopía de epifluorescencia; cuya

precisión, duración y grado de sesgo son diferentes.

7.2.1. Microscopía óptica

En la figura 5 mediante conteo por microscopía óptica, se observan cuatro fases

de crecimiento del cultivo de la cianobacteria. La fase de aclimatación dura 4 días, al

quinto día comienza la fase de crecimiento exponencial, que concluye el día 10

obteniéndose una densidad máxima de 109,630 cél/mL. La fase estacionaria dura

dos días, del día 10 al 12 y después el cultivo decae rápidamente.

La tasa de crecimiento en la fase exponencial fue de 0.10 (±0.01) div·día-1, con

un tiempo de generación de 2.76 (±0.02) días.

Se debe resaltar que con esta técnica se visualizó, por primera vez, a un

microorganismo diferente de la cianobacteria y fueron los bacilos, que en conjunto,

rodeaban a las células de G. catenatum formando “parches” tanto en células

individuales como en cadenas (Fig. 6 A, B).

25

Figura 5. Curva de crecimiento de la cianobacteria en medio GSe a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. Líneas verticales: desviación estándar.

Figura 6. Ubicación de los bacilos (flechas) en: A) células individuales y B) en cadenas celulares. Se observa cómo van rodeando al dinoflagelado hasta formar parches a su alrededor conforme el cultivo avanza con el tiempo.

7.2.2. Citometría de flujo

El uso de esta técnica únicamente nos permitió discernir entre poblaciones de

organismos autótrofos y heterótrofos, así como tener una aproximación del tamaño

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

cél/m

L

Día

26

celular de los microorganismos debido al uso de microesferas de poliestireno. Sin

embargo, no fue posible llevar a cabo un conteo celular debido al ruido electrónico

(interferencia eléctrica) del equipo y el tamaño de las microesferas (10 µm de

diámetro) que triplicaba en tamaño a los integrantes de la comunidad bacteriana.

A pesar de los inconvenientes en el método de análisis, el uso de la

autoflorescencia de la cianobacteria nos permitió localizar su población dentro de la

comunidad bacteriana. Utilizando la florescencia de la ficoeritrina y el tamaño celular,

la cianobacteria se encontró en la esquina inferior izquierda, indicando que presenta

poca florescencia y que su tamaño es muchísimo más pequeño que el de las

microesferas, localizadas en la parte superior derecha (Fig. 7). Al graficar la

florescencia roja y la complejidad de la partícula, la población de la cianobacteria se

recorrió horizontalmente hacia el eje de las ordenadas y nuevamente quedó en la

parte inferior, por lo que su autoflorescencia es baja y se comprueba que es una

partícula poco compleja, con forma semejante a una esfera (Fig. 8).

Al analizar la complejidad de la partícula y su tamaño, se logró diferenciar tres

poblaciones diferentes (primer indicio de que la comunidad bacteriana estaba

integrada por tres y no dos microorganismos). La primer población se caracterizó por

tener un tamaño pequeño y ser poco compleja, integrando a la cianobacteria; la

población de mayor tamaño que la cianobacteria y más compleja, integró a los

bacilos y la tercera, más grande y compleja que las anteriores agrupó a las bacterias

heterótrofas filamentosas (Fig. 9).

27

Figura 7. Citograma de la determinación del tamaño celular de la cianobacteria a través de citometría de flujo. Eje horizontal: tamaño de la partícula (FSC). Eje vertical: fluorescencia de la ficoeritrina.

Figura 8. Citograma de la determinación de la complejidad celular de la cianobacteria a través de citometría de flujo. Eje horizontal: complejidad de la partícula (SCC). Eje vertical: fluorescencia de la ficoeritrina.

28

Figura 9. Citograma de identificación de las tres poblaciones de microorganismos pertenecientes a la comunidad bacteriana asociada a la cepa G7 de G. catenatum mediante citometría de flujo. Eje horizontal: tamaño de la partícula (FSC). Eje vertical: complejidad de la partícula (SCC).

7.2.3. Microscopía de epifluorescencia

El conteo y la obtención de la curva de crecimiento de la cianobacteria, así

como de las bacterias heterótrofas filamentosas y bacilos se realizaron mediante

microscopía de epifluorescencia, observándose una mejor delimitación de las fases

de crecimiento.

Para la cianobacteria (línea continua con círculos), la fase de aclimatación tuvo

una duración de 21 días, a partir del día 22 al 63 se observa un crecimiento

exponencial, y posterior a este día, el cultivo decae. La máxima abundancia celular

fue de 75,527 ± 2,516 cél/mL. Inmediatamente, después de la fase exponencial

tardía, comenzó la fase de declive (Fig. 10).

29

La tasa de crecimiento fue de 0.038 (±0.024) div/día y el tiempo de generación

de 7.72 (±0.327) días.

La línea discontinua con cuadros, representa a las bacterias heterótrofas

filamentosas, que tuvieron un crecimiento similar al de la cianobacteria, registrándose

la fase de aclimatación del día cero al día 21, con un crecimiento exponencial hasta

el día 63, día en el que se registró la mayor abundancia (34,963 ± 898 cél/mL). No se

observó una fase estacionaria (Fig. 10). La tasa de crecimiento fue de 0.036 (±0.021)

div/día, mientras que el tiempo de generación fue de 8.26 (±0.541) días.

En el caso de los bacilos, (línea discontinua con triángulos) estos presentaron

una curva de crecimiento peculiar, iniciando con una fase de aclimatación muy corta

e inapreciable. Observamos que del día 14 al 21 se registra la primera fase

exponencial alcanzando una abundancia aproximada de 14,444 (±5,132 cél/mL)

seguida de una fase estacionaria con duración de siete días, para finalmente

presentarse un declive pronunciado, que representa, en el día 35, el comienzo de la

segunda fase exponencial que alberga la mayor densidad obtenida durante el día 49

(214,815 ± 12,830 cél/mL). A partir del día 50 y hasta el día 63 observamos la fase

de declive pero también se aprecia el inicio de una tercera fase exponencial que no

tuvo seguimiento por la muerte celular de los dos microorganismos restantes,

además que el tiempo de muestreo ya era bastante (Fig. 10).

La tasa de crecimiento de los bacilos, se obtuvo del día 14 al día 49 y fue de

0.0303 (±0.028) div/día, con un tiempo de generación de 9.903 (±0.86) días.

En cuanto a los patrones de cambio reflejados en las micrografías, podemos

observar que el día de siembra (día cero) tuvo una abundancia baja para los tres

microorganismos: cianobacterias, bacterias heterótrofas filamentosas y bacilos, la

cual incrementó con el tiempo, siendo los bacilos quienes lograron no solo obtener la

mayor abundancia celular sino también mantenerla por periodos más prolongados de

tiempo.

30

Durante la segunda semana de muestreo, se observa una fuerte dominancia de

bacilos, mientras que la abundancia de bacterias filamentosas y cianobacterias es

baja. Patrón que se fue invirtiendo durante los siguientes días. A finales del primer

mes ya se observaba un incremento celular a favor de la cianobacteria, el cual se

mantuvo, hasta observarse pequeños conglomerados que generalmente se

encontraban rodeadas de bacilos, contrario a las células filamentosas cuyo

comportamiento era solitario. No obstante, en los últimos días, cuando la abundancia

de las cianobacterias comenzó a disminuir, las bacterias filamentosas aumentaron su

población de tal forma que se les veía como redes enmarañadas al igual que a los

bacilos. Ambas bacterias (filamentosas y bacilos) se caracterizaron por tener ciclos

de crecimiento rápido y por formar patrones de agregación masivos, contrario a la

cianobacteria quien presentó un ciclo de crecimiento lento y con abundancias

relativamente baja (Fig. 11). Haciendo referencia al tamaño celular, del más grande

al menor, encontramos a las bacterias heterótrofas filamentosas, bacilos y

cianobacterias, con 5-10 µm; 4-5 µm y 2-3 µm, respectivamente (Fig. 12).

Figura 10. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana asociada a la cepa G7 Colima de G. catenatum en medio GSe a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. Círculos: cianobacteria. Cuadros: bacterias heterótrofas filamentosas. Triángulos: bacilos. Líneas verticales: desviación estándar. Eje vertical derecho: bacilos; eje vertical izquierdo: cianobacteria y filamentos.

0

50000

100000

150000

200000

250000

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70

cél/m

L

cél/m

L

Día

Cianobacteria Filamentos Bacilos

31

Figura 11. Patrones de cambio en la abundancia celular de los microorganismos pertenecientes a la comunidad bacteriana asociada a la cepa G7 de Gymnodinium catenatum con microscopía de epifluorescencia y a 1000 x.

32

Figura 12. Micrografía del tamaño celular de los tres micoorganismos de la comunidad bacteriana asociada a la cepa G7 de Gymnodinium catenatum, con microscopía de epifluorescencia y a 1000 x. Izquierda: bacilos. Centro: cianobacteria. Derecha: bacterias heterótrofas filamentosas.

El análisis mediante microscopía de epifluorescencia también nos permitió

detectar bacterias intracelulares en células de G. catenatum. Las bacterias

intracelulares (flechas en la figura 13) se visualizaron como pequeños puntos

fluorescentes.

Figura 13. Bacterias intracelulares en Gymnodinium catenatum con microscopía de epifluorescencia.

33


Todas las cepas presentaron la típica curva de crecimiento para esta especie,

con una fase de aclimatación corta, seguida de una fase exponencial, contrario a la

fase estacionaria que fue corta o nula debido a que la fase de declive se presentó

rápidamente después de alcanzar la abundancia máxima (Fig. 14).

La cepa G7 fue la que tuvo menor crecimiento, alcanzando la etapa de declive

en menor tiempo que el resto de las cepas, con una biomasa máxima de 1,146 ± 4

cél/mL en el día 14. Contrario a GCCV-7, que mostró la mayor biomasa celular, con

un máximo de 6463 ± 24 cél/mL en el doceavo día, seguido por la cepa michoacana

62L. Las cepas restantes presentaron biomasas máximas intermedias, las cuales se

encontraron entre 2,840 ± 38 y 1,625 ± 4 cél/mL. El inicio de la fase exponencial en

todas las cepas inició el día 2 y finalizó entre los días 10 (±3.02) y 18 (± 4.63), en

cuanto a la biomasa máxima, ésta se alcanzó entre los días 12 (±2.93) y 20 (±1.75)

(Tabla III).

En cuanto a las abundancias máximas, existieron diferencias significativas entre

las cepas GCMV-7, G7 New y G7 (F(4,15)=93292; p<0.05), observándose únicamente

dos grupos con características similares. Mientras que las tasas de crecimiento

variaron entre 0.215 (±0.02) y 0.0924 (±0.002) div/día. Los análisis estadísticos

mostraron diferencias significativas (p<0.05) para tres de las cinco cepas: G7,

GCCV-7 y 62L (H(4, N=20) = 17.15897) (Tabla III).

El tiempo de generación entre cepas varió entre 1.4 (±0.02) y 7 (±0.40) días,

encontrándose diferencias significativas (H(4, N=20) = 17.63979; p<0.05) en GCCV-7,

G7 y 62L, delimitándose dos grupos con características similares entre sí (Tabla III).

34

Tabla III. Datos promedio del crecimiento de las cinco cepas de G. catenatum en medio GSe. *representa

diferencias significativas (p<0.05).

Cepa Inicio de la

fase exponencial

Fin de fase exponencial

(días)

Tasa de crecimiento

(div/día)


Tiempo en alcanzar la biomasa

máxima (días)

Tiempo de generación

(días)

GCCV-7 2 10.2 ± 3.02 0.22 ± 0.02* 6463 ± 24 12.0 ± 2.93

1.4 ± 0.12*

GCMV-7 2 18.7 ± 4.63 0.07 ± 0.01 2840 ± 38* 20.7 ± 1.75

3.8 ± 0.13

G7 New 2 14.2 ± 3.47 0.09 ± 0.002 1625 ± 4* 16.4 ± 1.74 3.2 ± 0.63

G7 2 12.0 ± 2.93 0.04 ± 0.002* 1146 ± 4* 14.2 ± 3.47 7 ± 0.40*

62L 2 14.2 ± 3.47 0.14 ± 0.02* 6444 ± 4 16.4 ± 1.74 2.1 ± 0.01*

Figura 14. Curvas de crecimiento de las cinco cepas de Gymnodinium catenatum en medio GSe a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. Asteríscos: GCMV-7. Triángulos: G7 New. Cuadros: G7. Cruces: GCCV-7. Círculos: 62L. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales:

desviación estándar. Eje vertical derecho: GCCV-7 y 62 L; eje vertical izquierdo: GCMV-7, G7 New y G7.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

cél/m

L

Días

GCMV-7 G7 New G7 GCCV-7 62 L* * *

35

7.4. Formación de cadenas celulares

Durante el seguimiento de la curva de crecimiento de cada cepa, se observó el

patrón de las cadenas celulares, que en general mostró una mayor proporción de

células individuales (33.4 ± 8.6%), seguido por cadenas de 4-6 células (26 ± 4.7%),

de 2-3 células (25.8 ± 7.3%) y una menor producción de cadenas de 7 células y

mayores (15 ± 11.8%). Sin embargo, las excepciones fueron la cepa G7 New que

presentó un dominio de cadenas celulares largas, igual y/o mayores a 7 células (36.2

± 17.1%) y la cepa GCMV-7 con una mayor producción de cadenas de 2-3 células

(37.2 ± 15.7%) (Tabla IV).

Tabla IV. Porcentaje promedio de cadenas celulares y día de cultivo con mayor proporción de cadenas de 7 células y mayores en Gymnodinium catenatum. Los números resaltados en negritas, representan los mayores valores en cada categoría.

%

Cepa Células

individuales Cadenas 2-3 Cadenas 4-6 Cadenas ≥7

Día con la mayor proporción de cadenas ≥7 (% / día / fase)

GCMV-7 33 ± 11 37 ± 16 19 ± 11 11 ± 9 26% / 12 / exponencial tardía

G7 New 19 ± 12 18 ± 7 27 ± 6 36 ± 17 67% / 0 / siembra

G7 38 ± 15 27 ± 8 24 ± 13 11 ± 7 26% / 18 / declive

GCCV-7 41 ± 18 21 ± 12 31 ± 16 8 ± 5 15% / 2 / aclimatación

62L 36 ± 11 26 ± 13 29 ± 10 9 ± 5 15% / 4 / exponencial

La cepa GCMV-7, durante la fase de aclimatación mostró una mayor proporción

de células individuales (40.75 ± 12.19%), a partir del día 8 y hasta el declive la

presencia de cadenas celulares más largas fue prevaleciendo, obteniendo una mayor

producción de cadenas de 2-3 células (37.2 ± 15.7%), seguido de cadenas de 4-6

células. Mientras que la producción de cadenas con longitud igual y/o mayor a 7

células fue menor (11.5 ± 9) a pesar de haberse registrado un promedio de 26% de

cadenas con esta longitud durante el día 12, correspondiente al día con mayor

densidad celular (Fig. 15).

36

Figura 15. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de la cepa GCMV-7 de Gymnodinium catenatum en medio GSe. Rayas: células individuales. Gris: cadenas de 2-3 células. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de 7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento.

La cepa G7 New, a diferencia del resto, registró un dominio de cadenas de 7

células y mayores (36.2 ± 17.1%) en todo el ciclo de crecimiento, siendo más notorio

en la fase de aclimatación (67%) y hasta el día 6 (fase exponencial). En cuanto a las

células individuales, estas presentaron una baja producción (19.2 ± 11.6%), seguidas

de las cadenas de 2-3 células (17.6 ± 6.7%); mientras que las cadenas de 4-6 células

comenzaron a observarse más durante la fase exponencial- tardía (27 ± 5.8%) (Fig.

16).

0

1000

2000

3000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

% d

e c

adena

s c

elu

lare

s

Día

37

Figura 16. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de la cepa G7 New de Gymnodinium catenatum en medio GSe. Rayas: células individuales. Gris: cadenas de 2-3 células. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de 7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento.

Caso totalmente inverso al descrito anteriormente es el de la cepa G7, que

presentó oscilaciones en la formación de cadenas celulares, iniciando con un

dominio de células individuales (día de siembra), seguido de una mayor producción

de cadenas de 4-6 células (inicio de la fase exponencial). Posteriormente se observa

una alternancia entre células individuales, cadenas de 2-3 células y de 4-6 células.

En promedio, las células individuales fueron las dominantes (38.1 ± 14.6%), seguidas

por las cadenas de 2-3 células (25.5 ± 7.7%), de 4-6 células (24 ± 13.4%) y

finalmente, las menos representativas, las de 7 células y mayores (11.4 ± 7.5%) que

comenzaban a presentarse en mayor cantidad durante el declive (26%) (Fig. 17).

0

500

1000

1500

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

cél/m

L

% c

adenas c

elu

lare

s

Día

38

Figura 17. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de la cepa G7 de Gymnodinium catenatum en medio GSe. Rayas: células individuales. Gris: cadenas de 2-3 células. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de 7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento.

Otra cepa que mostró un dominio de células individuales a lo largo de todo el

ciclo de crecimiento, fue GCCV-7, con la diferencia que durante la fase de

aclimatación, las cadenas de 4-6 células fueron las dominantes (30.8 ± 16.3%). A

partir del día 6 (fase exponencial) y hasta el día 10 hubo una mayor producción de

células individuales, seguido de una mayor abundancia de cadenas de 2-3 células

(20.8 ± 12.3%). Sin embargo, el declive se caracterizó por presentar, nuevamente

una mayor cantidad de células individuales, que en promedio representaron un 40%.

En cuanto a las cadenas celulares de 7 células y mayores, su presencia fue baja (7.7

± 4.6%) (Fig. 18).

0

400

800

1200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

cél/m

L

% c

adena

s c

elu

lare

s

Día

39

Figura 18. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de la cepa GCCV-7 de Gymnodinium catenatum en medio GSe. Rayas: células individuales. Gris: cadenas de 2-3 células. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de 7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento.

Finalmente, la cepa 62L fue la que presentó mayor homogeneidad en la

proporción de cadenas celulares durante todo el ciclo de crecimiento, obteniendo

producciones promedio bastante semejantes en células individuales (35.5 ± 10.5%),

cadenas de 2-3 células (26.4 ± 12.7%), de 4-6 células (29.5 ± 10.5%). Sin embargo,

a pesar del bajo porcentaje de cadenas de 7 células y mayores (8.6 ± 4.5%), su

mayor presencia se dio durante la fase exponencial (15%), siendo el día 18 el único

con ausencia de las mismas (Fig. 19).

0

1500

3000

4500

6000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

cél/m

L

% c

adenas c

elu

lare

s

Día

40

Figura 19. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de la cepa 62L de Gymnodinium catenatum en medio GSe. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de 7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento.



En la figura 20 observamos que las curvas de crecimiento de los tratamientos y

el control tuvieron un comportamiento bastante similar, debido a que no se

encontraron diferencias significativas (H(3, N=16) = 4.966814; p<0.05) en la abundancia

celular. No obstante, el control fue el que presentó una mayor abundancia celular

(136,296 ± 34,735 cél/mL), seguido del tratamiento con 20, 15 y 10 mL de extracto.

La fase exponencial en todos los cultivos inició el día siete, mientras que la

biomasa máxima se obtuvo entre los 14 (±3.47) y 20 (±1.75) días. Las tasas de

crecimiento variaron de 0.0400 (± 0.01) a 0.0065 (± 0.0021) div/día, registrando

diferencias significativas (H(3, N=16) = 14.15929; p<0.05) únicamente para el control y

el tratamiento con 15 mL de extracto celular.

0

1500

3000

4500

6000

7500

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

% cadenas c

elu

lare

s

Día

41

Figura 20. Curvas de crecimiento de los cultivos de la comunidad bacteriana con extracto celular de Gymnodinium catenatum en medio Gse a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. Círculos: control. Cuadros: tratamiento con 10 mL de extracto celular. Triángulos: tratamiento con 15 mL de extracto celular. Rombos: tratamiento con 20 mL de extracto celular. Líneas verticales: desviación estándar.

Tabla V. Datos promedio del crecimiento de la comunidad bacteriana con extracto celular de Gymnodinium catenatum en medio GSe. *representa diferencias significativas (p<0.05).

75000

85000

95000

105000

115000

125000

135000

145000

0 7 14 21 28 35

cél/m

L

Día

Control 10 mL 15 mL 20 mL

Cultivo con extracto

celular

Inicio de fase exponencial

(día)


(días)

Tasa de crecimiento

(div/día)



(días)

Control 7 21± 9.03 0.04 ± 0.01* 136 296 ± 34 735 14.2 ± 3.47

10 mL 7 28± 11.06 0.007 ± 0.002 106 296 ± 9 449 20.3 ± 1.75

15 mL 7 28± 11.06 0.006 ± 0.002* 117 777 ± 5 879 20.3 ± 1.75

20 mL 7 28± 11.06 0.0164 ± 0.02 126 296 ± 21 150 14.2 ± 3.47

42


Las cepas inoculadas con la comunidad bacteriana presentaron curvas de

crecimiento diferentes entre sí, caracterizadas por una fase de aclimatación corta,

excepto para la cepa GCCV-7 que tardó el doble de tiempo (4 ± 1.58 días) en

presentar la fase de crecimiento exponencial donde todas las cepas alcanzaron su

respectiva biomasa máxima. Finalmente, la fase de decaimiento se presentó rápida y

abruptamente, justo después de la fase exponencial tardía (Fig. 21).

La duración de las curvas fue variable, teniendo un mínimo de 8 (±1.47) y un

máximo de 26 (± 1.47) días, lapso en el que se alcanzaron las biomasas máximas

correspondientes, siendo la cepa GCCV-7 la de mayor densidad celular (6,932 ± 26

cél/mL), seguida de GCMV-7 con 6,334 (±25) cél/mL, G7 con 1146 (±4) cél/mL y

finalmente la cepa michoacana, 62L, con 425 (±11) cél/mL. A pesar de las

diferencias de biomasa en las cepas, el tiempo en alcanzarlas fue más homogéneo,

pues dos de las cuatro cepas obtuvieron su biomasa máxima el día 14 (±3.47)

mientras que GCCV-7 la obtuvo el día 22 (±2.93).

En cuanto a la cepa 62L, no presentó un crecimiento con respecto al tiempo

sino que decreció, registrando su biomasa máxima celular el día cuatro, por lo que

las tasas de crecimiento, quedaron comprendidas entre 0.043 (±0.002) y 0.248

(±0.01) div/día (Tabla VI).

43

Figura 21. Curvas de crecimiento de las cuatro cepas de Gymnodinium catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana en medio GSe, a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. Líneas verticales: desviación estándar.

Tabla VI. Datos promedio del crecimiento de las cepas de Gymnodinium catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana en medio GSe.

Cepa Inicio de la

fase exponencial


(días)

Tasa de crecimiento

(div/día)



(días)

GCCV-7 + CB 4 24 ± 1.47 0.109 ± 0.018 6932 ± 26 22.4 ± 2.93

GCMV-7 + CB 2 16 ± 2.63 0.164 ± 0.01 6334 ± 25 14.2 ± 3.47

G7 + CB 2 16 ± 2.63 0.043 ± 0.002 1146 ± 4 14.2 ± 3.47

62L + CB 2 6 ± 1.47 0.248 ± 0.02 628 ± 316 4.1 ± 1.23

7.6. Curvas de crecimiento

En la cepa GCCV-7, caracterizada por sus mayores abundancias, observamos

que la presencia de la comunidad bacteriana prolongó un par de días más el

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

cél/m

L

Día

GCCV-7 + CB GCMV-7 + CB G7 + CB 62L + CB

44

crecimiento (2.1 ± 0.9 días), aumentando significativamente la abundancia máxima

alcanzada ( de 6,463 a 6,932 ± 26 cél/mL), no obstante, cabe resaltar que tal

densidad celular se obtuvo en un tiempo mayor (10 ± 2.13 días) además de

presentarse cortas fases estacionarias, caracterizadas por 1) la presencia de quistes

temporales en aproximadamente un 15 % del total de las células mientras que

durante la fase de aclimatación este porcentaje era del 90 % y 2) cambios

estructurales en las células del dinoflagelado: desarreglo del cíngulo y sulcus,

pérdida de flagelos, cambios en los patrones del nado, núcleo prominente con

cromosomas evidentes y lisis celular. Aspecto que prevaleció en ambas curvas fue la

rápida fase de declive, precedida por la fase exponencial tardía (Fig. 22 A).

En el caso de la cepa GCMV-7, la presencia de la comunidad bacteriana le

favoreció significativamente, al obtener una abundancia máxima de casi el doble de

células (de 2,840 a 6,334 ± 25 cél/mL) en un menor tiempo (6 ± 1.47 días),

presentándose una fase de crecimiento exponencial muy marcada al igual que la de

declive. Observamos que la fase de aclimatación en ambos casos fue corta, sin

embargo, nuevamente la presencia de quistes temporales predominó en esta fase

con un 86 %, porcentaje que fue disminuyendo con el paso del tiempo, hasta el día

10 donde ya sólo se observaba que el 2 % del total de células se encontraban en

este estadio de quietud, lo cual coincidió con el inicio de la fase exponencial. Cabe

destacar que esta cepa también presentó deformaciones celulares como: pérdida de

flagelos, lisis de la membrana celular, presencia de una membrana hialina y núcleo

con cromosomas evidentes (Fig. 22 B).

Para la cepa G7, contrario a las dos cepas anteriores, la presencia de la

comunidad bacteriana no favoreció su crecimiento, al registrarse una mayor biomasa

en ausencia de la misma (1,625 ± 4 cél/mL). En cuanto a la fase de aclimatación, en

ambos casos fue de 2 días y no se presenciaron quistes temporales ni cambios

morfológicos en las células. La curva de crecimiento perteneciente al monocultivo de

G. catenatum presentó un ligero crecimiento exponencial en el día dos, seguido por

una corta fase estacionaria que dio lugar a la fase exponencial, contrario al cultivo

45

inoculado con la comunidad bacteriana que presentó un incremento gradual con

respecto al tiempo. Para los dos cultivos, la fase de declive fue rápida, posterior a la

obtención de la máxima biomasa celular (Fig. 22 C).

Al igual que la cepa G7, en 62 L no se vio favorecido su crecimiento en presencia de

la comunidad bacteriana. Todo lo contrario, pues a pesar de haber obtenido su

máxima biomasa al cuarto día, ésta no fue ni el 10 % del total que obtuvo en

ausencia de la misma (628 ± 316 cél/mL). La duración de ambas curvas es

significativamente diferente (16.4 ± 1.74 días; p<0.05), siendo mayor para el

monocultivo del dinoflagelado donde se observa un incremento gradual en la

abundancia celular mientras que el tratamiento mostró un descenso desde el inicio

del experimento. Cabe resaltar que este experimento se realizó en dos ocasiones,

obteniendo el mismo resultado: un descenso abrupto en la densidad celular de G.

catenatum reflejado en 1) altos porcentajes de quistes temporales (95 %) desde el

día de siembra (día cero); 2) deformaciones en la células, como: pérdida de flagelos,

desarreglo de cíngulo y sulcus, desprendimiento de una membrana hialina, núcleo

prominente con cromosomas visibles, o bien, 3) lisis celular (Fig. 22 D).

46

Figura 22. Curvas de crecimiento de las cuatro cepas de Gymnodinium catenatum en presencia (cuadros) / ausencia (círculos) de la comunidad bacteriana en medio GSe. De izquierda a derecha: A) GCCV-7. B) GCMV-7. C) G7. D) 62 L. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

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8000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

cél/m

L

Día

GCCV-7 GCCV-7 + CB

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

Día

GCMV-7 GCMV-7 + CB

0

400

800

1200

1600

2000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

cél/m

L

Día

G7 G7 + CB

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

Día

62L 62L + CB

A

*

C

*

*

B

*

A

*

C*

D*

A* B*

47

7.7. Biomasa máxima

La biomasa máxima obtenida en presencia de la comunidad bacteriana dividió

en dos grupos a las cepas de G. catenatum: aquellas que obtuvieron una biomasa

máxima superior al control (GCCV-7 y GCMV-7) y en las cuales la biomasa máxima

se vio disminuida (G7 y 62L). No obstante, se encontraron diferencias significativas

en todos los tratamientos.

Dentro del grupo favorecido por la presencia de la comunidad bacteriana, la

cepa GCMV-7 vio incrementada su biomasa a más del doble (t(6gl)=185.529; p<0.05),

mientras que en GCCV-7 el incremento fue menor (aproximadamente 460±28

cél/mL; t(6gl)=31.5632; p<0.05 ). En cuanto a las cepas a las que inhibió la comunidad

bacteriana, el mayor descenso se obtuvo en la cepa 62L ya que la biomasa máxima

alcanzada no representó ni el 10 % de la obtenida en el monocultivo del

dinoflagelado (t(6gl)=44.9595; p<0.05); contrario a la cepa G7, cuya diferencia entre

tratamiento y control fue de tan sólo 479±13 cél/mL (t(6gl)=168.0443; p<0.05 ) (Fig.

23).

Figura 23. Biomasa máxima de las cuatro cepas de Gymnodinium catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana en medio GSe, a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

GCCV-7 GCMV-7 G7 62L

cél/m

L

Ausencia CB Presencia CB

* * * *

*

*

*

48

7.8. Tasa de crecimiento

De manera general, las cepas de G. catenatum inoculadas con la comunidad

bacteriana superaron las 0.1 div/día, con excepción de la cepa G7 (0.043 ± 0.002

div/día), observándose una tasa de crecimiento de entre 0.24 (±0.02) y 0.109

(±0.018) div/día.

Para los monocultivos del dinoflagelado, se obtuvieron tasas de crecimiento

menores a las 0.1 div/día y por tanto, también más bajas que las obtenidas en los

tratamientos de inoculación, con excepción de las cepas GCCV-7 (t(6gl)=1635.174) y

G7 (t(6gl)=7.1637) que registraron una mayor tasa de crecimiento en ausencia de la

comunidad bacteriana, mostrando diferencias significativas en ambos casos

(p<0.05).

En cuanto a las cepas GCMV-7 y 62L, también presentaron diferencias

significativas (p<0.05) (t(6gl)=905.097; t(6gl)=185.329, respectivamente) en las tasas de

crecimiento, siendo mayores en presencia de la comunidad bacteriana (Fig. 24).

Figura 24. Tasa de crecimiento de las cuatro cepas de Gymnodinium catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana en medio GSe, a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3


div

/día


*

*

*

*

* * * *

49

7.9. Tiempo de generación

Al igual que con la biomasa máxima y la tasa de crecimiento, el tiempo de

generación dividió en dos grupos a las cepas: aquellas donde la división celular fue

mayor en presencia de la comunidad bacteriana y donde fue menor en ausencia de

la misma. Cabe destacar que dentro del primer grupo, la cepa G7 fue quien obtuvo

un tiempo de generación significativamente mayor que el resto de los tratamientos y

monocultivos de G. catenatum (7 ± 3.4 días, t(6gl)=11.9675; p<0.05) mientras que en

ausencia de la comunidad bacteriana fue la cepa GCMV-7 la que presentó un tiempo

de generación mayor que el resto de las cepas, con diferencia significativa

(t(6gl)=39.13755; p<0.05).

En la cepa GCCV-7 (t(6gl)=16.4457) se observó un tiempo de generación mayor

en presencia de la comunidad bacteriana (2.76 ± 1.15 días), contrario a la cepa 62L

(t(6gl)=95.98881) que registró una división celular mayor en ausencia de esta (2.13 ±

1.1 días). No obstante, en ambas cepas hubo diferencia significativa (p<0.05) (Fig.

25).

Figura 25. Tiempo de generación de las cuatro cepas de Gymnodinium catenatum inoculadas con la comunidad bacteriana en medio GSe, a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12.*representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar.

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00


día

s


* * * *

*

*

50

7.10. Longitud de cadenas celulares

La presencia de la comunidad bacteriana en la cepa GCMV-7 durante todo el

ciclo de crecimiento, disminuyó la proporción de céluas individuales (de 32.7 ± 13.8 a

a 20 ± 11 %) e incrementó, de manera significativa (X2 0.05,3) = 6.4836; p<0.05) la

producción de cadenas celulares de 4-6 células (de 18.5 ± 10.3 a 31 ± 9 %) y de 7

células y mayores (11.4 ± 3.2 a 14 ± 10.2 %). En ambos casos la fase de

aclimatación fue corta, dominando las células individuales en el control mientras que

en el tratamiento las cadenas de 2-3 células, así como de 4-6 células fueron las

predominantes (X2 0.05,3) = 73.2054; p<0.05). Durante la fase de crecimiento

exponencial, en los dos cultivos se fue incrementando la producción de cadenas

celulares más largas, observándose una diferencia significativa (X2 0.05,3) = 21.155;

p<0.05) en las cadenas de 2-3 células, mientras que al llegar al final de esta fase y

comenzar con el declive, la tendencia fue invirtiendose, registrando una mayor

producción de células individuales en el tratamiento y aumentando la proporción de

cadenas de 2-3 y 4-6 células en el control (X2 0.05,3) = 8.9330; p<0.05), quien mantuvo

dicha producción de cadenas celulares por cuatro días más (Fig. 26; A y A’).

Para la cepa G7, en presencia de la comunidad bacteriana se tuvo un

predominio de células individuales, (38.1 ± 14.6 %) contrario al control, donde

dominaron las cadenas de 7 células y mayores (36. 1 ± 17 %). No obstante y a pesar

de haberse mantenido ese patrón durante la mayor parte del ciclo de crecimiento, en

los días de aclimatación e inicio de la fase exponencial, la producción de cadenas de

4-6 células aumentó significativamente (de 25.5 ± 6.3 a 41.5 ± 3.5 %; X2 0.05,3) = 73.

62.7859; p<0.05). Dicho patrón se mantuvo durante la fase exponencial,

incrementando también la producción de cadenas de 2-3 células, sin embargo, las

cadenas de 7 células y mayores no predominaron hasta el declive, donde se tuvo

una producción de células individuales y cadenas celulares homogénea

(aproximadamente del 25 %). Resaltemos que nuevamente el control presentó una

prologación de dos días en su crecimiento, durante los cuales la proporción de

cadenas celulares de 7 células y mayores fueron las dominantes (Fig. 26; B y B’).

51

La cepa GCCV-7 se caracterizó por presentar una mayor variabilidad en la

formación de cadenas celulares a lo largo de su crecimiento, obteniendo una

disminución considerable en la proporción de células individuales (de 40.7 ± 18.1 a

26 ± 21.4 %) y aumentando la producción de cadenas de 7 células y mayores (de 7.6

± 4.5 a 17 ± 10.6 %). Para las cadenas celulares de 2-3 y 4-6 células no se

observaron cambios, logrando una proporción de 23 y 31 %, respectivamente (X2

0.05,3) = 22.6090; p<0.05) (Fig. 27; C y C’).

Finalmente, en la cepa 62L en presencia de la comunidad bacteriana, las

células individuales mantuvieron una baja producción a lo largo del cultivo al igual

que las cadenas de 2-3 células, mientras que las cadenas correspondientes a 4-6 y 7

células y mayores predominaron (X2 0.05,3) = 65.3825; p<0.05) (Fig. 27; D y D’).

52

Figura 26. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de las cepas GCMV-7 (A y A’) y G7 (B y B’) de Gymnodinium catenatum en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Rayas: células individuales. Gris: cadenas de 2-3 células. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de

7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento del control y la línea semi-continua el tratamiento.

0

1000

2000

3000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

% d

e c

adenas c

elu

lare

s

Día

0

2000

4000

6000

8000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

cé

l/m

L

% d

e c

adenas c

elu

lare

s

Día

0

500

1000

1500

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

cél/m

L

% c

adenas c

elu

lare

s

Día

0

400

800

1200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

cél/m

L

% c

adenas c

elu

lare

s

Día

GCMV-7

GCMV-7 + CB

G

7

G7 + CB

A

A’

B

B’

G7

53

Figura 27. Formación de cadenas durante la curva de crecimiento de las cepas GCCV-7 (C y C’) y 62L (D y D’) de Gymnodinium catenatum en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Rayas: células individuales. Gris: cadenas de 2-3 células. Puntos: cadenas de 4-6 células. Azul: cadenas de 7 células y mayores. La línea continua representa la curva de crecimiento del control y la línea semi-continua el tratamiento.

0

1500

3000

4500

6000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

cél/m

L

% c

adenas c

elu

lare

s

Día

0

2000

4000

6000

8000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

cél/m

L

% d

e c

adenas c

elu

lare

s

Día

0

2000

4000

6000

8000

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

cél/m

L

% cadenas c

elu

lare

s

Día

0

200

400

600

800

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2 4 6 8

cél/m

L

% d

e c

adenas c

elu

lare

s

Día

GCCV-7

C

GCCV-7 + CB

C’

62L

D

62L + CB

D’

54

7.11. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana en los cultivos con

contacto celular

Se evaluó el crecimiento de la comunidad bacteriana asociada a las cepas

tratamiento de G. catenatum, observándose un patrón general para todos los

cultivos: la abundancia de la cianobacteria aumentaba, mientras que los bacilos y las

bacterias heterótrofas filamentosas disminuían.

En la cepa GCCV-7, al inicio del ciclo de crecimiento dominaban los bacilos y

filamentos, sin embargo, a partir del día 12, los filamentos comenzaron a decrecer

mientras que los bacilos, al registrar un pequeño declive el día ocho, comenzaron a

recuperar su crecimiento los siguientes días. En cuanto a la cianobacteria, desde el

día de siembra mantuvo un crecimiento constante y gradual, obteniendo la

abundancia máxima el día 24 (Fig. 28 A).

En la cepa GCMV-7 se observa que al iniciar el ciclo de crecimiento, la

cianobacteria tenía una abundancia baja, a partir del día cuatro comienza la fase

exponencial que termina con la obtención de la mayor abundancia el día 20, mientras

que los bacilos inician con una abundancia alta que va en declive a partir del cuarto

día para después mantener constante su crecimiento. Finalmente, los filamentos

presentaron dos puntos mínimos de crecimiento, el primero en el día cuatro y el

segundo al dieciseisavo día para posteriormente registrar un crecimiento exponencial

(Fig. 28 B).

Nuevamente observamos que en la cepa G7, la cianobacteria inicia su

crecimiento con una abundancia más baja que los bacilos y filamentos, la cual va en

incremento hasta el octavo día, donde observamos una fase estacionaria de cuatro

días, seguida de la fase exponencial que alberga la máxima densidad celular en el

día 16. Las bacterias heterótrofas filamentosas presentaron un crecimiento peculiar,

ya que comienzan el ciclo con un crecimiento gradual y a la alza, el cual se ve

interrumpido desde el día ocho dando lugar a la fase estacionaria y después al

declive, caso contrario a los bacilos, que a pesar de registrar un ligero declive el

55

mismo día, vuelven a presentar un crecimiento exponencial que se ve diezmado el

día 12 (Fig. 28 C).

La excepción al patrón de crecimiento antes descrito fue la cepa 62L, debido a

que la cianobacteria presentó una abundancia mayor que la de los bacilos y

filamentos, además que desde el día de siembra comenzó con un crecimiento

exponencial. Los filamentos mantuvieron un crecimiento constante a lo largo del ciclo

mientras que los bacilos, al igual que la cianobacteria, desde el día cero presentaron

un crecimiento exponencial, no obstante, no lograron alcanzar una abundancia

mayor que esta última (Fig. 28 D).

De manera específica para la cianobacteria, únicamente las cepas G7 y GCCV-

7 registraron diferencias significativas (H(3, N=16) = 14.13844; p<0.05) (Fig. 28). La tasa

de crecimiento varió entre 0.040 (±0.021) y 0.12 (±0.01) div/día, mostrando

diferencias significativas (H(3, N=16) = 14.15929; p<0.05) sólo para 62L y GCMV-7 (Fig.

29). El tiempo de generación entre cepas varió entre 2.5 (±1.04) y 7.34 (±2.44) días y

mostró diferencias significativas (H(3, N=16) = 14.13844; p<0.05), entre las cepas 62L y

GCMV-7, observándose tres grupos con características similares (Fig. 30).

56

Figura 28. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana asociada a las cepas de G. catenatum. Círculos: cianobacteria. Cuadros: bacterias heterótrofas filamentosas. Triángulos: bacilos. A) GCCV-7. B) GCMV-7. C) G7. D) 62L. Líneas verticales: desviación estándar. Eje vertical derecho: bacilos; eje vertical

izquierdo: cianobacteria y filamentos.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

0

50000

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150000

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0 4 8 12 16 20 24

cél/m

L

cél/m

L

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Cianobacteria Bacilos Filamentos

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0

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0 4 8 12 16 20

cél/m

Lcé

l/m

L

Día

Cianobacteria Bacilos Filamentos

0

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10000

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160000

0 4 8 12 16

cé

l/m

L

cél/m

L

Día

Bacilos Cianobacteria Filamentos

0

50000

100000

150000

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250000

0

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20000

30000

40000

50000

0 4 8

cél/m

L

cél/m

L

Día

Cianobacteria Filamentos Bacilos

GCCV-7 + CB

GCMV-7 + CB

G7 + CB

62L + CB

A*

B*

C*

D*

57

Figura 29. Tasa de crecimiento de la cianobacteria en los cultivos tratamiento de G. catenatum en medio GSe, a 24° C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. * representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar.

Figura 30. Tiempo de generación de la cianobacteria en los cultivos tratamiento de Gymnodinium catenatum en medio GSe, a 24 °C, 34 ups, ciclo luz:oscuridad 12:12. Letras diferentes representan diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar.

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140


div

/día

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00


día

s

*

*

abc

abc

b

c

*

58

7.12. Cambios morfológicos de Gymnodinium catenatum en presencia de la

comunidad bacteriana

Los principales cambios celulares observados en células de G. catenatum, en

los experimentos con contacto celular fueron: 1) desarreglo en el sulcusy cíngulo, 2)

ruptura de la membrana celular, 3) células con forma aplanada o de trapecio, 4)

desarreglos en el material citoplasmático, 5) núcleos prominentes con cromosomas

condensados, 6) quistes temporales y 7) lisis celular. Estos patrones fueron

visualizados en los tratamientos, con excepción de la cepa G7, a lo largo del ciclo de

crecimiento, presentándose en altos porcentajes (80 – 90 %) en el día de siembra y

en la fase de aclimatación, conforme el cultivo iba creciendo este porcentaje fue

disminuyendo, volviendo a presentarse en la mayoría de las células posterior a la

fase exponencial tardía. En las cepas GCCV-7 y GCMV-7, además de los cambios

morfológicos antes descritos, se observó un cambio en la coloración en los

tratamientos, los cuales se tornaron de un tono verde limón muy evidente. Esta

coloración se presentó a partir del día 8 y 10, respectivamente, coincidiendo con el

inicio de la fase exponencial. Sin embargo, no se vio inhibido el crecimiento de G.

catenatum (Fig. 31 y 32).

Figura 31. Cultivos inoculados con la comunidad bacteriana. A) GCMV-7 en el día seis de cultivo, sin cambio en la coloración. B) GCCV-7 en el día diez de cultivo, con un cambio de color evidente. C) Comparación en la tonalidad del cultivo, día seis del control y del tratamiento de la cepa GCCV-7.

59

Figura 32. Células de G. catenatum en presencia de la comunidad bacteriana. A) Célula individual del control sin cambios aparentes. B) Célula rodeada de una membrana característica de un quiste temporal. C) Ruptura de la membrana, pérdida de flagelo y desarreglo del cíngulo y sulcus. D) Quiste temporal rodeado de bacterias. E) Célula con forma trapezoide. F) Célula redondeada con núcleo evidente y cromosomas condensados. G) Cadena de cuatro células del control. H) Cadena celular rodeada por membrana hialina. I) Desarreglo del cíngulo y sulcus. J) Ruptura de la membrana celular. K) Desarreglos citoplasmáticos. L) Lisis celular.

60

7.13. Perfil de pigmentos

7.13.1. Cianobacteria

La composición del perfil de pigmentos de la cianobacteria se integró por

cuatro pigmentos, siendo la clorofila a la más abundante, seguida por la zeaxantina,

diadinoxantina y los menos abundantes, fueron los β-carotenos (Fig. 33).

Figura 33. Perfil de pigmentos de la cianobacteria asociada a la cepa G7 de Gymnodinium catenatum. Líneas verticales: desviación estándar.


bacteriana

El perfil de pigmentos en los cultivos de G. catenatum en presencia/ausencia

de la comunidad bacteriana se integró por ocho pigmentos fotosintéticos. La clorofila

a, pigmento primario, fue el más abundante mientras que los pigmentos accesorios,

0

10

20

30

40

50

60

70

Chl a Zeaxantina Diadinoxantina β-caroteno

% p

g/c

él

61

carotenoides (zeaxantina y β-caroteno) y xantofilas (diadinoxantina, dinoxantina y

diatoxantina) variaron su producción en cada cepa.

En la cepa GCMV-7, la presencia de la comunidad bacteriana aumentó de

manera significativa la producción de zeaxantina (t7gl = 13.7992; p<0.05), β-caroteno

(t7gl = 9.49328; p<0.05) y diatoxantina (t7gl = 9.01344; p<0.05). En cuanto al resto de

los pigmentos presentaron variaciones menores en su producción final, sin

observarse diferencias significativas (t7gl = 2.2622; t7gl = 0.311; t7gl = 0.85; t7gl =

1.59783; t7gl = 0.5083; p<0.05, para chl a, chl c, peridinina, diadinoxantina y

dinoxantina, respectivamente) (Fig. 34).

Figura 34. Perfil de pigmentos de la cepa GCMV-7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar. No se incluye a la clorofila a, para mostar al resto de los pigmentos accesorios que presentaron concentraciones más bajas.

En el caso de la cepa GCCV-7, al igual que la cepa anterior presentó un

aumento significativo en la producción de cuatro pigmentos en presencia de la

comunidad bacteriana: clorofila a (t7gl = 9.7066; p<0.05), zeaxantina (t7gl = 4.52033;

p<0.05), dinoxantina (t7gl = 3.43360; p<0.05) y β-caroteno (t7gl = 8.86364; p<0.05). El

0

5

10

15

20

25

30

% p

g/c

él

Ausencia CB

Presencia CB

*

*

*

*

*

*

62

resto de los pigmentos tuvo una producción similar en presencia/ausencia de la

comunidad (Fig. 35).

Figura 35. Perfil de pigmentos de la cepa GCCV-7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar. No se incluye a la clorofila a, para mostar al resto de los pigmentos accesorios que presentaron concentraciones más bajas.

La cepa 62L en presencia de la comunidad bacteriana no registró cambios

significativos (t7gl = 0.304539; t7gl = 1.148394; t7gl = 0.504810; t7gl = 2.25283; t7gl =

0.026127; t7gl = 0.893056; t7gl = 0.739977; t7gl = 0.026649; p<0.05, para chl a, chl c,

peridinina, zeaxantina, diadinoxantina, dinoxantina, diatoxantina y β-carotenos,

respectivamente)en la producción de pigmentos, manteniendo su producción

homogénea (Fig. 36).

0

5

10

15

20

25

% p

g/c

él

Ausencia CB

Presencia CB

*

*

*

*

*

*

63

Figura 36. Perfil de pigmentos de la cepa 62L en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. No se incluye a la clorofila a, para mostar al resto de los pigmentos accesorios que presentaron concentraciones más bajas.

Finalmente, en la cepa G7, la presencia de la comunidad bacteriana aumentó

(de 51.8 ± 2.3 a 74.99 ± 0.26) la producción de clorofila a (t7gl = 7.2887; p<0.05),

peridinina (t7gl = 15.9007; p<0.05) y dinoxantina (t7gl = 11.4268; p<0.05), mientras que

en ausencia de la comunidad bacteriana la zeaxantina (t7gl = 26.1616; p<0.05) y los

β-carotenos (t7gl = 44.0215; p<0.05) registraron una producción de 28.5 (±1.03) y

12.2 (±0.26) % versus una total inhibición de dichos pigmentos en presencia de la

misma comunidad (Fig. 37).

0

5

10

15

20

25

30

35

% p

g/c

él

Ausencia CB

Presencia CB

64

Figura 37. Perfil de pigmentos de la cepa G7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. *representa diferencias significativas (p<0.05). Líneas verticales: desviación estándar. No se incluye a la clorofila a, para mostar al resto de los pigmentos accesorios que presentaron concentraciones más bajas

7.14. Perfil de toxinas paralizantes

Los diversos análogos producidos por Gymnodinium catenatum han sido

divididos en función del grupo sustituyente en la cadena lateral, en carbamoil (STX,

NEO, GTX1-4), decarbamoil (dcSTX, dcNEO, dcGTX1-4) y N-sulfocarbamoil (B1-2 y

C1-2), además que los pares enantioméricos se expresan como sumatorias, ya que

se epimerizan con facilidad bajo las condiciones de extracción y análisis. A pesar de

que pueden ser determinados de manera individual, las cantidades no reflejan

necesariamente la composición original en las células.

Se identificaron ocho toxinas: las N-sulfocarbamoil C1/2; las decarbamoil

dcNEO, dcSTX y dcGTX2/3 y las carbamoil GTX2/3.

Por grupo de toxinas y en la cepa GCMV-7, observamos que las toxinas N-

sulfocarbamoil, en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana fueron las

0

5

10

15

20

25

30

35

% p

g/c

él

Ausencia CB

Presencia CB

*

*

*

*

*

*

65

dominantes representando más del 80 %pmol, seguidas de las decarbamoil (> 8

%pmol) y finalmente, la menor proporción correspondió a las toxinas carbamoil (> 0.5

%pmol). No se registraron diferencias en el perfil de toxinas en presencia de la

comunidad bacteriana (X2 0.05,3) = 0.3490; p>0.05) (Fig. 38).

Figura 38. Perfil de toxinas de la cepa GCMV-7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Rojo: toxinas N-sulfocarbamoil (C1/2). Amarillo: toxinas decarbamoil (dcNEO, dcSTX, dcGTX2/3). Negro: toxinas carbamoil (GTX2/3).

En GCCV-7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana también las

toxinas N-sulfocarbamoil (C1/2) fueron las más abundantes, con una proporción > 95

%. Las toxinas decarbamoil fueron las segundas más abundantes con más del 3

%pmol en ambos cultivos y finalmente las carbamoil, que presentaron diferencia

significativa (X2 0.05,3) = 33.3417; p<0.05) en la proporción de producción, siendo

mayor en presencia de la comunidad bacteriana con un 0.92 %pmol. (Fig. 39).

66

Figura 39. Perfil de toxinas de la cepa GCCV-7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Rojo: toxinas N-sulfocarbamoil (C1/2). Amarillo: toxinas decarbamoil (dcNEO, dcSTX, dcGTX2/3). Negro: toxinas carbamoil (GTX2/3).

En la cepa 62L, observamos que en ausencia de la comunidad bacteriana,

fueron las toxinas decarbamoil las dominantes con un 86.76 %pmol, seguidas de las

N-sulfocarbamoil y por último, las carbamoil. Sin embargo, en presencia de la

comunidad bacteriana, el perfil cambia, siendo nuevamente las toxinas más

abundantes las N-sulfocarbamoil (54.17 %pmol), seguidas por las decarbamoil y

carbamoil (45.69 y 0.13 %pmol respectivamente), dichos cambios fueron

significativos (X2 0.05,3) = 45.3892; p<0.05) (Fig. 40).

Figura 40. Perfil de toxinas de la cepa 62L en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Rojo: toxinas N-sulfocarbamoil (C1/2). Amarillo: toxinas decarbamoil (dcNEO, dcSTX, dcGTX2/3). Negro: toxinas carbamoil (GTX2/3).

67

En la cepa G7 se observa que la comunidad bacteriana aumenta

significativamente (X2 0.05,3) = 0.9650; p<0.05) la proporción de toxinas carbamoil (0.53

a 0.65 %pmol) y N-sulfocarbamoil (70.76 a 87.72 %pmol) y disminuye la producción

de toxinas decarbamoil (Fig. 41).

Figura 41. Perfil de toxinas de la cepa G7 en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Rojo: toxinas N-sulfocarbamoil (C1/2). Amarillo: toxinas decarbamoil (dcNEO, dcSTX, dcGTX2/3). Negro: toxinas carbamoil (GTX2/3).

7.15. Toxicidad

La toxicidad total (definida como equivalentes de STX/cél) presentó menos

variaciones en función de la cepa y en presencia/ausencia de la comunidad

bacteriana. 62L fue la cepa de mayor toxicidad en ausencia de la comunidad

bacteriana (126 ± 41 ng STX eq/cél) mientras que GCCV-7 fue la cepa de mayor

toxicidad en presencia de la comunidad bacteriana (103 ± 43 ng STX eq/cél). Esta

diferencia se vincula directamente con que en presencia de la comunidad bacteriana,

la cepa 62L disminuyó la producción de toxinas decarbamoil y N-sulfocarbamoil,

mientras que la cepa GCCV-7 incrementó la producción de las toxinas

carbamatadas, decarbamatadas y N-sulfocarbatadas (Fig. 42 B y C).

68

En cuanto a la cepa GCMV-7, no presentó cambios en su toxicidad total pero

si se observó que en presencia de la comunidad bacteriana disminuye la producción

de toxinas decarbamoil y N-sulfocarbamoil (Fig. 42 A).

La cepa G7 fue la que presentó la menor toxicidad tanto en el control como en

el tratamiento y es que en presencia de la comunidad bacteriana disminuye la

producción de todos los grupos de toxinas (carbamoil, decarbamoil y N-

sulfocarbamoil)(Fig.42D).

69

Figura 42. Toxicidad (ngSTXeq/cél) de las cepas de G. catenatum en presencia/ausencia de la comunidad bacteriana. Líneas verticales: desviación estándar.

0

5

10

15

20

25

30

Carbamatadas Decarbamoil Sulfocarbamoil

ng

ST

Xeq

/cél


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


ng

ST

Xe

q/c

él


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


ng

ST

Xeq/c

él

Ausencia CB

Presencia CB

0

0.5

1

1.5

2

2.5


ng

ST

Xe

q/c

él

Ausencia CB

Presencia CB

A

B

C

D

70

VIII. DISCUSIÓN


Para el crecimiento de la cianobacteria aislada de la comunidad bacteriana

asociada a la cepa G7 de G. catenatum, se seleccionó al medio de cultivo GSe

porque en este se mostró un mejor crecimiento y por cumplir con los requerimientos

necesarios en la calidad del agua (esterilizada por filtración), sales minerales (macro

y micronutrientes esterilizados por calor húmedo) y factores de crecimiento

(vitaminas esterilizadas por filtración), además de la adición de extracto de

lombricompostaje que otorga un plus de nutrientes (N:P) y proporciona una fuente de

nitrógeno, ya sea en su forma amoniacal o de nitrito necesarias para un crecimiento

óptimo (González-González, 2010; Mendoza-Guerrero, 2011; Ortíz-Moreno et al.

2012).

Si bien, no se encontró referencia del cultivo de cianobacterias unicelulares

marinas en medio GSe, existen estudios donde utilizan medios de cultivo más

selectivos con la adición de extracto de suelo, obteniendo con ello un mejor

crecimiento. Tal es el caso del medio mineral estándar o SOT (Ogawa y Terui, 1970)

utilizado en el mantenimiento de Spirulina sp., para cianobacterias marinas, son

característicos el medio MN (Fuenmayor et al. 2009) y ES (Provasoli, 1957) por

utilizar agua de mar natural y poseer un menor aporte de sales minerales, y, el medio

ASN-III (Rippka, 1988) para el aislamiento de cianobacterias fijadoras de nitrógeno.

Otra ventaja, es que los macro y micronutrientes no varían tanto entre un medio y

otro, por lo que el aporte nutricional proporcionado es el necesario para el desarrollo

de estas microalgas (Torres-Ariño, 2001; 2004; 2011; Monroy-Sampieri, 2014).

Existen muchas técnicas de aislamiento de cianobacterias, sin embargo, las

más utilizadas son las manuales, entre las que destaca el fototactismo acompañado

de la migración vertical debido a que estratifica la presencia de los diversos

microorganismos, eliminando la mayor cantidad de bacterias, especialmente los

bacilos Gram (-) (Tovar-Ramírez, 1999). Por otra parte, el estriado en placa con agar

71

únicamente nos permitió la purificación del cultivo, pues el crecimiento de la

cianobacteria en dichas condiciones no se favoreció, lo cual podría atribuirse al grado

de sequedad de la superficie del agar, pues a concentraciones mayores de 1.5 % de

agar, éste actúa como inhibidor del crecimiento (Allen, 1968; Olivas, 2004). En el

presente estudio se trabajó con una concentración de 1 % de agar y a pesar de estar

dentro del límite de tolerancia, no se obtuvo un buen crecimiento de la cianobacteria.

8.2. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana

En los últimos 25 años se han desarrollado una gran variedad de métodos que

evalúan la abundancia y actividad del femto, pico y microplancton, siendo la

microscopía de epifluorescencia una de las técnicas más utilizadas para el conteo

directo de bacterias, demostrando que constituyen una de las comunidades más

abundantes de los océanos (Soto-Castor et al. 2002). Sin embargo, existen otras

técnicas que permiten la visualización y observación puntual de estos

microorganismos, teniendo ventajas y limitaciones dependiendo el enfoque de cada

estudio (Legendre et al. 2001; Bouvier et al. 2007)

En el presente estudio y tal como lo describe Vázquez y colaboradores (2010)

el uso de la microscopía óptica no nos permitió la correcta distinción entre la

cianobacteria y los bacilos. En cuanto al conteo celular con la cámara de Neubauer,

particularmente se tuvieron dos limitaciones: 1) las estimaciones celulares en cada

triplicado eran extremadamente variables conforme el tiempo de cultivo avanzaba y

2) el tiempo de conteo por muestra era demasiado (30-45 minutos), convirtiéndose

en una técnica tediosa, contrario al citometro, que analizó 30 muestras en una hora,

3 minutos por muestra, su precisión difirió en un 2 % entre muestra y muestra y nos

permitió evaluar características intrínsecas de las células, tales como su tamaño y

complejidad (La Ferla et al. 2003; Calvo-Díaz y Morán, 2006; Bouvier et al. 2007).

Sin embargo, a pesar de tantas ventajas que presenta la citometría de flujo

(identificación y aislamiento rápido de organismos, disminución en los tiempos de

procesamiento, análisis y toma de decisiones, análisis de las características

72

intrínsecas de las células) en el análisis celular, en nuestro estudio únicamente nos

permitió separar a los organismos autótrofos de los heterótrofos y tener una

aproximación del tamaño celular de los mismos, esto debido a una mala calibración

del equipo, el exceso de ruido electrónico que arrojaba el citometro, el uso de

microesferas que triplicaban en tamaño a los micoroganismos y la falta de

fluorocromos que facilitarían la identificación de subgrupos específicos dentro de

poblaciones o comunidades celulares (Castillo-Navarrete, 2005; Forget et al. 2010).

En teoría, es posible usar un citometro de flujo para medir los parámetros

intrínsecos tanto en bacterias como en células eucariontes, pero en la práctica, en

una bacteria la señal de estos parámetros es mil veces menor (Castillo-Navarrete,

2005), por lo que su medición es difícil cuando no se tiene experiencia además que

estos organismos presentan variaciones fotoeléctricas que hacen “indetectables”

algunos componentes bacterianos (Shapiro, 2003)

Además, se debe considerar que las microalgas al tener la capacidad de ajustar

su concentración de clorofila en función de las condiciones de iluminación (foto-

aclimatación) el citometro las cuenta como células de mayor tamaño, complejidad o

con mayor fluorescencia (Forget et al. 2010) es por esto que existió una enorme

variabilidad en los conteos entre esta técnica y la microscopía óptica y

epifluorescente.

En cuento al tamaño correcto de las microesferas, Gasol y Del Giorgio (2000) y

Campbell (2001) mencionan que para el estudio del picoplancton es necesario el uso

de microesferas de un tamaño no mayor a 2 µm de diámetro las cuales servirán

como referencia intermedia del tamaño celular, ubicando a los organismos por

debajo y sobre las mismas al momento de graficar el tamaño celular (FSC) y

complejidad (SCC) versus la fluorescencia roja de la ficoeritrina, de lo contrario, la

posible referencia que te proporcionen sub o sobreestimará el tamaño celular, como

en nuestro caso.

73

A pesar del uso de la microscopía óptica y de la citometría de flujo, la tinción

fluorescente y el conteo directo por microscopia de epifluorescencia permanecerá

como el método estándar de enumeración de bacterias en ambientes acuáticos,

siendo el método más eficaz y tomado como base para la interpretación de los datos

ya que se trata de una técnica donde las observaciones son directas, puntuales y

personales, dando realce a las características particulares que necesite cada

investigador (Betancourt et al. 1997; La Ferla et al. 2003; Mecalco-Hernádez, 2010),

por lo que las dos técnicas antes descritas fueron métodos complementarios a la

microscopía de epifluorescencia, aportando características diferentes como la

identificación y cuantificación de las tres fracciones de la comunidad bacteriana.

Debido a que las cianobacterias presentan elevada plasticidad en formas y

tamaños, aquellas que presenten un diámetro de 0.7 a 3 µm y tengan forma esférica

entrarán dentro del grupo de las cianobacterias unicelulares cocoides, por lo que la

presente en la comunidad bacteriana asociada a G. catenatum entra dentro de este

grupo y teóricamente se caracterizaría por 1) preferir irradiancias bajas e

intermedias, comprendidas dentro del intervalo de los 58.8 a 156 µmolm-2s-1; 2)

presentar un crecimiento óptimo con luz blanca; 3) tener un nivel de tolerancia de 0

a 100 ups, y un crecimiento óptimo a 35 ups y 4) una curva de crecimiento con fases

estacionarias cortas de entre seis y nueve días, posterior a las cuales se obtiene la

máxima densidad celular y después el crecimiento se ve inhibido (Díaz-Hernández,

1997; Morales et al. 2002; Rosales-Loaiza et al. 2008; Poot-Delgado et al. 2009).

Sin embargo, a pesar de que las condiciones de cultivo a las que se mantuvo la

cianobacteria de este trabajo están dentro del intervalo de crecimiento descrito en la

bibliografía para cianobacterias marinas, unicelulares y cocoides, no obtuvimos un

buen crecimiento, reflejado en densidades celulares bajas. Así mismo, la tasa de

crecimiento (0.038 - 0.1 div/día) también fue más baja (0.14 - 0.37 div/día) mientras

que el tiempo de generación obtenido (2.76 – 7.72 días) fue mayor al reportado por

Poot-Delgado y colaboradores (2009) el cual fue de 4.85 – 5.89 días.

74


La curva de crecimiento fue la típica para la especie, caracterizada por una fase

de aclimatación corta, iniciando al segundo día con la fase exponencial. La fase

estacionaria no se presentó ya que rápidamente después de alcanzar la máxima

densidad celular, se observó la fase de declive (Martínez-Tecuapacho, 2009;

Bustillos-Guzmán et al. 2012; Costa et al. 2015).

En 2010, Oh y colaboradores mencionan que las tasas de crecimiento son

características de cada cepa, pues al comparar 83 cepas de G. catenatum de

florecimientos distintos en la Bahía de Inokushi, Japón, obtuvieron que incluso cepas

aisladas el mismo día y bajo las mismas condiciones mostraron diferencias

significativas, concluyendo que la especie presenta respuestas cepa/específica, es

decir, que cada una tendrá un comportamiento diferente a pesar de estar expuestas

a las mismas condiciones de aislamiento, cultivo y crecimiento, lo cual se pudo

confirmar en el presente estudio, al obtener dos cepas favorecidas por la comunidad

bacteriana y dos inhibidas, considerándose la presencia/ausencia de dicha

comunidad como única variable.

En general, se obtuvo una tasa de crecimiento entre 0.04 (± 0.002) y 0.22 (±

0.02) div/día, siendo únicamente GCCV-7 y 62L quienes superaron las 0.1 div/día

con 0.22 (± 0.02) y 0.14 (± 0.02) div/día, respectivamente, teniendo con ello el menor

tiempo de generación (1.4 ± 0.012 y 2.1 ± 0.01 días). Específicamente, para G.

catenatum se ha reportado una tasa de crecimiento mínima de 0.07 div/día (Durán-

Riveroll, 2014) y máxima de 0.34 div/día (Hallegraeff et al. 2011) bajo las mismas

condiciones de cultivo del presente estudio. También existen registros de tasas de

crecimiento intermedias (0.14 div/día) pero en medio f/2, con un intervalo de

temperatura de 15 – 29 °C, 30 ups y 230 µmolm-2s-1 (Band-Schmidt et al. 2004).

Debe reconocerse que las cepas mexicanas han presentado tasas máximas

de crecimiento menores comparadas con aquellas aisladas de otros países, con la

excepción de las cepas de Bahía Concepción, Bahía de La Paz y Mazatlán (Band-

Schmidt et al. 2006) obteniendo tasas de crecimiento de 0.70 a 0.82 div/día. En

75

nuestros experimentos, únicamente la cepa G7 (0.04 ± 0.002 dív/día) obtuvo una

tasa de crecimiento más baja de lo reportado en literatura, el resto quedó dentro del

intervalo establecido para cepas de G. catenatum antes mencionado, aunque con

valores bajos.

Existen numerosos trabajos que evalúan el crecimiento de G. catenatum ante la

variación de diversos factores abióticos. Específicamente y evaluando la

temperatura, salinidad y medio de cultivo no se encontraron diferencias

estadísticamente significativas (Band-Schmidt et al. 2004; Band-Schmidt et al. 2006;

Bustillos-Guzmán et al. 2012; Durán-Riveroll, 2014). Sin embargo, al analizarse

diferentes proporciones de N:P (4:1, 16:1, 32:1 y 64:1) en cultivos semi-continuos

(Hernández-Sandoval, 2010) si se halló una diferencia significativa , reafirmándose la

respuesta cepa/específica antes mencionada ya que nosotros encontramos

diferencias en tres de las cinco cepas (GCCV-7, G7 y 62L), constituyendo el segundo

reporte en donde el crecimiento del dinoflagelado se ve afectado por un factor biótico

(Fernández-Herrera, 2013).

El ecotipo mexicano de G. catenatum se caracteriza por tolerar un amplio

rango de temperatura (11.5 – 30 °C), con un crecimiento entre los 21 y 29 °C, y

dentro de un rango de salinidad entre 28 y 38 ups (Band-Schmidt et al. 2004). Las

condiciones de cultivo de este estudio fueron a 24 °C y a una salinidad de 34 ups,

entrando dentro del rango de crecimiento. No obstante, Blackburn y colaboradores

(1989) establecieron que un buen crecimiento en G. catenatum se verificaba en las

divisiones celulares, siendo las óptimas cada 3 a 4 días, por lo que únicamente las

cepas GCMV-7 y G7 New (3 ± 0.13; 3.2 ± 0.63 días, respectivamente) presentaron

un buen crecimiento, debido a que el resto tuvo un tiempo de generación menor al

descrito.

8.4. Formación de cadenas celulares

Cada cepa mostró un comportamiento distinto, pero en general se observó

una disminución de células individuales al comenzar la fase de crecimiento

76

exponencial, formándose cadenas celulares más largas conforme la edad del cultivo

avanzaba.

Blackburn y colaboradores (1989) señalan que una mayor longitud de cadenas

en el cultivo indica que están en mejores condiciones fisiológicas pues observaron

que durante la fase de crecimiento exponencial, la mayoría de las células formaban

cadenas de 4-16 células y al ir avanzando en el tiempo y bajo condiciones limitantes,

estas cadenas se rompen en células individuales.

Dichas observaciones coinciden con nuestros resultados, ya que a pesar de

que G7 fue la cepa que presentó la menor abundancia celular y tasa de crecimiento

no fue la que tuvo una mayor proporción de células individuales a lo largo de todo el

cultivo (1146 ± 4 cél/mL; 0.04 ± 0.002 div/día; 38 ± 15 %) sino 62L y GCCV-7,

quienes obtuvieron las mayores densidades celulares y tasas de crecimiento (6444 ±

4 cél/mL; 0.14 div/día; 36 ± 11 % y 6463 cél/mL; 0.22 div/día; 41 ± 18 %,

respectivamente).

Aunado a lo anterior, estudios previos han demostrado que el largo de las

cadenas es influenciado también por las condiciones y composición del medio de

cultivo (Blackburn et al. 1989) encontrando que en medio GSe se obtiene una mayor

producción de cadenas celulares largas (Band-Schmidt et al. 2004; Durán-Riveroll,

2014) debido a que este medio tiene extracto de suelo que estimula el crecimiento,

agregando un plus de micronutrientes (González-González, 2010; Ortíz-Moreno et al.

2012). A pesar de que no se evaluó este factor en nuestro estudio, los resultados nos

dan la pauta a decir que no contibuye a la formación de cadenas celulares largas,

debido a que solo en una cepa predominaron las cadenas celulares de siete células y

mayores a lo largo del cultivo (G7 New con 67 %).

77



En trabajos previos, donde se han expuesto a otros microoganismos

(diatomeas, copépodos, crisofitas) a filtrados celulares de algún dinoflagelado, se ha

obtenido una total inhibición en el crecimiento de estos organismos y dependiendo el

tiempo y volumen de exposición ha podido recuperarse o no el cultivo (Arzul et al.

1999; Fuentes-Pascacio, 2010; Kim y Park, 2010).

La comunidad bacteriana de nuestro estudio al estar expuesta a los

metabolitos secundarios de G. catenatum disminuyó su densidad celular máxima y

tasa de crecimiento durante todo el cultivo, por lo que a pesar de la posible

disponibilidad de nitrógeno en forma de aminoácidos libres en el medio, no se

favoreció su crecimiento.

La exposición a los filtrados celulares se llevó a cabo porque a través de

microscopía óptica (Fig. 5) se observaba que tanto los bacilos como la cianobacteria

se agrupaban alrededor de las células del dinoflagelado, por lo que se pensó que la

interacción entre las especies se desarrollaba a una escala espacio temporal corta

donde el efecto de los metabolitos secundarios se haría evidente al utilizar los

filtrados de los exudados liberados al medio, detectando cambios en el crecimiento

tal como lo describe Arzul y colaboradores (1999).

Sin embargo, la microscopia de epifluorescencia dilucidó parcialmente por qué

no hubo un incremento en la densidad celular de la comunidad bacteriana, al

evidenciar que los bacilos constituyen bacterias intracelulares (Fig. 11) mientras que

la cianobacteria se encuentra inmersa en el mucus de carbohidratos que produce el

dinoflagelado (Band-Schmidt, com. pers.), creándose un micro hábitat con las

condiciones necesarias para su crecimiento.

78


Curvas, tasas de crecimiento y formación de cadenas celulares

El estudio de la interacción bacteria-microalga ha tomado relevancia de la

última década al presente, siendo descritos varios aspectos como: la producción

autónoma de toxinas por parte de las bacterias, la intervención que tienen en 1) la

síntesis de toxinas 2) en el apareamiento y 3) la influencia directa o indirecta en el

desarrollo de ciertos estadios del ciclo de vida de los dinoflagelados (Albinsson,

2011; Bolch et al. 2011; Albinsson et al. 2014). Sin embargo, estos estudios no

proporcionan información acerca del comportamiento e influencia de la comunidad

bacteriana en el crecimiento, específicamente, en los cambios de densidad celular,

tasas de crecimiento y efectos en el perfil de pigmentos en células vegetativas, por lo

que el presente estudio es el primero para la especie que aborda esos puntos,

además de evaluar los cambios en el perfil de toxinas paralizantes.

En estudios previos se ha concluido que la interacción bacteriana que

presenta G. catenatum es específica y la estimulación o inhibición en su crecimiento

dependerá del tipo de bacteria asociada a sus cepas (Hold et al. 2001; Uribe y

Espejo, 2003; Croft et al. 2005).

Además al cultivar al dinoflagelado con más de una bacteria, su curva de

crecimiento se ve modificada al interrumpirse abruptamente la fase de crecimiento

exponencial por un declive pronunciado, producto de un agotamiento de nutrientes,

principalmente nitratos y fosfatos, siendo estos últimos, utilizados por las bacterias

como agentes estimulantes en su crecimiento (Córdova et al. 2003; Bolch et al.

2004). Dichas características fueron observables en nuestros experimentos (Fig. 22),

siendo la fase de declive repentina y precedida por la obtención de la mayor

densidad celular, un comportamiento constante para todas las cepas. En cuanto al

agotamiento de nutrientes, no se puede concluir al respecto debido a que estos no

fueron cuantificados.

79

Sin embargo, al comparar las curvas de crecimiento de G. catenatum en

presencia/ausencia de la comunidad bacteriana (Fig. 23), nos percatamos que en

presencia de la misma, se obtienen dos patrones de comportamiento: el primero, es

un factor estimulante en el crecimiento de la microalga, traducido en la obtención de

densidades celulares mayores (Fig. 23 B) y en una prolongación en el tiempo del

cultivo (Fig. 23 A) lo que coincide parcialmente con lo reportado para cepas de

Alexandrium spp. donde la presencia de bacterias prolonga la fase de crecimiento

exponencial, modulando la disponibilidad de nutrientes pero no incrementa de

manera significativa las tasas de crecimiento, por el contrario, se registran tasas de

crecimiento bajas producto de un letargo en el crecimiento (Hold et al. 2001; Uribe y

Espejo, 2003; Maas et al. 2007). Esto último solo se observó en la cepa GCCV-7 ya

que GCM-V-7 no solo vio incrementada su densidad celular sino también su tasa de

crecimiento (Fig. 24 y 25).

El segundo patrón de comportamiento fue la inhibición en el crecimiento

de G. catenatum (Fig. 23 C y D) en presencia de la comunidad bacteriana, lo que

podría ser explicado en base a lo descrito por Albinsson (2011) para co-cultivos de

G. catenatum en presencia de la bacteria marina Marinobacter sp. donde observa

que la bacteria presenta cambios en la expresión génica (supresión de genes

reguladores de la producción de toxinas PSP) causando efectos estimulantes en una

cepa e inhibitorios en tres cepas.

Sin embargo, se debe considerar que a pesar de haberse demostrado que las

bacterias presentes en una cepa específica de dinoflagelado son capaces de

asociarse a otra cepa de la misma o de diferente especie, no tienen el mismo efecto

en todas las cepas, incrementando el crecimiento en algunas e inhibiéndolo en otras

como es el caso de los trabajos de Bolch y colaboradores (2011) quienes trabajaron

con la actinobacteria Alcanivorax sp. y Albinsson y colaboradores (2014) quienes

estudiaron el efecto de Marinobacter sp. y Alcanivorax sp. sobre G. catenatum

Dentro de las cepas que vieron interrumpido su crecimiento en presencia de la

comunidad bacteriana, está la cepa michoacana 62L, que mostró un descenso

80

significativo en su densidad celular de más del 90 %. Esto coincide con lo reportado

por Alavi y colaboradores (2001) en cepas del dinoflagelado Pfiesteria que tras

inocular la comunidad bacteriana a cepas específicas de la microalga, esta presentó

descensos significativos en su densidad celular, la cual logró recuperarse al re-

aislarse de la comunidad bacteriana y concluyendo que la inhibición en el crecimiento

por parte de las bacterias se debe a la liberación de metabolitos secundarios al

medio.

Matsumoto (2011) mantuvo a G. catenatum en dos tipos de cultivos: con

filtrados celulares y contacto directo con la bacteria Alcanivorax obteniendo una

inhibición en los primeros y una estimulación significativa en el crecimiento de los

segundos, infiriendo que la sustancia promotora del crecimiento no es una sustancia

intracelular o que la concentración no es lo suficientemente alta para estimular

completamente el crecimiento del dinoflagelado. Aunado a esto, se ha demostrado

que algunas especies de dinoflagelados son capaces de ingerir cianobacterias

unicelulares o algunas bacterias pequeñas (< 2 µm) debido a que estas les

proporcionan factores orgánicos de crecimiento (principalmente aminoácidos)

(Skovgaard, 2000; Jeong et al. 2005a; Skelton et al. 2009).

Específicamente, G. catenatum ingiere células de la cianobacteria

Synochococcus spp. (Jeong et al. 2005b) demostrando que la especie presenta una

alta selectividad por este organismo debido a la calidad nutricional que le provee, sin

embargo, también se menciona que la microalga proporciona formas asimilables de

carbono al producir ácidos grasos, esteroles, lípidos y aceites en abundancia por lo

que la presencia de la cianobacteria de nuestro estudio dentro del mucus producido

por G. catenatum podría establecerse como una relación de mutualismo debido a

que ambos proveen de factores estimulantes en el crecimiento mientras que la

presencia de bacilos intracelulares confirmaría lo descrito por Töbe (2003) al

localizarse en compartimientos ricos en metabolitos, como lo es el citoplasma (Fig.

14).

81

Dado que los trabajos realizados para la especie de interés no han trabajado

con células vegetativas sino con quistes de resistencia, su germinación y

supervivencia, no existen datos comparables que nos eluciden si los resultados

obtenidos son efectos positivos de la comunidad bacteriana asociada pero Kim y

Park (2010) al exponer al dinoflagelado Fragilidium duplocampanaeforme a varias

especies fitoplanctónicas, observó una disminución en la longitud de las cadenas

celulares, muerte celular y la formación de quistes temporales, demostrando que el

contacto directo entre especies diferentes puede modificar completamente la

estructura de la comunidad fitoplanctónica.

Haciendo realce a la formación de cadenas celulares, Fernández-Herrera

(2013) en sus experimentos de alelopatía de Chattonella marina var. marina sobre G.

catenatum menciona que las primeras células en morir del dinoflagelado fueron las

individuales, pero sugiere que las cadenas celulares al tener una mayor superficie de

contacto, serán más susceptibles al efecto por contacto directo, lo que explicaría

porque las cepas 62L y G7 no presentaron un incremento en su crecimiento, al ser

las cepas con mayor proporción de cadenas celulares largas, contrario a GCMV-7 y

GCCV-7 que si incrementaron su crecimiento en presencia de la comunidad

bacteriana pero también presentaron una mayor producción de células individuales.

8.6. Curvas de crecimiento de la comunidad bacteriana en los cultivos con

contacto celular

La comunidad bacteriana asociada a cepas de G. catenatum ha sido

caracterizada filogenética y funcionalmente, determinándose que se integra por 15 a

24 genotipos bacterianos distintos (Green et al. 2004). Sin embargo, a pesar de ser

tan variable, estudios previos han concluido que el efecto de la comunidad bacteriana

en el dinoflagelado se debe a la dominancia de una, máximo dos especies, más no a

la coexistencia de las mismas ya que en los cultivos mixtos, la bacteria dominante

tiene efectos en el crecimiento de la microalga e inhibe el crecimiento del resto de las

bacterias asociadas (Albinsson, 2011; Albinsson et al. 2014). Estas observaciones

podrían explicarnos el por qué la cianobacteria, a diferencia de los bacilos y

82

filamentos, logra un mejor crecimiento en las distintas cepas de G. catenatum aquí

evaluadas (Fig. 29), mostrando un incremento gradual y constante en su densidad

celular, contario a los otros dos microorganismos que presentan amplias oscilaciones

en su crecimiento.

Por otra parte, la dinámica de crecimiento de las distintas bacterias cultivadas

con células de G. catenatum sugiere que el dinoflagelado tiene efectos de interacción

diferentes para cada bacteria, lográndose el establecimiento de diferentes

asociaciones ecológicas dependiendo el impacto de la interacción entre los dos

microorganismos.

Se han reconocido para esta especie, una asociación mutualista con la

bacteria Marinobacter sp. (Bolch et al. 2004; Green et al. 2004; Albinsson, 2011;

Albinsson et al. 2014) y un amensalismo con Alcanivorax borkumensis debido a que

G. catenatum presentó una mortalidad alta (89 %) en presencia de la bacteria,

mientras que esta última duplicó su población en las primeras dos horas de iniciado

el experimento (Green et al. 2004).

Nuestro estudio no identificó a las bacterias asociadas a la cepa G7 de G.

catenatum, sin embargo, existe la posibilidad de que los bacilos pudiesen ser una

especie del género Alcanivorax ya que morfológicamente son similares y se ha

reportado la presencia de esta bacteria en cepas aisladas de diversos ecotipos

(Bolch et al. 2011).

En cuanto a las tasas de crecimiento y densidades celulares máximas

obtenidas por la comunidad bacteriana y aquellas previamente descritas, las

diferencias se atribuyen a tres factores: 1) el método de cuantificación de la

comunidad, ya que en estudios anteriores se ha utilizado el PCR en tiempo real

(Albinsson, 2011) y el conteo por diluciones seriadas (Subramanian, 2008) versus la

microscopía de epifluorescencia del presente. 2) el estadio celular de G. catenatum

ya que previamente se evalúa el porcentaje de eclosión de los quistes de resistencia

y la posterior supervivencia de las células expuestas a la comunidad bacteriana

83

mientras que nosotros trabajamos con células vegetativas que a pesar de no haber

sido aclimatadas, los experimentos fueron viables y 3) la densidad inicial de

células/quistes del dinoflagelado, teniendo en nuestro estudio (500 cél/mL), una

densidad más baja a la reportada (>1000 cél/mL) (Albinsson et al. 2014).

8.7. Cambios morfológicos de Gymnodinium catenatum en presencia de la

comunidad bacteriana

Gymnodinium catenatum es una especie que se caracteriza por la formación de

dos tipos de quistes, por el proceso sexual se obtienen los quistes de resistencia

mientras que en células vegetativas y móviles se llega a desarrollar una membrana

hialina que rodea a la célula, formándose un quiste temporal o pelicle (Figueroa,

2005). Ambos procesos de enquistamiento responden ante condiciones

desfavorables y son parte fundamental del ciclo de vida de la especie, al favorecer

sus eventos de proliferación (Figueroa et al. 2006; 2008).

La interacción bacteria-microalga se ha basado en la influencia que la

comunidad bacteriana tiene en la germinación y supervivencia de quistes de

resistencia en G. catenatum, más no en la formación de estos a partir del contacto

con las bacterias, ya que una de las principales características de estos quistes es la

ausencia de bacterias intracelulares producto de la doble capa que los protege

(Töbe, 2003). Sin embargo, la capacidad de producir quistes como respuesta a la

presencia de otras especies si ha sido reportada (Uchida et al. 1999),

específicamente, la formación de quistes temporales por efectos alelopáticos fue

descrita por primera vez en 2004 por Fistarol y colaboradores quienes expusieron

células del dinoflagelado Scrippsiella trochoidea a filtrados celulares de Alexandrium

tamarense.

En este estudio, no se encontraron quistes de resistencia pero si quistes

temporales, producto del contacto directo con la comunidad bacteriana,

presentándose en altos porcentajes durante la fase de siembra, aclimatación e inicio

del crecimiento exponencial, además de observarse distintos desarreglos

84

morfológicos en las células de G. catenatum modificando con ello la dinámica

poblacional de la especie (Albinsson, 2011).

Son varios los trabajos que han inducido la formación de quistes combinando

cultivos monoalgales (Blackburn, 1989; Green et al. 2004, 2010; Figueroa, 2005;

Figueroa et al. 2006; 2008; Albinsson, 2011; Bolch et al. 2011; Matsumoto, 2011;

Albinsson et al. 2014) y en todos se ha demostrado que G. catenatum presenta

distintas rutas de enquistamiento durante su ciclo de vida pero deben de existir

condiciones limitantes para su crecimiento como la deficiencia en los nutrientes

(N:P), estrés ambiental, cambios en su fotoperiodo, disminución de la temperatura,

entre otros, pero no se ha reportado la producción de quistes temporales por la

interacción con comunidades bacterianas, pero sí por contacto directo con una

rafidoficea (Fernández-Herrera, 2013). Por lo tanto, este es el primer reporte sobre la

inducción de quistes temporales en G. catenatum en presencia de una comunidad

bacteriana.

Los distintos desarreglos que se observaron (Fig. 33) ya habían sido descritos

por Figueroa y colaboradores (2006; 2008), no obstante, nosotros observamos

patrones de cambio característicos de la división sexual del planocigoto: pérdida de

flagelos, desarreglo en el citoplasma, en el cíngulo y sulcus, además de un núcleo

evidente con cromosomas condensados, característico de la fusión de gametos.

Dichas observaciones sustentan una de las hipótesis establecidas por los mismos

autores, que indica que los procesos sexuales se desencadenan como resultado de

una adición de nutrientes, provenientes quizá de los exudados bacterianos.

Otro evento observado fue la presencia de quistes en cadenas celulares, dando

la pauta a pensar que el proceso sexual es una ruta flexible y no unidireccional como

se pensaba ya que el enquistamiento de las cadenas celulares podría deberse a la

fusión de gametos con células vegetativas, a la fusión de dos cadenas o a la fusión

de células pertenecientes a la misma cadena (Figueroa et al. 2008).

85

Finalmente, el tiempo en el que se observaron los cambios estructurales en las

células de G. catenatum no corresponden con los reportados en trabajos previos (72

hrs para la obtención de un quiste del planocigoto) ya que nosotros los observamos 3

hrs después de la inoculación de la comunidad bacteriana.

8.8. Perfil de pigmentos

8.8.1. Cianobacteria

En general, los pigmentos fotosintéticos tienen una distribución específica y

restringida a una clase de microalgas, así como la peridinina es el pigmento

característico de los dinoflagelados, la clorofila a y sus pigmentos accesorios,

comúnmente denominados ficobilisomas, son los pigmentos principales de las

cianobacterias (Ludeña-Hinojosa, 2007).

No obstante, la clorofila a no es el único pigmento encontrado en las

cianobacterias ya que estas necesitan aumentar el rango de absorción de luz

utilizado para la fotosíntesis, en especial, a longitudes de onda donde la clorofila

tiene una absorción baja (Rosales-Loaiza et al. 2008). Es por esta misma razón que

el perfil de pigmentos característico de este grupo de organismos incluye a los β-

carotenos y a la zeaxantina, quienes actúan en el fotosistema I y II, respectivamente,

haciendo más eficiente la captura de la luz.

Como se ha venido mencionando, la comunidad bacteriana presente en cepas

específicas de G. catenatum está formada por bacilos, bacterias heterótrofas

filamentosas y una cianobacteria, evidenciando su presencia con el perfil de

pigmentos descrito en la figura 32, donde se observa la presencia, en un alto

porcentaje, de clorofila a, zeaxantina y β-caroteno. No obstante, también

presenciamos otro pigmento accesorio, la diadinoxantina, que es una xantofila que

está reemplazando a las ficobilinas y su presencia al igual que la de la zeaxantina se

86

ha observado en condiciones de alta intensidad de luz (>150 µmolm-2s-1) (Pérez-

Rontomé, 2000).

En estudios previos se han encontrado estos mismos pigmentos, reportándose

como característicos de la picocianobacteria Synechococcus-DC2, observándose

características de cultivo similares como el fotoperiodo de 12:12 hrs luz:ocuridad,

agua de mar filtrada y estéril adicionada con vitaminas, una temperatura de 23 ± 1 °C

y a 155 µmolm-2s-1 de irradiancia, por lo que Díaz-Hérnández (2010) menciona que

los posibles cambios en el perfil de pigmentos pueden deberse a altas irradiancias,

concentraciones elevadas de N2 y al incremento en nutrientes.


bacteriana

El perfil de pigmentos característico de G. catenatum está conformado por 10

pigmentos: carotenoides polares, clorofila c, peridinina, cis-peridinina, dinoxantina,

diadinoxantina, diatoxantina, carotenoides, clorofila a y β-carotenos, coincidiendo con

el descrito para otros dinoflagelados como Gyrodinium resplendens y Gymnodinium

sanguineum (Hallegraeff et al. 1991).

Estudios anteriores mencionan que el contenido de pigmentos fotosintéticos

puede cambiar como respuesta a factores causantes de estrés, a la capacidad

fotosintética o al estado de desarrollo en el que se encuentre la microalga, no

obstante, dado que de los ocho pigmentos obtenidos en los perfiles (Figs. 36-39)

solamente uno es característico de la cianobacteria, las diferencias encontradas en la

producción de dinoxantina, diatoxantina y peridinina se puede atribuir a las

diferencias en la densidad celular de G. catenatum en presencia/ausencia de la

comunidad bacteriana (Fig. 24).

87

8.9. Perfil de toxinas paralizantes

La presencia de toxinas hidrofílicas, tanto en cepas mexicanas como en cepas

de otros países, ha sido un tema bastante controversial, discutido e investigado. En

el caso de las cepas mexicanas, Band-Schmidt y colaboradores (2010) hicieron una

revisión y concluyen que de manera característica, G. catenatum produce los

análogos STX, neoSTX, GTX2-3, dcGTX2-3, B1-2 y C1-2. Las toxinas decarbamoil

(dcGTX2-3) y N-sulfocarbamoil (C1-2), son generalmente los análogos con mayor

contribución molar, sin embargo, se ha determinado que la presencia, ausencia y

proporción de los análogos varía constantemente entre cepas y poblaciones, y a la

fecha no se conoce una cepa de G. catenatum que produzca todos los análogos,

aunque típicamente todas las cepas sintetizan más de uno (Cembella, 1998).

También se han reportado variaciones dentro de las mismas poblaciones y

diferencias en las proporciones de los análogos en función de factores físicos

(salinidad y temperatura) y nutricionales (medio de cultivo) (Camino-Ordás et al.

2004; Band-Schmidt et al. 2004, 2006, 2014; Gárate-Lizárraga et al. 2005; Oh et al.

2010; Bustillos-Guzmán et al. 2012, 2015; Albinsson et al. 2014). Dado que todos

estos factores fueron controlados en nuestros tratamientos y que la única variable fue

la presencia/ausencia de la comunidad bacteriana podemos atribuir los cambios en el

perfil de toxinas y en la toxicidad a la presencia de este factor biótico.

Son numerosos los trabajos donde se reportan los distintos análogos

producidos por G. catenatum y básicamente dependiendo el método para su

detección y análisis serán los análogos reportados. Específicamente, Negri y

colaboradores (2007) describen la producción de al menos 21 análogos de STX en

G. catenatum, sin embargo, para cepas mexicanas Bustillos-Guzmán y

colaboradores (2015) reportan 25 análogos: 10 hidrofílicos (toxinas carbamoil:

GTX2/3; decarbamoil: dcSTX, dcNEO y dcGTX2/3 y N-sulfocarbamoil: C1/2 y B1/2) y

15 tipo benzoil (GC1-6, GC1a-5a y GC1B, 2b, 4b y 5b). De los análogos descritos, no

fueron detectados los de tipo benzoil y las toxinas B1/2 en este trabajo y no hubo

diferencias en el número de análogos entre cepas, como lo reporta Band-Schmidt y

88

colaboradores (2006), quienes encontraron un mayor número de análogos en cepas

de Bahía Concepción en medio GSe.

En la mayoría de las cepas, con excepción de la 62L (Fig. 39), las toxinas

C1/2 (N-sulfocarbamoil) mostraron abundancias relativas constantemente superiores

a 70 % pmol, llegando a representar hasta el 95.79 % pmol en GCCV-7. La alta

proporción de toxinas C se considera una característica de G. catenatum, con pocas

excepciones (Band-Schmidt et al. 2010), lo que coincide con los resultados obtenidos

en este estudio. La única excepción fue la cepa 62L al mostrar una mayor proporción

de toxinas decarbamoil en ausencia de la comunidad bacteriana lo cual nos

explicaría la mayor toxicidad de esta cepa, ya que el factor de toxicidad relativa es

superior a la de las toxinas C1/2. Este patrón coincide con los de Gárate-Lizárraga y

colaboradores (2005) y Band-Schmidt y colaboradores (2006) quienes encontraron

una mayor proporción de dcNEO en cepas de Bahía de La Paz.

Se ha sugerido que la proporción de dcNEO está directamente relacionada

con el largo de las cadenas celulares (Band-Schmidt et al. 2006), lo cual coincidiría

con este estudio porque 62L fue una de las cepas que presentó mayor proporción de

esta toxina en ausencia de la comunidad bacteriana, pues en presencia de la misma,

la proporción de cadenas celulares largas se inhibió al igual que la producción de

este tipo de toxina.

El resto de las toxinas, pertenecientes al grupo de las carbamoil (GTX2/3) se

encontraron constantemente en muy bajas proporciones, no superando el 2 % del

total, lo cual también ha sido reportado como característico de la especie (Hallegraeff

et al. 2011).

Los perfiles de toxinas permanecieron relativamente constantes en todas las

cepas, algunas diferencias podrían deberse a: deficiencias nutricionales, a un

desacoplamiento en la síntesis de toxina durante la división celular, asincronía en la

división celular en los tratamientos, o bien, modificaciones en el ciclo de vida debido

a que los genes relacionados en la producción de toxinas se expresan en diferentes

89

niveles del mismo, por lo que si este sufre alguna alteración, la producción de toxinas

se afectará (Anderson et al. 1990; Taroncher-Oldenburg et al. 1997, 2000; Zhuang et

al. 2012).

8.10. Toxicidad

Los resultados en este trabajo mostraron un patrón de cambio en la toxicidad

celular de G. catenatum, ya que en presencia de la comunidad bacteriana, disminuye

la producción de toxinas decarbamoil y N-sulfocarbamoil en la mayoría de las cepas,

excepto en la cepa GCCV-7 que fue la más tóxica y a su vez la que presentó una

mayor contribución de toxinas carbamatadas y decarbamoil.

Para cepas de G. catenatum se ha calculado la toxicidad promedio, variando

de una región a otra. Particularmente para cepas mexicanas Bustillos-Guzmán y

colaboradores (2012) reportaron valores de entre 21.75 ± 2.93 y 10 pg STX eq/cél en

cepas de Bahía Concepción; Band-Schmidt y colaboradores (2006) reportan una

toxicidad promedio de 13 a 101 pg STX eq/cél para cepas de Bahía de Mazatlán y

Durán-Riveroll (2014) encuentra valores máximos de 28 ± 5.1 y mínimos de 1.2 ± 0.3

pg STX eq/cél.

Sin embargo, en este estudio se encontraron valores máximos de 103.2 ± 43 y

mínimos de 1.7 ± 0.5 pg STX eq/cél en presencia de la comunidad bacteriana, siendo

el valor máximo superior a lo reportado, lo cual podría asociarse a dos cosas: 1) la

liberación de exudados bacterianos ricos en nitrógeno que favorecen la producción

de toxinas en el dinoflagelado y 2) la producción autónoma de toxinas PSP por parte

de la cianobacteria (Orr et al. 2013).

De acuerdo con Anderson y colaboradores (1990), el contenido de toxina es

un reflejo de la cantidad inicial de toxina en una célula y el equilibrio entre la síntesis

y la pérdida de la misma, ya sea por liberación al medio, catabolismo o división

celular. Sin embargo, en cepas que han sido inoculadas con bacterias específicas se

90

ha observado un patrón de disminución en la toxicidad celular, sugiriéndose que las

bacterias son factores de estrés y/o que liberan al medio metabolitos secundarios

precursores que desencadenan la síntesis de la toxina (Albinsson, 2011; Albinsson et

al. 2014).

IX. CONCLUSIÓN

Este estudio encontró una variación considerable en la dinámica de

crecimiento de Gymnodinium catenatum en presencia de una comunidad bacteriana

integrada por tres distintos microorganismos: bacterias heterótrofas filamentosas,

bacilos intracelulares y una cianobacteria extracelular que rodea a las células del

dinoflagelado en forma de parche. Sin embargo, con la información obtenida en el

presente trabajo no podemos determinar con exactitud el tipo de relación ecológica

entre estos microorganismos y el dinoflagelado pero basados en nuestros resultados,

proponemos la hipótesis de que la interacción entre las bacterias intracelulares, la

cianobacteria extracelular y el dinoflagelado es bimodal: durante la fase de

crecimiento exponencial del cultivo la relación es mutualista al presentarse un

crecimiento óptimo en todos los organismos.

Mientras que al envejecer el cultivo e iniciando la fase de declive, esta

interacción se vuelve parasitaria, debido a las modificaciones en el ciclo de vida que

presenta G. catenatum, desarrollando quistes temporales y cambios morfológicos en

sus células, lo que desencadena una alta mortalidad. Esta hipótesis nos permitiría

explicar la rápida desaparición de los florecimientos algales nocivos en la naturaleza,

sin la exclusión de otros factores.

En cuanto al crecimiento, no queda claro si estos microorganismos lo

favorecen ya que se obtuvo un factor estimulante en dos cepas e inhibitorio en otras

dos pero la formación de cadenas más largas de células si se ve favorecida, al

disminuir la proporción de aparición de células individuales en todas las cepas a lo

largo del cultivo. Además, la presencia de la comunidad bacteriana incrementó la

producción de la clorofila a, zeaxantina y β-carotenos.

91

Finalmente, los resultados de este estudio indican que la comunidad

bacteriana desempeña un papel importante en la producción de toxinas paralizantes

de G. catenatum, debido probablemente a interacciones bioquímicas entre especies.

Si bien es cierto que el perfil de toxinas no presentó modificaciones, si se muestra

que la cantidad total de toxina por célula disminuye, considerando a las bacterias y a

la cianobacteria, agentes estresantes. No obstante, aún se debe seguir estudiando

esta interacción ya que son muchas las interrogantes que quedan sin indicios de

respuesta, además que los mecanismos de acción son totalmente desconocidos.

X. LITERATURA CITADA

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