efecto de la temperatura sobre el semen criopreservado de dos genotipos bovinos del bos indicus

7/23/2019 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL SEMEN CRIOPRESERVADO DE DOS GENOTIPOS BOVINOS DEL BOS INDICUS

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Revista CITECSA - INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ Volumen 6; Nmero 10. Octubre-2015

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL SEMEN CRIOPRESERVADO DEDOS GENOTIPOS BOVINOS DEL BOS INDICUS

Temperature effects on cryopreserved semen from two bovine genotypes of BosIndicus

Efeito da temperatura sobre o smen criopreservado de dois gentipos bovinos do

Bos Indicus

Villa Duque, Norberto1. Chaverra Benavides, Swelen2. Garca Rojas, Darwin3.Nieto Omeara, Nathalia4. Ortiz Sanchez, Jorge5.

Recibido: 27 de Agosto de 2015Aceptado: 17 de Noviembre de 2015

Resumen

El presente trabajo evalu la criopreservacin a -196C, la descongelacin y laaplicacin del semen, en 33 ganaderas bovinas del Magdalena Medio y se estudi,in vitro, el efecto de los errores encontrados sobre la supervivencia e integridad delas membranas espermticas. La recoleccin de informacin en fincas se realizmediante formulario especfico. El estudio in vitrose ejecut en el laboratorio deBiotecnologa Reproductiva Animal del Instituto Universitario de la Paz(Barrancabermeja, Colombia), y consisti en someter pajillas comerciales de 0.5 mlde toros Braman y Gyr a la tcnica instrumental convencional y a tres modificacionesde la misma (errores frecuentes), en un diseo completamente al azar. En ningunade las fincas evaluadas se aplic correctamente la prctica de la inseminacin

artificial (IA). Los errores ms frecuentes y notorios fueron: el exceso de tiempoutilizado para la extraccin de la pajilla del termo de almacenamiento, la

1 MVZ, MSc, Docente Escuela de MVZ. Grupo de investigacin en produccin y [email protected]

2MVZ, Estudiante tesista. UNIPAZ.3MVZ, Esp. Docente Escuela de MVZ.UNIPAZ.4Bact. Docente Escuela de MVZ. UNIPAZ.5Estad.MSc. Docente Escuela de Ciencias. UNIPAZ

CITECSAR E V I S T A

Ciencia Tecnolo a Sociedad Ambiente

B a r r a n c a b e r m e j a C o l o m b i aI S S N : 2 0 2 7 - 6 7 4 5
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Revista CITECSA - INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ Volumen 6; Nmero 10. Octubre-2015Villa, N. Chaverra, S. Garca, D. Nieto, N. Ortiz, J.

descongelacin de la pajilla en la axila y la no combinacin correcta entre tiempo ytemperatura. No existi diferencia significativa (P>0.01) entre los tratamientosevaluados para la supervivencia (S),la integridad acrosmica(MAN)y la integridadestructural de la membrana plasmtica(MPN). No obstante toman relevancia los

resultados porcentuales respecto al tratamiento convencional, los cuales, fueron losnicos que estuvieron por encima de las medias establecidas como mnimas enfavor de la capacidad fecundante del semen. Los valores ms bajos parasupervivencia, integridad y resistencia de membranas correspondieron al semen delgenotipo Brahman. Los resultados evidenciaron, en el genotipo Gyr, una mayorresistencia a la injuria y a la accin deletrea por efecto de la criopreservacin y porefecto de las fallas en el manejo de la temperatura en el momento de ladescongelacin de la pajilla.

Palabras clave: Acrosoma, inseminacin, genotipo, plasmtica, supervivencia

Abstract

This paper evaluated the cryopreservation effect; thawing and semen application in33 bovine herds in the Middle Magdalena and studied, in vitro, the effect of the founderrors on the integrity of the sperm membrane. Information on farms was performedusing specific form. The in vitro study was carried out in the laboratory ofReproductive Animal Biotechnology of Instituto Universitario de la Paz and consistedin putting commercial straws of 0.5 ml of Brahmanand Gyrbulls to the conventionaltechnique and to three amendments thereto (errors) by a randomized design. Noneof the evaluated farms applied correctly the practice of artificial insemination (AI).

The glaring errors were: excess time used to extract the straw, thawing in the armpitand not right combination of time and temperature. There was no significantdifference (P> 0.01) between the evaluated treatments for survival (S), the acrosomeintegrity (MAN) and the structural integrity of the plasma membrane (MPN). Becomesignificant the resulted percentages compared to conventional treatment, whichwere above the averages established as minimum in favor of the fertilizing capacityof semen. The lowest values for survival, integrity and resistance membranecorresponded to genotype Brahman semen. The Gyr genotype showed a greaterresistance to injury and deleterious action by effect of cryopreservation and the effectof failures in the handling of the temperature at the time of defrosting of the straw.

Key words: Acrosome, insemination, genotype, plasmatic, survival

Resumo

O presente trabalho avaliou a criopreservao a -196C, o descongelamento e aaplicao do smen, em 33 fazendas bovinas do Magdalena Meio e estudou-se, invitro, o efeito dos erros encontrados a respeito da supervivncia e integridade dasmembranas espermticas. A coleta da informao em fazendas realizou-se


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mediante formulrio especfico. O estudo in vitro executou-se no laboratrio deBiotecnologia Reprodutiva Animal do Instituto Universitrio da Paz(Barrancabermeja, Colmbia), e consistiu em someter canudos comerciais de 0.5ml de touros Braman e Gyr tcnica instrumental convencional e a trs

modificaes da mesma (erros frequentes), em um design completamente aoacaso. Em nenhuma das fazendas avaliadas aplicou-se corretamente a prtica dainseminao artificial (IA).Os erros mais frequentes e notrios foram: o excesso detempo utilizado para a extrao do canudo da termo de armazenamento, odescongelamento do canudo na axila e a no combinao correta entre tempo etemperatura. No existiu diferena significativa (P>0.01) entre os tratamentosavaliados para a supervivncia (S), a integridade acrossmica (MAN) e aintegridade estrutural da membrana plasmtica (MPN). No entanto tomamrelevncia os resultados percentuais a respeito do tratamento convencional, osquais, foram os nicos que estiveram por encima das medias estabelecidas comomnimas e favor da capacidade fecundante do smen. Os valores mais baixos parasupervivncia, integridade e resistncia de membranas correspondem ao smen dogentipo Brahman. Os resultados evidenciaram, no gentipo Gyr, uma maiorresistncia injria e ao deletria pelo efeito da criopreservao e pelo efeitodas falhas no manejo da temperatura no momento do descongelamento do canudo.

Palavras chave: Acrossma, inseminao, gentipo, plasmtica, supervivncia

Introduccin

La IA, biotecnologa reproductiva ms empleada en las empresas ganaderas, es defcil implementacin. Su consolidacin se ha logrado a partir del uso de semencongelado empacado en pajillas de 0.25 y 0.5 ml y de su aplicacin en el cuerpo deltero mediante una tcnica instrumental (TI) especfica (Foote, 2002). La utilizacinde esta biotecnologa ha contribuido notoriamente al mejoramiento gentico y alaumento de la productividad y rentabilidad de los hatos ganaderos en los cuales seha implementado; no obstante, errores en la prctica instrumental pueden afectarde manera grave la clula espermtica en detrimento de la fertilidad y laproductividad de la empresa (Nur et al, 2006; Pace et al, 1981).

La evaluacin de la fertilidad de un reproductor y la manera como es afectada porla manipulacin del semen, ya sea en fresco o criopreservado, requiere un mayorestudio de los factores involucrados en el proceso (Barth and Waldner, 2002;Saacke, 2003). La calidad del semen de un toro puede afectarse intrnseca yextrnsecamente (Barth and Waldner, 2002). En el primer caso, segn Spitzer,(2000) los factores pueden ser genticos, nutricionales, txicos, de estrs y edad.En el segundo caso puede ser por fallas en la manipulacin del semen, las cualesderivan de los protocolos de congelacin y descongelacin y no de la permanenciaa temperaturas bajas, siempre y cuando sean las indicadas (Correa et al; 1996;Pickett et al; 1978).


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La criopreservacin de semen a -196C detiene todos los procesos metablicos, loque permite su conservacin de manera indefinida (Nebel, 1997). Sin embargo,tanto en la criopreservacin como en la descongelacin se pueden presentar erroresque inducen alteraciones en las membranas celulares, los organelos y la interaccin

clula-clula, que a la postre afectan la capacidad fecundante del espermatozoide(Woods et al; 2004). El retorno a las condiciones fisiolgicas que ocurre durante ladescongelacin, es crtico para la supervivencia celular (Mazur, 1984), y los pasosinvolucrados en la descongelacin exigen mximo cuidado con el tiempo, latemperatura y la manipulacin de la pajilla; as por ejemplo, la descongelacin depajillas por ms de 30 segundos en temperaturas mayores a los 37C redundar enmayor nmero de alteraciones de las membranas espermticas (Correa et al; 1996;Rodrguez et al; 1975), y en porcentajes ms altos de retorno al celo (Almquist, etal; 1982; Pace et al, 1981).

Alteraciones similares suceden, cuando se manipulan las pajillas por fuera del cuellodel termo de almacenamiento, o cuando los niveles de nitrgeno lquido soninsuficientes para mantener la temperatura de -196C (Berndtson and Pickett,1978). Adems, las bajas temperaturas estn asociadas con el aumento de larigidez de la membrana espermtica, y con la reduccin de la velocidad delmovimiento de molculas a travs de la membrana, mediante los procesos detransporte activo, que terminan sometiendo la clula a estrs osmtico (Mendoza;et al; 2000; Watson, 2000) o a shock por fro, con los consecuentes cambios en laestructura del acrosoma (Brown et al; 1982; Nur et al, 2006).

Con el objetivo de detectar errores por parte de los inseminadores en laimplementacin de la TI con semen congelado, se observaron 33 hatos en elMagdalena Medio, se replicaron los principales en el Laboratorio y se evalu elefecto de los mismos sobre la supervivencia y la integridad de las membranasespermticas.

Materiales y mtodos

Primera faseEn esta fase se analizaron las condiciones de criopreservacin a -196C,descongelacin y aplicacin del semen, en 33 ganaderas bovinas del MagdalenaMedio. El anlisis de las condiciones de criopreservacin a -196C, se bas en laevaluacin de las condiciones de almacenamiento del termo de criopreservacin,del nivel de nitrgeno lquido, y del estado de las principales partes del termo (tapa,canastillas, escalerillas, cubierta externa y regla para verificacin del nivel denitrgeno). Las condiciones de manipulacin, descongelacin y aplicacin delsemen, se registraron directamente en el momento de la actuacin de cada uno delos 33 inseminadores. La recoleccin de la informacin en las fincas se realizmediante el diligenciamiento de un formulario elaborado previamente para este fin.

Segunda fase


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Una vez analizados los 33 formularios se seleccionaron los errores ms relevantes,con el propsito de establecer su efecto sobre la supervivencia y la integridad de lasmembranas espermticas (plasmtica y acrosomal), mediante modelo experimentalin vitro, desarrollado en el Laboratorio de Biotecnologa Reproductiva Animal

(LABRA) del Instituto Universitario de la Paz (Barrancabermeja, Santander,Colombia). El material experimental usado fueron pajillas comerciales de 0.5 ml(30x106 epzs), de toros Brahman y Gyr. Se probaron cuatro tcnicas instrumentales,diseadas para simular los errores detectados en finca, a saber:

TI1.Protocolo convencional: extraccin de las pajillas del termo de almacenamientoen menos de 10 segundos y descongelacin en agua a 37C durante 30 segundos.

Antes de vaciar la pajilla se sec con servilleta estril y su contenido (500l) seutiliz para el anlisis in vitro.

TI2.Descongelacin en la axila: la descongelacin de las pajillas se realiz en laaxila durante 30 segundos, antes de utilizar su contenido para el anlisis in vitro.

TI3.Descongelacin de la pajilla durante ocho minutos: la temperatura del aguapara descongelar la pajilla fue de 37C, pero el tiempo de descongelacin seextendi durante ocho minutos antes de utilizar su contenido para el anlisis in vitro.

TI4.Extraccin incorrecta de la pajilla: la canastilla y la escalerilla con las pajillas,fueron expuestas por fuera del cuello del termo de criopreservacin, durante 30segundos, tres veces diarias, cuatro das consecutivos, antes de utilizar sucontenido para el anlisis in vitro.

En la implementacin de las cuatro (3) TI, aparte del error, el desarroll estuvo deacuerdo al protocolo convencional establecido. La descongelacin de las pajillas enla TI4 se realiz segn el protocolo convencional, es decir, a 37C por 30 segundos(Nur et al, 2006; Pickett et al; 1978).

Con el fin de descartar el criopreservante, el cual imposibilita la evaluacin objetivade las variables, en los cuatro protocolos, una vez realizada la descongelacin dela pajilla, se diluy el semen en 3.5 ml de solucin salina fosfato-bufferada (PBS)por sus siglas en ingls: (phosphate buffered saline), a 37C, se centrifug a 500 gdurante 5 minutos, y se elimin el sobrenadante. Este proceso se realiz dos veces;el sedimento se utiliz para realizar el anlisis in vitro (Brackett and Oliphant, 1975;Risopatron et al; 1994).

Las variables evaluadas fueron:Supervivencia (S): para esta evaluacin se utiliz la tincin eosina-nigrosina (Mayeret al., 1951), utilizando los reactivos separadamente. El conteo se realiz en elMicroscopio de campo claro (magnificacin 400X). El resultado se dio en porcentajede vivos.


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Integridad de la Membrana Acrosomal (MAN):la evaluacin se realiz siguiendoel protocolo propuesto por (Prathalingam et al., 2007; Revell and Mrode, 1994;Rubio et al., 2009). Para el conteo se utiliz el microscopio de contraste de fase(magnificacin 400X). El resultado se dio en porcentaje de espermatozoides con

cresta apical normal (NAR, por sus siglas en ingls).Integridad Bioqumica de la membrana Plasmtica (MPN):la valoracin se hizode acuerdo con el protocolo propuesto por (Perez-LLano et al., 2001). El conteose realiz en el microscopio de contraste de fase (magnificacin de 400X), paradeterminar los positivos. El resultado se dio en porcentaje de espermatozoidespositivos.

MPN/MAN: La integridad de ambas membranas se realiz fijando losespermatozoides con glutaraldehido al 2% en una solucin ORT (OsmoticResistance Test, en dilucin 1:1), utilizando un microscopio de contraste de fases(magnificacin 400X). El resultado se dio en porcentaje (Daz et al., 2009).

Tratamiento de la informacin

Para el anlisis de los resultados de la primera fase se utiliz la estadsticadescriptiva. Los resultados de la segunda fase se describen a travs de grficos decajas y bigotes BOXPLOT, y a travs de tablas de contingencia. Se compararonlos resultados en cada genotipo respecto a los tratamientos usados, mediante laprueba no paramtrica Jonckheere-Terpstra de alternativas ordenadas paramuestras independientes (tratamientos), y la prueba U de Mann-Whitney paraevaluar diferencias entre los genotipos para cada uno de los tratamientosempleados. Las pruebas estadsticas se compararon al nivel de significacinmxima de 0.05, usando el programa IBM SPSS Statistics 22.0.

Resultados Y Discusin

Primera fase:En la siguiente tabla se describen los hallazgos encontrados en las 33 fincasevaluadas en estas zonas del Magdalena Medio respecto a las condicionespropuestas para el desarrollo de este trabajo: condiciones fsicas del termo,almacenamiento del termo, nivel del nitrgeno lquido, extraccin y descongelacindel semen y caractersticas de la inseminacin.

Como se indica en la Tabla 1, los resultados detallan irregularidades respecto a laestructura fsica y almacenamiento del termo de criopreservacin. Fallas en elmantenimiento del nivel del nitrgeno lquido. Igualmente fallas en el procedimientoinstrumental, desde la extraccin de la pajilla del termo, hasta la puesta del semenen el cuerpo del tero de la hembra bovina. Situaciones que comprometen laviabilidad espermtica y la fertilidad del hato (Catena and cabodevila, 1999).


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Tabla 1.Sntesis de los hallazgos.

ITEMCON FALLAS

(%)SIN FALLAS

(%)CONDICIONES DEL TERMO 3 97ALMACENAMIENTO DEL TERMO 85 15

NIVEL DE NITR GENO 18 82EXTRACCIN Y DESCONGELACINDEL SEMEN

95 5

CARACTER STICAS DE LAINSEMINACIN

90 10

Algunos de los termos observados, estaban almacenados en sitios con malaventilacin y estaban expuestos a la accin directa del sol. Otros, no solamenteestaban expuestos a la luz solar, sino tambin, almacenado en sitios mal ventilados.

Adems, se encontraron en zonas donde la temperatura ambiental promedio fue de32-34C, situacin que segn la comisin de urgencias mdicas de Madrid (URM)en sus recomendaciones para el uso del nitrgeno lquido, puede ocasionar, desde

una evaporacin exagerada de este, hasta un comprometimiento de la seguridadpersonal de quien los manipula. De acuerdo con Aga Fanoel nitrgeno lquido noes txico, pero puede causar asfixia al desplazar el oxgeno del aire; adems laexposicin a un ambiente deficiente de oxgeno (< 19.5%) puede causar mareo,nuseas, vmito, depresin, salivacin excesiva, disminucin de la agudeza mental,prdida de conocimiento y muerte.

En algunas fincas los termos se encontraron con irregularidades en la tapa y en laparte externa, situacin que podra ocasionar prdida de nitrgeno o como loafirman Grub and Wattiaux, (2006) o provocar un estallamiento del mismo por uncierre hermtico o por un bloqueo de la tapa. Las investigaciones de Berndtson and

Pickett, (1978); Pickett et al., (1978)explican la necesidad de mantener los nivelesde nitrgeno lquido en los termos de conservacin de semen bovino, en un nivelmnimo que permita mantener la temperatura al interior de ellos en -196C, aunqueestos se construyan de diferentes dimensiones y Pace et al., (1981)agrega, quems importante que el nivel del nitrgeno, es el hecho de que este produzca lossuficientes vapores para mantener la temperatura alrededor de los -196C y nocorra riesgo el proceso de criopreservacin.

El promedio del tiempo utilizado para la extraccin de la pajilla en las 33 fincasobservadas estuvo por encima del mnimo permitido (10-15 segundos) y lamanipulacin de la misma por fuera del cuello del termo fue observada en varias de

ellas. Situacin, que de acuerdo con Grub and Wattiaux, (2006); Looper, (2000)producen cambios de temperatura en la pajilla que conllevan daos de susorganelos y malos resultados en la fertilidad del hato; el dao depende del grado yduracin del calentamiento: hay ms dao cuanto ms aumenta la temperatura yms veces se realiza este calentamiento; el dao no se puede ver externamente, nise arregla si se almacena la pajilla otra vez correctamente.


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De los Inseminadores que descongelaron la pajilla en agua caliente, algunos lohicieron durante tiempos diferentes. Inseminar con pajillas descongeladas porencima de 37C durante ms de 30 segundos, segn las investigaciones de Correaet al., (1996); Pace et al., (1981); Pickett et al., (1978); Zekariya et al., 2006)

mostraron los ndices ms altos de retorno al celo despus de la inseminacin.Casi el 50% de los Inseminadores observados, utilizaron para la descongelacinde las pajillas con semen, recipientes sin tapa, situacin que de acuerdo con Angellet al., (2009); Tortolero et al., (2005), al quedar expuestas a la accin de los rayosultravioleta, podran ocasionarle daos al semen, que iran desde la produccin deespecies reactivas de oxgeno (ROS),hasta la fragmentacin del ADN. Si a esteltimo proceder se le agrega el hecho de que varios de los Inseminadoresobservados , no secan la pajilla antes de montarla en el inyector, como lo afirmanHafez, (2002); Schroeder, (1999),las posibilidades de ocasionar infecciones alinterior del tracto reproductivo de la hembra bovina aumentan.

En las observaciones se reportaron inseminadores que descongelaron la pajilla enla axila, hecho inusual en la implementacin correcta de este protocolo; utilizar estemtodo de descongelacin sometera a la pajilla con semen a una variacin detemperatura que podra conducir a dao de las membranas espermticas o a unaexcesiva produccin de radicales libres (RL),con el consecuente dao de la clula(Tortolero et al., 2005).

Cada pajilla debe ser utilizada en los primeros cinco minutos despus de sudescongelamiento, ya que las clulas espermticas descongeladas no solo sonsusceptibles a la temperatura, sino que tambin consumen sus reservasrpidamente (Grub and Wattiaux, 2006). Varios de los Inseminadores observados,en las 33 fincas visitadas, se demoraron ms de 5 minutos en el proceso de sacarla pajilla, montarla en el inyector (pistola) y ponerla en el tracto reproductivo de lahembra bovina dispuesta para inseminar. Situacin que compromete la membranaespermtica, al ser sometida a estrs, ocasionando cambios lipdicos en la mismade difcil reversin (Drobnis et al., 1993; Watson, 2000).Al existir prdida de lpidos,la membrana plasmtica se afecta por prdida de su capacidad de expansindurante la rehidratacin al volver a condiciones isotnicas (Seidel, 2006).

Segunda fase:Las cuatro tcnicas instrumentales, diseadas para simular los errores detectadosen finca evidenciaron los siguientes resultados relacionados en la tabla 2.

Se us la prueba estadstica Jonckheere-Terpstra para comparar el efecto de lostratamientos, entre toros Brahmn y Gyr.


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Tabla 2. Distribucin de los tratamientos segn genotipos evaluados.Genotipo

TotalBrahman Gyr

N % N % N %

Tratamiento

Convencional 3 25,0% 3 25,0% 6 25,0%

Descongelacin en la axiladurante 30 seg. 3 25,0% 3 25,0% 6 25,0%

Descongelacin por 8 min. 3 25,0% 3 25,0% 6 25,0%Por fuera del cuello deltermo

3 25,0% 3 25,0% 6 25,0%

Total 12 100,0% 12 100,0% 24 100,0%

Segn los resultados de la tabla 3, no hay evidencia suficiente en la muestra paraafirmar que exista diferencia significativa para la supervivencia entre los genotiposevaluados en la investigacin, lo cual se afirma con una confianza del 95%.

Tabla 3.Comparacin del porcentaje de supervivencia espermtica entre los Genotipos Brahmn yGyr.

Genotipo Estadstico de pruebaestandarizado1

N p

Brahmn -0.995 12 0.320Gyr 0.498 12 0.618

1 Prueba de Jonckheere-Terpstra de alternativas ordenadas para muestras independientes.

Tabla 4. Comparaciones del porcentaje de supervivencia espermtica entre los Tratamientos.

TratamientosU de Mann-Whitney

estandarizadan p

Convencional 1.091 6 0.400Descongelacin en la axila durante 30seg.

1.091 6 0.400

Descongelacin por 8 min. 1.964 6 0.100Por fuera del cuello del termo 1.964 6 0.100

Los porcentajes de supervivencia entre Brahmn y Gyr no varan entre lostratamientos de descongelacin empleados, en forma significativa, al nivel 0.05.

En la figura 1 se observa en trminos descriptivos, que el porcentaje desupervivencia espermtica difiere entre los genotipos bajo los tratamientosDescongelamiento por 8 minutos y Por fuera del cuello del termo y difierenlevemente para los tratamientos restantes. Por otro, lado los mayores porcentajesde supervivencia se observan en el genotipo Gyr bajo los tratamientos

Convencional y Descongelacin por 8 minutos y Por fuera del cuello del termo.

As no se haya presentado diferencias significativas entre los tratamientos, en estaevaluacin, lo porcentual toma mayor relevancia. Cinco (5) de las seis (6) muestrassuperaron los porcentajes mnimos aceptables (40% en semen congelado-descongelado), segn lo propuesto e investigado por (Barth et al., 2000; Catenaand Cabodevila, 1999; Gmez and Migliorisi, 2009), basados en las normasmnimas exigidas por el Departamento de Medicina del Rodeo y Teriogenologia de


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la Universidad de Saskatchewan, Canad y que se corresponden con las de lasnormas ISO 9002. Una muestra espermtica del semen de Brahmn, no alcanzeste mnimo, el resultado se da cuando la pajilla se descongel en la axila (protocolono convencional). Los resultados, para la supervivencia, estuvieron por debajo de

los obtenidos por Cabrera and Pantoja, (2012) solo por el efecto de lacriopreservacin, lo que podra estar sugiriendo efecto a causa de las fallas en laimplementacin de la Tcnica Instrumental.

Figura 1. Distribucin de la supervivencia en Brahmn y Gyr bajo cuatro diferentes metodologas dedescongelacin.

Inseminar con semen descongelado con porcentajes por debajo de los mnimos desupervivencia exigidos, comprometera la fertilidad y la productividad del hato engeneral, si se tienen en cuenta todos los aspectos relacionados con el transportedel espermatozoide y la capacitacin espermtica a que estn sometidas estasclulas antes de alcanzar el mpula del oviducto y ser capaz de fecundar un vulo(Hafez, 2002).

Segn la tabla 5, se observa que no hay evidencia suficiente en la muestra, paraafirmar que exista diferencia significativa para la evaluacin de la MembranaPlasmtica por efecto de los genotipos evaluados en la investigacin, lo cual seafirma al comparar los resultados en Brahmn y en Gyr, al nivel de significacin0.05.


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Tabla 5. Comparaciones del porcentaje de Membrana Plasmtica (Test de HOST) entre losGenotipos Brahmny Gyr.

GenotipoEstadstico de prueba

estandarizado1n p

Brahmn -1.279 12 0.201Gyr -0.855 12 0.3931Prueba de Jonckheere-Terpstra de alternativas ordenadas para muestras independientes.

Tabla 6. Comparaciones del porcentaje de Membrana Plasmtica (Test de HOST) entre losTratamientos.


estandarizadan p

Convencional 1.798 6 0.100Descongelacin en la axila durante30 seg.

1.771 6 0.100

Descongelacin por 8 min. 0.218 6 1.000

Por fuera del cuello del termo 1.964 6 0.100

Las comparaciones del porcentaje de membrana plasmtica entre Brahmn y Gyr,indicaron que no hay evidencia estadstica suficiente en la muestra para afirmar queexista diferencia significativa entre los tratamientos implementados, utilizandoHOST, lo cual se afirma al nivel 0.05.

En la figura 2, de forma descriptiva, se observa que el comportamiento delporcentaje de membrana plasmtica para el genotipo Brahmn difiere entretratamientos; por otra parte, en el genotipo Gyr el porcentaje de membranaplasmtica difiere entre los tratamientos convencional y por fuera del cuello deltermo . Finalmente, en trminos descriptivos la respuesta para los genotipos enestudio es superior bajo el tratamiento convencional, comparado con los otrosmtodos de descongelacin empleados.

No se encontr evidencia significativa por efecto del genotipo en la muestra en laevaluacin de la membrana plasmtica, utilizando el Test ORT, lo cual se afirmacon una confianza del 95%.

Tabla 7. Comparaciones del porcentaje de resistencia de la Membrana Plasmtica (Test ORT) entre

los Genotipos en Brahmn y Gyr.

GenotipoEstadstico de pruebaestandarizado1

n p

Brahmn -1.282 12 0.200

Gyr -1.421 12 0.155

1Prueba de Jonckheere-Terpstra de alternativas ordenadas para muestras independientes.


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Figura 2. Distribucin del porcentaje de membrana plasmtica (Test de HOST) en Brahmn y Gyrbajo cuatro diferentes metodologas de descongelacin.

La tabla 8 muestra que no hay evidencia suficiente en la muestra, para afirmar queexista diferencia significativa para la evaluacin de la Membrana Plasmtica,utilizando el Test ORT, lo cual se afirma al nivel de significacin 0.05.

Tabla 8. Comparaciones del porcentaje de resistencia de la Membrana Plasmtica (Test ORT)entre Brahmn y Gyr en Tratamientos.


estandarizadan p

Convencional 1.964 6 0.100Descongelacin en la axiladurante 30 seg.

1.964 6 0.100


Grficamente se observa que los valores para la Membrana Plasmtica (Test ORT)son ligeramente mayores en el tratamiento Convencional que en los demstratamientos empleados (Descongelacin en la axila por 30 segundos,descongelacin por 8 minutos y por fuera del cuello del termo), al mismo tiempo seevidencia que la descongelacin en la axila por 30 segundos genera una respuesta


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inferior en Brahmn y ligeramente inferior en Gyr en comparacin con los otrostratamientos.

Figura 3.Distribucin del porcentaje de membrana plasmtica (ORT) en Brahmn y Gyr bajo cuatrodiferentes metodologas de descongelacin.

Los valores mnimos que pueden garantizar una fertilidad idnea para esta variableenunciados por (Barth et al., 2000; Catena and Cabodevila, 1999; Gmez andMigliorisi, 2009) son, tambin, del 40%. Los resultados, como se aprecia en lasfiguras 2 y 3, solo favorecen al protocolo convencional y comprometen los demstratamientos, exceptuando al genotipo Gyr, cuando la pajilla se maneja por fuera delcuello de termo y por ms tiempo del recomendado.

Los resultados evidencian alteraciones de la membrana plasmtica, en porcentajes

ms elevados que los que se plantean por accin de la sola criopreservacin (Barthet al; 2000). Los lpidos (colesterol y cidos grasos) son los componentes msabundantes de la membrana plasmtica (vila et al., 2006). Estos lpidos son losque determinan la fluidez y la resistencia de la membrana durante los procesos decriopreservacin (vila et al., 2006). Los resultados evidencian este tipo dealteraciones, no solo producto del proceso de criopreservacin, pues como lodemuestra (Rubio et al; 2009) en su investigacin el proceso de criopreservacinproduce alteraciones de las membranas, pero los porcentajes resultantes de un


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buen manejo de la criopreservacin permiten conservar porcentajes idneos a favorde la fertilidad de cualquier programa de Inseminacin artificial.

En un trabajo realizado por (Bernardi et al; (2011) el porcentaje de espermatozoides

reaccionados a HOST disminuy significativamente cuando el tiempo utilizado parapasar la dosis del termo de nitrgeno al bao de descongelado fue de 1 o de 5(Tabla 2). Esta misma situacin se evidenci cuando la temperatura dedescongelado fue de 21, 55, 75 y 95C y cuando al mantener esta temperatura en37C, el tiempo de exposicin fue de 15, 5 o 10 (Tabla 4). Las variacionessealadas de estos dos parmetros fueron tambin significativas al demorar lainseminacin provocando exposicin de las dosis a temperatura ambiente (22C y9C) por el trmino de 20 (Tabla 5). Situaciones, que si bien no fueron exactamentelas mismas replicadas en este trabajo, si semejan el trabajo realizado y los errorescometidos por los inseminadores.

Es importante anotar que este trabajo referido se realiz en toros Holstein, loscuales, tal y como lo reporta Villa, (2010) en su investigacin, este genotipo mostrotener un semen ms resistente que los otros dos evaluados (Pardo suizo y Jersey).En otro trabajo realizado por (Barth et al; 2000), se hallaron parmetros ms bajospara el genotipo Brahmn, comparados con el genotipo Holstein. Las causaspueden deberse como lo seala Parks, (2003) a que el calentamiento de lostestculos provoca que los espermatocitos en la fase meitica sean destruidos y seden alteraciones en la transformacin de espermatides a espermatozoides,principalmente cambios de condensacin de la cromatina nuclear, formacin de lacola y desarrollo del casquete acrosmico. Lo cual lgicamente repercute en elproceso de criopreservacin y desarrolla poca resistencia a una mala manipulacin

de la pajilla.

No se encontr evidencia suficiente para afirmar que existen diferenciassignificativas en los resultados del porcentaje de NAR por efecto de los genotiposde estudio (Brahman y Gyr).

Tabla 9. Comparaciones de Membrana Acrosomal Normal (NAR) entre los genotipos Brahman yGyr.


estandarizado1n p

Brahman -0.426 12 0.670

Gyr -0.928 12 0.3541Prueba de Jonckheere-Terpstra de alternativas ordenadas para muestras independientes.

No se observaron diferencias significativas entre Brahman y Gyr respecto a lostratamientos empleados: convencional, descongelacin en la axila durante 30segundos, descongelacin por 8 minutos y por fuera del cuello del termo, lo cual seafirma con una confianza del 95%.


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Tabla 10.Comparaciones de Membrana Acrosomal Normal (NAR) entre tratamientos para losgenotipos Brahman y Gyr.


estandarizadaN p

Convencional 0.655 6 0.700

Descongelacin en la axiladurante 30 seg. 1.964 6 0.100


Figura 4. Distribucin del porcentaje de membrana Acrosomal Normal (NAR) en Brahman y Gyrbajo cuatro diferentes metodologas de descongelacin.

La figura 4 permite evidenciar que el tratamiento convencional mostr un porcentajede NAR superior a los dems tratamientos en cada uno de los genotipos. Por otrolado se observa que el comportamiento de la variable NAR es diferente entre losgenotipos dentro de los tratamientos Descongelamiento en la axila durante 30segundos, Descongelamiento por 8 min y por fuera del cuello del termo,Finalmente se observa que los valores ms bajos de NAR se presentan para elgenotipo Brahman en el tratamiento de descongelacin en la axila durante 30segundos

Tabla11. Comparaciones del porcentaje de Membrana plasmtica Normal/Membrana AcrosomalNormal (MPN/MAN) entre los genotipos Brahman y Gyr.


estandarizado1N p

Brahman -1.279 12 0.201Gyr -1.139 12 0.255

1Prueba de Jonckheere-Terpstra de alternativas ordenadas para muestras independientes.


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No hay evidencia suficiente en la muestra para afirmar que exista diferenciasignificativa entre los genotipos para MPN/MAN, lo cual se afirma con una confianzadel 95%.

Al comparar los resultados del porcentaje de MPN/MAN entre Brahman y Gyr, bajola influencia del tratamiento convencional, no se encontr evidencia suficiente parasealar diferencias entre genotipos, al nivel 0.05. Los tratamientos dedescongelacin en la axila por 30 segundos, descongelacin por 8 minutos y fueradel cuello del termo tampoco mostraron diferencias entre Brahman y Gyr respectoal porcentaje de MPN/MAN, lo cual se afirma con una confianza del 95% (tabla 12).

Tabla 12.Comparaciones del porcentaje de MPN/MAN entre los Tratamientos.


estandarizadaN p

Convencional 1.993 6 0.100Descongelacin en la axila durante

30 seg.

1.964 6 0.100

Descongelacin por 8 min. -0.674 6 0.700Por fuera del cuello del termo 1.964 6 0.100

La figura 5 se puede observar que los valores para MPN/MAN son mayores parael genotipo Gyr con respecto al genotipo Brahman en los tratamientosConvencional, Descongelacin en la axila por 30 segundo y Por fuera del cuellodel termo. De igual forma se puede observar que el tratamiento Convencional,con respecto a los dems tratamientos, presenta los mayores valores paraMPN/MAN en cada uno de los genotipos. Finalmente el menor valor para MPN/MANest presente en el genotipo Brahman en el tratamiento Descongelacin en la axiladurante 30 segundos.

Los resultados permitieron evidenciar que solamente el semen descongeladosometido al protocolo convencional estuvo por encima de los mnimos propuestosen las investigaciones de Barth et al., 2000; Catena and Cabodevila, 1999; Gmezand Migliorisi, 2009). En los dems tratamientos se evidenciaron resultados pordebajo de estos mnimos propuestos para la evaluacin de la Membrana Acrosomal(50%). Este hecho pudiera afectar notablemente la tasa de fertilidad, ya que elproceso de capacitacin acrosomal representa un requisito definitivo para lafertilizacin y slo los espermatozoides debidamente capacitados pueden realizarla reaccin acrosomal de manera sincronizada con la fase de penetracin del oocito,tienen la habilidad de pasar a travs de la zona pelcida y de fusionarse con el vulo

para formar un embrin (Januskauskas et al; 2000).Son pocos o de escasa publicacin los trabajos semejantes al presentado. Noobstante los resultados obtenidos en investigaciones que evaluaron solo el efectode la criopreservacin sobre las variables trabajadas, pueden servir de referencia.Ejemplo, son los resultados obtenidos en las investigaciones de (Rubio-Guillen etal; 2007), en las cuales evalu el efecto de la criopreservacin sobre ambasmembranas (plasmtica y acrosomal) evidenciando resultados ms altos


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porcentualmente, que los obtenidos en este trabajo, lo que estara sugiriendo undao agregado por las fallas en la manipulacin de las pajillas al momento deimplementar la Tcnica Instrumental en la Inseminacin Artificial. Estos resultados,en la evaluacin de la MP y de la MA son muy relevantes debido a que el ORT ha

demostrado tener una correlacin alta y positiva con la capacidad fecundante delespermatozoide (Quintero, 2003).

Figura 5. Distribucin del porcentaje de MPN/MAN Brahman y Gyr bajo cuatro diferentesmetodologas de descongelacin

Errores en la manipulacin de la pajilla afectan la funcionalidad espermtica, la cualpuede verse afectada por la injuria, causando un efecto deletreo sobre la funcindel acrosoma (Estvez, et al; 2000; Prathalingam et al; 2005) y de la membrana

plasmtica, potencial de membrana mitocondrial e integridad del ADN (Bollwein etal; 2008). Los espermatozoides sometidos a injuria estn sujetos a alteraciones ensu estructura, como dilatacin y rompimiento a nivel de la membrana, cambios depermeabilidad en la misma; hay cambios en la estructura de fosfolpidos y protenasque traen como consecuencia una reduccin en su motilidad y viabilidad(Thundathil et al; 1999; Roncoletta et al; 2006). Cambios estructurales danconllevan prematura capacitacin, afectandose la vida media de losespermatozoides y su capacidad fertilizante; diversos trabajos correlacionan la


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presencia de capacitacin espermtica prematura en semen descongelado con sucapacidad fertilizante (Thundathil et al; 1999; Maxwell et al; 1999).

En este trabajo se pudo evidenciar que las muestras seminales de los toros resisten

de manera distinta el proceso de congelacin- descongelacin seminal, de all quemuchas veces se puede encontrar toros destinados a IA, con excelentes parmetrosde calidad seminal en las muestras frescas y que sean catalogados posteriormentecomo malos congeladores, obteniendo diferentes fertilidades a nivel de campo(Madrid-Bury, 2004; Rubio Guilln et al, 2007).

En este trabajo, en trminos generales, el genotipo Brahman mostr los menoresporcentajes como respuesta a la injuria causada por los Inseminadores, tanto parala evaluacin de la membrana plasmtica (HOST y ORT), como para la evaluacinde la membrana acrosomal (ORT). Algunos autores reportan que los toros BosIndicus presentan siempre una menor produccin y menor calidad espermticas, sinimportar bajo qu condiciones se encuentran en comparacin con los Bos Taurus(Fields et al; 1982). Lo anterior concuerda con los resultados obtenidos en el trabajode (Villa, 2010), en el cual se evaluaron 3 genotipos del Bos Taurus bajo las mismascondiciones y variables y cuyos resultados fueron superiores a los obtenidos en lapresente evaluacin.

Conclusiones

Las observaciones a los 33 inseminadores permitieron evidenciar fallas en laimplementacin de la tcnica instrumental en los programas de inseminacinartificial con efectos deletreos para la calidad seminal del semen congelado-descongelado evaluado.

En trminos generales se puede concluir que no existi diferencia significativa entrelos tratamientos evaluados para las variables supervivencia y funcionalidad de lasmembranas espermticas (plasmtica y acrosomal) por efecto de los genotiposevaluados. No obstante adquiere relevancia la evaluacin descriptiva porcentual enla cual se puede apreciar efectos nefastos para la funcionalidad de la membranaplasmtica y acrosomal cuando se replicaron las fallas en el Laboratorio.

Se sabe que la criopreservacin, tiene como propsito garantizar la supervivenciade los espermatozoides, sin embargo, en una elevada y variable proporcin de ellossuele ocasionar daos irreversibles a la membrana plasmtica y acrosomal quepueden causar muerte celular e infertilidad. Los resultados de este experimentodemuestran que el proceso de congelacin-descongelacin afecta la integridad deestas membranas, tanto a lo referente a morfologa como a funcionalidad. Sinembargo, se pudo demostrar como los espermatozoides de los diferentes torosevaluados, resisten de manera distinta los efectos detrimentales de lacriopreservacin y las fallas en la implementacin de la tcnica instrumental. Asmismo, el estudio confirma que el dao criognico puede ocurrir indistintamente


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sobre la integridad estructural y funcional MP y MA, lo que pudiera afectar lacapacidad fecundante de las muestras seminales destinadas a IA.

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