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EFECTO DE LA VARIACIÓN DE PESO, DE LA CONDICIÓN
CORPORAL, DE LA EXPRESIÓN DE RECEPTORES DE LEPTINA Y DE HORMONA LUTEINIZANTE, EN LA ANOVULACIÓN
POSPARTO EN VACAS CEBÚ (Bos indicus).
CARLOS ANDRÉS GIRALDO ECHEVERRI
CORPORACIÓN ACADÉMICA CIENCIAS BÁSICAS BIOMÉDICAS UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
Medellín, 2006
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EFECTO DE LA VARIACIÓN DE PESO, DE LA CONDICIÓN CORPORAL, DE LA EXPRESIÓN DE RECEPTORES DE LEPTINA Y DE HORMONA
LUTEINIZANTE, EN LA ANOVULACIÓN POSPARTO EN VACAS CEBÚ (Bos indicus).
Por:
Carlos Andrés Giraldo Echeverri
Trabajo de investigación presentado como requisito para optar al título de
Magíster en Ciencias Básicas Biomédicas
Énfasis en Fisiología y Biotecnología de la Reproducción Animal
Directora:
Zulma Tatiana Ruiz Cortés
Asesores:
Martha Olivera Ángel
Jaime Iván Rodríguez
Juan Guillermo Maldonado
Grupo Reproducción, Fisiología y Biotecnología
Corporación BIOGÉNESIS
Corporación Académica Ciencias Básicas Biomédicas
Universidad de Antioquia
Medellín-Colombia
2006
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TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN 5
ABSTRACT 7
INTRODUCCIÓN 8
MARCO TEÓRICO 9
EVENTOS REPRODUCTIVOS DEL ANESTRO POSPARTO BOVINO 9
Vínculo vaca-ternero 9
Amamantamiento 10
Nutrición 11
REGULACION DE LA FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA 13
Eje Hipotálamo-Hipófisis-Ovario 13
Dinámica Folicular y Esteroidogénesis regulada por LH y OB 14
HIPÓTESIS 20
OBJETIVOS 20
METODOLOGÍA 21
Lugar de realización del proyecto 21
Unidades experimentales 21
Grupos y Tratamientos 21
Ovariectomía 22
Detección de Receptores por Inmunofluorescencia e Inmunohistoquímica 22
Análisis estadístico 24
RESULTADOS 25
Reinicio de la dinámica folicular posparto y variación en la CC y peso 25
Capacidad ovulatoria de el tercer folículo dominante posparto. 25
Correlación entre la variación de la Condición Corporal, peso Corporal y días a la
Dominancia Folicular 26
Determinación de la Expresión de Receptores de Leptina y de LH por
Inmunofluorescencia 27
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Determinación de la Expresión de Receptores de Leptina y de LH por
Inmunohistoquímica. 28
DISCUSIÓN 31
AGRADECIMIENTOS 35
BIBLIOGRAFÍA 36
ANEXOS 44
5
EFECTO DE LA VARIACIÓN DE PESO, DE LA CONDICIÓN CORPORAL, DE LA EXPRESIÓN DE RECEPTORES DE LEPTINA Y DE HORMONA
LUTEINIZANTE, EN LA ANOVULACIÓN POSPARTO EN VACAS CEBÚ (Bos indicus).
Carlos Andrés Giraldo Echeverri, Zulma Tatiana Ruiz Cortés.
Grupo Reproducción – Fisiología y Biotecnología. Corporación Biogénesis.
Corporación Ciencias Básicas Biomédicas. Universidad de Antioquia
RESUMEN
El prolongado período de anestro posparto afecta negativamente la eficiencia
productiva del ganado Cebú en Colombia. La anovulación posparto esta
influenciada por una interacción de procesos complejos (nutrición, ordeño y/o
amamantamiento) regulados por hormonas como la LH y la Leptina, así como sus
receptores, que en conjunto controlan la esteroidogénesis y la dinámica folicular.
En este estudio, se analiza la relación de la variación del peso corporal (PC) y de
la condición corporal (CC, escala 1-5) con el tiempo de aparición del los primeros
folículos dominantes (FD) y, la presencia de receptores de leptina y de LH en los
ovarios. Se realizó un seguimiento ultrasonográfico ovárico durante período
posparto en once vacas cebú para determinar su dinámica folicular, tan pronto
como el tercer FD fue detectado, las vacas fueron tratadas con LH (FDLH, n=4) o
solución salina (FDSS, n=4) y, 48h después, ovariectomizadas para determinar
receptores de leptina y de LH por inmunofluorescencia indirecta (IFI) e
immunohistoquímica (IHQ). Las vacas del grupo de control (n=3) que no
presentaron FD también fueron ovariectomizadas. No se encontró ningún efecto
significativo de PC y CC sobre los días al tercer FD. Sin embargo, se halló una
correlación negativa entre la pérdida de PC y la pérdida diaria de CC y el tiempo al
primer y tercer FD. Del grupo FDLH, el 75% (3/4) de las vacas tratadas, ovularon.
Del grupo FDSS, ninguna ovuló. La IFI no fue técnicamente posible, ya que se
encontró autofluorescencia en los tejidos, lo que interfirió con la señal de los
fluorocromos. Las muestras fueron tratadas con aumento de lavados con buffers y
detergentes bloqueadas con albúmina sérica bovina, suero canino y leche
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descremada; irradiadas por 24h con luz ultravioleta. Los resultados no fueron
satisfactorios. En la IHQ para ambos receptores, se encontró un patrón de
expresión similar durante el desarrollo folicular sugiriendo una comodulación a
nivel ovárico, siendo mayor en los folículos dominantes y en cuerpos
hemorrágicos, y menor en folículos en crecimiento, a nivel de células de la
granulosa, de la teca y en células luteinizadas.
Palabras Clave: Receptor de Leptina, Receptor de LH, Anestro Posparto.
Número de Páginas: 67
7
EFFECT OF VARIATION OF BODY WEIGHT, BODY CONDITION, LEPTIN AND LUTEINIZING HORMONE RECEPTOR EXPRESSION, IN POSTPARTUM
ANOVULATION OF ZEBU COWS (Bos indicus). ABSTRACT
Prolonged periods of anovulation postpartum negatively affect the productive
efficiency of zebu cattle in Colombia. Postpartum anovulation is influenced by an
interplay of complex processes (nutrition, milking and/or suckling) and the
hormonal background orchestrated by, among others, LH and leptin and their
receptors controlling steroidogenesis and follicular dynamics. This study seek for
the relationship between body weight (BW) and body condition (BC, 1-5 scale) the
time of appearance of first Dominant Follicles (DF) and the presence of leptin and
LH receptors in the ovaries. Ovarian ultrasonography was performed during the
postpartum period on eleven Zebu cows to monitor their follicular dynamics, when
the third DF was detected, the cows were treated with LH (n=4) or saline solution
(n=4) and 48h later they were ovariectomized to determine leptin and LH receptors
by indirect immunofluorescence (IFI) and immunohistochemistry (IHQ). Cows that
did not display DF were also ovariectomized (control, n=3). No significant effect of
variation of BW and BC on the days to third DF was found. There was also a
negative correlation between BW loss and daily BW loss with the time to the first
and third DF. In FDLH group, 75% (3/4) of cows, ovulation was induced. In FDSS
group, cows did not ovulate. The IFI studies for leptin and LH receptors detection
were technically impossible due to the presence of autofluorescence that interfed
the fluorochromes signals. In the IHQ studies for both receptors, was found a
pattern of expression similar during the follicular development suggesting a
comudulation to ovarian level, being greater in hemorrhagic bodies and dominant
follicles, and minor in growing follicles, at granulosa, theca and luteinized cells
levels.
Keywords: Leptin Receptor, LH Receptor, Postpartum Anestrus.
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1. INTRODUCCIÓN
El ganado Cebú (Bos indicus indicus) destinado a la producción de carne en el
trópico bajo colombiano, con amamantamiento permanente, presenta una baja
eficiencia reproductiva. Este fenómeno se debe, principalmente, a su prolongado
anestro posparto, el cual, generalmente se extiende hasta el destete, entre 8 a 10
meses posparto (Henao y col., 2000). Siendo en Colombia la producción de carne
bovina un renglón importante de la economía nacional, es de gran interés realizar
investigaciones, como el presente estudio, que intenten aclarar los mecanismos
celulares implicados en el anestro posparto.
El efecto que tienen las hormonas Luteinizante (LH) y la Leptina (OB) en la
regulación de la reproducción ha sido demostrado principalmente en ratones y
humanos y en otra variedad de especies. El papel de la LH en el anestro posparto
bovino, ha sido reportado en la literatura desde hace más de tres décadas
(Edgerton y Hafs, 1973; Echternkamp y Hansel, 1973). La OB fue descubierta a
mediados de los noventas (Zhang y col., 1994), pero su importancia en la fisiología
reproductiva ha sido ampliamente reportada (Barash y col., 1996). Sin embargo,
los mecanismos celulares y moleculares a nivel de gónadas y las vías de
regulación y señalización implicados en la regulación del anestro posparto bovino,
todavía no son completamente comprendidos.
En éste trabajo de investigación, se trató de determinar las relaciones de ambas
hormonas, comprendiendo sus características moleculares, su acción fisiológica a
nivel central y gonadal en el anestro posparto bovino, y su papel en el anestro
posparto.
9
2. MARCO TEÓRICO
2.1. EVENTOS REPRODUCTIVOS DEL ANESTRO POSPARTO BOVINO
El retorno a la actividad ovárica cíclica posparto está determinado por la
recuperación del eje hipotálamo–hipófisis–ovario, mediado por un complejo de
fenómenos hormonales, nutricionales y neuro–sensoriales debidos a la
interrelación de la vaca con su ternero y con el ambiente (Stagg y col., 1998).
El descenso rápido en las concentraciones séricas de estradiol al parto, retira el
bloqueo sobre el eje hipotálamo-hipófisis, estimulando la síntesis de ARNm para la
producción de gonadotropinas y aumentando la liberación de GnRH (Hormona
Liberadora de Gonadotropinas) (Robinson , 1996). La adenohipófisis se repleta de
LH, pero, aunque es necesaria para la maduración folicular y la ovulación, no
alcanza niveles séricos altos necesarios para la ovulación, debido al efecto del
amamantamiento del ternero, que induce una liberación pulsátil de baja frecuencia
y baja amplitud (Williams y col., 1993). Luego del parto, las vacas Cebú reinician
su actividad ovárica pronto, entre 26 a 78 días posparto, pero el anestro y la
anovulación se extienden hasta los 7 a 12 meses posparto, tiempo que
generalmente coincide con el destete de la cría (Ruiz-Cortés y Olivera-Ángel,
1999). Ésta condición es definida por Wiltbank y col. (2002) como "anovulación
con crecimiento folicular únicamente hasta la emergencia".
Se han propuesto tres factores claves implicados en el anestro posparto bovino:
2.1.1. Vínculo vaca-ternero: El “efecto del amamantamiento” en vacas tipo carne
es el factor más importante en la regulación de la extensión del anestro posparto,
y sugiere que el vínculo vaca-ternero es más importante que el efecto de la
succión para incrementar la frecuencia de pulsos de LH y otros factores claves
que desencadenan la ovulación (Stagg y col., 1998). Las vacas que son
amamantadas ad libitum por sus terneros, tienen una frecuencia de pulsos de LH
10
menor y un intervalo posparto levemente mayor que a las que se les restringe la
succión de su cría separándolos en corrales adyacentes, pero el efecto es más
evidente cuando la separación es total y no existe contacto por largos períodos
aumentando la frecuencia de pulsos de LH y disminuyendo de manera
contundente los días de anestro (Hoffman y col., 1996). La restricción del
amamantamiento a 20-30 minutos en el día y el aislamiento del ternero
disminuyen el anestro posparto, independiente a la energía suministrada en la
dieta de las vacas. A los 5 días de restringir el amamantamiento hubo un
incremento de los pulsos de LH (Stagg y col., 1998). El complejo neuro-sensitivo
involucra la visión y el olfato, ya que vacas ciegas y/o anósmicas, amamantando
su ternero o uno extraño, aumentaron significativamente la frecuencia de los
pulsos de LH (Griffith y Williams, 1996)
2.1.2 Amamantamiento: La succión del ternero y el ordeño regulan la liberación
de prolactina (PRL) y oxitocina a nivel central, ejerciendo un estímulo negativo
sobre la producción de LH. Además, el estrés inhibe la liberación de oxitocina
pero incrementa la PRL. Sin embrago, los estudios realizados en bovinos para
aclarar esta interrelación, denervando la glándula mamaria, no han demostrado
claramente la función inhibitoria de la PRL en el reinicio de la actividad
reproductiva posparto (Williams y col., 1993, Williams y col., 1996). Un estudio
realizado en Colombia en vacas cebú con amamantamiento continuo, demostró
que el reinicio de las ondas foliculares es temprano (26-78 días posparto), pero los
primeros folículos dominantes que ovularon se encontraron alrededor de los 250
días posparto (Ruiz-Cortés y Olivera-Ángel, 1999), diferente a otros resultados en
vacas cebú sin amamantamiento que presentaron folículos dominantes entre la
primera y segunda semana posparto (Toribio y col., 1995). Estos resultados
proponen un papel importante del amamantamiento en el alargamiento del anestro
posparto.
Los eventos metabólicos necesarios para la producción de leche durante lactancia
compiten por los nutrientes necesarios en la dinámica folicular para el retorno a la
11
ciclicidad posparto al darse ambos eventos de forma concomitante (Stevenson y
col., 1997). Por tal motivo, vacas con balance energético negativo al momento del
parto no podrán expresar ambos fenómenos al mismo tiempo.
2.1.3. Nutrición: La Condición Corporal (CC) es un parámetro subjetivo del
estado nutricional de los animales y se mide observando el grado de
engrasamiento a nivel de la inserción de la cola, anca, región dorsal y costados.
Por tal motivo, puede ser un indicativo de la cantidad de adipocitos productores de
OB. Algunos investigadores la califica en una escala de 1 a 5 (emaciada a obesa),
otros de 1 a 9, pero ambas escalas son prácticas y precisas (Klosterman y col.,
1968).
A pesar de la poca información publicada acerca de los parámetros óptimos de CC
en ganado Cebú, se ha demostrado que ésta es una expresión del metabolismo
energético, ya que para un pronto retorno a la ciclicidad posparto es necesario un
balance energético positivo (Bossis y col, 2000) el cual se ve reflejado por
ejemplo, en vacas amamantando, en una condición corporal entre 3.4 - 3.5 (escala
1-5) (Castillo y col, 1997). En el trópico colombiano, un grupo de vacas que no
estaban siendo amamantadas y que tenían una mejor condición corporal,
presentaron un retorno a la ciclicidad más rápido, comparadas con otro grupo de
vacas con amamantamiento permanente y menor condición corporal (Henao y col,
2000). Sin embargo, cuando el segundo grupo incrementó su condición corporal,
las vacas presentaron rápidamente su primera ovulación posparto y su primer
estro. El papel de la OB parece ser el de informar al hipotálamo el estado
energético del individuo y regular de esta manera los pulsos de LH necesarios
para la reactivación ovárica (Castillo y col, 1997).
El intervalo entre el parto y la primera ovulación, y el intervalo entre la primera y la
segunda ovulación, son significativamente mas cortos en vacas que reciben una
dieta alta en energía, comparadas con otras con dieta baja en energía, pero no se
presentan diferencias en la tasa de crecimiento folicular, ni en las concentraciones
12
de estrógenos circulantes, sugiriendo que el anestro posparto se alarga, no por
falta de crecimiento folicular, sino por fallas en la ovulación mediada por el estado
nutricional (Stagg y col, 1995).
Los mecanismos por los cuales una baja nutrición causa anestro y el retorno a una
CC adecuada resulta en reinicio de la ciclicidad en el ganado no han sido
completamente determinados. La restricción del alimento suprime la secreción de
LH en vacas de carne, novillas ciclando y novillas prepúberes, y éste efecto es
posiblemente mediado por la reducción en la secreción de GnRH ya que la
administración de ésta hormona induce la ovulación. Las concentraciones de
hormona del crecimiento, insulina, factor de crecimiento insulinoide tipo I (IGF-I),
glucosa y ácidos grasos no esterificados (NEFAS) en sangre son indicativos de la
disponibilidad de energía y puede proveer señales de corta o larga duración que
median los efectos de la nutrición en la secreción de LH.
La disminución en la CC, peso corporal y/o en el aporte de alimento reduce la tasa
de crecimiento y la persistencia de los folículos dominantes, a su vez, el
incremento en estos tres factores las aumenta. Sucede el mismo fenómeno con
folículos subordinados. Luego de realimentar a un grupo de vacas mejorando su
CC y peso corporal, la frecuencia y la amplitud de los pulsos de LH y su
concentración media fueron aumentando gradualmente (Bossis y col, 2000).
Durante el ayuno, la señal de la OB es removida y la pulsatibilidad de LH y la
función reproductiva declinan rápidamente. Se ha reportado que el ayuno causa
cesación del ciclo estral en ratones, el cual puede ser restaurado por
realimentación o administración de la OB por dos días, lo cual es acompañado por
un incremento de LH plasmática. En mujeres con anorexia nerviosa, la
disminución en el consumo de alimento conduce a la disminución en la secreción
de OB, lo cual resulta en reducción de la secreción de gonadotropinas, causando
una reversión del estatus prepuberal. El estatus prepuberal puede ser revertido
13
por incremento en el consumo de calorías y resultar en la secreción de OB por el
adipocito (Yu y col., 1997).
2.2. REGULACION DE LA FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA 2.2.1. Eje Hipotálamo-Hipófisis-Ovario: La reproducción está regulada, a nivel
central, por una red neuronal y células secretoras de hormonas agrupadas en
compartimentos especializados ubicados en el hipotálamo y la hipófisis. En los
ovario de las hembras, también se secretan hormonas producidas por las células
de la granulosa y de la teca. Los tres órganos conforman el eje hipotálamo-
hipófisis-ovario, que se estimula e inhibe a través de sus productos para regular la
actividad reproductiva y en el cual OB y LH tienen un importante papel.
La secreción de gonadotropinas por la hipófisis esta controlada por la liberación de
Hormona Liberadora de LH (LHRH/GnRH) y por el Factor Liberador de Hormona
Folículo estimulante (FSHRF/GnRH) a nivel del hipotálamo, las cuales tienen
receptores en los gonadotrofos hipofisiarios que inducen la exocitosis de los
gránulos secretores de gonadotropinas (McCann y col., 2001). La regulación de la
liberación de estas gonadotropinas está dada por hormonas gonadales, como los
esteroides, la inhibina y la activina, además de otras sustancias producidas a nivel
central como acetilcolina, norepinefrina, dopamina, serotonina, melatonina y ácido
glutámico (McCann y col., 1998).
En cuanto a la OB, actúa sobre el hipotálamo de ratas produciendo estados de
anorexia cuando es inyectada en el tercer ventrículo, actuando como señalizadora
de la condición corporal y reguladora del consumo de alimento (Schwartz y col.,
1996) modificando la expresión y la biosíntesis del Neuropéptido Y (NPY) por las
neuronas del núcleo arcuato (Chilliard y col., 2001; Schwartz y col., 1996).
Cuando la liberación de NPY es inhibida por OB, se libera LHRH y, por lo tanto,
LH (Yu y col., 1997; McShane y col., 1993). De forma directa, en cultivos de
adenohipófisis, se induce la liberación de LH al agregar OB al cultivo (Yu y col.,
14
1997). De la misma manera, se encontraron concentraciones séricas de LH
aumentadas en primates no-humanos a los que se les administró OB
intracerebroventricular (García y col., 2002). La sensibilidad a la OB esta bajo
control de los esteroides gonadales (Yu y col., 1997).
2.2.2 Dinámica Folicular y Esteroidogénesis regulada por LH y OB (Figura 1):
La esteroidogénesis esta regulada por múltiples factores según el estado
fisiológico, nutricional o de bienestar en el que se encuentre el animal. En este
caso consideraremos al colesterol, las gonadotropinas, la leptina, la insulina, el
factor de crecimiento insulinoide tipo I (IGF-I) y a los glucocorticoides.
La esteroidogénesis depende del aporte intracelular de colesterol, ya sea que
provenga de la sangre transportado por las lipoproteínas, o sintetizado de novo
por la vía del acetato. Para capturar el colesterol circulante, la célula de la teca
expresa receptores específicos, los cuales son endocitados luego de unirse a las
lipoproteínas. Tanto estos receptores, como el transporte del colesterol
intracitoplasmático, son controlados, entre otros, por un factor de transcripción
conocido como la Proteína Reguladora de Esterol (SREBP, que posee un
elemento de unión a los elementos SRE de los promotores de algunos genes
implicados en la esteroidogénesis), sobre la cual la OB tiene actividad reguladora
(Ruiz-Cortes y col., 2003). Luego, este colesterol citoplasmático sirve como
sustrato para la producción consecutiva de pregnenolona, progesterona, 17α-
hidroxiprogesterona y androstenediona, a través de una cascada enzimática
regulada por la interacción de la LH con su receptor en células de la teca. Esta
Androstenediona atraviesa la membrana basal y es transformada a estrógenos en
la célula de la granulosa. La producción de estrógenos se incrementa a medida
que se da el crecimiento de las ondas foliculares y, en la luteinizacion, se cambia
la ruta metabólica hacia la producción de progesterona. El inicio de la dinámica
folicular se da con el reclutamiento de los folículos primordiales, el cual, en el
posparto y durante el ciclo estral, se considera independiente de la acción de
gonadotropinas. Luego, la emergencia depende de FSH, y cuando se establece la
15
dominancia folicular, únicamente de LH (Ireland y col, 2000; Gore-Langton y
Armstrong, 1998). Sin embargo, la esteroidogénesis depende de ambas
gonadotropinas en los estadíos foliculares hasta la divergencia, y de LH en el
folículo dominante (Evans y Fortune, 1997). La identificación de las sustancias
inhibitorias responsables de la disminución en la concentración de FSH y de las
sustancias involucradas en el cambio a la dependencia de LH no han sido bien
clarificadas (Ginther y col, 1996). Las vías de señalización en la dependencia a
LH en las células de la teca producen cambios en la expresión de genes que son
críticos para la producción de estrógenos. Específicamente, la activación de los
receptores de LH en las células de la teca lleva directamente a la estimulación de
altos niveles de producción de androstenediona.
La LH es producida por los gonadotropos en la hipófisis anterior, comparte una α-
subunidad con la Hormona Folículo Estimulante (FSH) y ambas poseen una β-
subunidad específica responsable de su acción biológica (Arije y col., 1974). El
gen codificador para la α-subunidad, posee 4 exones y tres intrones, contiene CRE
(elemento de respuesta a AMPc) en su promotor y traduce entre 730 y 800
aminoácidos, dependiendo de la especie. La hormona coriónica humana (hCG),
tiene actividad LH y su secuencia de aminoácidos es muy similar (Erickson y col.,
1985), pero su β-subunidad es codificada por seis genes mientras que la de LH
solo por uno, y presenta una vida media mas larga in vitro debido a su C-terminal
mas largo (Arije y col., 1974). El receptor de LH pertenece a la familia de
receptores unidos a proteína G - unidos al nucleótido guanina, con un dominio
extracelular largo, siete hélices transmembranales y un corto dominio intracelular
carboxi-terminal (Kawate, 2004), muy similar al de hCG. Ha sido demostrado en
células de la granulosa, Leydig, y luteales, además de implantes de peritoneo y
útero. El dominio carboxi-terminal es el sitio de regulación con la unión de LH y
contiene sitios de fosforilación mediada por proteína quinaza C (Arije y col., 1974).
La mayor significancia de esta respuesta a LH es el proveer del substrato de
aromatasa P450 (andrógenos) para las células de la granulosa donde será
16
metabolizado para producir estrógenos (Erickson y col., 1985). La aromatasa se
expresa en la vía sintética de estrógenos desde folículos con 4 mm de diámetro y
bajos niveles de estrógenos se encuentran en el líquido intrafolicular de folículos
entre los 5 a 7 mm. Las concentraciones de estradiol (17β-estradiol, el estrógeno
más abundante) van aumentando a medida que se da el crecimiento folicular y
puede comportarse como un factor inhibidor de FSH y un facilitador de la
dependencia a LH (Ginther y col, 1996). Los folículos seleccionados presentan en
la granulosa niveles altos de ARNm para aromatasa P450, en el fluido folicular
altas concentraciones de estradiol, y en teca y granulosa mayor expresión de
ARNm para el receptor de LH, al día 4 de la onda, en comparación con los
folículos reclutados o que están en proceso de regresión (Xu y col, 1995, Xu y col,
1995a). El folículo dominante suprime la onda de FSH ya que secreta factores
como la inhibina, el estradiol y IGF-I (Kulick y col, 2001), que en conjunto inhiben
el crecimiento de los folículos subordinados y el inicio de una nueva emergencia
folicular (Ginther y col, 1996).
El estado nutricional del animal es un factor importante en la regulación de la
esteroidogéneis, donde la OB tiene un papel clave. En 1950 fue descubierta una
línea de ratones mórbidamente obesos (C57BL/6) que tenían la mutación ob/ob
homocigota recesiva, asociada a un síndrome de obesidad en humanos con
diabetes tipo II. Zhang y col. en 1994 aislaron el gen involucrado en dicho
desorden y su proteína codificada de 167 aminoácidos conocida como leptina.
Ésta, producida en el tejido adiposo, participa en vías de señalización para regular
el balance energético, por parte del hipotálamo, expresado en la cantidad de grasa
corporal. La transcripción y traducción de OB ocurren en el tejido adiposo,
placenta, y tracto gastrointestinal, en un gen de 20kb en el brazo largo del
cromosoma 7 (7q31.2) humano con tres exones y dos intrones y su promotor tiene
sitios SAP (secreted aspartyl proteinases), GRE (elemento de respuesta a
glucocorticoides) y CRE (Zhang y col., 1994) entre otros. La expresión del gen OB
en adipocitos es regulada por muchos factores que incluyen a la insulina,
prolactina, factores ambientales como el fotoperíodo (días largos aumentan la
17
secreción y viceversa) (García y col., 2002), y la expresión es diferente según las
regiones donde se deposita grasa (Kim y col., 2000). El receptor OB fue
inicialmente caracterizado en el plexo coroide del ratón como un receptor anclado
a membrana por un dominio simple, relacionado con el componente de traducción
de señal gp130 de los receptores de IL-6, G-CSF, y LIF (Tartaglia y col., 1995) en
su porción intracelular. Existen cuatro isoformas cortas del receptor (OB-Ra, c, d,
f) con pequeños dominios intracelulares y una isoforma larga (OB-Rb) altamente
homóloga al dominio de señalización de la familia del receptor de citoquinas tipo I,
todas teniendo un dominio extracelular común. La forma larga utiliza la vía
JAK/STAT (Janus kinasa/señal de transcripción y activación de la traducción), así
como la vía MAPK/ERK para la transducción de señales (Prolo y col., 1998, Ruiz-
Cortes y col., 2003). Las isoformas cortas tendrían otras formas de señalización
por vía de genes de activación temprana como c-fos, junB y podrían interactuar
con la forma OB-Rb. En roedores y humanos, se cree que existen algunas
proteínas de unión a OB, una de ellas ha sido identificada como el dominio
extracelular del receptor OB. Se cree que una de las proteínas de unión de OB en
el dominio extracelular de su receptor juega un papel crítico en el transporte de
ésta a través de la barrera hemato-encefálica y se le ha llamado receptor soluble
OB-Re (García y col., 2002). La expresión de diferentes isoformas de OB-R se ha
demostrado en el humano, ratones, ratas, bovinos, caprinos, suinos, y en gran
variedad de tejidos como los riñones, el hígado, el bazo, el cerebro, y el aparato
reproductivo (Ruiz-Cortes y col., 2003). Por ejemplo, en la oveja se detectó en
hipotálamo, adenohipófisis, glándula mamaria y médula adrenal) (Chilliard y col.,
2001).
Otras hormonas como la insulina y el IGF-I también regulan la función reproductiva
en términos del estado energético del animal. La insulina tiene un efecto
estimulador de la esteroidogénesis al inducir la actividad de la aromatasa en la
granulosa el cual se ve antagonizado directamente por la OB especialmente en las
células indiferenciadas, mostrando que el número de receptores para OB en los
folículos maduros es menor y por lo tanto menos sensibles al efecto negativo de la
18
OB. Además en ausencia de insulina, la OB tiene poco o ningún efecto en la
esteroidogénesis (Spicer y Francisco, 1997). Sin embargo, el efecto en la
granulosa de bovinos no parece ser una inhibición directa de la unión de la
insulina a su receptor y no afecta el crecimiento basal de éstas células mediado
por insulina (Spicer y Francisco, 1997), aunque si lo hace disminuyendo el
crecimiento mediado por IGF-I (Spicer, 1991). Más aún, la OB no tiene efectos en
la inducción de la producción de estradiol mediada por IGF-I en la granulosa de
bovinos, en la producción de progesterona mediada por FSH en granulosa de
ratas, ni en la producción de estradiol y progesterona mediada por LH en ovarios
de ratas, pero de forma colectiva, los estudios al respecto indican que las altas
concentraciones de OB en mujeres obesas inhiben la esteroidogénesis de la
granulosa mediada por IGF-I, insulina o gonadotropinas (Spicer, 1991; Erickson,
2001). Son necesarios nuevos estudios para aclarar su acción inhibitoria en el
ovario bovino, de rata y humano. A nivel de las células tecales, la OB inhibe la
esteroidogénesis mediada por insulina en bovinos aunque, igual que en la
granulosa, no parece ser de forma directa, y la producción de androstenediona
mediada por LH en humanos (Spicer, 1991).
El estado nutricional, reflejado en su peso y en su condición corporal, es un factor
determinante en la fisiología del anestro posparto. Por lo tanto, este fenómeno
puede aclararse a través de la interacción, de la hormona leptina con la
gonadotropina LH, a nivel de ovario, donde aún no esta totalmente explicado. Por
estas razones, esta investigación propuso estudiar la relación entre estas dos
hormonas en la resolución de la fisiología reproductiva luego del parto.
19
Figura 1. Modelo de esteroidogénesis bovina.
20
4. HIPÓTESIS
La variación en el peso corporal y la condición corporal, y la expresión de
receptores de Leptina y de la Hormona Luteinizante en el ovario, determinan la
capacidad ovulatoria de los primeros folículos dominantes y, la dinámica folicular
posparto en ganado Cebú.
5. OBJETIVOS
5.1. Evaluar la capacidad ovulatoria de los primeros folículos dominantes y, el
efecto de los cambios de peso y condición corporal en la dinámica folicular
posparto.
5.2 Estudiar la expresión de receptores de Leptina y de LH en los folículos
ovulados y no ovulados.
21
6. METODOLOGÍA:
6.1. Lugar de realización del proyecto:
El trabajo de campo fue realizado en la Hacienda “El Progreso”, propiedad de la
Universidad de Antioquia, ubicada en el municipio de Barbosa (Antioquia,
Colombia), con 1.400 m.s.n.m., temperatura promedio de 20°C, una precipitación
anual de 1.300 mm y, en una formación ecológica de bmh-MB según la
clasificación de Holdriege (Holdriege, 1996). Los potreros están sembrados en
pasto nativo, pasto Estrella, Uribe y Braquiaria (Cynnodon spp, Hypharrenia ruffa,
Brachiaria humidicola), con agua corriente y disposición de sal (8% P) a voluntad.
6.2. Unidades experimentales:
Fueron seleccionadas once vacas Cebú en posparto de la región, con 3 a 7
lactancias de edad, una condición corporal igual o superior a 3.0 y en estado de
preñez avanzada. Los animales pastorearon a voluntad y se esperó a que
parieran. No se apartaron de sus terneros.
6.3. Grupos y Tratamientos:
Una semana luego del parto, se inició el seguimiento de la dinámica folicular
utilizando ecografía transrectal (Aloka SSD-500, tiempo real, sonda 5MHz, Aloka
CO, LTD, Tokio, Japón) cada 48 horas (ver Anexo 1). Los diámetros foliculares y
la ubicación de los folículos fueron registrados, y se determinó como folículo
dominante aquel que presentaba un diámetro superior a 10 mm durante dos
observaciones consecutivas (ver Anexos 2 y 3).
Los grupos se conformaron de la siguiente manera:
22
a) Grupo Folículo Dominante–Tratamiento con Solución Salina (FDSS) (n=4): Al
observarse el tercer folículo dominante, las vacas fueron tratadas con 2 mL de
solución salina al 5% vía intravenosa. Se realizó ecografía ovárica a las 24 y 48
horas para determinar si ovulaban o no. A las 48 horas del tratamiento se realizó
ovariectomía.
b) Grupo Folículo Dominante–Tratamiento con Hormona Luteinizante (FDLH)
(n=4): Al observarse el tercer folículo dominante, las vacas fueron tratadas con
3.000 UI de hCG (Chorulon®, Intervet, The Netherlands), vía intravenosa. Se
realizó ecografía ovárica a las 24 y 48 horas para determinar si ovulaban o no. A
las 48 horas del tratamiento se realizó ovariectomía.
c) Grupo Control (CON) (n=3): Vacas que no presentaron dominancia folicular
antes de 60 días. No recibieron ningún tratamiento y se les realizó ovariectomía.
El peso de los animales se midió utilizando cinta bovinométrica (Heinrichs y
Lammers, 2001), y la Condición Corporal fue evaluada en escala de 1 a 5 (Ruiz y
col., 1999), ambos, una vez por semana.
6.4. Ovariectomía:
Ambos ovarios de cada animal fueron extraídos por ovariectomía lateral izquierda.
Las vacas fueron sedadas y se les aplicó anestesia paravertebral para el
procedimiento quirúrgico (ver Anexo 4)
Los ovarios fueron transportados en solución salina fosfatada (PBS) a 4°C, luego
congelados y conservados a -20°C.
6.5. Detección de Receptores por Inmunofluorescencia e Inmunohistoquímica:
23
Las estructuras de los ovarios fueron clasificadas como Folículos en Crecimiento,
Folículo Dominante y Cuerpo Hemorrágico. Los cortes se embebieron en Optimal
Cutting Temperature (O.C.T. compound®, Tissue-Tek, Sakura USA, Torrance, CA)
y se realizaron criocortes de 5µ, colocados en láminas tratadas con polilisina (ver
Anexo 5). Los tejidos fueron congelados a -20°C hasta que fueron procesados.
Como primeros anticuerpos se utilizaron:
- Anti-Receptor de Leptina: Quimera del receptor de Leptina/Fc, recombinante en
ratón, expresado en células NSO. (SIGMA®, USA, Product No. L4912)
- Anti-Receptor de Hormona Luteinizante: Anticuerpo policlonal de cabra
desarrollado contra una región interna del receptor de LH humano (Santa Cruz
Biotechnology, Inc. USA, LHR (K-15): sc-26341)
Como segundos anticuerpos para Inmunofluorescencia se utilizaron:
- Anti-anti-Receptor de Leptina: Anti-IgG de Cabra (Molécula completa) conjugado
con CY3, desarrollado en conejo (Sigma-Aldrich, Inc. USA, C2821).
Además, se realizó una contratincióntinción con DAPI.
- Anti-anti-Receptor de Hormona Luteinizante: Anti-IgG de Cabra (Molécula
completa) conjugado con FITC, desarrollado en conejo (Sigma-Aldrich, Inc. USA,
F2016).
Además, se realizó una tinción nuclear con DAPI (ver Anexo 6).
Como segundos anticuerpos para Inmunohistoquímica se utilizaron:
- Anti-anti-Receptor de Leptina: Anti-Inmonuglobulina-G (molécula completa) de
ratón, conjugada con Peroxidasa y desarrollada en conejo.
- Anti-anti-Receptor de Hormona Luteinizante: Anti-Inmonuglobulina-G (molécula
completa) de cabra, conjugada con Peroxidasa y desarrollada em conejo.
Además, se realizó una tinción de contraste con Hematoxilina (ver Anexo 7).
Como controles se utilizaron cortes de hipotálamo bovino (control positivo OBR),
células de granulosa bovina cultivadas in vitro, cortes de folículo dominante de una
24
vaca ciclando (control positivo LHR), cortes de epidermis bovina (control negativo
OBR y LHR). Además, se realizaron los controles negativos de la técnica, sin
agregar durante el procesamiento, el primer anticuerpo, obteniendo una señal de
expresión de los receptores negativa.
Luego del tratamiento de las muestras, fueron analizadas de la siguiente manera:
(a) Se tomaron fotografías a 40X de los campos representativos para cada
estructura ovárica, (b) las fotografías fueron descargadas en el programa Adobe
Photoshop® (Ver. 4.0, Adobe Systems), (c) se seleccionó una máscara de
dimensiones fijas para todas las muestras, esta se desplazaba en las zonas de
interés (células de la granulosa, teca y luteinizadas), para contar en su interior, el
número de células positivas (con expresión de cada uno de los receptores) y el
número de células negativas (sin expresión), hasta ajustar un total de 100 células
por campo, (d) los datos fueron tabulados, se hallaron los porcentajes de
expresión de cada receptor en cada estructura y, se procesaron para estadística
descriptiva, obteniendo los promedios y las desviaciones estándar.
6.6. Análisis estadístico:
Para el análisis estadístico fue utilizado el programa STATISTICA® (Ver. 5.0,
StatSoft, USA).
Para estudiar la capacidad ovulatoria del tercer folículo dominante, se analizaron
los datos de forma descriptiva, agrupando las vacas que presentaron dominancia
folicular (FDSS, FDLH, n=8). En este mismo grupo, se realizó una correlación de
Pearson entre la variación en la condición corporal y el peso corporal, con los días
a la dominancia folicular.
Para el análisis de la expresión de OBR y LHR, se tomaron los promedios de
expresión en cada una de las estructuras (folículo en crecimiento, folículo
dominante y cuerpo hemorrágico), y se les realizó un ANOVA, para un diseño
25
desbalanceado. Se realizó un test de Levene para probar homogeneidad de
varianzas.
Además, se realizaron correlaciones de Spearman entre la expresión de
receptores y, las variables de cambio en condición corporal, peso y días a
dominancia folicular.
Se estimó una diferencia significativa de p<0.05.
7. RESULTADOS
7.1. Reinicio de la dinámica folicular posparto y variación en la CC y peso
En el posparto temprano, las vacas presentaron un peso de 366.42±41.89 kg y CC
de 3.5±0.25, en promedio. Hasta los 30 días posparto el peso disminuyó en un
índice de 0.68±1.32 kg/día, con vacas que perdieron desde 1kg hasta 50 kg en el
período de seguimiento folicular, y la CC hasta 2.5±0.45 en promedio. Luego de
una semana del parto, todas las vacas ingresaban a seguimiento de la dinámica
folicular, y todas presentaban cohortes de folículos emergiendo para ese tiempo.
En el grupo de vacas que presentaron dominancia folicular (FDLH y FDSS, n=8),
la primera dominancia folicular ocurrió a los 29.5±14.6 días, y la tercera
dominancia folicular a los 53.6±17 días. Las vacas FDA (n=3) fueron
ovariectomizadas a los 35±6.7 días posparto, sin presentar FD.
7.2. Capacidad ovulatoria de el tercer folículo dominante posparto.
En el grupo FDLH, de las cuatro vacas tratadas, en tres (75%) se indujo la
ovulación del tercer folículo dominante y en una no (25%), luego de la aplicación
exógena de LH. En el grupo FDSS, ninguna de las vacas ovuló, luego de la
aplicación de solución salina (Tabla 1)
26
Tabla 1. Presentación de la ovulación en vacas con dominancia folicular, tratadas
con solución salina (SS) y hCG (LH).
7.3. Correlación entre la variación de la Condición Corporal, peso Corporal
y días a la Dominancia Folicular:
De forma general, incluyendo todos los animales que presentaron dominancia
folicular, no se encontró un efecto significativo (p>0.05) entre la variación de la
Condición corporal y el Peso Corporal, sobre la presentación de la dominancia
folicular, incluso cuando en el análisis eran incluidas las vacas con marcada
pérdida de Peso Corporal. Sin embargo, en los análisis de regresión, se encontró
una asociación negativa no significativa (r=-0.45, r2=20.25%) (p>0.05) entre la
pérdida de peso diaria y la presentación de dominancia y, una asociación positiva
no significativa (r=0.25, r2=6.35%) (p>0.05) entre el cambio de la condición
corporal y los días a la presentación de la primera dominancia folicular. Estas
mismas asociaciones, entre pérdida de peso diaria (r=-0.38, r2=14.44%)(p>0.05),
pérdida de condición corporal (r=0.19, r2=3.61%)(p>0.05) se hallaron al día de
aparición de la tercera dominancia folicular.
Al tomar este mismo grupo con dominancia folicular, y hacerles una correlación
entre la pérdida de peso diaria y los días a la primera y tercera dominancia
folicular, se encontró que la pérdida de peso diaria determinaría en un 26% los
días a la aparición del primer folículo dominante (r=-0.51) y, en un 37% los días al
tercer folículo dominante (r=-0.61), de forma significativa (p<0.05). Esta
27
correlación negativa indicaría que, lo cual, a mayor pérdida de peso diaria, menos
días a la presentación deL FD,
7.4. Determinación de la Expresión de Receptores de Leptina y de LH por
Inmunofluorescencia
La determinación de la expresión de OBR y LHR por IFI, no fue posible realizarse
ya que el tejido ovárico presentaba autofluorescencia, lo que impedía encontrar un
patrón de expresión, al ser similar al control negativo de la técnica, y la señal de
los fluorocromos se confundía. Para contrarrestar esté fenómeno se realizaron
varios tratamientos:
a) Aumento de lavados con PBS, Tritón-X y Tween-20: No hubo disminución de la
autofluorescencia, como se observa en la Figura 2 (Dr. Carlos Vélez y Dra.
Marlene Jiménez, comunicación personal)
Figura 2. Corte histológico de folículos en crecimiento que presentan
autofluorescencia, tratados con aumento de lavados.
b) Bloqueo con Albúmina Sérica Bovina (BSA) al 10%, Leche descremada al 5% y
Suero Canino: No hubo disminución de la autofluorescencia, como se observa en
la Figura 3. La leche genera pequeños gránulos autofluorescentes (Dra. Doris
Ruiz, comunicación personal).
28
Figura 3. Corte histológico de cuerpo hemorrágico que presenta autofluorescencia,
tratado con albúmina sérica bovina.
c) Exposición a lámpara de mercurio por 6 horas y a lámparas UV (20W) y Neón
(18W) por 48 horas: No hubo disminución de la autofluorescencia, como se
observa en la figura 4 (Neumann M y Gabel D, 2002).
Figura 4. Corte histológico de folículo dominante que presenta autofluorescencia,
tratado con exposición a luz ultravioleta y neón.
d) Digitalización y medición de píxeles por un analizador de imágenes: El
programa no es lo suficientemente potente a la resolución de las fotografías (Dr.
Mario Cerón, comunicación personal).
29
7.5. Determinación de la Expresión de Receptores de Leptina y de LH por
Inmunohistoquímica.
La IHQ reveló la presencia de OBR y LHR en las células luteinizadas de los
cuerpos hemorrágicos y en células de la granulosa y de la teca (Figuras 5, 6 y 7).
30
Figura 5. Expresión de LHR y OBR en células de la granulosa y teca de folículos
en crecimiento. Las zonas positivas presentan color café.
Figura 6. Expresión de LHR y OBR en células de la granulosa y teca de folículos
dominantes. Las zonas positivas presentan color café.
Figura 7. Expresión de LHR y OBR en células luteinizadas de cuerpo hemorrágico.
Las zonas positivas presentan color café.
31
Con respecto a la expresión de LHR, se encontró un patrón de expresión bajo en
los folículos en crecimiento (p<0.05), comparado con la alta expresión en los
folículos dominantes y en los cuerpos hemorrágicos, entre los que no hubo
diferencia significativa. La expresión de OBR presentó la misma tendencia que
LHR, aunque solo hubo diferencia significativa entre la expresión en folículos en
crecimiento y en los cuerpos hemorrágicos (p<0.05) (Figura 14).
Figura 8. Comparación de los porcentajes de expresión de LHR y OBR en las
estructuras ováricas (Fol.Crec = Folículo en crecimiento, Fol.Dom = Folículo
dominante, Cpo.Hem = Cuerpo hemorrágico). Diferentes letras entre columnas del
mismo receptor significan diferencia estadística (p<0.05).
8. DISCUSIÓN
Durante el posparto temprano, las vacas Cebú presentan actividad folicular
temprana, ya que se observan folículos emergentes relacionados con el
crecimiento de cohortes foliculares, alrededor de una semana luego del parto. En
32
este estudio, incluso, se pudo observar que la mayoría de las vacas (FDLH y
FDSS, n=8) presentaron dominancia folicular temprana (alrededor de un mes
posparto), con folículos que tienen capacidad ovulatoria ya que responden a la
administración de análogos de LH. Por lo tanto, el fenómeno de la anovulación
posparto puede ser debido a la incapacidad para la producción de un pico
preovulatorio de LH, mas que una disminución en su frecuencia de liberación: la
vaca hace dominancia folicular pero solo ovula si tiene un aumento rápido y
significativo de LH circulante. La ausencia del pico preovulatorio de LH parece
deberse al efecto del amamantamiento permanente que tenían los animales
experimentales, de acuerdo con lo reportado en la literatura (Giraldo y col., 2005;
Henao y col., 2000), donde se conoce que la repleción de la adenohipófisis con LH
ocurre en las primeras semanas posparto en las vacas, sin embargo, la liberación
del pulso de LH necesario para la maduración folicular y ovulación, se encuentra
ausente debido al amamantamiento del ternero (Williams y col., 1993). Luego del
parto, las vacas Cebú reinician su actividad ovárica pronto, entre 26 a 78 días
posparto, pero el anestro y la anovulación se extienden hasta los 7 a 12 meses
posparto, tiempo que generalmente coincide con el destete de la cría (Ruiz-Cortés
y Olivera-Ángel, 1999). Ésta condición es definida por Wiltbank y col. (2002) como
"anovulación con crecimiento folicular únicamente hasta la emergencia". Además,
en el presente estudio, este fenómeno probablemente se ve relacionado con la
expresión de LHR a nivel de células de la granulosa y de la teca, lo que apoya el
hecho de que las vacas si tienen la capacidad ovulatoria, entendiendo que
presentan el primer suceso necesario para la ruta de señalización para la
ovulación, pero que no se desencadena por ausencia de ligando: la LH en forma
de pico preovulatorio.
Ni la pérdida del peso ni la variación en la CC fueron factores determinantes en la
presentación de la primera dominancia folicular. Esto concuerda con otros
estudios como el de Mejía y col (2003) donde el peso corporal no fue el factor
limitante para la presentación del estro. También concuerda con otras
investigaciones (Dunn y Kaltenbach, 1980; Richards y col., 1986; Wright y col.,
33
1992; Olivera y col., 1996), donde la condición corporal posparto no tiene tanta
importancia en la fisiología reproductiva, como lo es la CC y el peso preparto.
También, a diferencia de otros estudios, donde la variación en CC y Peso, son
variables con una influencia clara en el reinicio de la dinámica folicular y en la
establecimiento de la dominancia folicular posparto, en nuestro estudio
presentaron un impacto poco significativo. Se observaron correlaciones como que
el período a la presentación de las primeras dominancias foliculares sea mas
corto, si la vaca pierde mas peso. Sin embargo, esto se tradujo en que el
momento de presentación de los primeros folículos dominantes esta explicada
sólo en un 20.25% por el las variaciones de peso y de CC, evidenciando que el
fenómeno es un hecho multifactorial. Además, las vacas no presentaron ovulación
espontánea durante el periodo de estudio, lo que puede indicar que a nivel
folicular se encuentren las condiciones de señalización para OB y LH por la
expresión de sus receptores, pero, que las concentraciones circulantes de ambas,
que varían según el estado nutricional de la vaca, sean un factor clave para inducir
la ovulación.
La expresión de LHR fue significativamente mayor en las vacas que presentaron
dominancia folicular, hayan ovulado, o no, comparado con las vacas que no
hicieron dominancia folicular y solo presentaban folículos en crecimiento. Durante
el período de dominancia folicular se producen altas cantidad de estrógenos
(especialmente 17b-estradiol), los cuales son necesarios para la ovulación. El
pico preovulatorio del pulso de LH ocurre luego del pico de estradiol (Ginther y col,
1996; Bergfdel y col., 1996), por lo tanto, la ausencia de este en la anovulación
posparto, puede deberse a una disminución en la esteroidogénesis la cual esta
regulada tanto por LH como por OB.
En este estudio reportamos, por primera vez, la expresión de receptores para OB
a nivel de células de la granulosa, teca y luteinizadas de bovino. En ovario de
ratas, se ha reportado la expresión del OBR a nivel de oocitos, células
endoteliales, teca y cuerpo lúteo (Ryan y col, 2003; Duggal, 2002) donde el
34
porcentaje de expresión era menor en los folículos en crecimiento y aumentaba
con el desarrollo folicular. En gallinas también se ha encontrado un patrón de
expresión del OBR (Cassy y col., 2004), el cual, fue constante en células de la
teca, pero que disminuyó claramente con la diferenciación folicular en las células
de la granulosa, en gallinas de lento crecimiento. También se ha hallado una alta
expresión en células de la teca, y menor, en oocitos, células de la granulosa y
luteinizadas de murinos (Ryan y col., 2002). En porcinos fue encontrado un patrón
de expresión en células de la teca, granulosa y luteinizadas, el cual aumentaba
paralelo al progreso de la luteinizacion (Ruiz ZT y col, 2003). En humanos, se ha
encontrado la expresión del OBR a nivel de oocitos y células estromales (Abir y
col., 2005; Karlsson y col., 1997; Cioffi y col., 1997) y en líquido folicular (Welt CK
y col., 2003). De forma general, estos hallazgos han demostrado el papel que
tiene la señalización por leptina en el ovario, para los procesos de estoidogenesis
y maduración de oocitos.
Con respecto a nuestros hallazgos, los OBR se observan con una expresión
similar a los LHR, durante los estadios consecutivos de crecimiento folicular y
luteinizacion temprana, en cada una de las estructuras ováricas. Este hallazgo,
sugiere un papel importante de la relación OB-LH y su comodulación positiva a
nivel de la expresión de receptores foliculares, durante la esteroidogénesis en
bovinos y, la adquisición de la capacidad ovulatoria para resolver el anestro
posparto. Por otro lado, en un modelo de luteinización in vitro desarrollado en
nuestro grupo para hallar la expresión de ambos receptores, se encontró que la
comodulación entre ambos receptores es negativa, esto es que la expresión
máxima de un receptor coincide con la expresión mínima del otro y que además
esta interacción va depender del grado de luteinización de las células de
granulosa en cultivo (Montaño y col, 2006, tesis), lo cual sugiere que estos dos
modelos se complementan y permiten describir la dinámica de ambos receptores
desde el desarrollo folicular, ovulación y formación del cuerpo lúteo. Poco antes de
la ovulación, las células de la granulosa y teca comienzan un proceso de
luteinización aumentando la síntesis y liberación de progesterona, la cuál alcanza
35
niveles altos en suero luego de la ovulación y formación del cuerpo lúteo por parte
de las células de la granulosa y teca agrupadas. Aparentemente la disminución en
la secreción de OB, y en su ARNm, en la fase tardía y folicular temprana no tiene
correlación con la producción de progesterona, en contraste con resultados
obtenidos en mujeres y roedores en los cuales la OB sérica aumentó luego de una
terapia de reemplazo con estradiol y progesterona (García y col., 2002). En
cultivos de células de granulosa y teca de cerdos y en cortes de ovario en
diferentes estadios de la fase lútea, OB y su receptor tuvieron alta concentración
en el CL de mitad de ciclo y baja en el CL posovulatorio y en regresión, lo que
indicaría una regulación positiva de la OB en la producción de P4 (Ruiz-Cortés y
col., 2003).
Podemos concluir que en el fenómeno fisiológico del anestro posparto bovino, las
vacas presentan una reactivación ovárica temprana y llegan a adquirir
rápidamente su capacidad ovulatoria, entendida por la expresión de receptores
para la Hormona Luteinizante y Leptina a nivel folicular, pero esta se ve limitada
por la pérdida de peso diaria y por la ausencia del pico preovulatorio de LH.
Ambas hormonas, se comodulan a nivel de ovario y regulan la esteroidogénesis,
ya que se pudo observar un patrón de expresión similar de receptores y que
aumentaba a medida que avanzaba el desarrollo folicular. Estos hallazgos
permiten dar el primer paso en el modelo hipotético de esteroidogénesis
planteado, pero, es necesario realizar próximas investigaciones encaminadas a
completar la ruta de señalización de los receptores para ambas hormonas, para
establecer a cuales genes regulan su expresión en el ovario, y correlacionarlo con
niveles séricos para hormonas esteroideas.
8. AGRADECIMIENTOS
Este proyecto fue financiado por el Internacional Foundation for Science (IFS).
36
A la Dra. Zulma Tatiana Ruiz, Dra. Martha Olivera Ángel, al Dr. Jaime Iván
Rodríguez, al Dr. Juan Guillermo Maldonado, a la Dra. Nélida Rodríguez, por su
apoyo como Comité Tutorial.
Al Departamento de Formación Académica de Haciendas, de la Facultad de
Ciencias Agrarias de la Universidad de Antioquia por el préstamo de las
instalaciones de la Hacienda “El progreso”.
Al personal de la Hacienda “El progreso”, por su apoyo logístico y de manejo con
los animales, especialmente a Demetrio, Lilian y Pedro.
A la Dra. Doris Ruiz del Departamento de Dermatología del Hospital San Vicente
de Paúl por su colaboración en el procesamiento de los cortes de tejido.
A mi familia, la señora Miryam Echeverri y Ana Eva Echeverri.
A la señora Martha Mesa, por su incondicional apoyo.
A todos los amigos(as) y compañeros(as), integrantes del Grupo Reproducción,
Fisiología y Biotecnología, especialmente a Lina María Carrillo, Ariel Marcel
Tarazona, José Bran, Edinson Cardona, Silvia Jara, Andrés Felipe Montoya,
Carolina Mesa, Erika Lorena Montaño, por su acompañamiento permanente, su
buena energía y cariño.
A todas las personas que me han acompañado en el hecho de vivir.
A la Corporación de Ciencias Básicas Biomédicas de la Universidad de Antioquia,
donde fue realizada esta Maestría.
37
9. BIBLIOGRAFÍA
Abir R , Ao A, Jin Sh, Barnett M, Raanani H, Ben-Haroush A, Fisch B. 2005.
Leptin and its receptors in human fetal and adult ovaries. Fertility and Sterility
84(6):1779-1782.
Arije GR, Wiltbank JN, Hopwood ML. 1974. Hormone levels in pre- and post-
parturient beef cows. J Anim Sci. Aug;39(2):338-47.
Barash IA, Cheung CC, Weigle DS, Ren H, Kabigting EB, Kuijper JL, Clifton DK,
Steiner RA. 1996. Leptin is a metabolic signal to the reproductive system.
Endocrinology 137(7):3144-3147.
Bergfeld EGM, D'Occhio MJ, Kinder JE. 1996. Pituitary Function, Ovarian
Follicular Growth, and Plasma Concentrations of 17p-Estradiol and Progesterone
in Prepubertal Heifers during and after Treatment with the Luteinizing Hormone-
Releasing Hormone Agonist Deslorelin. Biology of Reproduction 54:776-782
Bossis I, Wettemann RP, Welty SD, Vizcarra J, Spicer LJ. 2000. Nutritionally
induced anovulation in beef heifers: ovarian and endocrine function during
realimentation and resumption of ovulation. Biology of Reproduction 62:1436-
1444.
Cassy S, Metayer S, Crochet S, Rideau N, Collin a, Tesseraud S. 2004. Leptin
receptor in the chicken ovary: potential involvement in ovarian dysfunction of ad
libitum-fed broiler breeder hens. Reprod Biol Endocrinol. 2:72.
Castillo GH, Ruiz ZT, Olivera M, Jiménez C. 1997. Reactivación ovárica posparto
en vacas Cebú Brahman con relación al peso y la condición corporal. Rev Col
Cienc Pec 10(1):12-18.
38
Chilliard Y, Bonnet M, Delavaud C, Faulconnier Y, Leroux C, Djiane J, Bocquier F.
2001. Leptin in rumiants. Gene expression in adipose tissue and mammary gland,
and regulation of plasma concentration. Domestic Animal Endocrinology 21:271-
295.
Cioffi JA, Van Blerkom J, Antczak M, Shafer A, Wittmer S, Snodgrass HR. 1997.
The expression of leptin and its receptors in pre-ovulatory human follicles. Mol
Hum Reprod. 3(6):467-72.
Duggal PS, Weitsman SR, Magoffin DA, Norman RJ. 2002. Expression of the
long (OB-RB) and short (OB-RA) forms of the leptin receptor throughout the
oestrous cycle in the mature rat ovary. Reproduction 123(6):899-905.
Dunn TG y Kaltenbach CC. 1980. Nutrition and the postpartum interval of the ewe
sow and cow. Journal of Animal Science 51 Supl 2:29.
Echternkamp SE, Hansel W. 1973. Concurrent changes in bovine plasma
hormone levels prior to and during the first postpartum estrous cycle. J Anim Sci.
Dec;37(6):1362-70
Edgerton LA, Hafs HD. 1973. Serum luteinizing hormone, prolactin,
glucocorticoid, and progestin in dairy cows from calving to gestation. J Dairy Sci.
Apr;56(4):451-8.
Erickson GF, Magoffin DA, Dyer CA, Hofeditz C. 1985. The ovarian androgen
producing cells: a review of structure/function relationships. Endocr Rev 6:371–
399.
Erickson GF, Shimasaki S. The physiology of folliculogenesis: the role of novel
growth factors. Fertility and Sterility 76 (5) (2001)
39
Evans ACO, Fortune JE. 1997. Selection of the dominant follicle in cattle occurs
in the absence of differences in the expression of messenger ribonucleic acid for
gonadotropin receptors. Endocrinology 138(7):2963-2971.
García MR, Amstalden M, Williams SW, Stanko RL, Morrison CD, Keisler DH,
Nizielski SE, Williams GL. 2002. Serum leptin and its adipose gene expression
during pubertal development, the estrous cycle, and different seasons in cattle.
Journal of Animal Science 80:2158-2167.
Ginther OJ, Wiltbank MC, Fricke PM, Gibbons JR, Kot K. 1996. Selection of the
dominant follicle in cattle. Biology of Reproduction 55:1187-1194.
Giraldo CA, Ruiz ZT, Restrepo LF, Olivera M. 2005. Interrupción temporal del
amamantamiento (ITA) en vacas Cebú y su efecto en la función ovárica. Redvet
VI(12) Diciembre.
Gore-Langton RE, Armstrong DT. 1998. Follicular steroidogenesis and its control.
En: Knobil E, Neill JD. The Physiology of reproduction. Vol 1, 2da edición, 571-
627. Raven Press, New York.
Griffith MK, Williams GL. 1996. Roles of Maternal Vision and Olfaction in
Suckling-Mediated Inhibition of Luteinizing Hormone Secretion, Expression of
Maternal Selectivity, and Lactational Performance of Beef Cows. Biology Of
Reproduction 54:761-768
Heinrichs J, Lammers B. 2001. Monitoring dairy heifer growth. Pennsylvania
State Univer. http://www.das.psu.edu/dcn/calfmgt/growth/docs/measure.html
Henao G, Olivera-Ángel M, Maldonado-Estrada JG. 2000. Follicular dynamics
during the postpartum anestrous and the first estrous cycle in suckled or non-
suckled Brahman (Bos indicus) cows. Animal Reproduction Science 63:127-136
40
Hoffman DP, Stevenson JS, Minton JE. 1996. Restricting calf presence without
suckling compared with weaning prolongs postpartum anovulation in beef cattle.
Journal of Animal Science 74:190-198.
Holdriege LR. 1996. Ecología basada en zonas de vida. Instituto interamericano
de cooperación para la agricultura. San José de Costa Rica.
Ireland JJ, Mihm M, Austin E, Diskin MG, Roche F. 2000. Historical perspective of
turnover of dominant follicles during the bovine estrous cycle: key, concepts,
studies, advancements, and terms. Journal Dairy Science 83:1648-1658
Karlsson C, Lindell K, Svensson E, Bergh C, Lind P, Billig H, Carlsson LM,
Carlsson B. 1997. Expression of functional leptin receptors in the human ovary. J
Clin Endocrinol Metab. 82(12):4144-8.
Kawate N. 2004. Studies on the regulation of expression of luteinizing hormone
receptor in the ovary and the mechanism of follicular cyst formation in rumiants.
Journal of Reproduction and Development 50(1).
Kim H, Chi Y, Chung K, Kim K, Choi Y, Baik M. 2000. Differential response of
obese gene expression from fasting in bovine adipose tissues. Biosci Biotechnol
Biochem. 64(10):2240-2242.
Klosterman EW, Sanford LG, Parker CF. 1968. Effect of cow size and condition
and ration protein content upon maintenance requirements of mature beef cows. J
Anim Sci. 27(1):242-246.
Kulick LJ, Bergfelt DR, Kot K, Ginther OJ. 2001. Follicle selection in cattle: follicle
deviation and codominance within sequential waves. Biology of Reproduction
65:839-846.
41
McCann SM, Karanth S, Mastronardi CA, Les Dees W, Childs G, Miller B, Sower
S, Yu WH. 2001. Control of gonadotropin secretion by follicle-stimulating
hormone-releasing factor, luteinizing hormone-releasing hormone, and leptin.
Archives of Medical Research 32:476-485.
McCann SM, Kimura M, Walczewska A, Karanth S, Rettori V, Yu WH. 1998.
Hypothalamic control of FSH and LH by FSH-RF, LHRH, cytokines, leptin and nitric
oxide. Neuroimmunomodulation. 5(3-4):193-202.
McShane TM, Petersen SL, McCrone S, Keisler DH. 1993. Influence of food
restriction on neuropeptide-Y, proopiomelanocortin, and luteinizing hormone-
releasing hormone gene expression in sheep hypothalami. Biol Reprod.
49(4):831-839.
Mejía C, Henao G, Botero J, Acevedo LI, Giraldo AM, Trujillo LE. 2003.
Variaciones en el peso y la condición corporal posparto y su relación con algunos
parámetros de eficiencia reproductiva en vacas cebú. Rev Col Cienc Pec Vol. 16,
Suplemento: 85
Montaño EL, Ruiz-Cortés ZT. 2006. Expresión de receptores de leptina y de LH;
efecto de sus ligandos en la esteroidogénesis en un modelo de luteinización in
vitro. Maestría en Ciencias Animales, Universidad de Antioquia, Trabajo de grado.
Neumann M, Gabel D. 2002. Simple method for reduction of autofluorescence in
fluorescence microscopy. J Histochem Cytochem. Mar;50(3):437-9.
Olivera M. 1996. Días abiertos en vacas Brahman y su relación con peso y
condición corporal. Rev Col Cienc Pec 9 Supl:66-67.
42
Prolo P, Wong ML, Licinio J. 1998. Leptin. The International Journal of
Biochemistry and Cell Bilogy 30:1285-1290.
Richards MW, Spitzer JC, Warner MB. 1986. Effect of varying levels of
postpartum nutrition and body condition at calving on subsequent reproductive
performance in beef cattle. Journal of Animal Science. 62:300.
Robinson JJ. 1996. Nutrition and reproduction. Animal Reproduction Science
42:25-34.
Ruiz-Cortes ZT, Martel-Kennes Yan, Gevry NY, Downey BR, Palin MF, Murphy
BD. 2003. Biphasic Effects of Leptin in Porcine Granulosa Cells. Biology of
Reproduction 68:789–796.
Ruiz-Cortés ZT, Olivera-Angel M. 1999. Ovarian follicular dynamics in sucked
zebu (Bos indicus) cows monitored by real time ultrasonography. Anim Reprod Sci
54:211-220.
Ryan NK, Van der Hoek KH, Robertson SA, Norman RJ. 2003. Leptin and Leptin
Receptor Expression in the Rat Ovary. Endocrinology 144(11):5006-5013.
Ryan NK, Woodhouse CM, Van der Hoek KH, Gilchrist RB, Armstrong DT, Norman
RJ. 2002. Expression of leptin and its receptor in the murine ovary: possible role in
the regulation of oocyte maturation. Biol Reprod May;66(5):1548-54.
Schwartz MW, Seeley RJ, Campfield LA, Burn P, Baskin DG. 1996. Identification
of Targets of Leptin Action in Rat Hypothalamus. J Clin Invest 98(5):1101–1106.
Spicer LJ, Francisco CC. 1997. The adipose obese gene product, leptin: evidence
of a direct inhibitory role in ovarian function. Endocrinology 138:3374-3379.
43
Spicer LJ. 1991. Leptin: a possible metabolic signal affecting reproduction.
Domestic Animal Endocrinology 21:257-270.
Stagg K, Diskin MG, Sreenan JM, Roche JF. 1995. Follicular development in
long-term anoestrous suckler beef cows fed two levels of energy postpartum.
Animal reproduction Science 38:49-61.
Stagg K, Spicer LJ, Sreenan JM, Roche JF, Diskin MG. 1998. Effect of Calf
Isolation on Follicular Wave Dynamics, Gonadotropin and Metabolic Hormone
Changes, and Interval to First Ovulation in Beef Cows Fed Either of Two Energy
Levels Postpartum. Biology of Reproduction 59:777–783
Stevenson JS, Lamb GC, Hoffmann DP, Minton JE. 1997. Interrelationships of
lactation and postpartum anovulation in suckled and milked cows: Review.
Livestock Production Science 50:57-74.
Tartaglia LA, Dembski M, Weng X, Deng N, Culpepper J, Devos R, Richards GJ,
Campfield LA, Clark FT, Deeds J, et al. 1995. Identification and expression
cloning of a leptin receptor, OB-R. Cell. 83(7):1263-1271
Toribio RE, Molina JR Forsberg M, Kindahl H, Eqvist LE. 1995. Effects of calf
removal at parturition on postpartum ovarian activity in Zebu (Bos indicus) cows in
the humid tropics. Acta Vet Scand 36:343-352.
Welt CK, Schneyer AL, Heist K, Mantzoros CS. 2003. Leptin and soluble leptin
receptor in follicular fluid. J Assist Reprod Genet Dec;20(12):495-501.
Williams GL, Guzman Vega G, Zochi C, Gazal O. 1996. Mechanisms regulating
suckling-mediated anovulation in cows. In: Stone GM, Evans G (eds.), Animal
Reproduction: Research and Practice, Anim Reprod Sci Suppl 42:289-297.
44
Williams GL, Mcvey WR, JR, Hunters JF. 1993. Mammary Somatosensory
Pathways Are Not Required for Suckling-Mediated Inhibition of Luteinizing
Hormone Secretion and Delay of Ovulation in Cows. Biology of Reproduction
49:1328-1337
Wiltbank MC, Gümen A, Sartori R. 2002. Physiological classification of
anovulatory conditions in cattle. Theriogenology 57:21-52
Wright IA, Rhind SM, White TK. 1992. A note on the note of pattern of food intake
and body condition and the duration of the post-partum anoestrous period and LH
profiles in beef cows. Animal Production. 54:143-146.
Xu Z, Garverick HA, Smith GW, Smith MF, Hamilton SA, Youngquist RS. 1995.
Expression of messenger ribonucleic acid encoding cytochrome P450 side-chain
cleavage, cytochrome P450 17a-hydroxylase, and cytochrome P450 aromatase in
bovine follicles during the first follicular wave. Endocrinology 136:981–989.
Xu Z, Garverick HA, Smith GW, Smith MF, Hamilton SA, Youngquist RS. 1995a.
Expression of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone receptor
messenger ribonucleic acids in bovine follicles during the first follicular wave. Biol
Reprod 53:951–957.
Yu WH, Kimura M, Walczewska A, Karanth S, y McCann SM. 1997. Role of leptin
in hypothalamic–pituitary function. Proc Natl Acad Sci 94:1023–1028.
Zhang Y, Proenca R, Maffei M, Barone M, Leopold L, Friedman JM. 1994.
Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature
372(6505):425-432
45
Anexo 1:
Protocolo para el uso del ecógrafo en investigación para reproducción animal
PROTOCOLO 01 Creado por: Carlos Andrés
Giraldo E. Modificado por: Carlos Andrés
Giraldo E. Fecha de creación: 30 nov/2002 Última modificación: 10 abr/2005 Frecuencia de revisión:
12 meses Última revisión: 10 abr/2005
Aprobación del coordinador:
Aprobación del gerente de calidad:
Propósito: Algunos de los usos de la ecografía, en especial de diagnóstico, investigación y manejo reproductivo son: caracterización de ondas foliculares, diagnóstico de patologías del aparato reproductor, diagnóstico temprano de gestación, determinación precoz del sexo fetal, punción y aspiración folicular para colectar oocitos, estudio de la viabilidad embrionaria, determinación de la edad de gestación, evaluación ginecológica de donantes y receptoras de embriones, determinación del momento de inicio de superovulación de donantes, estimación de la respuesta superovulatoria, determinación del momento de aplicación de agentes lúteo líticos para sincronizar celos (medición de cuerpo lúteo), evaluación de la respuesta del ovario a otros sistemas de sincronización de celo, determinación del momento y/o tasa de ovulación para servicio (aplicado especialmente en yeguas y cerdas), determinación de gestaciones múltiples (aplicado especialmente a ovejas, cabras, cerdas, perras), determinación precoz de mellizos para dejar uno (aplicado especialmente en yeguas, vacas), aplicación en los machos, para estudio de glándulas accesorias, testículos y epidídimo, medición de la grasa y músculo dorsal para clasificar canales, evaluación del grado de fibrosis en la glándula mamaria, evaluación de tendones y tejidos blandos superficiales especialmente en las extremidades Equipos y Materiales: Ecógrafo ALOKA: Echocamera Modelo SSD-500, versión software 9.0 Sondas ultrasonográficas de 7.5 y 5 MHz, y Transvaginal. Grabadora y reproductor de VHS (con control remoto). Monitor a blanco y negro. Cables de conexión para video. Cortapicos de voltaje. Extensión eléctrica. Cassettes de VHS.
46
Procedimiento: A. ESTUDIO ECOGRÁFICO:
1. Prepare el paciente Si es un estudio transrectal en bovinos, asegúrese de que el animal esté lo suficientemente inmóvil dentro de un brete. Si es un estudio a través de la piel, rasure los pelos (en lo posible), desengrase la piel con alcohol y aplique gel en la zona que desea explorar.
2. Conecte el cortapicos a la extensión eléctrica y enciéndalo. Verifique que el led rojo se encuentre encendido.
3. Conecte el enchufe del ecógrafo al cortapicos. 4. Conecte la sonda que va a utilizar al ecógrafo y gire la perilla de ésta para
que quede fija. 5. Encienda el ecógrafo. Nota 1: Siempre cuide de que la sonda no corra peligro de caerse o de golpearse para que no se estropee, una sugerencia es colgar el cable transductor al cuello. 6. Coloque suficiente gel sobre el transductor. En ecografía transrectal puede
colocar la sonda dentro de una guante de palpación desechable al cual le ha agregado gel dentro de un dedo, esto protege la sonda y mejora la resolución de las imágenes.
7. Desplace el transductor sobre la zona que desea explorar. B. ESTUDIO ECOGRÁFICO CON GRABACIÓN DE LAS IMÁGENES: B1. Grabación con visualización de las imágenes en el ecógrafo y en el monitor:
1. Conecte los cables de video formando un circuito entre el ecógrafo, VHS y monitor. (Figura A)
2. Conecte los enchufes correspondientes de cada aparato al cortapicos. Repita los pasos del punto A.
Nota 2: Ya que el monitor posee un voltaje de 220 voltios, se debe colocar en su enchufe un transformador de energía. 3. En la parte posterior del ecógrafo se encuentra una palanca pequeña que
permite abrir el circuito para que se visualice la imagen ecográfica en el monitor. Esta palanca se debe halar hacia fuera suavemente y dirigir hacia arriba.
4. El VHS debe estar configurado en el canal “Line 1” para comenzar a grabar. Ésto se logra apretando los botones “Chanel +/-“ en el panel frontal del aparato, o por medio del control remoto hasta que aparezca “Line 1” en la pantalla digital.
5. Introduzca un cassette de VHS. Nota 3: Recuerde que para poder grabar en un cassette, éste debe de tener la pestaña de seguridad en el borde frontal, sobre el lado derecho, del cassette. 6. Apriete los botones “Record + Pause” en el panel frontal del VHS o desde el
control remoto. En éste momento el equipo está dispuesto a grabar las imágenes producidas por el ecógrafo.
47
7. Inicie la exploración ecográfica. 8. En el momento que considere necesario, apriete el botón “Pause” del VHS
o desde el control remoto, así comenzara a grabar las imágenes. Nota 4: Si desee grabar las mediciones de los tejidos analizados, debe realizarlas mientras el VHS se encuentra grabando, de lo contrario, no podrá medirlas cuando revise el material grabado en el cassette. Más adelante se explicarán los procedimientos de medición. 9. Para detener la grabación apriete “Pause” si va a continuar con otros
pacientes o estructuras; o “Stop” si va a terminar el estudio ecográfico. Nota 5: Durante todo el proceso de ecografía y grabación, se visualizarán las imágenes tanto en el ecógrafo como en el monitor.
B2. Grabación con visualización de las imágenes únicamente en el ecógrafo:
1. Conecte los cables de video entre el ecógrafo y el VHS (Figura B). 2. Conecte los enchufes del ecógrafo y el VHS al cortapicos. 3. Repita los pasos del punto A. 4. Repita los pasos 4 a 9 del punto B1.
C. REPRODUCCIÓN DE LAS IMÁGENES GRABADAS:
1. Conecte los cables de video entre el monitor y el VHS. (Figura C) 2. Conecte los enchufes de ambos aparatos al cortapicos. 3. Inserte el cassette en el VHS. Nota 6: Si desea proteger las imágenes grabadas contra grabaciones no deseadas, rompa la lengüeta de seguridad del cassette en el borde frontal. 4. Rebobine el cassette con el botón “Rew” del panel frontal del VHS o desde
el control remoto. 5. Configure el canal 3 en el VHS con los botones “Chanel +/-“ hasta que
aparezca en la pantalla digital. 6. Apriete el botón “Play” y comenzara a visualizar las imágenes en la pantalla
del monitor. Nota 7: Las imágenes también se pueden reproducir en la pantalla del ecógrafo, pero esta forma no es recomendada por la casa manufacturadora del mismo. Para tal fin se dispondría un circuito con los cables de video como se muestra en la Figura A, y se cambiaría la posición de la palanca detrás del ecógrafo.
48
Figura A Figuras B y C
49
PANEL DE CONTROL A Ver Figura 4
1. POSICIONADOR: Para desplazar las marcas calibradoras por la imagen del monitor
2. CALIPER MARK (Marcas calibradoras): Son dos, “x” o “+”, y se usan para marcar los puntos de medición.
3. MARK REF (Marca referencia): Para fijar las marcas calibradoras en un punto.
4. MEASUREMENTS (Mediciones): Son dos, para mediciones lineales y, para mediciones de áreas circulares.
5. NEAR GAIN (Ganancia Cerca): Para incrementar o disminuir la ganancia (brillo) en el campo cercano a la imagen del ultrasonido (cerca de la piel).
6. FAR GAIN (Ganancia Lejos): Para incrementar o disminuir la ganancia (brillo) en el campo lejano a la imagen del ultrasonido (lejos de la piel).
7. MAGNIFICATION (Magnificador): Para aumentar o reducir la imagen. PANEL DE CONTROL B
Ver Figura 4
1. PRINT (Imprimir): Para imprimir imágenes con cámara o impresora. 2. MODE (Modo): Para mostrar la imagen en los distintos modos:
3. IMAGE DIRECTION (Dirección de la imagen): Cambia la dirección del despliegue lateral de la imagen.
4. FREEEZE (congelar): Para congelar la imagen. 5. ID: Para entrar la identificación del paciente. 6. COMMENT (Comentario): Para agregar comentario acerca de la imagen. 7. NUEVO PACIENTE (New Patient): Para agregar un nuevo paciente.
50
8. FOCUS (Foco): Para seleccionar la zona focal de la imagen.
MEDICIÓN DE IMÁGENES A. LONGITUD
1. Obtenga la imagen y oprima FREEZE para congelarla. 2. Presione el botón de MEASUREMENT de longitud (Figura D), el led se
prenderá indicando que está activado. 3. Desplace la marca calibradora (+) hasta el primer extremo de la imagen a
medir por medio del POSICIONADOR. 4. Presione el botón MARK REF. 5. Desplace la marca calibradora (+) hasta el otro extremo de la imagen a
medir por medio del POSICIONADOR. 6. En el borde derecho de la pantalla del ecógrafo encontrará la longitud en
centímetros de la imagen medida. 7. Puede modificar los puntos de medida por medio del botón MARK REF y
moviendo las marcas calibradoras con el POSICIONADOR. 8. Si necesita otra medida de longitud sin borrar la actual, oprima el botón de
la otra marca calibradora (x) y repita el procedimiento de los pasos 1 al 6. En el borde derecho de la pantalla del ecógrafo aparecerán las dos mediciones.
9. Para terminar la medición oprima de nuevo el botón de MEASUREMENT de longitud, el led indicador se apagará.
B. AREA / CIRCUNFERENCIA
1. Obtenga la imagen y oprima FREEZE para congelarla. 2. Presione el botón de MEASUREMENT de área (Figura D), el led se
prenderá indicando que está activado. 3. Desplace la marca calibradora (+) hasta el extremo superior de la imagen
circular o elíptica que desea medir, por medio del POSICIONADOR. 4. Presione el botón MARK REF. 5. Desplace la marca calibradora (+) hasta el extremo inferior. 6. Presione el botón MARK REF. Aparecerá una pequeña elipse punteada
con otras dos marcas calibradoras (+) horizontales
51
7. Con el POSICIONADOR hacia la derecha podrá ampliar la elipse de forma horizontal, y hacia la izquierda la disminuirá.
8. En el borde derecho de la pantalla del ecógrafo aparecerá la lectura siguiente:
Área: en centímetros cuadrados. C (circunferencia): longitud de la circunferencia en centímetros. S (eje corto): longitud del eje corto en centímetros. L (eje largo): longitud del eje largo en centímetros. 9. Para terminar la medición oprima de nuevo el botón de MEASUREMENT de
área, el led indicador se apagará. Figura D:
52
Anexo 2:
Ecografía transrectal en hembras bovinas
PROTOCOLO 02 Creado por: Carlos Andrés Giraldo E. Modificado por: Carlos Andrés
Giraldo Fecha de creación: 3 sep/2003 Última modificación: 10 abr/2005 Frecuencia de revisión: 12 meses Última revisión: 10 abr/2005 Aprobacióndel coordinador:
Aprobación del gerente de calidad
Propósito: La ecografía transrectal es una herramienta apropiada para el estudio de la anatomía y fisiología del aparato reproductivo en los bovinos. A través del uso de la ultasonografía se pueden evaluar parámetros como gestaciones tempranas, dinámica folicular, sexaje de fetos, integridad de los tejidos, entre otras. Equipos y Materiales: Ecógrafo ALOKA 100, Modelo SSD-500, Software 9.0 Sonda Ultrasonográfica 7.5 MHz. Gel para ultrasonido Guantes de palpación desechables Regulador de voltaje Extensión eléctrica Adaptador para conexión Procedimiento: 1. Asegurar el animal en un brete donde permanezca inmóvil. 2. Conectar el regulador de voltaje a una fuente eléctrica, usando la extensión y
el convertidor en los casos en que sean necesarios. Asegurarse que el regulador tenga el fusible funcionando correctamente.
3. Conecte el enchufe del ecógrafo al regulador de voltaje. 4. Coloque de 10 a 20 c.c. de gel dentro de un guante de palpación, introduzca la
sonda ultrasonográfica dentro y haga un nudo o coloque cinta para que el gel permanezca protegiendo al transductor. Además, este procedimiento mejora la resolución de las imágenes.
5. Conecte la sonda ultrasonográfica al ecógrafo en el puerto que queda en el lado derecho. Gire la perilla de la sonda hacia arriba.
6. Encienda el ecógrafo usando el encendido que queda en la parte de atrás. 7. Colóquese un guante de palpación y lubríquelo con un poco de gel. 8. Realice una palpación exploratoria del tracto reproductivo, lo cual le permite
tener una ubicación espacial de las estructuras y un diagnóstico presuntivo. En lo posible, evitar evacuar el recto de materia fecal para evitar el estimulo para defecar y disminuir la posibilidad de laceraciones en la mucosa.
53
9. Extraiga la mano del recto. 10. Pase el cable de la sonda por encima de sus hombros. 11. Coloque el transductor de la sonda en la palma de la mano, ubique sus dedos
por encima adoptando una forma de cuña. 12. Introduzca su mano con la sonda dentro del recto, venciendo el esfínter anal
con delicadeza. 13. Haga un barrido del fondo de la cavidad pélvica desplazando el transductor de
lado a lado, ubicando las estructuras que conforman el aparato reproductivo. 14. Manipule los órganos de interés y remítase al protocolo de manejo del ecógrafo
para datos puntuales del diagnóstico de imágenes (PROTOCOLO 01)
54
Anexo 3:
Ecografía transrectal para estudios de dinámica folicular en bovinos
PROTOCOLO 03 Creado por: Carlos Andrés
Giraldo E Modificado por: Carlos Andrés
Giraldo Fecha de creación: 3 sep/2003 Última modificación: 10 abr/2005 Frecuencia de revisión: 12 meses Última revisión: 10 abr/2005 Aprobacióndel coordinador:
Aprobación del gerente de calidad
Propósito: El estudio de la dinámica folicular en hembras bovinas por medio del ultrasonido a permitido comprender la anatomía de los ovarios, y el comportamiento fisiológico durante el inicio de la pubertad, el ciclo estral, la reactivación ovárica posparto y la respuesta a tratamientos hormonales o de manejo reproductivo. Equipos y Materiales: Ecógrafo ALOKA 100, Modelo SSD-500, Software 9.0 Sonda Ultrasonográfica 7.5 MHz. Gel para ultrasonido Guantes de palpación desechables Regulador de voltaje Extensión eléctrica Adaptador para conexión Procedimiento: 15. Para iniciar, remítase al protocolo de ecografía transrectal en hembras bovinas
(PROTOCOLO 02). 16. Ubique primero el ovario ipsilateral al de la mano que utiliza para palpar (sólo
por que es un poco mas difícil de alcanzar) 17. La imagen ecográfica del ovario se describe de la siguiente manera:
A. El ovario se define como una estructura oval-circular de diferentes tamaños en su diámetro (+/- 20 a 50 mm).
B. El estroma y la médula tiene una tonalidad gris intermedia y el borde generalmente es una tenue línea blanca.
C. Los folículos son estructuras circulares, anecogénicas (negras), dispuestas en cualquier parte dentro de la imagen del área del ovario, con dimensiones que varían en su diámetro (desde 3 mm hasta +/- 18 mm o más).
D. Los cuerpos lúteos son estructuras circulares, ecogénicas (un tono de gris alto), dispuestas en cualquier parte dentro de la imagen del área del ovario, con dimensiones variables y que pueden tener en el centro una pequeña cavidad visualizada como un círculo anecogénico.
55
18. Para los procedimientos de análisis de imágenes, remítase al PROTOCOLO 01.
19. Realizar dos observaciones ecográficas de los ovarios, una longitudinal y otra transversal, tomando en ambas las medidas de los folículos y luego promediándolas.
20. Los datos se deben anotar en el registro (Figura A) para facilitar su posterior análisis. En lo posible, contar con un (a) ayudante. Dentro de cada circunferencia, que representa a cada ovario, se dibuja cada folículo o cuerpo lúteo en la ubicación aproximada, y en el interior de cada uno, se coloca el diámetro en mm.
21. Para un análisis adecuado de la dinámica folicular, la observación de los ovarios se debe realizar de forma consecutiva, cada 12, 24 o 48 horas (según la fineza del modelo experimental).
22. Los datos se descargan a una hoja de calculo (Excel) como se muestra en la Figura B. Se tiene en cuenta es el conjunto de folículos, ya no discriminado por ovario (a no ser que la metodología lo considere necesario). Luego se grafica.
56
Figura A REGISTRO DE DATOS DE DINÁMICA FOLICULAR
Identificación Vaca REGISTRO Nro Datos Retrospectivos Obtenidos por Registro
Raza Edad Padre Madre Número de Partos Dias Abiertos Actuales Fecha Último Parto Días Abiertos Promedio Intervalo Entre Partos Promedio Servicios Concepción Promed Condición Corporal Producción Láctea Promedio Amamantamiento (si/no) Duración Lactancia Promedio
Seguimiento Ecográfico Fecha Ovario Derecho y Ovario Izquierdo Fecha Ovario Derecho y Ovario Izquierdo
D M A Diámetro Folículos y CL (mm) D M A Diámetro Folículos y CL (mm)
Fecha Hora Observaciones Síntomas de Calor I. Artificial / M natural Toro:
57
VACA 30
0
2
4
6
8
10
12
02/11/200
5
04/11/20
05
06/11/200
5
08/11/20
05
10/11/200
5
12/11/200
5
14/11/20
05
16/11/200
5
18/11/200
5
20/11
/2005
22/11/200
5
24/11
/2005
26/11
/2005
28/11/200
5
30/11
/2005
02/12/200
5
04/12/20
05
06/12/200
5
08/12/20
05
10/12/20
05
12/12/200
5
14/12/20
05
16/12
/2005
18/12/200
5
20/12
/2005
22/12/200
5
24/12/200
5
26/12
/2005
Días
Diá
met
ro F
olic
ular
Serie1
Serie2
Serie3
Serie4
Serie5
Serie6
Serie7
Serie8
Serie9
Serie10
Serie11
Serie12
Serie13
Serie14
Serie15
Figura B. Ejemplo de hoja de cálculo en Excel.
58
Anexo 4: Ovariectomía en hembras bovinas: PROTOCOLO 04 Creado por: Carlos Andrés
Giraldo Modificado por: Carlos Andrés
Giraldo Fecha de creación: 10 abr/2005 Última modificación: Frecuencia de revisión:
12 meses Última revisión:
Aprobación del coordinador:
Aprobación del gerente de calidad:
Propósito: Extraer los ovarios en un momento fisiológico o patológico específico, para realizar técnicas de análisis posteriores sobre las estructuras presentes en ellos, y poder acercarse al entendimiento de la fisiología dinámica de los ovarios. Equipos y Materiales: Brete 2 Tubos cónicos plásticos 50 mL (Ej: Falcon®) Fuente de agua (manguera, etc.) Solución Fosfatada Buferada 1X (PBS) Lazos Marcador indeleble Mesa para instrumental Compresas (Ej:Gasa, toallas, toallas higiénicas) Solución jabonosa de yodo 3 frascos (50 mL) Lidocaína 10% Cepillo pequeño 1 frasco (10 mL) Xilacina 5% Barbera y Hojas de afeitar 1 frasco (50 mL) Penicilina-Estreptomicina Cuchillas bisturí #10 Instrumental básico grandes especies Guantes de palpación desechables Guantes de cirugía desechables 3 Agujas 16Gx1½ Solución yodada 1 jeringa de 1 mL Algodón 5 jeringas de 10 mL Alcohol Trocar de 10 cm (“Aguja eutanasia”) Nylon de pesca (30 lb) Nevera de icopor pequeña Venoclisis (Usado o nuevo) Hielo Insecticida externo en polvo. ** Como mínimo un ayudante de cirugía y un ayudante de manejo. Procedimiento:
1. Dejar en ayuno de sólidos y líquidos a la vaca durante 12 horas. 2. Preparar el material de cirugía y dar instrucciones a los ayudantes. 3. Asegurar la vaca en el brete. Cerciorarse de una fuente de agua cercana. 4. Pasar dos lazos a modo de cinchas delante de los miembros posterior y
detrás de los miembros anteriores. Fijarlos con un nudo de fácil soltura. Esto con la finalidad de evitar que el animal se caiga al suelo.
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5. Aplicar vía intravenosa entre 0.2 - 0.5 mL de Xylacina para hembras Bos indicus, 1 mL para Bos taurus.
6. Preparar y aplicar el antibiótico vía intramuscular. 7. Depilar la fosa paralumbar izquierda (FPI) aplicando yodo jabonoso y
usando la barbera en la dirección del pelo. 8. Lavar y desinfectar el área depilada. 9. Existen dos tipos de protocolos para la anestesia local que se pueden usar
(seleccionar uno, 9a o 9b): 9a. Aplicar anestesia epidural baja: Ubicar el agujero sacro-coccígeo moviendo la cola hacia arriba y abajo. Con una aguja 21Gx1½ con el bisel hacia craneal, entrar hasta alcanzar el espacio subaracnoideo. Depositar 5 mL de lidocaina. Esta anestesia permite una desensibilización y relajación del tracto reproductivo y recto, además de la cola. Aplicar anestesia paravertebral: Ubicar las apófisis transversas de la 13° vértebra torácica, y 1, 2 y 3° lumbares, hacia el lado izquierdo. En la mitad de cada una de las apófisis y hacia el borde craneal, aplicar 2 mL de lidocaína con aguja 16Gx1½. Con el trocar entrar hasta tocar la apófisis y aplicar 10 mL de lidocaina en el borde craneal superior y 10 mL en el borde craneal inferior, en cada una de las vértebras. Esta anestesia permite un bloqueo en los músculos de la FPI. 9b. Aplicar anestesia epidural baja: Igual que en el numeral 9a. Aplicar anestesia local: Con una aguja 16Gx1½ aplicar entre 40 – 50 mL de lidocaína, intramuscular, y en forma de abanico, en la FPI.
10. Lavarse y desinfectarse las manos y los brazos, luego colocarse guantes de palpación y encima guantes de cirugía.
11. Realizar con el bisturí una incisión en la piel de 20 cm aproximadamente en el centro y un poco hacia caudal de la FPI.
12. Hay dos formas de abrir los músculos abdominales (abdominal externo, abdominal interno y transverso abdominal) y el peritoneo (seleccionar uno, 12a o 12b):: 12a. Incidir de manera similar a la piel, y en el mismo plano con el bisturí, hasta exponer la cavidad abdominal. 12b. Introducir una tijera de tejido recta cerrada, hasta la cavidad abdominal, en la mitad de la incisión. Sacar la tijera e irla abriendo, luego introducir los dedos y debridar siguiendo las fibras musculares.
13. Introducir la mano izquierda, ubicar el cérvix y traerlo hacia fuera. Luego deslizar la mano por el cuerno derecho. Ubicar y fijar el ovario derecho dentro de la mano, sacándolo de la bolsa ovárica. Traerlo hasta exponerlo cerca de la incisión.
14. Colocar una pinza Fergunson con la mano derecha en el borde de fijación del ovario. Dejarla durante unos minutos y cortar el ovario con una tijera de tejido.
15. Depositar el ovario en un tubo cónico de 50 mL lleno de PBS. Marcar el tubo con número de la vaca, ovario izquierdo o derecho, fecha. Depositarlo en la nevera con hielo.
16. Repetir los pasos 13, 14 y 15 para el ovario izquierdo.
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17. Realizar una sutura en X teniendo en cuenta el peritoneo y todos los músculos abdominales.
18. Realizar puntos en U a nivel de piel. Reforzarlos con pequeños tozos de venoclisis, pasando por el interior el nylon.
19. Lavar y aplicar insecticida a nivel de la incisión. 20. Aplicar antibiótico como mínimo por tres días, evaluar a diario y retirar los
puntos externos a la semana. 21. Disponer de los ovarios para las técnicas a realizar o congelar hasta que se
vayan a procesar (PROTOCOLOS 5, 6 y 7)
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Anexo 5: Criocorte de tejidos congelados PROTOCOLO 05 Creado por: Carlos Andrés Giraldo Modificado por: Fecha de creación: 10 abr/2005 Última modificación: Frecuencia de revisión:
Última revisión: 10 abr/2005
Aprobación del coordinador:
Aprobación del gerente de calidad:
Propósito: El corte de tejidos bajo condiciones de congelación, permite que moléculas y estructuras a nivel celular conserven su estructura y posición por un tiempo prolongado, sin desnaturalizarse. Equipos y Materiales: Criotomo Pinzas Cuchillas Medio Optimal Cutting Temperature (OCT) (polietilin glicol + polivinil alcohol) Pincel Portaobjetos tratados con poli-lisina Lápiz punta de diamante Gradilla para placas Procedimiento:
1. Se descongelan las muestras en agua a temperatura ambiente. 2. Se corta el área de interés en forma de cuña pequeña. 3. El trozo de tejido se coloca en los criomoldes del criotomo y se incluyen en
medio OCT 4. Se depositan dentro de el criostato hasta que se congelen. 5. Se calibra la cuchilla para cortes de 5 micras de espesor. 6. Se marcan adecuadamente las placas portaobjetos. 7. Se realizan los cortes de forma sucesiva, depositándolos cuidadosamente
en los portaobjetos con ayuda de un pincel. 8. Las placas se empacan en gradillas. 9. Se almacenan a temperatura de congelación.
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Anexo 6: Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) PROTOCOLO 06 Creado por: Zulma Tatiana Ruiz Modificado por: Erika Lorena Montaño Fecha de creación: Última
modificación: 10 abr/2005
Frecuencia de revisión:
Última revisión: 10 abr/2005
Aprobación del coordinador:
Aprobación del gerente de calidad:
Propósito: La técnica de inmunofluorescencia indirecta permite la visualización de proteínas o receptores proteicos específicos a través de la reacción antígeno-anticuerpo y la amplificación de la fluorescencia mediada por un segundo anticuerpo marcado. Equipos y Materiales: Acetona o Metanol. Timer. Solución Bufferada Fosfatada (PBS 1X) Solución de Tween 20®: Tween 0.05%/PBS 1X Solución de Triton X-100®: Triton 0.2%/PBS 1X Solución de Albúmina Sérica Bovina (BSA): BSA 5%/PBS 1X Colorante de ADN: DAPI (Concentración deseada) Solución Anticuerpo Específico: Anticuerpo específico/Solución BSA (Concentración deseada) Solución Segundo Anticuerpo Marcado: Lápiz de cera o Lápiz corrector (Ej: Liquid Paper®) Cámara Oscura Permanentemente Húmeda: Puede construirse de forma sencilla, utilizando un recipiente rectangular, plano y de un alto de ± 4 cm., el cual se forra evitando la entrada de la luz. En el fondo se fijan varios palitos de madera a una distancia que permita sostener las placas y en el medio se colocan toallas de papel que se humedecen constantemente con agua. Micro pipetas (100 µL especialmente) y puntas desechables. Cámara de vidrio para sumergir portaobjetos. Solución Vectashield®: Vectashield disuelto en PBS y glicerina. Laminillas cubreobjetos. Toallas de papel. Esmalte para uñas transparente Refrigerador a 4°C. Congelador a -20°C. Procedimiento:
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1. Fijar las placas: Si son células de cultivo in vitro, utilizar metanol por 20 minutos mínimo. Si son cortes de tejido, utilizar acetona durante 10 minutos mínimo. Congelar hasta continuar el proceso.
2. Delimitar la superficie de trabajo: Utilizar lápiz de cera o corrector líquido. Esto permite la utilización precisa de sustancias costosas en sitios de interés específico, ya que al depositarlas, se forma un menisco en el sitio señalado.
3. Lavar con PBS 1X: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 4 veces. 4. Lavar con la solución de Tritón®: Sumergir las placas durante 5 minutos si
son cortes de tejido. Durante 10 minutos si son células de cultivo. El Triton es un detergente no aniónico que produce un aumento en la permeabilidad de las membranas celulares.
5. Lavar con la solución de Tween®: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 4 veces. El Tween es un detergente no aniónico que permite un lavado de proteínas periféricas de forma suave, sin eliminar las proteínas integrales de membrana.
6. Adicionar con la solución de BSA: Colocar dentro de la superficie de trabajo señalada durante 15 minutos como mínimo. En células de cultivo el volumen a utilizar es de máximo 150 microlitros para laminillas cuadradas, 50 microlitros para laminillas redondas. La BSA permite bloquear el tejido o las células al ocupar espacios por ser de gran tamaño, aumentando la especificidad del anticuerpo lanzado con su ligando. Además, provoca un incremento en la constante dieléctrica del medio (una medida de su habilidad para disipar cargas), e influye en el grado de hidratación de la membrana, lo cual puede alterar la orientación esteárica del determinante antigénico o puede disminuir la entropía disponible para dirigir la reacción.
7. Adición del primer anticuerpo específico: Disuelto en la solución de BSA a la concentración deseada. Se deposita en el área marcada. Se deja toda la noche a 4°C, o a 2 horas a temperatura ambiente. Este primer anticuerpo va dirigido contra la proteína de interés y generalmente es de tipo monoclonal.
8. Lavar con la solución de Tween®: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 4 veces.
9. Preparar una cámara oscura y con humedad permanente aplicándole agua a las toallas de papel.
10. Adicionar el segundo anticuerpo marcado (antiPrimerAcpo): Disuelto en la solución de BSA a la concentración deseada. Se deposita en el área marcada. Se deja durante 1 hora a temperatura ambiente. Este segundo anticuerpo va dirigido contra el primer anticuerpo, generalmente es una Inmunoglobulina G. Van marcados con diversos fluorocromos, entre los que se encuentran CY3 y. Es importante conocer cual es la longitud de onda de la emisión de fluorescencia de cada fluorocromo, para utilizar un filtro apropiado en microscopía de epifluorescencia.
11. Lavar con la solución de Tween®: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 2 veces.
12. Adicionar un colorante de ADN: Disuelto en PBS 1X a la concentración deseada. Se deposita en el área marcada. Se deja durante 5 minutos a
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temperatura ambiente. El DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) es un ejemplo de fluorocromo que puede pasar membranas de células vivas y fijas para unirse estrechamente con el ADN, además, en microscopía de fluorescencia es excitado con luz ultravioleta con una absorción máxima de 358 nm y una emisión máxima de 461 nm. (azul/cyan). El DAPI puede unirse también al ARN pero no fluorece mucho (emisión alrededor de 400 nm) DAPI y es altamente carcinogénico.
13. Lavar con PBS 1X: Sumergir las placas durante 5 minutos. 14. Adicionar Vectashield®: Se coloca una gota cubriendo todo el tejido o las
células y se coloca el cubreobjetos encima. Esta sustancia permite una mejor visualización de la inmunofluorescencia al disminuir la difracción de la luz.
15. Fijar el cubreobjetos: Se le agrega esmalte transparente para uñas en los bordes y se espera a que se seque.
16. Almacenar: Se guardan a 4°C hasta la primera visualización. Luego se guardan a -20°C. Guardan en un recipiente que no permita la entrada de luz para aumenta la duración de la fluorescencia.
17. Microscopía de epifluorescencia.
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Anexo 7: Inmunohistoquímica Indirecta PROTOCOLO 07 Creado por: Carlos Andrés Giraldo Modificado por: Fecha de creación: 28 marzo 2006 Última modificación: Frecuencia de revisión: Última revisión: Aprobación del coordinador:
Aprobación del gerente de calidad:
Propósito: Encontrar la ubicación y la cantidad aproximada de receptores de las hormonas luteinizante y leptina a nivel de las membranas celulares en cortes de ovarios bovinos en diferentes etapas del ciclo estral. Equipos y Materiales: Acetona Timer. Solución Bufferada Fosfatada (PBS 1X) Solución de Tween 20®: Tween 0.05%/PBS 1X Solución de Triton X-100®: Triton 0.2%/PBS 1X Solución de Albúmina Sérica Bovina (BSA): BSA 5%/PBS 1X Solución Anticuerpo Específico: Anticuerpo específico/Solución BSA (Concentración deseada) Solución Segundo Anticuerpo Marcado: Lápiz de cera o Lápiz corrector (Ej: Liquid Paper®) Cámara Oscura Permanentemente Húmeda Micro pipetas (100 µL especialmente) y puntas desechables. Cámara de vidrio para sumergir portaobjetos. Solución Vectashield®: Vectashield disuelto en PBS y glicerina. Laminillas cubreobjetos. Toallas de papel. Esmalte para uñas transparente Refrigerador a 4°C. Congelador a -20°C. Muestras: Ovarios obtenidos em distintas etapas del anestro bovino. Fueron congelados em PBS, luego sumergidos em OCT y realizados cortes de 5u em láminas tratadas com polilisina. Se han mantenido en -20°C desde el momento del corte. Anticuerpos: Primarios:
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- Anti-Receptor de Leptina: recombinante de ratón, quimera del receptor de leptina/Fc, expresado en células NSO (SIGMA). - Anti-Receptor de hormona Luteinizante: Anticuerpo policlonal de cabra desarrollado contra una región interna del receptor de LH humano (Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA, LHR (K-15): sc-26341) Secundarios: - Anti-IgG de ratón (H+L) conjugado com preoxidasa. Anticuerpo desarrollado em conejo.(Invitrogen). - Anti-IgG de cabra (H+L) conjugado com preoxidasa. Anticuerpo desarrollado em conejo.(Invitrogen) Procedimiento:
1. Fijar las placas utilizando acetona fría durante 10 minutos. Congelar hasta continuar el proceso.
2. Bloquear actividad endógena de peroxidasa com 3% de Peróxido de hidrogeno por 10 minutos.
3. Lavar con PBS 1X: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 4 veces. 4. Lavar con la solución de Tritón®: Sumergir las placas durante 5 minutos si
son cortes de tejido. El Triton es un detergente no aniónico que produce un aumento en la permeabilidad de las membranas celulares.
5. Lavar con la solución de Tween®: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 4 veces. El Tween es un detergente no aniónico que permite un lavado de proteínas periféricas de forma suave, sin eliminar las proteínas integrales de membrana.
6. Lavar con agua destilada por 5 minutos. 7. Colocar las muestras en 0.01M de buffer citrato (pH 6.0) y calentar en el
microondas en dos ciclos (15 minutos a 750W, 15 minutos a 375W). 8. Bloquear con la solución de BSA: Colocar dentro de la superficie de trabajo
señalada durante 15 minutos como mínimo. La BSA permite bloquear el tejido o las células al ocupar espacios por ser de gran tamaño, aumentando la especificidad del anticuerpo lanzado con su ligando. Además, provoca un incremento en la constante dieléctrica del medio (una medida de su habilidad para disipar cargas), e influye en el grado de hidratación de la membrana, lo cual puede alterar la orientación esteárica del determinante antigénico o puede disminuir la entropía disponible para dirigir la reacción. Otra alternativa: bloqueo del background con suero de cabra 1:20 (Dakor) en 0.05M Tris HCl buffer + 0.5M NaCl, pH:7.6 (TBS)
9. Adición del primer anticuerpo específico: Disuelto en la solución de BSA a la concentración deseada. Se deposita en el área marcada. Se deja toda la noche a 4°C, o a 2 horas a temperatura ambiente. Este primer anticuerpo va dirigido contra la proteína de interés y generalmente es de tipo monoclonal.
10. Lavar con la solución de Tween®: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 4 veces.
11. Preparar una cámara oscura y con humedad permanente aplicándole agua a las toallas de papel.
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12. Adicionar el segundo anticuerpo marcado (antiPrimerAcpo): Disuelto en la solución de BSA a la concentración deseada. Se deposita en el área marcada. Se deja durante 1 hora a temperatura ambiente. Este segundo anticuerpo va dirigido contra el primer anticuerpo, generalmente es una Inmunoglobulina G.
13. Lavar con la solución de Tween®: Sumergir las placas durante 5 minutos, repetir 2 veces.
14. Lavar con PBS 1X: Sumergir las placas durante 5 minutos. O hacerlo con TBS por 5 minutos + 0.1M buffer ácido acético/acetato de sodio (pH:6.0) por 5 minutos.
15. Revelado de la actividad peroxidasa: 0.03% de 3,3’-diaminobencidina en 0.1M de buffer ácido acético/acetato de sodio (pH:6.0), conteniendo 2.5% de sulfato de níquel amoniaco, 0.2% de b-D-glucosa, 0.04% de cloruro de amonio y 0.01% de glucosa ácida.
16. Detener la reacción con un lavado de TBS a (monitorear la reacción deseada al microscopio)
17. Adicionar Vectashield®: Se coloca una gota cubriendo todo el tejido o las células y se coloca el cubreobjetos encima. Esta sustancia permite una mejor visualización de la inmunofluorescencia al disminuir la difracción de la luz.
18. Fijar el cubreobjetos: Se le agrega esmalte transparente para uñas en los bordes y se espera a que se seque.
19. Almacenar: Se guardan a 4°C hasta la primera visualización. Luego se guardan a -20°C.