efecto de tratamientos tÉrmicos en combinaciÓn con …

vii

EFECTO DE TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN COMBINACIÓN CON LOS

ACEITES ESENCIALES DE CLAVO Y TOMILLO SOBRE LA

SUPERVIVENCIA DE Listeria monocytogenes EVALUADA IN VITRO Y EN

UNA SOPA COMERCIAL.

JUAN PABLO HUERTAS BAQUERO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Cartagena, España.

2008

viii




UNA SOPA COMERCIAL


TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL




Cartagena, España.

2008

ix

NOTA DE ADVERTENCIA

―La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la

verdad y la justicia‖.

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

xi




UNA SOPA COMERCIAL


APROBADO

__________________ _______________________ Dra. Ingrid Schuler Phd Dra. Janeth Arias Palacios M.Sc,

Bióloga Bacterióloga

Decana Académica Directora de carrera




Cartagena, España.

2008

xii

Después de 5 años de dura lucha por fin alcanzo la cima de esta metar. Es uno de los

momentos cumbre anhelado por muchos y hoy soy yo el que vive ese momento, pero esto

no hubiera sido posible sin la presencia de muchas personas (algunas aun hoy presentes,

otras se perdieron y otras fueron llamadas ante el gran jefe), no sé si estaría mal decir que

-―Soy una obra viviente, a la cual muchos contribuyen a darle forma y color, a partir de

pinceladas de sentimientos bellos y cinceladas de palabras de justicia y verdad”- pero es

la única forma de definir lo que quiero expresar. Debido a lo anterior dedico este trabajo

a:

Dios el arquitecto de todo, sin el nada de esto podría ser.

Mi mamita donde quiera estés, ya hemos logrado la segunda gran meta, te extraño y sé

que no estás muy lejos de mi porque estas en mí y a mi lado, protegiéndome y

apoyándome.

Mi padre, gordo gracias por tu amor y tu apoyo, en el momento más crítico de nuestras

vidas asumiste el rol de papa y mamá y como todo lo que haces no te quedo grande, se

cuantos sacrificios has hecho por nosotros se cuantas preocupaciones pasaste y solo por

sacarnos adelante, como te dije delante de más de 50 personas mis metas, sueños, anhelos

y logros son también tuyos este es mi regalo al mejor padre del mundo.

Mi hermano, mijo se que aunque no andamos muy juntos, el sentimiento de amor es muy

grande y siempre estamos como una sombra detrás del otro para protegernos y cuidarnos,

sin usted, aunque no lo crea, esto no se hubiera hecho real, gracias.

Mi abuelita, mi tío y la familia Huertas la mejor familia del mundo, su apoyo

incondicional para con nosotros tres es una bendición, ustedes son más que tíos y primos

padres madres y hermanos, Gustavito y Raulito 5 años y medio después el trato ha sido

cumplido y ese trato más que con ustedes fue conmigo.

Edna, una gran mujer, sin tu presencia en mi camino creo que nada de esto sería lo que es,

pero más que todo te agradezco que AMES A MI PADRE Y LO HAGAS FELIZ creo

que eso es lo que más ánimo me da pues la felicidad de él es la mía y todo es gracias a ti.

Debo agradecer tu apoyo, tus consejos y el ánimo que me das en cada paso para seguir

adelante creo que sin eso no hubiera podido poner esta bandera. Gracias por considerarme

un hijo más estando siempre pendiente de mí, haciéndolo de corazón y no de obligación.

También agradezco a tu familia unas personas que me quieren y los quiero unos amigos y

compañeros geniales una familia que nos adopto en su seno a mi padre y a mí.

Dorita, sin ti este gran sueño hubiera sido un poco imposible, tu eres un ángel que

apareció en mi camino en el momento adecuado sin tu presencia tal vez nada de esto sería

real.

Familia Forero Vargas, mi segunda familia, una familia que ha estado para mí y conmigo

en todo momento, una familia que me tomo como un hijo más creo que solo puedo decir

que los amo mucho.

Mis amigos los cuales no necesito plasmar sus nombres, pues ellos saben quiénes son,

algunos desde el colegio y otros desde la universidad gente que plasmaron su huella, y de

los cuales tuve y tengo el privilegio y el honor de decir son mis amigos y aun mas porque

desde la distancia me lo muestran.

Marta poco tiempo pero tu ayuda y tu apoyo en un mundo desconocido para mí fue y es

muy importante.

Ilusa esto es también gracias a ti, se que la vida pareciera injusta, pero todo posee un

motivo.

xiii

Agradecimientos

Al Dr. Pablo Fernández, por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio,

con su grupo de investigación e iniciar una nueva etapa en mi vida. Por confiar en

mí y por toda la ayuda brindada tanto profesional como personal.

A la Dra. Janeth, por decirme donde buscar el pony y darme la oportunidad de

venir a buscarlo. Una persona que desde que la conocí no fue una profesora fue

una amiga, por siempre tener una palabra para iluminar cualquier camino.

A Leymaya, tanto que agradecerle, su apoyo cognoscitivo en el proyecto fue

importante pero su amistad fue esencial, por estar conmigo en todo momento y en

toda situación, por brindarme la mano cuando el mundo quería venirse encima,

por siempre estar ahí para escucharme y darme animo Pieza fundamental en este

proyecto y en mi nueva vida.

Al Dr. Alfredo Palop, por tener su despacho abierto a las miles de dudas que

surgieron durante el proyecto, su ayuda fue de gran valor para comprender

muchas cosas.

A May, Vera, Mª Dolores, Marina y Raquel, sin lugar a dudas el mejor grupo de

laboratorio que existe, ¿que hubiera sido de mi sin su amistad, sin el cotilleo?,

creo que hubiera sido imposible soportar tanto trabajo. Por siempre tener algún

tema para amenizar el día, y bueno por tender la mano ante los miles de

problemas y dudas que surgieron.

A Fermín, (dios mío para el un agradecimiento aparte) por soportar y arreglar

cada cosa que sin querer se dañaba o se averiaba (insisto Fermín yo no fui), por

enseñarme que en la vida toca ser y saber de todo un poco (microbiólogo,

ingeniero, electricista, etc.) e igual que los demás gracias por su amistad.

A todos aquellos que en algún momento trabajaron conmigo en el laboratorio, por

su compañía y amistad, personas que dejaron huella en mi: João, Clementina,

Lola, José, Navarrete, Cifre, Lola y Loli, Sergio, Salva, Caro, Justine, y muchos

más que tal vez se me pasaran pero nunca se les olvidará.

Juan D parce fundamental tu amistad, bacano tener un parcerazo como tú, bacan

gracias.

Alicia & Grillo, 2 grandes amigos, espero su amistad perdure en el tiempo pues

personas con sus cualidades no existen muchas. Gracias por estar en todo

momento un abrazo tios.

A mis amigos de GPR, por brindarme su amistad, un chiste en el pasillo y estar

pendientes de cómo iba todo.

Al personal docente de la PUJ, Martha, María M, Ana K, y todos aquellos que

ayudaron en mi formación.

A la UPCT por brindarme las instalaciones, equipos y medios para la realización

de este proyecto.

xiv

RESUMEN

Los consumidores de hoy en día están exigiendo alimentos mínimamente

procesados sin aditivos químicos y que no sean expuestos a tratamientos agresivos

como las altas temperaturas, los cuales pueden modificar sus características

nutricionales y organolépticas. El objetivo de esta investigación fue evaluar el

efecto de los aceites A.E. provenientes de las plantas de clavo y tomillo en

combinación con tratamientos térmicos, para el control de uno de los principales

patógenos de interés en la industria alimentaria como lo es L.monocytogenes. Para

poder determinar el efecto de este tratamiento se aplicaron tratamientos

isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC solos y en combinación con los A.E. a

dos concentraciones sobre la cepa L.monocytogenes CETC 4032. Después de cada

tratamiento se recuperó el microorganismo en un medio no selectivo y en uno

selectivo, obteniéndose que al exponer el microorganismo luego de los

tratamientos en un medio de recuperación con un factor de inhibición, se observa

una mayor reducción en la población. A nivel de los aceites esenciales se obtuvo

que el aceite de tomillo inhibió por completo la población inicial del

microorganismo a una concentración de 0.01% desde el tiempo 0 del tratamiento.

Para el aceite esencial de clavo se obtuvo una reducción in vitro de 4-log de 3,29

min en un medio de recuperación no selectivo y de 2,5 en un medio selectivo a

una concentración de 0,01%. Al aplicar el tratamiento anterior con una

concentración de 0,05% del A.E. en una crema de calabacín se obtuvo una

reducción decimal de 3-log en 1 min. Los resultados obtenidos en la investigación

nos permiten concluir que los A.E. evaluados presentan gran eficacia en la

disminución de la población de L.monocytogenes CETC 4032 siendo más efectivo

el aceite esencial de tomillo que el de clavo.

xv

Tabla de Contenido

1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 22

2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 24

2.1 Generalidades .............................................................................................. 24

2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) ................................ 24

2.2 Listeria monocytogenes .............................................................................. 25

2.2.1 Historia ................................................................................................. 25

2.2.2 Morfología ........................................................................................... 25

2.2.3 Factores de crecimiento........................................................................ 26

2.2.4 Clasificación ............................................................................................... 26

2.2.5 Reservorio ............................................................................................ 28

2.2.6 Alimentos ................................................................................................. 28

2.2.6.1 Leche y productos lácteos ................................................................. 30

2.2.6.2 Carne y productos carnicos ............................................................... 31

2.2.6.3 Otros Alimentos ................................................................................ 32

2.2.7 Métodos de detección ............................................................................... 33

2.2.7.1 Métodos de aislamiento .................................................................... 35

2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas .................................................... 36

2.2.8 Virulencia ................................................................................................. 37

2.2.8.1 Entrada a las células del hospedero ................................................... 39

2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular. ................................. 39

2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático ................................................. 40

2.2.8.4 Diseminación célula-célula ............................................................... 40

2.2.9 Listeriosis ................................................................................................. 41

2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis) ............................................................. 41

2.2.9.2 Invasivo ............................................................................................. 42

2.2.9.3 Tratamiento ....................................................................................... 42

2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos ……43

2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor) ............................ 43

2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z ........................................................... 43

2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D) .......................................... 44

2.3.2.2 Valor Z .............................................................................................. 45

2.3.3 Termorresistómetro .................................................................................. 46

2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los microorganismos

....................................................................................................................... 47

xvi

2.4 Antimicrobianos naturales ............................................................................... 49

2.4.1 Aceites esenciales..................................................................................... 50

2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales ............................... 50

2.4.1.2 Eugenol (clavo) ..................................................................................... 52

2.4.1.3 Carvacrol y Timol (Tomillo) ............................................................. 54

2.5 Modelo y distribución Weibull ........................................................................ 58

2.6 Factor de exactitud (Af) .................................................................................. 62

3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 64

4. OBJETIVOS ................................................................................................... 66

5. HIPOTESIS .................................................................................................... 67

5.1 Predicciones ................................................................................................ 67

6. MATERIALES Y METODOS .......................................................................... 68

6.1 Materiales .................................................................................................... 68

6.1.1 Microorganismo ................................................................................... 68

6.1.2 Medios de cultivo ................................................................................. 68

6.1.3 Aceites esenciales................................................................................. 69

6.1.4 Equipos ................................................................................................. 69

6.1.5 Materiales ............................................................................................. 69

6.2 Metodología ................................................................................................ 70

6.2.1 Activación del microorganismo ........................................................... 70

6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro .................... 70

6.2.2 Recuento inicial .................................................................................... 70

6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC .................... 71

6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC ............... 72

6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites

esenciales de tomillo y clavo......................................................................... 75

6.2.6 Tratamientos sobre el alimento ............................................................ 77

6.3 Análisis Estadístico de los datos ................................................................. 78

7 Resultados y Discusión ...................................................................................... 78

7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC ..................................................... 79

7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC ........................................ 84

7.1.2.1 Predicciones ...................................................................................... 89

7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales. ....... 99

7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite

esencial de tomillo....................................................................................... 100

xvii

7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite

esencial de clavo ......................................................................................... 101

7.3 Tratamientos sobre el alimento ................................................................. 107

7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC. .............................................. 108

8. Conclusiones ................................................................................................. 118

9. Recomendaciones .......................................................................................... 119

10. Bibliografia ................................................................................................. 120

xviii

INDICE DE TABLAS

TABLA 1. TIEMPO DE MUESTREO EN LOS TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS POR

TEMPERATURA ................................................................................................................. 71

TABLA 2. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A

55ºC (EN BASE 10) ............................................................................................................ 72

TABLA 3. DILUCIONES A REALIZAR Y SEMBRAR PARA EL TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A

60ºC (EN BASE 10) ............................................................................................................ 72

TABLA 4. PERFIL DE TEMPERATURAS PARA LOS TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. RANGO

DE TEMPERATURAS Y VELOCIDADES POR PERFIL. ............................................................. 73

TABLA 5. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A

SEMBRAR (EN BASE 10). ................................................................................................... 74

TABLA 6.TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC, TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A

SEMBRAR (EN BASE 10). ................................................................................................... 74

TABLA 7 TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.01%, TIEMPO DE

MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ............................... 75

TABLA 8. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. CLAVO AL 0.05%, TIEMPO DE

MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ................... 75

TABLA 9. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO

DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. .......................... 76

TABLA 10. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC CON A.E. TOMILLO AL 0.01%, TIEMPO

DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. .............. 76


MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA. ............................... 76


MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10) EN MEDIO BHIA+NACL. ................... 77

TABLA 13. TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC CON A.E. TOMILLO 0.01% Y 0.05%,

TIEMPO DE MUESTRO Y DILUCIONES A SEMBRAR (EN BASE 10). ........................................ 77

TABLA 14. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE

CORRELACIÓN (RO) Y R2 PARA LISTERIA MONOCYTOGENES CETC 4032 EN UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC. ................................................................................. 80



TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC. ................................................................................. 82

TABLA 16. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS. ................................ 83

TABLA 17. . VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, INDICE DE


TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC. ............................................................................ 86



TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC. ............................................................................ 89

TABLA 19. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS. ........................... 89

TABLA 20. INTEGRACIÓN DE LA LETALIDAD ALCANZADA EN UN CALENTAMIENTO NO

ISOTÉRMICO HASTA 55ºC CON UN PERFIL ISOTÉRMICO A LA MISMA TEMPERATURA Y

PREDICCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SUPERVIVIENTES EN FUNCIÓN AL CÁLCULO

DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN EL MEDIO BHIA. ................................................. 91



xix


DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. .......................................... 92




DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA. ...................................................... 93




DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO BHIA+NACL. .......................................... 94

TABLA 24. PARÁMETROS DE LA DISTRIBUCIÓN WEIBULL ESTIMADOS A PARTIR DE LAS

CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE

ESENCIAL DE CLAVO. ...................................................................................................... 102


CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A UN

TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC Y UNA CONCENTRACIÓN DE 0,01% DE ACEITE

ESENCIAL DE CLAVO ....................................................................................................... 104

TABLA 26. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE


TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. .......................... 108

TABLA 27. VALORES DE INTERVALOS DE CONFIANZA (IC 95%), D, ÍNDICE DE


TRATAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC SOBRE CREMA DE CALABACÍN. .......................... 109

TABLA 28. VALORES Z OBTENIDOS PARA TRATAMIENTOS ISOTÉRMICOS EN CREMA DE

CALABACÍN. ................................................................................................................... 109


CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE

CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON UNA

CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO. ......................................... 114


CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE

CALABACÍN EXPUESTA A UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 60ºC CON UNA

CONCENTRACIÓN DE 0,05% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO ......................................... 115

xx

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1. HABITAT DE L.MONOCYTOGENES Y VIAS DE CONTAMINACIÓN ................................ 28

FIGURA 2. RESUMEN MODIFICADO DE TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS GENERALES DE

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN PARA LISTERIA SPP. Y LISTERIA

MONOCYTOGENES EN MUESTRAS AMBIENTALES Y DE ALIMENTOS. .................................... 34

FIGURA 3. SISTEMA METODOLÓGICO PARA LA IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA DE LISTERIA

SPP. MODIFICADO ............................................................................................................ 37

FIGURA 4. REPRESENTACIÓN ESQUÉMATICA DE LA BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN

INTRACELULAR POR L.MONOCYTOGENES .......................................................................... 38

FIGURA 5. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA FISIOPATOLOGÍA DE LA INFECCIÓN POR

LISTERIA SPP. .................................................................................................................... 41

FIGURA 6. GRÁFICA DE SUPERVIVENCIA .................................................................................. 44

FIGURA 7. GRAFICA DE VALOR D. ............................................................................................ 45

FIGURA 8. GRAFICA DE TERMO RESISTENCIA Y VALOR Z. ........................................................ 46

FIGURA 9. LOCALIZACIÓN Y MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS COMPONENTES DE A.E

SOBRE LA CÉLULA BACTERIANA. ...................................................................................... 51

FIGURA 10. EUGENOL .............................................................................................................. 53

FIGURA 11. ESQUEMA SUGERIDO DE ACCIÓN SUGERIDO PARA EL CARVACROL SOBRE LA

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA .......................................................................................... 55

FIGURA 12. TIMOL ................................................................................................................... 56

FIGURA 13. CARVACROL .......................................................................................................... 56

FIGURA 14. EJEMPLO MODIFICADO DE CONCAVIDADES. .......................................................... 61

FIGURA 15. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES

ISOTÉRMICAS (55ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL ...................... 79


ISOTÉRMICAS (60ºC) EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ..................... 81

FIGURA 17. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO

ISOTÉRMICAS (N.I) A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ............ 85

FIGURA 18. COMPORTAMIENTO DE LA POBLACIÓN DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032

DURANTE EL PERFIL N.I A 55ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL...... 85

FIGURA 19. SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CONDICIONES NO

ISOTÉRMICAS (N.I) A 60ºC EN MEDIO DE RECUPERACIÓN BHIA Y BHIA+NACL. ............ 88

FIGURA 20. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN

CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA. ............................................. 92

FIGURA 21. CURVA DE SUPERVIVENCIA L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE UN

CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 55ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ................................. 93

FIGURA 22. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE

UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA. ....................................... 94

FIGURA 23. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 DESPUÉS DE

UN CALENTAMIENTO NO ISOTÉRMICO A 60ºC EN MEDIO BHIA+NACL. ........................... 95

FIGURA 24. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO

BHIA, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL MODELO

DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE

TEMPERATURA DE 3ºC/MIN. .............................................................................................. 97

FIGURA 25. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN MEDIO

BHIA+NACL, A PARTIR DE LOS RESULTADOS DE ESTA INVESTIGACIÓN A CON EL

xxi

MODELO DE BIGELOW PARA TRATAMIENTOS NO ISOTÉRMICOS Y UN AUMENTO DE

TEMPERATURA DE 3ºC/MIN. .............................................................................................. 98

FIGURA 26. CURVA DE SUPERVIVENCIA DE L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EXPUESTA A

UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO A 55ºC CON 0,01% DE ACEITE ESENCIAL DE CLAVO

EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN

DE WEIBULL. .................................................................................................................. 102



EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA

DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL............................................................................................ 103



EN MEDIO BHIA A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN

DE WEIBULL ................................................................................................................... 104



EN MEDIO BHIA+NACL A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA

DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL............................................................................................ 105


ISOTÉRMICAS (55ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO

SELECTIVO Y NO SELECTIVO. .......................................................................................... 108


ISOTÉRMICAS (60ºC) EN CREMA DE CALABACÍN Y CRECIMIENTO EN MEDIO

SELECTIVO Y NO SELECTIVO. .......................................................................................... 109

FIGURA 32. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE

L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 55ºC. .............. 111

FIGURA 33. COMPARACIÓN ENTRE LAS CURVAS DE SUPERVIVENCIA DE

L.MONOCYTOGENES CETC 4032 EN CREMA DE CALABACÍN E IN VITRO A 60ºC. .............. 111


UN TRATAMIENTO ISOTÉRMICO EN CREMA DE CALABACÍN A 55ºC CON 0,05% DE

ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR

DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .......................... 113



ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE

LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ............................... 113



ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN NO SELECTIVO A PARTIR

DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. .......................... 114



ACEITE ESENCIAL DE CLAVO EN MEDIO DE RECUPERACIÓN SELECTIVO A PARTIR DE

LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. ............................... 115

22

1. INTRODUCCIÓN

Con el descubrimiento de los microorganismos gracias a la invención del

microscopio por parte de Anthony Van Leeuwenhoek (1632-1723), la visión del

mundo tal y como se conocía en ese tiempo cambió drásticamente, las teorías que

formularon investigadores como el filósofo romano Lucrecio (circa 98-55 a.C.) y

el médico Girolamo Fracastoro (1478-1553) sobre la presencia de ―criaturas vivas

invisibles‖ causantes de enfermedades fueron confirmadas.

Desde aquellos tiempos hasta la actualidad el ser humano se ha visto favorecido y

afectado por los microorganismos. Beneficiado porque aprovecha las cualidades

(metabólicas, genéticas, etc.) de algunos de estos para la elaboración de alimentos

(pan, queso, cerveza, etc.), elaboración de medicamentos (antibióticos, vitaminas,

vacunas, etc.) y en la actualidad como agentes recuperadores de ambientes y

ecosistemas contaminados por la actividad industrial del hombre en una rama de

la microbiología llamada biorremediación. Pero como se dijo anteriormente,

también se ha visto afectado a nivel salubre debido a las enfermedades que estos

provocan y que han generado grandes acontecimientos históricos como la peste

negra en 1347. Con el descubrimiento del microscopio y la creación de la

microbiología, el ser humano se ha preocupado por mejorar los niveles de la salud

desde diferentes puntos, algunos de ellos como la industria farmacéutica, la

industria alimentaria y la medicina entre otros.

Una de las ramas de la microbiología encaminada a asegurar la salud del hombre

y de los animales es la microbiología de alimentos, esta rama es la encargada de

verificar que los alimentos producidos por el sector agroalimentario, sean seguros,

confiables e inocuos para la salud previniendo la generación de brotes

epidemiológicos de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), como por

ejemplo: el cólera, la listeriosis, la salmonelosis, entre otras.

Para esto la industria utiliza conservantes químicos como nitritos, benzoato sódico

y meta bisulfito sódico los cuales han demostrado gran eficacia en el control

23

microbiológico de los alimentos. Sin embargo, estudios recientes han demostrado

que estos compuestos ó sustancias derivadas de estos son peligrosos para la salud,

como por ejemplo las nitrosaminas, compuesto cancerígeno proveniente de la

transformación de los nitritos.

Por otro lado, en la última década, los consumidores reclaman alimentos naturales

mínimamente procesados, es decir, que mantengan sus características

organolépticas y nutricionales intactas, pero que a su vez sean inocuos con un

mayor tiempo de frescura sin la adición de compuestos químicos ó aplicación de

técnicas agresivas, como la exposición a altas temperaturas.

En este sentido, los investigadores han explorado varias alternativas, como la

combinación de tratamientos, por ejemplo: temperaturas moderadas con pH, aw,

entre otros; y lo más reciente es el uso de componentes antimicrobianos naturales

los cuales han sido usados durante décadas para la conservación y sazonamiento.

24

2. MARCO TEÓRICO

2.1 Generalidades

2.1.2 Enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs)

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) son uno de los mayores

problemas de la salud mundial, pueden causar una enfermedad pasajera o pueden

ser tan graves que pueden llegar a causar la muerte. Estas enfermedades resultan

por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con agentes químicos

(plaguicidas, fertilizantes, etc.) o por agentes biológicos (microorganismos,

parásitos, y/o algunas substancias toxicas que estos producen).

Las ETAs pueden ser de 3 tipos:

Infecciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de alimentos

contaminados por microorganismos perjudiciales (patógenos) vivos (virus,

bacterias, parásitos) Ej.: Salmonella spp, Listeria monocytogenes, el virus de la

Hepatitis A (Anónimo 1, 2007).

Intoxicaciones: Son aquellas enfermedades causadas por la ingestión de toxinas

formadas en tejidos de plantas o animales, o de productos metabólicos de

microorganismos en los alimentos, o por sustancias químicas que se incorporan a

ellos de modo accidental, incidental o intencional desde su producción hasta su

consumo. Ocurren cuando estas toxinas o venenos de bacterias o mohos todavía

están presentes en los alimentos ingeridos, las toxinas no son detectadas por el

consumidor, pues no tienen olor ni sabor y algunas pueden soportar los

tratamientos térmicos realizados a los alimentos como por ejemplo la cocción, a

estas toxinas se les denomina toxinas termorresisentes. Entre los microorganismos

que producen toxinas se encuentran: Clostridium botulinum (toxina botulínica),

Escherichia coli (toxina shiga), toxinas del pez globo (Michanie, 2007; Anónimo

1, 2007).

Toxi-infecciones: Son enfermedades causadas por la ingestión de una cierta

concentración de microorganismos vivos capaces de causar una enfermedad y

25

poseen la capacidad de producir, sintetizar o liberar toxinas unas vez ingeridas. Ej.

Vibrio cholerae (cólera) (Anónimo 1, 2007).

2.2 Listeria monocytogenes

2.2.1 Historia

La primera descripción de Listeria monocytogenes fue en 1926 debida a un brote

epidemiológico en unos cerdos de guinea y conejos, y no fue reconocida como un

serio problema de salud, hasta que causó un gran brote invasivo con una alta tasa

de mortalidad en las provincias marítimas de Canadá. Este fue el primer brote que

demostró que este microorganismo es un patógeno alimentario y se ha demostrado

que muchos de los casos de listeriosis son producidos por la ingestión de

alimentos contaminados. Después de este brote, se dio un gran interés en

investigar y conocer la epidemiología de este organismo, para proteger a los

consumidores de la manera más efectiva contra el mismo, (Swatiman et al., 2007).

2.2.2 Morfología

El género Listeria está constituido por bacilos Gram positivos cortos y regulares,

de 0.4 a 0.5 m de ancho por 0.5 a 2.0 m de largo que pueden disponerse

individualmente o en cadenas cortas, presentando a menudo formas en ―V‖ en

cultivos viejos. Pueden aparecer en filamentos cortos y la capacidad de coloración

puede perderse (Blanco, 1994), no esporulados, aerobios y anaerobios

facultativos, son catalasa positivos, productores de acido L(+) láctico en el

metabolismo fermentativo de la glucosa, oxidasa negativos, esculina positivos

(Blanco, 1994), L monocytogenes, L.seeligeri y L.ivanovii son hemolíticos en

agar sangre con 5% vol/vol de sangre de caballo o cordero. L.monocytogenes y

L.seeligeri presentan un pequeño halo de hemólisis alrededor de las colonias que,

en numerosas ocasiones, es difícil de observar de tal forma que se hace necesario

retirar la colonia para poder detectarlo, L.ivanovii presenta un amplio doble halo

de β-hemólisis. Para diferenciar más claramente entre estas especies, se utiliza un

test de potenciación de su actividad hemolítica con Staphylococcus aureus

productor de β-hemolisina (esfingomielinasa C) y Rhodococcus equi, denominado

26

test de CAMP (Michanie, 2007). Mientras L. ivanovii presenta un característico

efecto de potenciación en forma de ―pala‖ con R. equi, en L. monocytogenes y L.

seeligeri se observa un efecto en forma de cerilla. Con S. aureus tan sólo L.

monocytogenes y L. seeligeri muestran una potenciación de su actividad

hemolítica (Blanco, 1994).

Son móviles por flagelos perítricos que se expresan mejor a 20-25ºC que a

temperaturas más elevadas, son bastantes resistentes a agresiones fisico-químicas

lo que les confiere una gran resistencia en el medio ambiente y puede sobrevivir

por prolongados periodos de tiempo (15 años) siempre que se encuentren en

presencia de materia orgánica y que las condiciones de pH, temperatura, aw, etc.

Sean favorables. (Blanco, 1994).

2.2.3 Factores de crecimiento

El género Listeria spp. presenta una temperatura mínima de crecimiento de 0.4ºC

(Blanco, 1994), otros documentos reportan que la temperatura mínima es de -1.5

(Michanie, 2007), si bien la temperatura óptima es de 37ºC y la temperatura

máxima es de 45ºC, el rango de pH es de 4.3 a 9.4 siendo el pH 7 el óptimo para

su desarrollo y la actividad de agua (aw) mínima que permite su crecimiento es de

0.92 (Michanie, 2007; Anónimo 4, 2007).

La atmósfera ideal para su desarrollo es

de microaereofilia, pero tolera las condiciones aerobias, puede crecer en

concentraciones altas de CO2 (Ej.30%) pero en concentraciones de 100% de CO2

es inhibida.

2.2.4 Clasificación

La clasificación del género listeria ha sufrido muchas variaciones, a lo largo de

más de 30 años, y se le ha incluido en diferentes familias y géneros dentro del

Bergey`s manual of determinative bacteriology. En la séptima edición de 1957,

fue incluido dentro de la familia Corynobacteriaceae debido a sus características

morfológicas. Con el tiempo y gracias a estudios de taxonomía numérica y de

pared celular, evidenciaron la nula o baja relación entre Listeria y las

corinebacterias y evidenciaron su errónea clasificación, (Domínguez, 2001).

27

Los estudios quimiotaxonómicos demostraron que el género Listeria posee un

bajo contenido de Guanina+Citosina (G+C) 36-42%, carencia de ácidos micólicos

y presencia de ácidos lipoteicoicos, presencia de peptidoglicano de la variedad

A1 asociados a ácidos teicoicos del tipo polirribitol-fosfato, y por poseer como

menaquinona principal la MK7. Todo esto, conllevó a la confirmación de la

estrecha relación de este género con los géneros Lactobacillus, Staphylococcus,

Streptococcus, Bacillus, Enterococcus, Lactococcus gracias a la proximidad que

los estudios de taxonomía numérica presentan y a la semejanza en las propiedades

quimitaxonómicas. Con esto, en 1974 en la siguiente edición del manual Bergey

aparece incluido en la sección 16 como género de afiliación incierta cerca de los

géneros anteriormente mencionados y con los cuales posee relación, (Blanco,

1994; Garcia, 1995; Domínguez, 2001).

Gracias a los avances de tecnologías genéticas (hibridación DNA-DNA, análisis

del ARNr 16S) se demostró la escasa relación filogenética entre el género Listeria

y las corinebacterias y la cercanía con los géneros Brochotrix y Lactobacillus

(Blanco, 1994). Gracias a estos avances, se ubicó este género en la familia

Listeriaceae, que está ubicado en la subrama del genero Clostridium de las

bacterias Gram positivas, basado en el bajo contenido de G+C en su genoma

(Gasanov et al., 2005). Las cuatro secuencias disponibles hasta hoy de

L.monocytogenes (cepas Ende, F6854, F2365, H7858) tienen un tamaño promedio

entre 2,893,921 bp y 2,953,211 bp con un contenido aproximado de G+C del 38%

y cerca de 2900 genes codificadores de proteínas. La cantidad de G+C de

L.welshimeri y de L.innocua son de 36.4% y 37% respectivamente. Los análisis

de los genomas, de estas bacterias del género Listeriaceae permitieron evidenciar

particularidades y semejanzas entre estas, como las diferencias entre las cepas

patógenas y no patógenas. Uno de los rasgos semejantes entre las bacterias

pertenecientes a este género, es la fuerte conservación en la organización

genómica, sin inversiones o cambios de largos segmentos geonómicos. Una casi

perfecta conservación en el orden y en la relativa orientación de los genes

heterólogos fue identificada, demostrando e indicando una gran estabilidad y una

28

filogenia cercana entre los genomas de las bacterias del género Listeria

(Buchrieser, 2007).

Actualmente, el género listeria se halla constituido por seis especies:

L.monocytogenes, L.inonocua,L.seeligeri, L.welshimeri, L.grayi y L.ivanovii con

sus dos subespecies indoniencis e ivanovii (Blanco, 1994).

2.2.5 Reservorio

Listeria monocytogenes es un microorganismo ubicuo, está de modo saprofito en

gran cantidad de nichos medioambientales, considerándose su hábitat principal el

suelo y la materia vegetal en descomposición y en aguas continentales (Fig.1).

También se encuentra normalmente en la flora intestinal de animales y está en las

heces de un 2 a 6% de la población. Se encuentra también en ensilados y en el

entorno de la producción de alimentos (Fig.1) (Blanco, 1994; Michanie, 2007).

Figura 1. Habitat de L.monocytogenes y vias de contaminación (Reguera et al.,

1995)

2.2.6 Alimentos

Como se comentó en un apartado anterior una de las principales vías de

contaminación son los alimentos. Algunas investigaciones y reportes proponen

que los alimentos susceptibles y con más probabilidad de encontrar este

29

microorganismo son salchichas, fiambres, leche, leche pasteurizada y derivados

lácteos, carne y productos cárnicos, y debido a su presencia en aguas servidas se

puede encontrar en vegetales regados con agua contaminadas y no tratadas

(Blanco, 1994; Michanie, 2007).

Diversos factores, son un reflejo de los cambios sufridos en el estilo de vida de

los consumidores, entre estos se pueden incluir: (i) progresos médicos que han

producido un cambio demográfico, incrementando la proporción de población de

edad avanzada e inmunocomprometida; (ii) cambios en el sistema de producción

primaria de alimentos (producción a gran escala de materias primas, modificación

de las técnicas de procesado de los alimentos, expansión de la industria

alimentaria y desarrollo de sistemas de almacenamiento en frío); (iii)

modificaciones en los hábitos de alimentación (incremento en la demanda por

parte de los consumidores de alimentos listos para comer, precocinados,

refrigerados o congelados pero con un mínimo requerimiento de tiempo de

cocinado antes de su consumo); (iv) realización de la compra una vez a la semana

(Domínguez, 2001).

Como ya se comentó antes al ser este un microorganismo ubicuo y encontrarse

presente de manera normal en la flora intestinal en algunos organismos, los

enfermos y portadores sanos (animales y humanos) son una de la fuentes más

importantes de contaminación en la industria alimentaria, debido a la

diseminación en el ambiente de L.monocytogenes por parte de estos a través de la

orina, heces y otras secreciones (Fig.1) (Blanco, 1994).

Se han aislado colonias de L.monocytogenes, de agua por la descongelación de

refrigeradores domésticos, gracias a la capacidad de este microorganismo de

soportar bajas temperaturas, lo que puede causar la contaminación cruzada de los

productos refrigerados generando un riesgo para el consumidor (Blanco, 1994;

Michanie, 2007; Farber, 1991; Mena et al., 2003).

30

Otro punto de contaminación de los alimentos, es la contaminación cruzada por la

mala higiene de equipos y personal que laboran en plantas de producción, en seis

plantas de delicatesen en Francia, se identificó contaminación cruzada entre

alimentos crudos y cocinados por los procedimientos inadecuados de limpieza y

desinfección, como fuentes importantes de contaminación (Mena et al., 2003)

2.2.6.1 Leche y productos lácteos

La leche y los productos lácteos son los alimentos en los cuales se han realizado

mas investigaciones, debido a su alta incidencia en relación a los brotes de

listeriosis presentados entre 1983 y 1987 en USA y Suiza.

L.monocytogenes por ser un microorganismo ubicuo puede contaminar a las vacas

lecheras provocándoles mastitis, la cual puede presentarse con ó sin alteración

mamaria y/o de la leche de los animales afectados y Listeria spp. puede seguir

siendo excretada en la leche aun 3 meses después de la desaparición de los

síntomas (Fig.1).

En los demás productos lácteos su presencia se debe a 2 factores: uno es la

utilización de leche contaminada y mal tratada como materia prima para la

elaboración de derivados lácteos (queso, leches achocolatadas, postres, etc.) y dos

a la capacidad que tiene este microorganismo de crecer a temperaturas de

refrigeración, y alcanzar niveles de hasta 107 ufc/mL durante el almacenamiento si

el producto está contaminado (Blanco, 1994).

En estudios realizados por Mena et al. 2003 en Portugal, obtuvieron como

resultado que de 6 muestras de leche cruda 1 estaba contaminada con Listeria

(incidencia del 16.7%), de 28 muestras de leche pasteurizada ninguna presentó

presencia del microorganismo, de 371 muestras de quesos fabricados a partir de

leche pasteurizada 6 resultaron positivas (incidencia 1.6%) y de 50 muestras de

queso fresco 2 dieron positivas en presencia del microorganismo (incidencia del

4.0%) y en España un estudio realizado por Vitas et al., 2003 obtuvieron que de

340 muestras de leche de vaca obtuvieron presencia de: 23 L.monocytogenes, 24

31

L.innocua, 1 L.welshimeri, 1 L.seeligeri. La leche fresca pertenece a los productos

crudos que sufren un proceso de cocción o calentamiento antes de su uso o

consumo (Vitas et al., 2003) lo cual es reflejado por la ausencia de Listeria en

las muestras de la lache pasteurizada, y la presencia de listeria en productos a

partir de este tipo de materias primas es a causa de la contaminación cruzada

durante elaboración de los productos.

La leche cruda permite una presencia medianamente alta de patógenos por el

proceso de obtención, transporte y contaminación cruzada, pero como es un

producto que no se consumirá crudo y sufrirá un proceso de calentamiento

(pasteurización, UHT, entre otros) que asegurara la destrucción del 100% de

patógenos no se tiene mucha relevancia sobre la misma.

2.2.6.2 Carne y productos carnicos

Se ha aislado L.monocytogenes de muy diversos tipos de carne. La carne de ave y

sus derivados, son los mas susceptibles y los que mayor incidencia presentan entre

los diferentes alimentos investigados y la contaminación aumenta a medida que

avanza el procesado y distribución del producto, aunque los recuentos obtenidos

no son superiores a 102 UFC/mL (Vitas et al.,2003; Mena et al., 2003).

Las carnes rojas presentan una mayor presencia de Listeria spp. siendo esta mayor

en la carne de porcino que en las de vacuno y ovino, aunque los recuentos no son

superiores a 5 UFC/mL. En productos derivados como el paté se han llegado a

obtener recuentos de hasta 106 UFC/g (Blanco, 1994).

Mena et al. 2003, analizaron 105 muestras de carne, 15 fueron de pollo crudo

(músculo) de las cuales 9 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria

(incidencia del 60%), 17 de carne roja (músculo) de las cuales 3 dieron positivo

(+) para la de Listeria (incidencia del 17.7%), 4 muestras de jamón de las cuales

solo 1 dio positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 25%), 44

muestras de jamón curado (presunto) de los cuales 1 dio positivo (+) para la

presencia de Listeria (incidencia del 2.3%) y 25 muestras de pescado crudo de las

32

cuales 3 dieron positivo (+) para la presencia de Listeria (incidencia del 12.0%) y

en España un estudio realizado por Vitas, y col. 2003 obtuvieron que de 295

muestras de carne cruda obtuvieron presencia de: 103 L.monocytogenes, 103

L.innocua, 45 L.welshimeri, 4 L.seeligeri, de 158 muestras de carne de ave de

corral (pollo y pavo) obtuvieron presencia de 57 L.monocytogenes, 106 L.innocua,

6 L.welshimeri, 2 L.seeligeri.

Para las carnes crudas se acepta una presencia moderada de patógenos por los

procesos que sufre el producto para su obtención (matanza, destripado, etc.) y la

preparación de las porciones (picado, troceado, etc.) pero como estos productos

sufrirán un proceso de cocción y su temperatura interna alcanzará los 70ºC y

asumiendo que el proceso es listericida si realiza de manera correcta (Vitas et al.,

2003; Mena et al., 2003).

2.2.6.3 Otros Alimentos

Se han encontrado reportes de L.monocytogenes en productos refrigerados

precocidos, listos para comer, congelados, y verduras y hortalizas crudas. (Blanco,

1994; Domínguez, 2001)

La presencia en alimentos listos para consumo (ALC) ó ready to eat , refrigerados

y congelados se debe a que estos alimentos se consumen, sin ningún tratamiento

térmico o tratamientos muy suaves, que no aseguran la eliminación de

L.monocytogenes (Blanco, 1994).

Las investigaciones de Vitas et al.. 2003 y de Mena et al.. 2003, concuerdan en

que los ALC poseen una alta probabilidad de causar listeriosis en los

consumidores, aunque estos productos sufran procesos de conservación y/o

maduración, y procesos de cocción que aseguren su inocuidad para los

consumidores, el riesgo radica en la contaminación directa ó cruzada por contacto

con superficies de equipos en los cuales se han manipulado alimentos crudos los

cuales presentan una alta probabilidad de contaminación con Listeria spp. Otros

estudios, han demostrado que los refrigeradores pueden ser una fuente potencial

33

de colonización y contaminación de alimentos por parte de Listeria

monocytogenes debido a su capacidad psicotrofa y a la generación de un ambiente

adecuado para su desarrollo y multiplicación debido a la ausencia de

microorganismos patógenos, y valores de pH y aw adecuados (Vitas et al., 2003).

Algunos autores y entidades recomiendan cero tolerancia en 25 g de productos

que posean un tiempo de vida útil mayor a una semana, debido a que

investigaciones en microbiología predictiva han demostrado, que a una

temperatura de almacenamiento de 0-5ºC y por más de 5 días la concentración

final de listeria puede ser de 103 ufc/g partiendo de una concentración de 10

células, y si el almacenamiento es a 10ºC se puede alcanzar una concentración de

107 ufc/g , si el tiempo es menor recomiendan una concentración < 100 ufc/g,

(Vitas et al.,2003).

Para los productos de carne cocinada y ALC, debido a sus cualidades y métodos

de conservación como se ha descrito anteriormente, son un medio idóneo para el

crecimiento de L.monocytogenes en todo el concepto microbiológico y por eso

deben tener un control igual que el de productos que posean duración de más de

una semana (Vitas et al., 2003; Mena et al., 2003).

2.2.7 Métodos de detección

Desde la aparición de ETAs, ha habido una constante investigación, búsqueda y

diseño de métodos más rápidos y más sensibles para la detección de

microorganismos patógenos, sobre todo en la industria alimentaria, debido a las

normas de gobiernos y organismos internacionales de ofrecer, alimentos inocuos

para el consumidor y para mejorar su aceptación en el mercado ofreciendo

tiempos de vida útil más largos.

Existen variados y diferentes procedimientos y protocolos avalados por agencias

internacionales como FDA, ISO, para el aislamiento de Listeria monocytogenes,

igualmente, existe gran diversidad de técnicas para la identificación de colonias

aisladas, métodos de identificación epidemiológica y el futuro para la detección de

34

microorganismos está encaminado a las tecnologías genéticas que se basan en el

análisis del RNA y DNA (Gasanov et al., 2004).

Figura 2. Resumen modificado de técnicas y procedimientos generales de

aislamiento, identificación y tipificación para Listeria spp. y Listeria

monocytogenes en muestras ambientales y de alimentos (Gasanov et al., 2004).

La mayoría de pruebas, protocolos y test usados para la detección de

microorganismos en la industria alimentaria no diferencian las especies de

Listeria. Estos protocolos son regulados y certificados por agencias

gubernamentales como la FDA (Food and Drug Administration) o la USDA (US

deparment of agricultura) en Estados unidos ó la ANZFA (Australian and New

Zeland food administration) en Australia. Desde la perspectiva de higiene la

presencia de alguna especie no patógenica de Listeria como L.innocua puede

indicar la potencial transmisión o presencia de L.monocytogenes (Gasanov et al.,

2004).

La mayoría de pruebas que se usan en la actualidad en los laboratorios de

microbiología de alimentos para la detección de L.monocytogenes están basados

35

en métodos de cultivo y anticuerpos, pero el reto de la industria alimentaría es

usar métodos moleculares. Algunas de las desventajas de los método moleculares,

es el costo de equipos y reactivos y que es necesario tener personal altamente

entrenado y capacitado para este tipo de pruebas, aparte no diferencia entre células

vivas y muertas, alguna de sus ventajas, es que no se basa en la expresión de

factores antigénicos, enzimáticos o proteicos, es fiable y se basa en las diferencias

entre los genomas y se pueden realizar en la misma fracción de tiempo que toman

los métodos convencionales (Gasanov et al., 2004).

2.2.7.1 Métodos de aislamiento

Históricamente, el aislamiento de Listera spp. de muestras de alimentos y

ambientales ha sido un reto debido a la capacidad de este microorganismo de

crecer a bajas temperaturas. Por lo que, antiguamente se solía aislar de las muestra

clínicas poniéndolo a crecer en medios de cultivo a 4ºC por largos periodos de

tiempo hasta poder evidenciar el crecimiento de colonias. Este tipo de método,

toma demasiado tiempo y no permite la recuperación de células de Listeria spp.

dañadas. Hay tres elementos claves: enriquecimiento, tiempo de aislamiento y

recuperación de células dañadas, los cuales son factores que se han de tener en

cuenta en los procesos de aislamiento si se desean obtener los mejores resultados

para el control de Listeria spp. en la industria alimentaria.

Las pruebas aprobadas por agencias reguladoras, deben detectar por lo menos una

célula de Listeria en 25 g de muestra ó producto a analizar. Esta sensibilidad solo

se puede lograr usando métodos y medios en el cual el microorganismo sea capaz

de llegar a una concentración de 104

UFC/mL el cual es un límite detectable. Dos

de los protocolos más usados para la detección de Listeria spp. en cualquier

alimento y que han sido certificados y avalados por agencias reguladoras son el

método de análisis bacteriológico (BDMA) de la FDA y el de la Organización

internacional de estándares (ISO) 11290, estos dos métodos poseen en común el

uso de 25 g de muestra para enriquecimiento en un medio que sea selectivo e

inhiba la microflora acompañante, y la siembra en medios sólidos selectivos e

identificación bioquímica de las colonias sospechosas (Gasanov et al., 2004).

36

2.2.7.2 Identificación de colonias aisladas

Los métodos de enriquecimiento, demoran entre 30 y 48 horas y como se dijo

anteriormente, debe continuarse con la identificación de los microorganismos

aislados. Después de seleccionar un método de enriquecimiento validado para

Listeria se debe considerar la extensión en la cual el método ha sido validado, en

pocas palabras continuar usando protocolos validados y aceptados por agencias

reguladoras. Mientras varios países tienen sus propios esquemas de validación, la

AOAC en Washington, es la autoridad más reconocida en el mundo. La AOAC de

métodos oficiales, posee una gran variedad de métodos para la búsqueda de

Listeria que incluye métodos rápidos como inmunoensayos hasta pruebas basadas

en genética

Para la identificación existen varios métodos tales como: Confirmación por

pruebas bioquímicas, la Prueba de CAMP, pruebas de basadas en anticuerpos,

ELISA, inmunocaptura, y a nivel de las pruebas moleculares tenemos:

Hibridación de DNA y la PCR, en los estudios epidemiológicos se llega a la

tipificación del microorganismo (Gasanov et al., 2004).

37

Figura 3. Sistema metodológico para la identificación fenotípica de Listeria spp.

modificado (Gasanov et al., 2004)

2.2.8 Virulencia

L.monocytogenes puede invadir el ojo y la piel del hombre después de una

exposición directa, se ha observado en accidentes de laboratorio, veterinario y

personal que labora en mataderos. Pero en la mayoría de casos de listeriosis en

humanos la puerta de entrada es la parte superior del tracto gastrointestinal por el

consumo de alimentos contaminados con dosis muy altas del microorganismos

(106 UFC/mL ó g de alimento consumido) (Garza et al., 2002; Álamo et al.,

2006).

La bacteria luego de entrar por el tracto, atraviesa la barrera mucosa del intestino

probablemente ayudada por la endocitosis de las células endoteliales (placas de

peyer), y crece eficazmente dentro de los enterocitos y mononucleares, lo cual

38

permite que parte de su población alcance el torrente sanguíneo y se disemine por

vía hematógena. Luego de la translocación del intestino el hígado es el primer

órgano blanco donde se multiplica activamente antes de que la infección sea

controlada por la inmunidad mediada por células, luego de alcanzar el hígado los

otros tres órganos blancos de este patógeno son la placenta, el cerebro y el sistema

nervioso, (Álamo et al., 2006; Reguera et al., 1995).

Cuando la bacteria se interna en la célula, sea por fagocitosis o fagocitosis

inducida, queda englobada en un fagosoma monomembranal, del cual luego

escapa asegurando su libertad en el citosol, multiplicándose libremente en el

citoplasma, luego se desplaza por el interior hacia el exterior de la célula

hospedora alcanzando las células subyacentes, quedando nuevamente englobadas

en el nuevo hospedador dentro de un fagosoma bimembranal. En concreto, los

eventos implicados en el proceso infectivo global, son (Vazquez et al., 2001;

Garza et al., 2002) (figura 4):

i) Entrada a las células del hospedador.

ii) Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.

iii) Desplazamiento intracitoplasmático.

iv) Diseminación célula-célula.

Figura 4. Representación esquématica de la biología de la infección intracelular

por L.monocytogenes (Reguera, et al., 1995)

39

2.2.8.1 Entrada a las células del hospedador

La forma en la cual el microorganismo ingresa a las células no fagocíticas es

semejante a la clásica fagocitosis, ya que implica la interacción del ligando del

primero con el receptor de las segundas, como ya se dijo las placas de peyer y las

células M son el primer sitio de invasión, posteriormente el bacilo es englobado

por los macrófagos residentes. Las proteínas que participan en la internalización

inducida de Listeria en la célula, son las internalinas A y B que son codificadas

por los genes InlA e InlB. Luego de su ingreso las células quedan internadas en un

fagosoma constituido de una sola membrana, que luego interactuara con un

lisosoma para la destrucción de las bacterias pero este microorganismo es capaz

de escapar antes que esto suceda (Garza et al., 2002; Domínguez, 2001).

2.2.8.2 Escape del fagosoma y desarrollo intracelular.

Dentro del fagosoma la bacteria queda englobada alrededor de 30 minutos en el

caso de L.monocytogenes, el fagosoma se acidifica rápidamente por medio de

ATPasas de protones. La supervivencia bacteriana y su posterior multiplicación

en el citosol van a ser el resultado de una competición entre la fusión del

fagosoma-lisosoma y la exposición oxidativa de las células hospedadoras

(Domínguez, 2001), los mecanismos para evitar esto son la expresión de los genes

(hly) de las toxinas líticas (listeriosina O con interacción sinérgica de fosfolipasas)

para la destrucción del fagosoma y la expresión de dos enzimas, catalasa y

superóxido dismutasa, que la protegen de la oxidación fagolisosómica (Garza et

al., 2002).

Una vez que se concreta la lisis del fagosoma (en el fagosoma monomembranal

solo interfiere la listeriosina O y en el fagosoma bimembranal intervienen las

fosfolipasas junto con la listeriosina) el microorganismo se libera al citosol donde

se multiplica en un tiempo de 50 minutos (Garza et al., 2002).

40

2.2.8.3 Desplazamiento intracitoplasmático

Dentro del citoplasma la bacteria expresa otro gen de virulencia denominado

ActA, que es una proteína que manipula los componentes del citoesqueleto de la

célula hospedadora para su tránsito intracelular e intercelular. Durante la

internalización, el microorganismo absorbe varios filamentos cortos de actina

(Garza et al., 2002), y durante su división se observa una densa nube de actina que

la rodea. Asociada con la replicación bacteriana se va a producir una

redistribución de los filamentos de actina, concentrándose en uno de los polos de

la bacteria (Domínguez, 2001), formándose estructuras (actínicas) semejantes a la

cola de una cometa.

Posteriormente, se produce una polimerización continua de la actina en dicho polo

que mediante un mecanismo similar al de los cohetes, propulsa las bacterias por el

citoplasma (Domínguez, 2001), aportando una fuerza locomotora que logra

velocidades de 0.05 a 0.3 m/seg (Garza et al., 2002).

2.2.8.4 Diseminación célula-célula

La adquisición de movilidad asociada a la polimerización de los filamentos de

actina alcanza la membrana plasmática de la célula infectada para poder invadir a

las células vecinas (Garza et al., 2002; Álamo et al., 2006).

Los bacilos se desplazan a través del citoplasma hacia la membrana

citoplasmática, utilizando los filamentos de actina polimerizados, una vez logran

este objetivo, la empujan progresivamente provocando que se produzcan

prolongaciones alargadas llamadas filópodos o protruciones, desde cuyo interior

continúan ejerciendo presión, de esta manera dichas proyecciones terminan siendo

fagocitadas por las células adyacentes (Garza et al., 2002). Como consecuencia de

esto, las bacterias quedan atrapadas en una vacuola rodeada por una doble

membrana, la interna constituida por la membrana citoplasmática de la primera

célula y la externa por la membrana de la nueva célula invadida (Domínguez,

2001; Vazques et al., 2001).

41

2.2.9 Listeriosis

A pesar de la amplia presencia de la bacteria en el ambiente la enfermedad no es

frecuente y afecta principalmente a adultos inmunocomprometidos, mujeres

embarazadas, recién nacidos, granjeros, veterinarios y enfermos crónicos

(Michanie, 2007).

La listeriosis presenta dos tipos de cuadros: invasivo y no-invasivo, el cuadro

invasivo suele ocurrir en personas con sistemas inmunes muy débiles (VIH

positivos, gerontes, embarazadas, fetos y neonatos, personas que padecen cáncer,

diabetes, cirrosis, y en las que reciben medicamentos inmunodepresores o han

sido sometidas a transplantes), y la no invasiva ocurre en cualquier persona que

haya consumido una alta dosis de Listeria monocytogenes (Garza et al., 2002).

Figura 5. Representación esquemática de la fisiopatología de la infección por

Listeria spp. (Vasquez et al., 2001)

2.2.9.1 No invasivo (gastroenteritis)

Los síntomas son diarrea, fiebre, dolor muscular, dolor de cabeza, dolor

abdominal y vomito en casos menos frecuentes, la incubación del microorganismo

y reflejo de los síntomas se dan entre la primera hora y los 7 días.

42

2.2.9.2 Invasivo

Las infecciones invasivas tienen un tiempo de incubación de 1 a 90 días, se

presentan síntomas parecidos a una gripe, diarrea con presencia de vomito, tiene

una mortalidad del 30% y una tasa de hospitalización del 92%, la concentración

de microorganismo para causar la enfermedad es de 100-1000 células.

Las enfermedades que puede causar son (Garza et al., 2002; Michanie, 2007) :

I. Infecciones durante el embarazo.

II. Granulomatosis linfatiséptica.

III. Sepsis de origen desconocido (septicemia).

IV. Meningoencefalitis, cerebritis, y romboencefalitis.

V. Infecciones focales.

2.2.9.3 Tratamiento

L.monocytogenes es susceptible a gran cantidad de antimicrobianos y su

resistencia es ocasional, excepto a las tetraciclinas, estudios han comprobado que

es capaz de adquirir genes de resistencia provenientes de Enterococcus spp. y

Streptococcus spp. entre otros, lo cual puede aportarle resistencia a gentamicina,

estreptomicina, eritromicina y sulfametoaxol (Michanie, 2007).

Algunos autores reportan que la combinación de penicilina, ampicilina y

opcionalmente un amino glucósido (ej.gentamicina) es el más efectivo, algunos

otros adicionan el tratamiento con quinolonas, macrolidos y trimetropim-

sulfametaxol, y otros recomiendan que la asociación ampicilina-cotrimoxazol,

subrayando que es superior a la combinación de ampicilina-penicilina-

gentamicina, ya que reduce la mortalidad y las secuelas cerebrales (Garza et al.,

2002).

43

2.3 Métodos más usados para el control de L.monocytogenes en alimentos

2.3.1 Tratamientos térmicos (control microbiano por calor)

La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque por diferentes

microorganismos (bacterias, levaduras, mohos), y estos alimentos pueden resultar

perjudiciales para la salud del consumidor.

El fuego y el agua en ebullición se han utilizado para esterilizar y desinfectar

desde la época de los griegos, siendo el calor aún hoy en día uno de los métodos

más comunes para la destrucción de microorganismos (Prescott et al., 1999),

debido a que los microorganismos mueren rápidamente cuando son sometidos a

temperaturas superiores a las de su óptima de crecimiento. Esto permite utilizar

altas temperaturas para eliminarlos por termodestrucción, la sensibilidad de los

microorganismos a los tratamientos térmicos es diferente, las esporas son más

termorresistentes que las células vegetativas y los microorganismos Gram-

positivos lo son más que los Gram-negativos (Anónimo 2, 2007).

2.3.2 Cinética de muerte: Valores D y Z

Al someter a una población bacteriana a la acción del calor, a una temperatura

constante, el número de supervivientes es una función exponencial del tiempo de

tratamiento: a intervalos iguales de calentamiento la población se reduce en igual

proporción. La cinética de destrucción microbiana es, por tanto, una cinética de

reacción de primer orden (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007):

Nt = N0 e-kt

Siendo:

Nt: número de microorganismos trás ―t‖ minutos de tratamiento.

N0: número inicial de microorganismos.

k: constante de inactivación.

t: tiempo de tratamiento.

Así pues, al representar el logaritmo del número de supervivientes a un

tratamiento térmico, realizado a temperatura constante, frente al tiempo, se

44

obtiene una línea recta. Esta representación se denomina gráfica de supervivencia

(Palop, 2007).

Figura 6. Gráfica de supervivencia (Palop, 2007)

2.3.2.1 Tiempo de reducción decimal (Valor D)

Para definir la termorresistencia microbiana se creó un parámetro al que se

denominó ―tiempo de reducción decimal o valor DT‖ que se definió como el

tiempo que es preciso tratar a una población microbiana a la temperatura T para

reducir su recuento a la décima parte, o lo que es lo mismo, para que la línea de

supervivencia atraviese un ciclo logarítmico. Si consideramos N0 como el número

de células al inicio del tratamiento y NX el número de células sobrevivientes

después de un tratamiento de t minutos a una temperatura T, el valor D se

calcula:

𝐷𝑡 =𝑋

𝑙𝑜𝑔 𝑁0 𝑁𝑥

DT= x/Log(N0/NX) ó DT=-1/m (donde m es la pendiente de la grafica de

supervivencia (Prescott et al., 1999; Palop, 2007).

45

Figura 7. Grafica de valor D (anónimo 1, 2007).

2.3.2.2 Valor Z

Si aumentamos la temperatura del tratamiento, el valor D disminuye de forma

logarítmica. Por tanto, representando el logaritmo de los valores DT frente a la

temperatura de tratamiento, obtendremos una línea recta denominada gráfica de

termodestrucción. La gráfica de termodestrucción permite conocer la

termorresistencia que presentará el microorganismo a cualquier temperatura de

tratamiento y su pendiente indica la termodependencia de las reacciones que

conducen a su destrucción. A partir de la gráfica de termodestrucción se define el

valor z como el número de ºC que hay que aumentar a la temperatura de

tratamiento para reducir el valor DT a la décima parte, es decir, para que la línea

de termodestrucción atraviese un ciclo logarítmico, el valor z se calcula:

ΔT

z =

log DT2 – log DT1

o simplemente Z=-1/m (donde m es la pendiente de la gráfica de

termodestrucción) (Anónimo 1, 2007; Garza, 2007, Palop, 2007).

46

Figura 8. Grafica de termorresistencia y valor Z. (Anónimo 2, 2007).

2.3.3 Termorresistómetro

El termorresistómetro es un instrumento diseñado para la determinación de la

resistencia de los microorganismos al calor. Este instrumento permite la

aplicación directa de un tratamiento térmico preestablecido, durante un tiempo

determinado en condiciones controladas, a una muestra de alimento o a un medio

sintético. (Palop, 2007)

El termorresistómetro consiste en un tanque de acero presurizado, calentado por

una resistencia eléctrica y homogeneizado mediante una hélice de agitación. La

temperatura del instrumento se controla mediante un autómata programable. Está

dotado de un puerto para adicionar los microorganismos, por medio de una jeringa

y una aguja estéril. En este instrumento se pueden realizar tratamientos

isotérmicos (temperatura constante a través del tiempo) y no isotérmicos (rampas

de temperatura, la temperatura aumenta de manera gradual y constante durante el

tiempo deseado hasta una temperatura final) (Fernández, 2007).

47

2.3.4 Factores que influyen sobre la termorresistencia de los

microorganismos.

En cualquier tratamiento antimicrobiano puede ocurrir que algunas células sean

dañadas pero no mueran debido a que algunas células sean más termorresistentes

que las demás por la producción de proteínas de choque térmico ó HSP (Heat

Shock Proteins) u otros mecanismos (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006).

Aparte de esto, la resistencia de los microorganismos al calor esta supeditada a

una serie de factores, entre los cuales están:

-Tipo de microorganismos: Las bacterias esporuladas son las formas mas

resistentes, llegando algunas de ellas, a sobrevivir a tratamientos de varios

minutos a 120ºC, seguido están las bacterias vegetativas, levaduras y hongos

presentan una termorresstencia similar, la mayoría mueren tras estar unos minutos

a una temperatura entre 70 y 80ºC (Anonimo 3, 2007; Garza, 2007).

-Temperatura: Algunas investigaciones han demostrado que la termorresistencia

de las esporas está influenciada por la temperatura de esporulación, así si la

esporulación tiene lugar a la temperatura óptima de crecimiento, o superior, su

termorresistencia será mayor que si el crecimiento hubiera tenido lugar en

temperaturas más bajas. Las formas vegetativas presentan un comportamiento

similar a las esporuladas pues en general, cuanto más se aproxima a la

temperatura óptima de crecimiento durante la fase de crecimiento más elevada es

su termorresistencia (Garza, 2007; Der Lin et al., 2003).

-pH del medio de tratamiento: Quizás el factor más importante que afecta la

termorresistencia sea el pH. La resistencia de los microorganismos es

generalmente máxima a valores de pH próximos a la neutralidad, entre 6.0 y 8.0, y

decrece cuando el medio es ácido (Garza, 2007). Investigaciones de Hassani et al.

2003 y de Hassani et al. 2007, demostraron que a un pH ácido la termorresistencia

disminuía y conforme aumentaba el pH la termorresistencia también aumentaba.

-Actividad del agua: La reducción en la actividad del agua en el medio de

tratamiento aumenta considerablemente la termorresistencia tanto en los esporos

48

como en las células vegetativas, lo que se refleja en la necesidad de utilizar

temperaturas de tratamiento más elevadas o tiempos más prolongados (Garza,

2007). Fernández, y col. 2006, realizaron un modelo en el cual el efecto del aw

sobre la termorresistencia de L.monocytogenes varía dependiendo de la

temperatura del tratamiento.

-Composición del medio: El contenido de azúcares, la adición de conservantes,

la presencia y el tipo de ácidos orgánicos y la presencia de sales, tienen un efecto

importante sobre la termorresistencia de los microorganismos. El azúcar en

concentraciones altas protege a las células contra la inactivación térmica pero no

solo la concentración influye, sino también el tipo de azúcar interviene

significativamente en el efecto protector (Garza, 2007). La sal en los alimentos

juega un rol importante pues el primer efecto que tiene sobre las células es la

plasmolisis, luego tiene otros efectos como deshidratación, interferencia

enzimática, retiro de oxígeno y la toxicidad de los iones, cloro y sodio, cuando el

cloruro de sodio es ionizado (Der lin et al., 2003). Schultze, et al.. 2006,

determinaron en su investigación que el D60 de L.monocytogenes en una mezcla

de frankfurter con una concentración de 8.5% es de 2.2 minutos y a

concentraciones de 11 y 23% fue de 1.7 minutos, lo que desmiente que una

mayor concentración de grasas produce un aumento de la termorresistencia de los

microorganismos.

Listeria spp. es capaz de sobrevivir a bajas temperaturas debido al cambio de

composición que realiza en su membrana (Gandhi et al., 2006). Según la teoría de

membrana fluida, la membrana en los organismos, al estar a temperaturas altas

aumenta su proporción de ácidos grasos saturados, y a bajas temperaturas las de

ácidos grasos insaturados y hopanoides. Listeria spp. a bajas temperaturas,

aumenta la proporción de C15:0 a expensas de C17:0 cuando la temperatura es

reducida de la ideal (7ºC), todo esto con el objeto de mantener la fluidez adecuada

de la membrana (Gandhi et al., 2006) ajustándose al modelo de mosaico fluido de

Singer y Nicholson.

49

Las condiciones conocidas que afectan la resistencia a los tratamientos térmicos

por parte de Listeria spp son, entre otros, el estado en el ciclo de crecimiento,

temperatura alta (19 ò 37ºC) durante el crecimiento (debido a que afecta la

biosíntesis de lípidos), la composición membranal y síntesis de proteínas,

exposición a otros estreses y las células que se encuentran en fase estacionaria,

influyen en la resistencia a la inactivación térmica por parte de este

microorganismo. La termotolerancia tiende a aumentar significativamente después

de un shock térmico (30 minutos a 48ºC) en células crecidas a 4ºC. El caldo de

crecimiento juega un papel importante, pues afecta la tasa de crecimiento y la

composición de constituyentes celulares que determinan la termotolerancia de las

células bacterianas. (Doyle, 1999; Doyle et al., 2000).

2.4 Antimicrobianos naturales

Los antimicrobianos son sustancias que pueden inhibir o detener el crecimiento de

microorganismos, estos pueden ser de origen natural (animal, vegetal y

microbiano) ó sintético (ácidos orgánicos y ésteres) (Raybaudi et al., 2006).

Se estima que en la parte aérea de las plantas, la filosfera y especialmente en las

hojas, existen alrededor de 106-10

7 células/cm

2 (10

8 células/g) de

microorganismos, principalmente bacterias. Globalmente las plantas producen

más de 100.000 productos naturales de bajo peso molecular, también conocidos

como metabolitos secundarios. Esta diversidad tan rica resulta de un proceso

evolutivo para la adquisición de defensa mejorada frente a los ataques de

microorganismos, insectos y otros animales (Domingo et al., 2003).

Desde tiempos antiguos y en la actualidad se conocen y reconocen las propiedades

antimicrobianas de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. Se han

realizado investigaciones y se ha encontrado que los compuestos presentes en

estas plantas son derivados simples y complejos del fenol, los cuales son volátiles

a temperatura ambiente (Marcén, 2000; Raybaudi et al., 2006).

50

2.4.1 Aceites esenciales

Los aceites esenciales (A.E.) son compuestos lipídicos muy olorosos obtenidos

mediante la extracción de diferentes partes de plantas (flores, yemas, semillas,

hojas, ramas, corteza, hierba, madrea, frutos, raíces, etc.) usando solventes

orgánicos ó técnicas como la destilación. Estos aceites están compuestos por

mezclas de ésteres, aldehídos, cetonas, terpenos, hidrocarburos cíclicos y

alcoholes. Además son compuestos muy solubles en alcohol pero poco solubles en

agua (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).

Los A.E que contenían un aldehído o un fenol como principal componente fueron

los más activos frente a bacterias del tracto respiratorio, seguido por los alcoholes

y, con una menor acción antimicrobiana, los aceites que contenían

mayoritariamente cetonas, ésteres o hidrocarburos. La actividad de un aceite

esencial está relacionada con sus constituyentes principales (estos pueden

constituir hasta un 85% del total, mientras que el resto se presentan como trazas),

la configuración estructural y grupos funcionales de sus compuestos, y con

posibles sinergias entre los compuestos. En consecuencia hay que diferenciar

entre la mezcla total del aceite esencial de una planta y cada uno de sus

componentes activos (Castillejos, 2005; Raybaudi et al., 2006).

La composición de los aceites esenciales puede variar mucho dependiendo de la

variedad (propiedades determinadas genéticamente), la zona geográfica o

climatología (medio ambiente), la edad de la planta, la parte utilizada en la

extracción, y el método de secado y extracción del aceite (Castillejos, 2005).

2.4.1.1 Mecanismos de acción de los aceites esenciales

Los aceites esenciales al tener un gran número de compuestos, su acción

antimicrobiana no se atribuye a un único mecanismo, sino a varios debido a los

múltiples blancos en la célula. Una característica importante de los aceites

esenciales es su hidrofobicidad, característica que les permite unirse a los lípidos

de la membrana celular desestabilizando su estructura y aumentando su

51

permeabilidad, generando la salida de iones, metabolitos y demás moléculas que

pueden conllevar a la muerte (Burt, 2004; Castillejos, 2005). Estudios demuestran

que la mayoría de las propiedades antibacterianas frente a microorganismos

patógenos por parte de los A.E se debe en un alto porcentaje a los compuestos

fenólicos como el timol, el carvacrol y el eugenol presentes en estos (Burt, 2004).

Según algunos estudios señalan, la localización y la cantidad de grupos hidroxilo

sobre los grupos fenólicos de estas moléculas está relacionado con su toxicidad:

una mayor oxidación es responsable de una mayor capacidad bactericida

(Castillejos, 2005). Es razonable pensar que sus mecanismos de acción sean

parecidos a los de otros compuestos fenólicos, generalmente se consideran la

desestabilización de la membrana citoplasmática, la interrupción en la fuerza

protón motriz (FPM), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación

de componentes celulares, (Burt, 2004). También pueden actuar sobre las

proteínas de la membrana citoplasmática. Los hidrocarburos lipofílicos pueden

acumularse en la bicapa lipídica e interferir en la interacción lípido proteína.

Además, también es posible una interacción directa entre los compuestos

lipofílicos con la parte hidrofóbica de la proteína. Como consecuencia, pueden

modificar la actividad de las enzimas que regulan la producción de energía o la

síntesis de compuestos estructurales (Castillejos, 2005).

Figura 9. Localización y mecanismo de acción de los componentes de A.E sobre

la célula bacteriana. (Burt, 2004; Castillejos, 2005)

52

Aparentemente los componentes de los A.E. interaccionan con las ATPasas que

están presentes en la membrana citoplasmática (Burt, 2004), Gill y col. 2006, en

su investigación determinaron que el eugenol, el carvacrol, y el cinemaldehido,

componentes de aceites esenciales, inhibían la obligada actividad de la ATPasa de

membrana de E.coli y L.monocytogenes. Las membranas bacterianas contienen un

alto número de diferentes enzimas con función ATPasa incluyendo aquellas

involucradas en el transporte activo de proteínas, como la ATPasa F1F0 que es la

encargada de la regulación del pH celular. La inhibición de estas funciones puede

afectar la sobrevivencia celular, las concentraciones para inhibir la actividad de

las ATPasas es la misma que se necesita para la desestabilización de la membrana

celular, lo que sugiere que la interrupción de las funciones de estas enzimas es una

causa secundaria más que una primaria de la muerte celular.

Otra investigación de Gill et al. 2005, permitió evidenciar que el carvacrol y el

eugenol aumentan la permeabilidad de la membrana afectando la movilidad de

E.coli y L.monocytogenes ofreciendo gran evidencia que la desestabilización de la

membrana es la causa primaria de la muerte celular por acción de estos

compuestos. El flagelo de estas bacterias esta estructuralmente integrado a la

membrana y el cual recibe energía proveniente del gradiente de protones más que

por los intermediarios fosforilados del ATP.

2.4.1.2 Clavo (Eugenol)

El clavo es una especia proveniente de las plantas del género Syzygium spp, esta

ha sido usada desde tiempos antiguos en la medicina tradicional, teniendo usos de

expectorante, estimulante, analgésico, anti flatulento, etc, y en la odontología

como antiséptico, por lo cual es común encontrarlo en gomas y en cremas dentales

para el tratamiento y prevención de la caries (Chaieb et al., 2007).

El aceite esencial proveniente del clavo está constituido por 36 componentes

(Chaieb, K, et al., 2007) y con altas concentraciones de: eugenol (figura 12), -

caryophyleno, -humuleno, epóxido de humuleno, etil hexanoato, 2-heptanona,

53

humulenol, calacoreno y calameneno (Chaieb et al., 2007; Raina et al., 2001; Fu

et al., 2007).

Figura 10. Eugenol

El eugenol pertenece al grupo de los fenilpropanos que son sustancias

ampliamente distribuidas entre los vegetales y se caracterizan por un anillo

aromático unido a una cadena de 3 carbonos y derivados biosintéticamente del

ácido shikímico 2-metoxi-4-(2-peopenil) fenol (bolilla, 2007), los compuestos con

estructura fenólica demostraron tener una actividad antimicrobiana superior

debido a su carácter hidrofóbico. Estudios dan importancia al grupo hidroxilo y su

localización en la estructura fenólica para obtener una mayor capacidad

antimicrobiana (Castillejos, 2005).

Se teoriza sobre la posible interacción del grupo hidroxilo con proteínas

inhibiendo su acción, concentraciones subletales de eugenol inhibieron la

producción de las amilasas y proteasas de B.cereus. El deterioro de la pared

celular y el alto grado de la lisis celular también se comprobó en otras

investigaciones (Burt, 2004).

Estudios han comprobado la eficacia del aceite esencial del clavo como

antimicrobiano pero todavía no se conoce muy bien su forma de acción, pero se

sabe que el componente responsable de esta actividad antimicrobiana es el

eugenol. Kamel y col. 2007, determinaron la acción antibacteriana del eugenol

54

extraído del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, L.monocytogenes,

E.fecalis, P.aureginosa, S.typhimurium y M.luteus, y determinaron que el menor

diámetro de inhibición fue de 8 mm. Para L.monocytogenes el halo de inhibición

por parte del A.E fue de 15 mm con una DS (desviación estándar) de 0, dando un

resultado muy bueno al compararlo con la gentamicina que dio como resultado un

halo de 38mm sobre este mismo microorganismo.

En otro estudio Fu y col. 2007, realizaron un estudio de la actividad

antimicrobiana del clavo sobre S.epidermidis, E.coli, S.aureus, P.aureginosa,

B.subtilis y P.vulgaris encontraron que a menor halo de inhibición fue de 9mm

para P.aureginosa y el mayor fue de 18.2mm para P.vulgaris lo cual fueron

resultados óptimos teniendo como control la estreptomicina.

2.4.1.3 Tomillo (Carvacrol y Timol)

El tomillo es una especia proveniente de las plantas del género Thymus spp, y se

le atribuyen propiedades antiespasmódica, expectorante, antiséptica,

antiinflamatoria y otras más (Ettayebi et al.,1999; López, 2006; Bounatirou et al.,

2007). El tomillo es usado en la industria alimentaria como agente saborizante y

aromático y en las preparaciones farmacológicas su aceite esencial esta en le

ranking de los 10 aceites esenciales más usados en el mundo (Solomakos et al.,

2007; Rasooli et al., 2005).

Se sugiere que la presencia y el número de grupos hidroxilo sobre el grupo fenol

de estas moléculas está relacionado con su toxicidad: una mayor hidroxilación es

responsable de una mayor capacidad bactericida. La presencia del grupo hidroxilo

en la molécula de carvacrol, al igual que en el timol, provoca la entrada y el

escape de iones potasio (Figura 13), que conlleva a la disminución del pH, el

aumento en el gasto de energía (ATP) y, finalmente, la muerte celular del

patógeno. (Castillejos, 2005).

55

Figura 11. Esquema sugerido de acción sugerido para el carvacrol sobre la

membrana citoplasmática (Castillejos, 2005)

El aceite esencial que se obtiene del tomillo esta compuesto por 60 componentes

(Solomakos et al., 2007) de los cuales 32 fueron identificados por Bounatirou, y

col. 2007. Los componentes mayoritarios y a los cuales se les atribuye la

capacidad antibacteriana son el timol y el carvacrol y se da alguna responsabilidad

minoritaria a los componente minoritarios como lo son el p-cimeno, -terpineno y

-caryphyleno los cuales pueden actuar de manera sinérgica con el timol y el

carvacrol aumentando su capacidad antimicrobiana (Bounatirou et al., 2007;

Solomakos et al., 2007). Muchos autores discrepan sobre cual es el componente

mayoritario del tomillo (timol ó carvacrol) y dan diferentes porcentajes de

presencia de cada uno. Burt, 2004, en su revisión da que el timol esta entre un 10

a un 64%, el carvacrol está entre un 2 a 11%, el -terpineno entre un 2 a 31% y

que el p-cimeno esta entre un 10 a 56%, por otro lado Bounatirou, y col. 2007,

comentan que el p-cimeno está en mayores cantidades cuando el carvacrol está en

menores cantidades y esto se presenta cuando la parte de la planta que se usa para

la extracción del aceite esencial es muy joven, y aseveran que este aceite es el

precursor del carvacrol.

El timol (figura 14) y el carvacrol (figura 15), son compuestos fenólicos que son

similares estructuralmente difiriendo en la posición del grupo hidroxilo. Como ya

56

se dijo en el apartado anterior, los compuestos con estructura fenólica poseen una

mayor actividad antimicrobiana que los que no la poseen y la presencia y

localización del grupo hidroxilo es un factor importante en esta actividad,

Algunos investigadores, observaron que el carvacrol y el timol actuaban de forma

diferente frente a microorganismos Gram positivos y negativos, también en otros

estudios no se observó la importancia de la posición del grupo hidroxilo, y la

capacidad antimicrobiana del timol y carvacrol fue similar (Castillejos, 2005).

Figura 12. Timol

Figura 13. Carvacrol

El carvacrol y el timol aumentan la permeabilidad de la membrana celular

desintegrando la membrana externa de las bacterias Gram negativas, liberando los

lipolisacáridos (LPS) y aumentando la permeabilidad de la membrana

citoplasmática a ATP (Castillejos, 2005; Burt, 2004). Las mediciones de ATP

57

interno y externo revelaron que el ATP celular interno disminuía mientras que no

había un aumento proporcional en el exterior celular, de acuerdo a esto se

presume que la tasa de síntesis de ATP disminuyo o que la tasa de hidrólisis de

ATP incrementó. En un estudio, se evidenció que las toxinas diarreicas de

B.cereus se vieron inhibidas por la presencia de carvacrol tanto en medio de

cultivo como en sopa y esto puede deberse a que la excreción de la toxina es un

proceso activo, y de acuerdo a las dos presunciones anteriores no hay suficiente

ATP o fuerza protonmotriz (FPM) para exportarla fuera de la célula.

Alternativamente el crecimiento específico da a teorizar que la célula usa la

energía (ATP) para mantener las funciones vitales para sostener su viabilidad,

dejando a un lado la producción de toxinas (Burt, 2004).

El carvacrol interactúa con la membrana uniéndose a la bicapa de fosfolípidos,

provocando la desestabilización de la misma, aumentando su fluidez e

incrementando la permeabilidad pasiva. También, se ha observado el paso de

metabolitos celulares a través de la membrana celular. El potencial de membrana

también disminuye, debilitando la FPM y el gradiente de pH a través de la

membrana (Catillejos, 2005). Se concluye por tanto que el carvacrol crea canales

a través de la membrana empujando las cadenas de ácidos grasos de los

fosfolípidos, permitiendo que los iones abandonen el citoplasma (Burt, 2004).

Por otro lado, el timol se une a las proteínas de membrana de manera hidrofóbica

y por puentes de hidrogeno, lo que cambia las características de la permeabilidad

de la membrana. Estudios demostraron, que el timol tiene un efecto más

inhibitorio en un pH de 5.5 que en uno de 6.5. Al estar en un pH acido la molécula

de timol se vuelve más indisociable y por tanto mas hidrofóbica, y por tanto se

puede unir mejor a las aéreas hidrofóbicas de las proteínas disolviéndose mejor en

la fase lípida (Burt, 2004) lo que puede apoyar la confirmación de la salida de

iones intracelulares de K+

(Castillejos, 2005) por el cambio de la permeabilidad de

la membrana.

58

2.5 Modelo y distribución Weibull

El método convencional para calcular la eficiencia de la inactivación térmica de

los microorganismos en seguridad alimentaria, se basa en el método clásico de los

valores D y z, desarrollado por Bigelow, Ball y Stumbo (Stumbo,1973), el cual se

basa en la hipótesis de que las curvas de supervivencia microbianas y de esporas

bacterianas siguen una cinética de primer orden, apoyándose en el postulado de la

teoría mecanística en la cual la muerte celular es causada por la inactivación de

enzimas vitales ó de complejos enzimáticos.

En consecuencia, el valor D es estimado a partir de la relación lineal que existe

entre el logaritmo de la reducción decimal del número de microorganismos

supervivientes y el tiempo del tratamiento a una temperatura dada. En muchos

casos, en las curvas de supervivencia obtenidas a partir de tratamientos térmicos

no se observa una relación lineal, y por tanto no obedece una cinética de primer

orden, siendo normalmente observado los fenómenos de hombros (concavidades

hacia abajo) y colas (concavidades hacia arriba).

Se han desarrollado y propuesto gran variedad de modelos para la descripción de

las curvas de supervivencia no lineales, algunos de tendencia mecanística o

pseudo-mecanistica o simplemente empíricos. La teoría mecanística postula que

todos los microorganismos de una misma población tienen la misma probabilidad

y por tanto existe una homogeneidad en la población. En contraposición a esta

teoría, está la teoría probabilística, la cual asume que ―en una población, aunque

esta sea pura, existe una variación biológica, en otras palabras, una

heterogeneidad entre las células microbianas‖ (van Boekel, 2002) por tanto, la

muerte celular por la inactivación térmica no está gobernada por modelos

cinéticos de primer orden, hallándose más relacionada a una distribución

exponencial.

Existen gran variedad de modelos para sustentar esta teoría; entre estos el modelo

Weibull es el que gana en popularidad debido a su simplicidad y flexibilidad. Su

59

uso se debe a la aplicación del principio de la parsimonia, el cual postula: que para

un problema existen dos ó más respuestas y entonces la más simple será la

correcta, argumentándose lo anterior en la teoría de la navaja de Ockham la cual

se fundamenta en dos premisas muy simples: ―en igualdad de condiciones la

solución más sencilla es probablemente la correcta” y ―No ha de presumirse la

existencia de más cosas que las absolutamente necesarias”, indicado lo anterior

las explicaciones nunca deben multiplicar las causas sin necesidad. Lo anterior en

pocas palabras indica que el modelo presenta mayor flexibilidad, robustez y

simpleza entre los demás modelos (Mafart et al., 2002; van Boekel, 2002).

El modelo proviene de ingeniería donde se usa para describir el tiempo de fallo en

sistemas mecánicos y electrónicos y es igualmente útil para el análisis de datos de

supervivencia en microbiología, como por ejemplo, el tiempo de muerte luego de

la aplicación de un estrés.

La forma acumulativa de la distribución de Weibull para el análisis de curvas de

supervivencia no lineales (Eq.1) fue empleada (Ruiz et al., 2002):

𝐿𝑛 𝑁

𝑁𝑜 = −

𝑡

𝛼 𝛽

(1)

La cual fue modificada por Mafart et al., 2002 (Eq.2) y esta última es la que se

aplicará en la investigación para la modelización:

𝐿𝑜𝑔 𝑁

𝑁𝑜 = −

𝑡

𝛿 𝑝

(2)

Donde No es el número inicial de microorganismos (CFU/mL), N el número de

supervivientes luego de un tiempo de exposición en un tratamiento térmico t

(CFU/mL), t tiempo del tratamiento (min), δ tiempo de la primera reducción

decimal o factor de escala, p factor de forma (Mafart et al., 2002).

La distribución de Weibull puede ser:

60

a. Cóncava hacia arriba si p<1 (Fig.16B), lo que indicaría que las células

supervivientes tienen menos probabilidad de morir, indicando que estas últimas

son las más resistentes ó tal vez se adaptan al tratamiento.

b. Cóncava hacia abajo si p>1 (Fig.16A), que indicaría que las células supervivientes

se volverían mas termosensibles, en otras palabras; el daño acumulado provocado

haría más difícil que las células sobrevivan.

c. Y seguiría una distribución exponencial si p=1 (Fig.16C), lo que indica que la

probabilidad de muerte de las células no depende del tiempo, o en otras palabras,

cada célula es igualmente susceptible no importando cuanto dure el tratamiento.

La hipótesis implícita es que no existe variación biológica, por lo que se ajustaría

a una cinética de primer orden clásica (valores D y z). (Mafart et al., 2002; Van

Boekel, 2002; Chen and Hoover, 2004).

61

Figura 14. Ejemplo Modificado de concavidades (A) Concavidad hacia abajo

p>1, (B) Concavidad hacia arriba p<1 (C)Distribucion exponencial p=1. (Van

Boekel, 2002).

62

2.6 Factor de exactitud (Af)

La microbiología predictiva (M.P.) comprende el estudio de la respuesta de

crecimiento o de inhibición de microorganismos patógenos o alteradores

presentes en alimentos en función de factores que la afecten (ºT, pH, aw, etc.), y a

partir de estos datos predecir lo que sucederá durante el almacenamiento,

procesado, etc.

La M.P. es una tecnología de vanguardia para el aseguramiento de la inocuidad

alimentaria, la optimización de procesos y recursos, y mejoramiento de sistemas

de gestión de la calidad; permite evaluar objetivamente y cuantitativamente el

efecto de las operaciones de procesamiento, distribución y almacenamiento en la

calidad microbiológica de los alimentos, usando modelos matemáticos y técnicas

computacionales.

La M.P. combina la matemática, la estadística, los sistemas de información y la

tecnología. Esto conduce al desarrollo de modelos, los cuales reducen el tiempo

de experimentación, los costos, el recurso humano y el material.

En la microbiología predictiva, es necesario que los modelos y las predicciones

realizadas sean lo más seguras posibles, y para esto es necesario tener un índice o

un valor que evalue los modelos indicando si el modelo es seguro y no tiende a

fallos o por el contrario es un modelo inseguro y con tendencia a fallar. Para esto

Ross, 1996 sugirió el Factor de exactitud (Af) (Eq.3) como índice de evaluación

de los modelos:

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑎𝑐𝑡𝑖𝑡𝑢𝑑 𝐴𝑓 = 10 Σ log (𝐺𝑇𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑐 𝑕𝑜 𝐺𝑇𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 )/𝑛) (3)

La ecuación 3 esta generada para modelos de crecimiento, y para esta

investigación se usara el modelo de exactitud modificado por Ruiz et al., 2002

(Eq.4):

63

𝐴𝑓 = 10 Σ 𝐿𝑜𝑔 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜 −𝐿𝑜𝑔 𝑝𝑟𝑒𝑑𝑖𝑐 𝑕𝑜𝑠

𝑛 (4)

La ecuación 4 es más útil para la aplicación a modelos de inactivación térmica y

proporciona una medida de la media de precisión de las estimaciones, si el Af>1

existe una correlación pero con cierta desviación, es decir, existe una buena

correlación entre los valores predichos y los experimentales pero no es exacta, si

Af=1 existe una correlación exacta, denotando que los valores experimentales y

los de la predicción encajan perfectamente, en ambos casos los modelos son

seguros y la probabilidad de fallo es mínima; no obstante si Af<1 indica que no

existe correlación entre los valores predichos y los experimentales, y el modelo

puede ser inseguro, con tendencia a fallos.

64

3. JUSTIFICACIÓN

La integración de los mercados gracias a la globalización, y la nueva tendencia del

consumo de alimentos listos para consumir (precocinados, refrigerados o

congelados) que demanden un tiempo mínimo para su preparación y cocción antes

de su consumo, han incrementado el riesgo de las ETAs.

Uno de los principales patógenos de interés en la industria alimentaria es Listeria

monocytogenes, causante de la listeriosis. La mayor incidencia de esta enfermedad

en humanos está asociada al consumo de alimentos contaminados con el

microorganismo debido a su presencia en gran cantidad de productos, gracias a su

capacidad de crecimiento y supervivencia a distintos tratamientos y en diversas

condiciones de almacenamiento.

En la actualidad, para la conservación de alimentos se utilizan tratamientos

térmicos, los cuales afectan su calidad organoléptica y conservantes químicos que

son potencialmente peligrosos para la salud humana. Por lo anterior, los

consumidores de esta nueva era, demandan alimentos mínimamente procesados y

tratados, que posean sus características organolépticas intactas en lo posible, y

sean seguros para su salud. Por tanto, las técnicas de conservación a usar para

satisfacer las demandas del consumidor no deben ser agresivas y los conservantes

aplicados deben ser naturales; con la capacidad de prolongar la vida útil de los

alimentos en las despensas por un tiempo igual o mayor que los conservantes

químicos, salvaguardando principalmente la salud del consumidor.

Los tratamientos térmicos han demostrado ser efectivos para el control de

microorganismos patógenos alimentarios, pero el empleo de un único tratamiento

no es suficiente para asegurar su eliminación, por ende la combinación de 2

tratamientos es precisa para garantizar la inocuidad del alimento. Separadamente,

la exigencia de alimentos mínimamente tratados y procesados por parte de los

consumidores, ha contemplado la necesidad de disminuir el tiempo y/o la

potencia de los tratamientos térmicos junto con la eliminación de los conservantes

químicos, para proporcionar alimentos naturales con la mayoría de sus

65

características organolépticas intactas, por lo que se ha hecho urgente la

innovación de nuevas técnicas de conservación.

Desde tiempos antiguos, se conocen y reconocen las propiedades antimicrobianas

de muchas especias y hierbas usadas en los alimentos. La aplicación de los

diversos componentes antimicrobianos naturales, que han sido usados en los

alimentos para su conservación y sazonamiento, son el blanco y el objetivo de

muchas investigaciones, para determinar el efecto de éstos, sobre los

microorganismos patógenos de interés industrial, y su efectividad como

conservantes alimentarios.

Por estos motivos, se ha estudiado el efecto de los tratamientos térmicos,

isotérmicos y no isotérmicos, por separado y en combinación con los aceites

esenciales de tomillo y clavo para el control de Listeria monocytogenes (in vitro),

determinando el mejor tratamiento o la mejor combinación de tratamientos para

su aplicación sobre un alimento (in vivo), determinando el efecto y dando un gran

avance para el uso de estas sustancias en la industria alimentaria.

66

4. OBJETIVOS

General

Evaluar y determinar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos,

de manera individual y en combinación con los aceites esenciales de tomillo y

clavo en la supervivencia de Listeria monocytogenes.

Específicos

Determinar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a

60ºC en la supervivencia de L.monocytogenes in vitro.

Evaluar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a 60ºC

en combinación con diferentes concentraciones de aceite esencial de tomillo en la

supervivencia de L.monocytogenes in vitro.

Evaluar el efecto de los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y a 60ºC

en combinación con diferentes concentraciones de aceite esencial de clavo en la s

supervivencia de L.monocytogenes in vitro.

Aplicar y evaluar las mejores combinaciones de tratamientos térmicos y aceites

esenciales de tomillo ó clavo en la supervivencia de Listeria monocytogenes en un

alimento.

67

5. HIPOTESIS

La supervivencia de Listeria monocytogenes no se verá afectada

significativamente por los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos, ni por la

combinación de estos con los aceites esenciales de tomillo y clavo.

5.1 Predicciones

H0= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC no afectarán de

manera significativa la supervivencia de L. monocytogenes.

Ha= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55ºC y 60ºC afectarán de

manera significativa la supervivencia de L. monocytogenes.

H0= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación

con los aceites esenciales de tomillo y clavo, no afectarán de manera significativa

la supervivencia de Listeria monocytogenes.

Ha= Los tratamientos isotérmicos y no isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación

con los aceites esenciales de tomillo y clavo, afectarán de manera significativa la

supervivencia de Listeria monocytogenes.

68

6. MATERIALES Y METODOS

6.1 Materiales

6.1.1 Microorganismo

Se utilizó la cepa de Listeria monocytogenes CETC 4032, procedente de la

Colección española de cultivos de tipo CECT (Valencia, España), la cual se activo

en caldo B.H.I y luego se realizo aislamiento en placas de agar Oxford, estas

placas se mantuvieron en refrigeración durante la experiencia, y se criopreservó el

microorganismo en tubos ependorf a -80ºC, garantizando su pureza.

6.1.2 Medios de cultivo

Los medios de cultivos utilizados pertenecen a la casa comercial Scharlau Chemie

S.A. (Barcelona, España)

Agua de peptona tamponada: peptona 10 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, fosfato

disodico 9 g/L, fosfato potásico 1.5 g/L.

Caldo infusión cerebro corazón (B.H.I.): extracto de cerebro 12.5 g/L, extracto

de corazón 5 g/L, peptona 10 g/L, dextrosa 2 g/L, cloruro de sodio 5 g/L, fosfato

di-sodio 2.5 g/L.

Agar infusión cerebro corazón (B.H.I.A.): extracto de cerebro 12.5 g/L,

extracto de corazón 5 g/L, peptona de proteasa 10 g/L, dextrosa 2 g/L, cloruro de

sodio 5 g/L, fosfato di-sodio 2.5 g/L, agar 15 g/L.

B.H.I.A. 5% NaCl: agar B.H.I.A suplementado con cloruro de sodio en

porcentaje m/v (el cloruro de sodio que se usara es de la casa comercial Panreac

química S.A.).

69

6.1.3 Aceites esenciales

Los aceites esenciales de tomillo y clavo usados en esta investigación provinieron

de la casa comercial IBERCHEM y se conservaron a temperatura de refrigeración

(2-5ºC aprox.) para evitar su evaporización.

6.1.4 Equipos

Termorresistómetro Mastia (patente española 200302529)

Centrifugadora: Heraeus labo fuge 400R. (Kendro laboratory products)

Incubadora

Vortex

Autoclave

Baño termostatado.

Nevera

Dataloger

6.1.5 Materiales

Cajas de petri 14 x 90 mm

Frascos tapa rosca de 500 mL

Frascos tapa rosca de 100 mL

Tubos de 16 x 150 mm

Tubos 12 x 75 mm

Asa.

Balanza

Microscopio

Pipeta automática de 10 a 100L y de 100 a 1000L

Puntas para pipetas automáticas

Gradillas

Mechero

70

Jeringa de 5 mL

Aguja hipodérmica para jeringa de 5 mL

Dispensador

Tubos falcon

6.2 Metodología

6.2.1 Activación del microorganismo

En condiciones de esterilidad, se tomó una colonia del microorganismo del medio

Oxford refrigerado, procedimiento descrito en el apartado 6.1, y se inoculó en 50

mL de medio de cultivo BHI estéril, y posteriormente se incubó a 37ºC por 24h.

Luego del cultivo anterior, en condiciones de esterilidad, se traspasaron 100L a

50mL de medio líquido BHI estéril y se incubó a 37ºC por 24h. De este último

cultivo se realizaron hasta tres pases a nuevos medio de cultivo, y luego fue

necesario realizar una nueva activación.

6.2.2 Preparación de la suspensión para el termorresistómetro

En condiciones de esterilidad se tomaron los 50 mL del cultivo activado, se

transvasaron a tubos falcón (25 mL de cultivo por tubo), y se centrifugaron a 3500

rpm durante 20 minutos a 5ºC. Luego en condiciones de esterilidad se descartó el

sobrenadante y se adicionó 1 mL (por tubo) de agua peptonada estéril, y se agitó

en vortex hasta que la suspensión estuvo homogénea. Luego se recuperaron estas

suspensiones (2 mL de suspensión final) en una jeringa estéril de 5mL con aguja

hipodérmica estéril.

6.2.2 Recuento inicial

De la suspensión del termorresistómetro, en condiciones de esterilidad, se

tomaron 100L y se pasaron a un tubo con 9 mL de agua peptonada estéril,

teniendo como resultado una dilución de 10-2

.

71

Luego se realizaron diluciones seriadas, en agua peptonada estéril, hasta la

dilución 10-9

, y se sembraron en profundidad las diluciones 10-5

, 10

-6, 10

-8, 10

-9

en medio sólido BHIA y se incubo durante 24h a 37ºC. Pasado este tiempo se

realizó el recuento de las placas para determinar la concentración del inoculo.

6.2.3 Realización de los tratamientos Isotérmicos a 55 y 60ºC

Se adicionaron 350 mL de medio de cultivo líquido BHI al vaso del

termorresistómetro, y se esterilizó en el mismo a 135ºC durante 30 segundos, con

agitación de 10 rpm (que se mantuvo constante), seguido se programó el

termorresistómetro para que automáticamente descendiera y estabilizará la

temperatura a 55 ó 60ºC durante todo el experimento. Cuando la temperatura

estuvo estabilizada se adicionaron los 2mL de la suspensión preparada para el

termorresistómetro y las muestras se tomaron en los tiempos que indica la tabla 1.

Tabla 1. Tiempo de muestreo en los tratamientos isotérmicos por temperatura

ºT: 55ºC

t(min) muestreo 0 5 10 15 20 25 30

ºT: 60C

t(min) muestreo 0 0.5 1 1.5 2 3 5

En condiciones de esterilidad se tomaron 4mL de muestra en tubos de ensayo

estériles, e inmediatamente se pusieron en hielo para cortar el efecto de la

temperatura sobre el microorganismo.

Las muestras se sembraron en medio sólido BHIA para la recuperación de las

células supervivientes y lesionadas, y en medio BHIA+NaCl 5%, medio selectivo

para la recuperación de las células supervivientes. Las diluciones que se

sembraron de las muestras con tratamiento isotérmico a 55ºC, en medio BHIA y

BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 2.

72

Tabla 2. Diluciones a realizar y sembrar para el tratamiento isotérmico a 55ºC

(en base 10)

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 -5, -6, -7

5 -5, -6, -7

10 -4, -5, -6, -7

15 -4, -5, -6, -7

20 -4, -5, -6, -7

25 -2, -4, -6

30 -2, -4, -6

Las diluciones que se sembraron de las muestras con tratamiento isotérmico a

60ºC, en medio BHIA y BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 3.

Tabla 3. Diluciones a realizar y sembrar para el tratamiento isotérmico a 60ºC (en

base 10)

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 -5, -6, -7

0.5 -3, -4, -6

1 -2, -3, -4, -5

1.5 -2, -3, -4, -5

2 -1, -2

3 0, -1, -2

5 0, -1

Las placas de medio BHIA fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC, y las de

BHIA+NaCl 5% durante 48h a 37ºC. Los tiempos y las diluciones se han

especificado de acuerdo a trabajos realizados por el grupo investigador de

microbiología de alimentos de la UPCT. Cada uno de los experimento se realizó

por triplicado.

6.2.4 Realización de los tratamientos no isotérmicos a 55 y 60ºC

Se adicionaron 350 mL de medio de cultivo líquido BHI al vaso del

termorresistómetro, y se esterilizó en el mismo a 135ºC durante 30 segundos, con

73

agitación de 10 rpm (que se mantuvo constante), seguido se programó el

termorresistómetro para que automáticamente descendiera y estabilizará la

temperatura a 24ºC, cuando la temperatura estuvo estable se programo el

termorresistómetro para que realizará el perfil de temperaturas deseado. Cuando la

programación estuvo lista, se adicionaron los 2mL de la suspensión para el

termorresistómetro, y se inició el programa. Cada tratamiento tuvo 2 rampas de

calentamiento (preestablecidas de acuerdo a investigaciones previas realizadas por

el grupo de investigación de microbiología de alimentos de la UPCT) y la

temperatura final se mantuvo durante un cierto periodo de tiempo. Con ayuda de

registrador Almemo 3290, se registró la temperatura del medio cada segundo

durante el tratamiento. Los valores de las rampas se aprecian en la tabla 4.

Tabla 4. Perfil de temperaturas para los tratamientos no isotérmicos. Rango de

temperaturas y velocidades por perfil.

N.I 55ºC N.I 60ºC

Rampa Rango ºT Velocidad (ºC/min) Rango ºT Velocidad (ºC/min)

1 24-44ºC 30 24-49ºC 30

2 44-55ºC 12.5 49-60ºC 12

En condiciones de esterilidad, se tomaron 4mL de muestra en tubos de ensayo

estériles, e inmediatamente tomadas se colocaron en hielo para cortar el efecto de

la temperatura sobre el microorganismo.

Las muestras se sembraron en medio sólido BHIA para la recuperación de las

células supervivientes y lesionadas, y en medio BHIA+NaCl 5%, medio selectivo

para la recuperación/identificación de las células dañadas. Los tiempos de

muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento no isotérmico a

55ºC, en medio BHIA y BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 5.

74

Tabla 5. Tratamiento no isotérmico a 55ºC, tiempo de muestro y diluciones a

sembrar (en base 10).

Tiempo (min)

muestra

Diluciones a sembrar

(10x) sin NaCl


(10x) con NaCl

0 -5, -6, -7 -5, -6, -7

1 -5, -6, -7 -5, -6, -7

2 -5, -6, -7 -5, -6, -7

3 -5, -6, -7 -5, -6, -7

13 -5, -6, -7 -2, -3, -4

23 -2, -4, -6 -2, -4, -6

33 -2, -4, -6 -2, -3, -4

43 -2, -3, -4 -2, -3, -4

53 0, -1, -2 0, -1, -2

63 0, -1, -2 0, -1, -2

Para el tratamiento no isotérmico a 60ºC, los tiempos de muestreo y las

diluciones que se sembraron en medio BHIA y BHIA+NaCl 5% se especifican en

la tabla 6.

Tabla 6.Tratamiento no isotérmico a 60ºC, tiempo de muestro y diluciones a

sembrar (en base 10).

Tiempo (min)

muestra


(10x) sin NaCl


(10x) con NaCl

0 -5, -6, -7 -5, -6, -7

1 -5, -6, -7 -5, -6, -7

2 -5, -6, -7 -2, -4, -6

3 -2, -4, -5 -2, -4, -5

4 0, -2, -4 0, -2, -4

5 0, -2, -4 0, -2, -4

6 0, -2, -4 0, -2, -4

7 0, -2, -4 0, -2, -4

8 0, -2, -4 0, -2, -4

Las placas de medio BHIA, fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC y las de

BHIA+NaCl 5% durante 48h a 37ºC. Los tiempos y las diluciones, se

especificaron de acuerdo a trabajos realizados por el grupo investigador de

microbiología de alimentos de la UPCT. Cada uno de los experimentos se realizó

por triplicado.

75

6.2.5 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con los aceites

esenciales de tomillo y clavo.

El procedimiento utilizado para esta prueba, fue el mismo que el descrito en el

apartado 6.3.3, adicionando los aceites esenciales a las concentraciones de 0.01%

y 0.05%, cada aceite esencial será evaluado por separado. Las concentraciones a

trabajar se han especificado de acuerdo a trabajos realizados por el grupo

investigador de microbiología de alimentos de la UPCT. Cada uno de los

experimento se realizara por triplicado.

Los tiempos de muestreo y las diluciones que se sembraron para el tratamiento

isotérmico a 55ºC con A.E. clavo al 0.01% y 0.05% en medio BHIA y

BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 7 y 8.

Tabla 7 Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo de

muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA.

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 0, -1, -3, -5

1 -1, -2, -3

2 0, -1, -2

3 0, -1, -2

4 0, -1, -2

Tabla 8. Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de clavo al 0.05%, tiempo de

muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl.

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 0, -1, -3, 5

3 0, -1, -3, 5

6 0, -1, -3, 5

9 0, -1, -2

12 0, -1, -2

15 0, -1, -2

76


isotérmico a 55ºC con A.E. tomillo al 0.01% y 0.05% en medio BHIA y


Tabla 9. Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de tomillo al 0.01%, tiempo

de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 0, -1, -3, -5

1 0, -1, -2

2 0, -1, -2

3 0, -1, -2

4 0, -1, -2

.

Tabla 10. Tratamiento no isotérmico a 55ºC con A.E. de tomillo al 0.01%, tiempo

de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl.

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 0, -1, -3, -5

3 0, -1, -3, -5

6 0, -1, -3, -5

9 0, -1, -2

12 0, -1, -2

15 0, -1, -2


isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01% y 0.05% en medio BHIA y


Tabla 11. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo

de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA.

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 -1, -2, -3

10 -1, -2, -3

15 0, -1, -3

30 0, -1, -2

60 0, -1, -2

90 0, -1, -2

77

Tabla 12. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de clavo al 0.01%, tiempo

de muestro y diluciones a sembrar (en base 10) en medio BHIA+NaCl.

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 0, -1, -3, -5

10 0, -1, -3, -5

15 0, -1, -3

30 0, -1, -2

60 0, -1, -2

90 0, -1, -2


isotérmico a 60ºC con A.E. tomillo 0.01% y 0.05% en medio BHIA y

BHIA+NaCl 5% se especifican en la tabla 13.

Tabla 13. Tratamiento no isotérmico a 60ºC con A.E. de tomillo 0.01% y 0.05%,

tiempo de muestro y diluciones a sembrar (en base 10).

t(min)

muestra

Diluciones a

sembrar (10x)

0 0, -1, -3, -5

10 0, -1, -3, -5

15 0, -1, -3

30 0, -1, -2

60 0, -1, -2

90 0, -1, -2

6.2.6 Tratamientos sobre el alimento

Se evaluaron 3 diferentes tipos de sopa comercial a las cuales se les determino pH

y sólidos solubles, eligiendo la crema que ofreciera el pH más cercano a la

neutralidad para ser utilizada para aplicar los tratamientos. Al alimento

seleccionado se le determino la carga microbiana inicial realizando siembra de las

diluciones 100,10

-1, 10

-2 y 10

-3. El procedimiento utilizado para la realización de

los tratamientos fue el mismo que el descrito en la sección 6.3.5.

Para el tratamiento con los antimicrobianos se utilizo el doble de la concentración

efectiva en los tratamientos in vitro de acuerdo la bibliografía consultada y a

78

trabajos realizados por el grupo investigador de microbiología de alimentos de la

UPCT. Cada tratamiento se realizo por triplicado.

6.3 Análisis Estadístico de los datos

A los datos obtenidos se les realizó un Análisis de Varianza (ANOVA) utilizando

el software estadístico Statgraphics para establecer las diferencias significativas

entre las diferentes combinaciones probadas y sus replicas.

Las curvas obtenidas en los diferentes tratamientos (temperatura, aceites

esenciales y su combinación), se generaron graficando el Log de los

supervivientes contra el tiempo de tratamiento. Los parámetros obtenidos fueron

evaluados a partir de la distribución de Weibull.

Si la inactivación del microorganismo por la exposición a los tratamientos sigue

una distribución de Weibull, la función de supervivientes podría ser:

𝑆 𝑡 = 𝑒− 𝑡𝑎 𝑛

Donde: S(t) = fracción de supervivientes

t = tiempo

a = parámetro escala

n = parámetro de forma (describe la forma de la curva).

7 Resultados y Discusión

Los resultados obtenidos que se presentarán y discutirán a continuación se les

realizo un análisis de varianza (ANOVA) utilizando el software estadístico

Statgraphics. Obteniéndose como resultado que no existieron diferencias

estadísticamente significativas (p>0,05) entre las diferentes combinaciones

probadas y sus replicas.

79

7.1 Tratamientos térmicos

Se realizaron tratamientos isotérmicos y no isotérmicos, para observar el

comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 utilizando las graficas de

supervivencia, con el propósito de determinar el tratamiento que presentaba las

mejores condiciones y así evaluar el efecto producido sobre el patógeno al

combinarlo con aceites esenciales de clavo y tomillo.

7.1.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC

Luego de aplicar el tratamiento isotérmico a 55ºC por un tiempo de 30 minutos, se

obtuvo una disminución de un ciclo logarítmico (4,43x107 UFC/mL) en el medio

BHIA con respecto a la población inicial (8,93x108 UFC/mL) y de 4 ciclos

logarítmicos (8x104 UFC/mL) en el medio BHIA+NaCl con respecto a la

población inicial (6,8x108 UFC/mL) (figura 15). En la tabla 14, se muestran los

valores D, junto con los intervalos de confianza (IC), R2 y coeficiente de

correlación (r0).

Figura 15. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones

isotérmicas (55ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40

Lo

g u

fc/m

l

Tiempo (min)

55º ISO

NaCl 55ºC

80

Tabla 14. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Indice de correlación

(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento isotérmico a

55ºC.

D(a) ICs ICi R

2

Sin NaCl 23,19 48,83 2,02 0,99

NaCl 7,30 16,33 1,17 0,97

(a) Media de tres réplicas

Como puede observase en el medio de recuperación no selectivo, el cual permite

el crecimiento de todas las células (tanto lesionadas como no lesionadas), se

obtuvo un D55=23,19, indicando que la población de Listeria monocytogenes

CETC 4032 disminuye un ciclo logarítmico tras 23 minutos de tratamiento en

promedio, y permite deducir que el microorganismo posee una alta

termorresistencia a estas condiciones

En comparación, en el medio de recuperación selectivo, que solo permite el

crecimiento de células no lesionadas letalmente por el tratamiento térmico, se

obtuvo un D55NaCl=7,30, indicando que la exposición del microorganismo a un

factor adicional reduce en más de 10 veces el tiempo necesario para disminuir la

población de L.monocytogenes CETC 4032 en 1 ciclo logarítmico. En la figura

15, se puede observar que casi la mitad de la población sufre daños sub-letales por

el tratamiento térmico aplicado, corroborándose así uno de los principios de la

teoría probabilística, el cual postula que “en un cultivo puro existe una

heterogeneidad entre las células” (Van Boekel, 2002). Los resultados anteriores,

se asemejan a los obtenidos por Miller et al., 2006, en su investigación, en la cual

determino que el D55 para Listeria innocua en un medio selectivo es de 10,66

minutos con un R2 de 0,97.

Los resultados anteriores, conllevan a deducir que la población de

L.monocytogenes CETC 4032 después de aplicarle un proceso isotérmico a 55ºC

81

durante 30 minutos se reduce en: i) un 50% si el microorganismo posteriormente

del tratamiento se recupera en un medio que contenga un elemento de inhibición

adicional y ii) en un 10% si el medio carece de este componente. Esto sugiere,

que el daño causado a la población es a nivel de factores vitales de crecimiento y

de recuperación, pudiendo ser estos enzimas o proteínas.

Cuando se aplico el tratamiento isotérmico a 60ºC por un tiempo de 5 minutos, se

obtuvo una disminución de 6 ciclos logarítmicos (1,92x103 UFC/mL) con

respecto a la población inicial (1,25x109 UFC/mL) en el medio BHIA y de 7

ciclos logarítmicos (4,83x101 UFC/mL) con respecto a la población inicial

(6,32x108 UFC/mL) en el medio BHIA+NaCl. Cabe resaltar, que la población

inicial en el medio de recuperación selectivo se encontraba 1 ciclo logarítmico

por debajo con respecto a la población inoculada (4,8x109 UFC/mL) y a la del

medio de recuperación no selectivo, como se observa en la figura 16, evento que

no sucedió en el tratamiento a 55ºC. En la tabla 15, se especifican los valores D

junto con los IC, R2 y r0.


isotérmicas (60ºC) en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6

Lo

g U

FC

/mL

Tiempo (min)

60ºC NaCl

60ºC

82


(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento isotérmico a

60ºC.

D(a) ICs ICi R2

BHIA 0,87 2,02 0,16 0,96

BHIA+NaCl 0,78 2,39 0,26 0,83

(a) Media de tres replicas

Como puede notarse, el valor D60 en el medio de recuperación no selectivo fue de

0,877, lo que sugiere que es necesario un tiempo de 0,88 minutos, para disminuir

la población de L.monocytogenes CETC 4032 en 1 ciclo logarítmico, y que el

microorganismo bajo esta condición no presenta una alta resistencia al

tratamiento.

Sin embargo, en el medio de recuperación selectivo se obtuvo un D60NaCl= 0,783,

indicando que son necesarios 0,78 minutos para disminuir la población 1 ciclo

logarítmico, pero como se comento anteriormente, la población inicial fue 1

unidad menos en comparación con la del cultivo inoculado y con la población

inicial del medio no selectivo. Este resultado, apunta a que un 10% de la

población sufrió un daño letal con el simple hecho de ponerla en contacto con el

medio a la temperatura de tratamiento, sugiriendo, que el daño producido pudo

haber sido sobre componentes celulares, los cuales son importantes para la

recuperación y crecimiento de L.monocytogenes CETC 4032. Estos valores, no se

asemejan a los obtenidos por Miller et al., 2006, en su investigación con Listeria

innocua donde obtuvo un D60 de 2,73 en un medio no selectivo y de 1,08 en un

medio selectivo, apuntando esto a que posiblemente L.monocytogenes es menos

termorresistente que L.innocua en un tratamiento isotérmico a 60ºC.

Estos resultados, señalan que el daño recibido por L.monocytogenes CETC 4032 a

causa de un tratamiento isotérmico a 60ºC es letal, logrando una termodestrucción

de más del 50% de la población, tanto en el medio selectivo como en el no

selectivo tras 5 minutos de tratamiento. Si el medio en el cual el microorganismo

83

se encuentra, no contiene un factor de inhibición adicional menos del 50% de la

población podrá recuperarse, pero si el medio presenta un factor de inhibición

adicional solamente un 10% de la población sería capaz de recuperarse.

A partir de los resultados obtenidos se calcularon los valores z que se presentan en

la tabla 16.

Tabla 16. Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos.

D55 D60 Z

BHIA 23,19 0,88 3,51

BHIA NaCl 7,30 0,78 5,16

De acuerdo, con los resultados anteriores, se puede deducir que aplicar un

tratamiento isotérmico a 55ºC no es efectivo para la termodestrucción de

L.monocytogenes CETC 4032, pues el D obtenido es demasiado alto y sería

necesario un mayor tiempo para una disminución significativa de la población,

opción que no es muy favorable, si el tratamiento se quisiera evaluar sobre un

alimento. Pero si el alimento tratado, contiene otros factores de inhibición de

crecimiento como: pH, aw, atmosfera modificada, entre otros, puede que el

tratamiento sea más efectivo, produciendo una reducción significativa en el

tiempo de tratamiento, siendo muy interesante su evaluación.

En el caso de un tratamiento a 60ºC, los resultados obtenidos son destacables,

pues en un tiempo relativamente corto se reduce la población en casi el 50% y en

presencia de un factor de inhibición adicional se destruye cerca del 90%, con una

disminución de casi un 10% al contacto del microorganismo con el medio, siendo

el tratamiento propicio para ser evaluado en un alimento y observar el

comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032, incluso también podría

evaluarse si el alimento ó alguno de sus componentes influyesen en un aumento o

disminución del efecto del tratamiento sobre el microorganismo.

84

7.1.2 Tratamientos no isotérmicos (N.I) a 55 y 60ºC

El estudio del comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 bajo condiciones

de inactivación no isotérmicas (55ºC y 60ºC), asemejan las condiciones reales

durante un proceso de pasteurización, tratamiento que es empleado en la industria

alimentaria, lo cual concibe un mayor interés en su evaluación e investigación.

Los tratamientos se realizaron conforme a los perfiles de aumento de temperatura

establecidos en la metodología (ver tabla 4) presumiendo una disminución del

valor D y en consecuencia un incremento en la reducción de la población,

partiendo de la suposición, de que un tratamiento no isotérmico es más letal que

un tratamiento isotérmico. Al efectuar el tratamiento a 55ºC, exclusivamente con

el aumento de temperatura establecido en la metodología, no se observó una

reducción importante en la población de L.monocytogenes CETC 4032, durante el

tiempo que requirió el termorresistometro para lograr que el medio de evaluación

alcanzase la temperatura final de tratamiento, el cual fue de 3 minutos

aproximadamente. Resultados similares, se obtuvieron en el tratamiento a 60ºC.

Al ver que los resultados obtenidos eran contrarios a los esperados se adicionó un

perfil isotérmico, el cual tenía como temperatura establecida la temperatura final

de cada tratamiento, de acuerdo con lo propuesto por Conesa et al., 2003 en su

investigación.

En la figura 17, se presenta la curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC

4032 elaborada a partir de los resultados obtenidos en el tratamiento a 55ºC en

ambos medios:

85

Figura 17. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no

isotérmicas (N.I) a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.

Si se amplía lo sucedido durante el periodo no isotérmico (0-3 min) del

tratamiento se observa lo siguiente (fig. 18):

Figura 18. Comportamiento de la población de L.monocytogenes CETC 4032

durante el perfil N.I a 55ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.

0,000

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

8,000

9,000

0 10 20 30 40 50 60 70

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

N.I 55

N.I 55 NaCl

7,000

7,200

7,400

7,600

7,800

8,000

8,200

8,400

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

55ºC

55ºC NaCl

86

Estos resultados apuntan a que durante el periodo del aumento gradual de

temperatura, la población del microorganismo no disminuye, lo cual ya ha sido

comentado, dándose la disminución durante el perfil isotérmico (60 minutos).

En la tabla 17, se muestran los valores D, IC, r0 y R2 calculados para este

tratamiento. No obstante, se podría sugerir que estos resultados pertenecen más a

un tratamiento isotérmico que a uno no isotérmico y por tanto los valores D

calculados son fiables, debido a la disminución exponencial de la población.

Tabla 17. Valores de intervalos de confianza (IC 95%), D, Índice de correlación

(ro) y R2 para Listeria monocytogenes CETC 4032 en un tratamiento no

isotérmico a 55ºC.

D ICs ICi R2

DNI55 13,16 28,92 1,86 0,96

DNI55NaCl 10,52 23,97 1,87 0,93

Si se detallara el comportamiento del microorganismo durante los 63 minutos de

duración del tratamiento, podría decirse, que en el medio de recuperación no

selectivo durante los 3 primeros minutos la población se mantuvo en el mismo

nivel, a los 10 minutos siguientes la población disminuyo 2 ciclos logarítmicos

(3,67x106 UFC/mL) y al minuto 63 la población había disminuido 5 ciclos

logarítmicos (3,63x103 UFC/mL), todo lo anterior con respecto a la población

inicial en el mismo medio (1,67x108 UFC/mL). Mientras, en el medio de

recuperación selectivo durante los 3 primeros minutos, la población disminuyo un

ciclo logarítmico (1,33x107 UFC/mL), a los 10 minutos siguientes, se observó una

disminución de 3 unidades logarítmicas, y al minuto 63, la población había

disminuido 6 ciclos logarítmicos (1,36x102 UFC/mL) con respecto a la población

inicial (1,47x108 UFC/mL) en el mismo medio.

De acuerdo con lo anterior, se podría inferir varios comportamientos de

L.monocytogenes CETC 4032 frente al tratamiento y la repercusión del mismo

sobre el microorganismo. En la grafica 17, se puede observar que la disminución

87

de la población luego de los 3 primeros minutos sucedió de manera exponencial,

pero desde el minuto 33 hasta el 43 la población de L.monocytogenes CETC 4032

generó una resistencia al tratamiento térmico de casi 10 minutos en ambos

medios. Lin, et al., 2003 en su investigación con L.monocytogenes encontró que

luego de aplicar un tratamiento térmico al microorganismo, este incremento su

tolerancia a otros factores de inhibición, como el NaCl, a modo de efecto

secundario, resultado que concuerda con lo observado en nuestra investigación.

Aunque el microorganismo incremento su resistencia al tratamiento durante un

corto periodo de tiempo, se puede presumir que durante la fase de calentamiento,

el microorganismo experimento un daño letal, posiblemente al aumento rápido de

la temperatura, lo cual se vio reflejado en la disminución de la población y en la

reducción de casi 10 veces el valor D en comparación con el obtenido en el

tratamiento isotérmico.

En la figura 19, se presenta la curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC

4032 a partir de los resultados obtenidos en el tratamiento a 60ºC en ambos

medios. Se puede observar, que durante los primeros 2 minutos de tratamiento se

produce la aparición de hombros, apuntando esto a una acumulación de daños

letales por parte del microorganismo debido al efecto de la temperatura, lo cual

provocó una reducción en la población, confirmándose lo anterior en los tiempos

subsiguientes, donde se detalla una disminución exponencial de casi la mitad de la

población a los 4 minutos en el medio no selectivo y de casi un 90% al quinto

minuto en el medio selectivo; sin embargo, posteriormente se evidencia la

presencia de colas que de acuerdo con los resultados obtenidos por Mafart et al.,

2002; Aragao et al., 2007 y van Boekel, 2002, indica que la población

superviviente ha generado una resistencia tal al tratamiento que su eliminación es

complicada.

88

Figura 19. Supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en condiciones no

isotérmicas (N.I) a 60ºC en medio de recuperación BHIA y BHIA+NaCl.

La fase de calentamiento ocasionó daños letales en L.monocytogenes CETC 4032,

resultados similares se obtuvieron en el tratamiento a 55ºC, sin embargo, a

diferencia del anterior, este tratamiento no fue más eficaz que el isotérmico a la

misma temperatura. En la grafica de inactivación térmica del microorganismo

durante el tratamiento, se observó la presencia de los fenómenos de hombros y

colas, a consecuencia de esto, los valores D calculados empleando el método

tradicional propuesto por Bigelow, no son fiables, ver tabla 18. Fernández et al.,

1999, sugirieron que en este tipo de resultados el valor D debe ser determinado,

considerando la sección lineal de la curva, lo cual no se pudo llevar a cabo en este

caso, dado que tan solo se tomarían en cuenta 3 datos lo que no es un número de

datos estadísticamente representativo.

0,000

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

7,000

8,000

9,000

0 2 4 6 8 10

N.I 60ºC

N.I 60ºC NaCl

89



isotérmico a 60ºC.

D ICs ICi R2

DNI60 1,32 3,27 0,32 0,88

DNI60NaCl 0,92 2,15 0,18 0,92

A partir de los resultados obtenidos de los tratamientos se calcularon los valores Z

que se presentan en la tabla 19.

Tabla 19. Valores Z obtenidos para tratamientos no isotérmicos.

D55 D60 Z

N.I 13,16 1,32 5,00

N.I NaCl 10,52 0,92 4,72

El aumento de la termorresistencia por parte de L.monocytogenes CETC 4032

durante los tratamientos no isotérmicos, puede deberse a la activación de genes

que producen cambios en la composición de su membrana y/ó producción de

proteínas de shock térmico (HPS) (Hassani, et al., 2007; Millar, et al., 2006)

dándose esta activación durante la fase de calentamiento.

7.1.2.1 Predicciones

Con los resultados experimentales obtenidos a partir de los tratamientos no

isotérmicos, se aplicó el valor F para la predicción del comportamiento del

microorganismo. Las predicciones se realizan, con objeto de poder extrapolar los

tratamientos a medios ó alimentos con características parecidas ó similares al

medio utilizado, dando un avance en el conocimiento de la cinética de muerte de

L.monocytogenes CETC 4032 frente a los tratamientos aplicados.

90

De acuerdo a Periago et al., 2004, la eficacia de un proceso de preservación

térmica tiende a ser evaluado en términos de valores F. Los valores F, son

calculados utilizando la integración del efecto acumulativo del cambio de

temperatura durante el tratamiento del organismo blanco o espora incorporándolo

en la formula (Eq.5).

𝐹 = 10T−TR

Z (5)

Donde T es la temperatura del medio en un tiempo t del tratamiento, TR es la

temperatura de referencia (ºC) y Z es el incremento de temperatura necesario para

reducir en un ciclo logarítmico el valor D a la temperatura de referencia (TR) en

un tratamiento isotérmico.

El valor F puede definirse como el efecto equivalente de f minutos a TR

(asumiendo un calentamiento y enfriamiento instantáneo), sumando todos los

efectos letales producidos durante todas las combinaciones de tiempo y

temperaturas durante el tratamiento (Stumbo, 1973). Los tratamientos no

isotérmicos, se pueden considerar como tratamientos isotérmicos de muy corta

duración a temperaturas progresivamente altas (Conesa et al., 2003)

A partir de los datos obtenidos por el registrador de temperaturas, se realizó la

integración de las temperaturas (Valor F) utilizando la ecuación 5 en todos los

tiempos; con los resultados obtenidos se aplico la ecuación 6 (Eq.6) para la

obtención de la población superviviente teórica (tablas 20, 21, 22 y 23).

𝐿𝑜𝑔 𝑁 = 𝐿𝑜𝑔 𝑁0 – 𝐹

𝐷 (6)

Donde N es el número de células supervivientes, N0 es la población en el tiempo

0, F es la letalidad integrada y D es el tiempo de reducción decimal isotérmico a la

temperatura final del tratamiento no isotérmico evaluado.

91

Los resultados obtenidos a partir de la ecuación 6 se graficaron (figuras 20, 21, 22

y 23) junto con los resultados experimentales, para obtener una mejor

interpretación de las predicciones y su ajuste frente a los resultados reales,

sustentando esto último con el factor Af (tabla 20, 21, 22 y 23).

Tabla 20. Integración de la letalidad alcanzada en un calentamiento no isotérmico

hasta 55ºC con un perfil isotérmico a la misma temperatura y predicción de los

microorganismos supervivientes en función al cálculo de L.monocytogenes CETC

4032 en el medio BHIA.

Tiempo

(min)

Temperatura

(ºC)

Letalidad

Acumulada

(min a 55ºC)

Supervivientes

Log UFC/mL

(Predicción)

Supervivientes

Log UFC/mL

(experimentales)

0 24,96 4,87E-11 8,22 8,22

1 38,7 1,37E-06 8,22 8,02

2 46,93 0,002 8,22 8,10

3 57,01 0,85 8,18 8,23

13 55,81 18,17 7,44 6,56

23 55,9 35,33 6,70 5,90

33 55,85 52,58 5,95 4,93

43 55,84 69,90 5,20 4,74

53 55,71 87,30 4,45 4,27

63 55,88 104,70 3,70 3,56

Af 1,07

92

Figura 20. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un

calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA.




4032 en medio BHIA+NaCl.

Tiempo

(min)

Temperatura

(ºC)

Letalidad

Acumulada

(min a 55ºC)

Supervivientes

Log UFC/mL

(Predicción)

Supervivientes

Log UFC/mL

(experimentales)

0 24,96 2,48E-08 8,16 8,16

1 38,7 5,71E-05 8,16 8,07

2 46,93 0,02 8,16 7,47

3 57,01 0,72 8,06 7,12

13 55,81 15,20 6,08 5,44

23 55,9 29,66 4,10 4,60

33 55,85 44,17 2,11 3,56

43 55,84 58,71 0,12 3,46

53 55,71 73,31 -1,87 2,65

63 55,88 87,90 -3,86 2,13

Af 1,70

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 20 40 60 80

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

prediccion

experimentales

93

Figura 21. Curva de supervivencia L.monocytogenes CETC 4032 después de un

calentamiento no isotérmico a 55ºC en medio BHIA+NaCl.




4032 en medio BHIA.

Tiempo

(min)

Temperatura

(ºC)

Letalidad

Acumulada

(min a 60ºC)

Supervivient

es Log

UFC/mL

(Predicción)

Supervivientes

Log UFC/mL

(Experimentales)

0 25,08 2,00E-12 8,43 8,43

1 28,34 1,98E-10 8,43 8,23

2 50,3 0,0002 8,42 7,89

3 56,32 0,01 8,41 7,09

4 61,2 1,56 6,65 4,08

5 60,99 3,50 4,43 4,20

6 61,09 5,65 1,98 4,11

7 61,16 7,79 -0,46 3,57

8 61,11 9,95 -2,91 3,19

Af 1,30

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 20 40 60 80

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

prediccion NaCl

experimentales

94

Figura 22. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 después de

un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA.




4032 en medio BHIA+NaCl.

Tiempo

(min)

Temperatura

(ºC)

Letalidad

Acumulada

(min a 60ºC)

Supervivientes

Log UFC/mL

(Predicción)

Supervivientes

Log UFC/mL

(Experimentales)

0 25,08 2,81E-09 8,19 8,20

1 28,34 2,27E-07 8,19 7,77

2 50,3 0,002 8,19 7,58

3 56,32 0,045 8,14 5,57

4 61,2 1,33 6,49 3,26

5 60,99 2,90 4,48 1,90

6 61,09 4,59 2,33 1,26

7 61,16 6,27 0,18 1,38

8 61,11 7,96 -1,97 0,77

Af 1,105

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

Prediccion

Experimentales

95

Figura 23. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 después de

un calentamiento no isotérmico a 60ºC en medio BHIA+NaCl.

Los resultados obtenidos de las predicciones realizadas a partir de la integración

de la temperatura para 55ºC se ajustan mucho mejor que para 60ºC.

Para 55ºC, el modelo en el medio de recuperación no selectivo se ajusta de

manera ideal, notándose un comportamiento similar entre los datos

experimentales y los predichos, apoyando esta presunción con el valor Af, el cual

fue de 1,06 para este medio. Para el medio de recuperación selectivo, se obtuvo un

valor de 1,7 lo cual sugiere, que la predicción obtenida se ajusta, pero se desvía

de los resultados experimentales, debido a que se encuentra considerablemente

alejado de 1. Si se detalla la figura 21, se puede observar que los resultados

experimentales siguen la misma tendencia de los resultados predichos, pudiendo

ser que los valores negativos obtenidos en la predicción causen un aumento en el

Af. En general, el modelo para este tratamiento se ajusta muy bien. Por otro lado,

el microorganismo no presentó un comportamiento irregular, observándose una

misma tendencia de destrucción del microorganismo entre los datos reales y

predichos.

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 2 4 6 8 10

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

Prediccion

Experimentales

96

A 60ºC, el microorganismo presentó un comportamiento irregular como se

observa en la figura 19, lo cual ya se discutió en un apartado anterior, conllevando

esto a que los resultados experimentales no se ajusten de manera exacta, aunque

los valores Af calculados indiquen lo contrario debido a su cercanía a 1. Es

interesante observar, que para el medio de recuperación selectivo a 55ºC el Af sea

mayor que los obtenidos a 60ºC cuando a esta condición (ver figuras 22 y 23) las

curvas de supervivencia experimentales no se asemejan ni siguen un

comportamiento similar a los predichos, caso contrario en el medio de

recuperación selectivo a 55ºC (ver figura 21). Sería muy interesante el estudio de

este fenómeno, pero en esta investigación no se realizó debido a que no era el

objetivo.

El comportamiento irregular del microorganismo a 60ºC y las inconsistencias en

la modelización con el valor F, nos condujo a la búsqueda de otro modelo para la

predicción del comportamiento del microorganismo. Se optó por utilizar el

modelo de Bigelow para tratamientos no isotérmicos el cual se basa en la

aplicación de la siguiente ecuación (Eq.7):

𝐿𝑜𝑔 𝑁 = 𝐿𝑜𝑔𝑁0 −𝑧

𝐷𝑅×𝐿𝑛 10× 10

𝑇0−𝑇𝑅𝑍

×10

𝑇−𝑇0

𝑍

𝑎 (7)

Donde N es la población final predicha, No la población inicial experimental, T es

la temperatura del medio en un tiempo t del tratamiento, TR es la temperatura de

referencia (ºC), T0 la temperatura inicial del tratamiento (ºC), Z es el incremento

de temperatura necesario para reducir en un ciclo logarítmico el valor D calculado

en el tratamiento, DR el valor D a una temperatura de referencia y a la velocidad

de incremento de temperatura durante el tratamiento (ºC/min).

Al aplicar la ecuación 7, a los datos obtenidos a partir del tratamiento isotérmico a

60ºC se estableció que el modelo no se ajustaba (resultados no se muestran) como

se presumía. De acuerdo con lo propuesto por Cunha et al., 1997, para que este

modelo ajuste de manera correcta y la eficiencia este cerca al 100% debe cumplir

97

con los siguientes 2 factores: i) el aumento de temperatura debe estar entre

1ºC/min y 10ºC/min, y ii) la temperatura mínima de inicio debe estar oscilando los

40ºC.

Con los factores anteriormente nombrados aplicamos la formula a nuestros

resultados pero con una velocidad de aumento de 2ºC/minuto obteniendo un

modelo que se ajusta perfecto a los 2 medios a 60ºC como se observa en las

figuras 24 y 25. Por lo tanto si en esta experiencia se hubiese utilizado una

velocidad de calentamiento de 2ºC/min los resultados esperados podrían haber

sido diferentes.

Figura 24. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio

BHIA, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de Bigelow

para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de 3ºC/min.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7

log U

FC

/ m

l

Tiempo (min)

Gráfica de supervivencia Real

Calculada

98

Figura 25. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en medio

BHIA+NaCl, a partir de los resultados de esta investigación a con el modelo de

Bigelow para tratamientos no isotérmicos y un aumento de temperatura de

3ºC/min.

De acuerdo con los resultados obtenidos por la aplicación del modelo de Bigelow,

se determina que el comportamiento inusual del microorganismo es debido a las

velocidades de incremento de temperatura utilizadas en la investigación. Lo

anterior deja como resultados importantes que: i) dependiendo de las condiciones

de tratamiento, se pueden aplicar diferentes modelos buscando el que mejor se

ajuste a los resultados obtenidos, siendo un factor muy importante el incremento

de temperatura el cual debe ser constante y lineal (de acuerdo a los modelos

utilizados en la investigación) y no se debe superar los 10ºC/min, para una

eficacia óptima de los modelos, ii) El inicio de un tratamiento isotérmico a una

temperatura tan baja como 24ºC, puede ser un factor que ayude al aumento en la

resistencia a los tratamientos térmicos por parte del microorganismo y iii) la

exposición del microorganismo, a un aumento de temperatura rápido hasta 55ºC

(3min) y su posterior mantenimiento en condiciones isotérmicas, es más efectiva

en la termodestrucción de L.monocytogenes CETC 4032 que el tratamiento

isotérmico solo, obteniéndose una reducción de 4 unidades en el medio no

selectivo a los 30 minutos del tratamiento y de 5 en el medio selectivo.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7

log U

FC

/ m

l

Tiempo (min)

Gráfica de supervivencia Real

Calculada

99

Los tratamientos térmicos, en su mayoría, producen un efecto sub-letal en

L.monocytogenes CETC 4032, pues necesito de un mayor tiempo de incubación

para su crecimiento y recuperación, tanto en el medio BHIA y BHIA+NaCl,

observándose, tiempos de crecimiento de 48 horas y en algunos casos de 72 horas

para el medio selectivo, en comparación con el tiempo de crecimiento del

microorganismo, sin ningún tratamiento en medio BHIA el cual es de 24 horas.

Resultado semejante al obtenido por Miller et al.,2006 y por Jasson et al., 2007 en

sus investigaciones, los cuales obtuvieron que luego de los tratamientos térmicos

aplicados sobre L.monocytogenes y L.innocua los microorganismos presentaron

un incremento en el tiempo de crecimiento.

El BHIA+NaCl 0.5% (medio selectivo), solo permite el desarrollo de las células

que no fueron afectadas letalmente por el tratamiento, y pueden recuperarse sin

ser inhibidas por la concentración de sal. El NaCl causa alteraciones en la pared

celular a nivel de permeabilidad, incrementando el estrés osmótico y promoviendo

la plasmólisis celular. Algunos otros efectos de la sal para inhibir el crecimiento

de las células afectadas, son deshidratación, remoción de oxigeno y la toxicidad

de los iones sodio cuando se da la ionización del NaCl (Miller et al.,2006).

Del mismo modo, estos resultados corroboran la efectividad de los tratamientos

para el control de microorganismos patógenos en los alimentos y que la

combinación de estos con otros tratamientos ofrece mejores resultados asegurando

la inocuidad del alimento tratado.

7.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con los aceites esenciales.

Se realizaron las pruebas con los aceites esenciales en los tratamientos

isotérmicos, debido a que fueron los tratamientos en los que menor reducción de

población se presentó y el comportamiento del microorganismo en estos

permitiría observar de una manera más clara el efecto de los aceites esenciales.

100

7.2.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC en combinación con el aceite

esencial de tomillo.

Los resultados obtenidos en la investigación, no fueron los esperados de acuerdo

con la bibliografía consultada. Las investigaciones de Bounatirou et al., 2007,

Periago et al., 2001 A, Periago et al., 2001 B y Ettayebi et al., 2000, han

demostrado que los componentes mayoritarios del aceite esencial de tomillo

(carvacrol y timol) y el propio aceite esencial, no tienen un efecto listericida muy

amplio. En nuestra investigación, el A.E de tomillo a concentraciones de 0,01% y

de 0,05% en las 2 temperaturas evaluadas inhibió por completo el crecimiento de

L.monocytogenes CETC 4032 (los resultados no se indican). La inhibición total a

una concentración de 0,01%, la cual es considerablemente inferior a la empleada

en la bibliografía consultada, es un resultado muy importante e interesante, pues si

se observa la figura 15, pasados 30 minutos de tratamiento a 55ºC la disminución

de la población en el medio no selectivo fue de 1 unidad logarítmica, mientras que

con la adición del A.E de tomillo a una concentración de 0,01% en el tiempo 0 el

microorganismo no presento crecimiento, y aplicando el tratamiento por 15

minutos. Se realizaron réplicas acortando los tiempos de muestreo y del

tratamiento pero el resultado en todos los casos (no se presentan los resultados)

fue el mismo.

Periago et al., 2001 en su investigación con Bacillus cereus, obtuvo que los

componentes de aceites esenciales carvacrol y timol por separado a

concentraciones de 0,3 mmol/L, no presentaron efecto inhibitorio sobre las células

vegetativas de B.cereus, ni aun luego de haber expuesto el microorganismo a un

shock térmico, pero la combinación de estos junto con la nisina exhibieron un

efecto inhibitorio destacable. En otra investigación con dos diferentes cepas de

L.monocytogenes (STCC4031 y NCTN4032), Periago et al., 2001, obtuvieron

como resultados que el incremento de la concentración de carvacrol aumenta el

efecto antimicrobiano sobre el microorganismo y por otra parte, que la resistencia

a los efectos antimicrobianos varía entre cepas de un mismo microorganismo,

siendo este un factor importante en el estudio de estos.

101

Rasooli et al., 2005 en su investigación evidenciaron que el A.E de tomillo afecta

a L.monocytogenes a nivel de su pared celular, y dependiendo de la concentración

puede causar su ruptura, generando daño en organelos y hasta lisis celular. Los

resultados anteriores concuerdan con el efecto de los dos componentes

mayoritarios del tomillo (carvacrol y timol) propuestos por Burt 2004.

Los resultados obtenidos junto con la revisión bibliográfica realizada nos hacen

suponer que una concentración de 0,01% genera un debilitamiento y/o ruptura de

la pared celular, dejando la membrana expuesta a los efectos del calor (aumento

en la fluidez de la membrana, aumento en la permeabilidad y desnaturalización de

enzimas y proteínas) y a los efectos del propio A.E.

Parece ser que la temperatura, potencia el efecto del A.E. sobre L.monocytogenes,

pues de acuerdo con lo planteado por Moreira et al., 2005 en su investigación, la

actividad antimicrobiana de los compuestos principales con mayor actividad

antimicrobiana, mostraron su efecto máximo cerca a los 60 minutos de

incubación, teniendo en cuenta que no se aplico tratamiento térmico, mientras que

en nuestra investigación el efecto de los A.E sobre L.monocytogenes CETC 4032

fue casi inmediato, puesto que el tiempo transcurrido entre la inoculación del

microorganismo y la toma de la muestra de la población inicial fue

considerablemente corto. Se descarta, la posibilidad que el cultivo hubiera sufrido

daños letales durante la incubación, estuviera inviable ó presentará contaminación,

ya que antes del tratamiento se realizo el recuento del cultivo obteniéndose un

cultivo axenico con una concentración de 108 UFC/mL tras 24 horas de

incubación.

7.2.2 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60 ºC en combinación con el aceite

esencial de clavo

Los resultados obtenidos con el A.E de clavo a una concentración de 0,05% son

similares a los obtenidos con el A.E de tomillo, pues desde el tiempo 0 no se

observo crecimiento en ninguna de las 2 temperaturas (los resultados no se

102

indican). Sin embargo, con una concentración de 0,01% si se observó crecimiento.

Los datos obtenidos fueron analizados utilizando la ecuación de Weibull (eq.2).

En la Tabla 24 se presentan los parámetros δ (tiempo de la primera reducción) y p

(factor de forma) para un tratamiento a 55ºC y las curvas de los supervivientes en

las figuras 26 y 27.

Tabla 24. Parámetros de la distribución Weibull estimados a partir de las curvas

de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento

isotérmico a 55ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo.

δ p

BHIA 0,04 0,32

BHIA+NaCl 0,13 0,47

Figura 26. Curva de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a

un tratamiento isotérmico a 55ºC con 0,01% de aceite esencial de clavo en medio

BHIA. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5

Log U

FC

/mL

Tiempo (min)

Log UFC/ml

LogNpred

103



BHIA+NaCl. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.

Los resultados tanto en medio BHIA y BHIA+NaCl presentan una concavidad

hacia arriba (p<1) indicando que las células supervientes presentan una mayor

resistencia al tratamiento aplicado y una probabilidad muy baja de morir (Fig.26).

Los valores obtenidos del parámetro δ, permitieron determinar que la presencia de

un factor de inhibición adicional en el medio de recuperación el cual permite la

disminución de 4 unidades logarítmicas en un tiempo de 2,5 minutos mientras que

en un medio no selectivo seria de 3,29 minutos siendo estos mucho menores a los

observados en un tratamiento isotérmico.

En la Tabla 25 se presentan los parámetros δ (tiempo de la primera reducción) y p

para un tratamiento a 60ºC y las curvas de los supervivientes en las figuras 28 y

29.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5

Log U

FC

/mL

Tiempo (min)

Log UFC/ml

LogNpred

104


de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 expuesta a un tratamiento

isotérmico a 60ºC y una concentración de 0,01% de aceite esencial de clavo.

δ* p

BHIA 2,97 0,43

BHIA+NaCl 1,43 0,25

*Valor en segundos



BHIA. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.

-1

0

1

2

3

4

5

0 20 40 60 80 100

Log U

FC

/mL

Tiempo (seg)

Log UFC/ml

LogNpred

105



BHIA+NaCl. Resultados obtenidos con la distribución de Weibull.

Los resultados tanto en medio BHIA y BHIA+NaCl, presentan una concavidad

hacia arriba (p<1) indicando que las células supervientes presentan una mayor

resistencia al tratamiento aplicado y una probabilidad muy baja de morir. El valor

del parámetro δ, nos permite observar que la primera reducción logarítmica se da

a los 0,024 minutos en un medio selectivo y a los 0,050 minutos en un medio no

selectivo, siendo menores estos a los determinados en el tratamiento isotérmico.

A nivel experimental a 55ºC se obtuvo una disminución de 2 unidades

logarítmicas en el medio BHIA y de 3 unidades logarítmicas en el medio

BHIA+NaCl en el tiempo 0 con respecto a la población inicial (108 UFC/mL), y

durante los 4 minutos de tratamiento se observo crecimiento del microorganismo

en los dos medios de recuperación.

A 60ºC en el tiempo 0 la disminución fue de 4 unidades logarítmicas en el medio

BHIA y de 6 unidades logarítmicas en el medio BHIA+NaCl con respecto a la

población del cultivo inoculado (108 UFC/mL). En el medio de recuperación no

selectivo, se observó crecimiento durante los 90 segundos del tratamiento

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 20 40 60 80 100

Log U

FC

/mL

Tiempo (seg)

Log UFC/ml

LogNpred

106

mientras en el medio de recuperación selectivo se obtuvieron recuentos hasta el

tiempo 15 y en los restantes 75 segundos los resultados fueron <10 UFC/mL lo

que conllevó a reportar los resultados en unidades enteras, debido a que el modelo

de Weibull necesita de números naturales para su aplicación.

El modelo Weibull se ajusta de manera adecuada a los resultados obtenidos

permitiendo una estimación más precisa para la determinación de la inactivación

del microorganismo bajo las condiciones evaluadas. Como se observa en las

figuras 26, 27, 28 y 29, la curva predicha de supervivientes obtenida a partir del

modelo Weibull pasa por en medio de los datos experimentales demostrando un

ajuste que no es perfecto pero si muy bueno para nuestros resultados.

El A.E. de clavo presenta una concentración mínima inhibitoria (CMI) desde

0,062% (v/v) hasta 0,5% (v/v) (Fu et al., 2007) y un efecto listericida a una

concentración del 1% (v/v) (Oussalah et al., 2005; Chaieb et al., 2007) ó de 800µg

mL-1

, generando una disminución significativa de la población desde el contacto

y con un tiempo de 15 minutos para el efecto bactericida máximo (Moreira et al.,

2005) sin la aplicación de tratamientos térmicos. De acuerdo a lo anterior, los

resultados obtenidos en esta investigación son muy prometedores, pues el efecto

obtenido de la combinación del A.E y tratamientos térmicos es sinérgico,

disminuyendo la CMI a 0,01%, con una disminución significativa de la población

inoculada en el tiempo 0 y con un tiempo de efecto bactericida máximo menor de

15 minutos, de acuerdo con los resultados obtenidos por Moreira et al., 2005,

Oussalah et al., 2005 y Chaieb et al., 2007 en sus investigaciones.

Los resultados anteriores se pueden atribuir en gran parte al eugenol, componente

mayoritario del A.E de clavo, el cual tiene su blanco sobre los lípidos de

membrana, deterioro de la pared celular e inhibición de acción enzimática (Gill et

al., 2006; Filgueiras et al., 2006).

Gill et al., 2006 A y Gill et al., 2006 B, en sus investigaciones establecieron que

los componentes de los aceites esenciales eugenol y carvacrol tienen efectos de

107

inhibición sobre la acción enzimática de la ATPasa, la cual está presente en la

membrana bacteriana apoyando al desarrollo de funciones vitales tales como

producción de ATP, regulación de pH, transporte de proteínas y motilidad. Por

otra parte, apuntan a que la perturbación sobre la membrana celular es la causa

primaria de la muerte celular, y que la inhibición enzimática es un efecto

secundario, el cual disminuye la capacidad de crecimiento del microorganismo

luego de la exposición al A.E.

Los resultados obtenidos a partir del uso de los dos aceites esenciales, permiten

observar claramente que el A.E de clavo posee un efecto listericida mucho menor

que el que exhibe el A.E tomillo, concordando con los resultados obtenidos por

Oussalah et al., 2007 y Rasooli et al., 2005 en sus investigaciones. La

combinación de los componentes mayoritarios de estos aceites produce un efecto

aditivo (Burt, 2004), pero no se descarta la idea que los componentes minoritarios

tengan un papel importante sobre el efecto bactericida. El efecto listericida

reportado, se ve potenciado con la combinación de tratamientos térmicos,

corroborando los postulados propuestos por Gandhi et al., 2007 y Periago et al.,

2001, los cuales indican que la temperatura modifica en ciertas instancias la

sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos.

7.3 Estimación de la supervivencia de Listeria monocytogenes CETC 4032

durante un tratamiento térmico en combinación con el A.E. de clavo sobre

una sopa de calabacín

El alimento seleccionado para el ensayo fue una sopa de calabacín comercial

pasteurizada, el producto presentó un pH de 5,85 y un valor de 4,67 de sólidos

solubles y al sembrarlo en agar nutritivo no se observó el crecimiento de ningún

tipo de microorganismo tras 48 horas de incubación a 37ºC. Los tratamientos

seleccionados fueron los isotérmicos en combinación con el A.E de clavo por

presentar resultados propicios y mesurables para la experiencia.

Se aplicaron los tratamientos térmicos sin A.E., para determinar si algún

componente intrínseco del producto afectaba la supervivencia de

L.monocytogenes CETC 4032 luego de someterlo al tratamiento.

108

7.3.1 Tratamientos isotérmicos a 55 y 60ºC.

Los tratamientos isotérmicos se realizaron de manera similar al procedimiento,

utilizado en el medio de referencia (BHI), se utilizo la velocidad igual a 20 rpm

para lograr una adecuada homogenización y transferencia del calor, debido a la

densidad de la sopa. A partir de los resultados obtenidos se obtuvieron las graficas

de supervivencia, figuras 30 y 31, y se calcularon los valores D (tablas 26 y 27) y

el valor z (tabla 28).


isotérmicas (55ºC) en crema de calabacín y crecimiento en medio selectivo y no

selectivo.



isotérmico a 55ºC sobre crema de calabacín.

D ICs ICi R2

BHIA 10,51 25,66 2,46 0,93

BHIA+NaCl 7,34 16,46 1,19 0,97

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 5 10 15 20 25 30 35

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

55ºC

55ºC NaCl

109


isotérmicas (60ºC) en crema de calabacín y crecimiento en medio selectivo y no

selectivo.



isotérmico a 60ºC sobre crema de calabacín.

D ICs ICi R2

BHIA 1,14 3,23 0,35 0,86

BHIA+NaCl 1,04 2,83 0,30 0,88

Tabla 28. Valores Z obtenidos para tratamientos isotérmicos en crema de

calabacín.

D55 D60 Z

BHIA 10,51 1,14 5,19

BHIA+NaCl 7,34 1,04 5,89

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

60ºC

60ºC NaCl

110

Si se comparan los valores D obtenidos a 55ºC in vitro (tabla 16) y los obtenidos

en el producto (tabla 28), aunque no presentan una gran diferencia, permiten

inferir que el pH del alimento puede influir en el aumento del efecto bactericida

aumentando los daños letales sobre L.monocytogenes CETC 4032 en el medio de

recuperación no selectivo. En el medio de recuperación selectivo, los valores D

son similares y las poblaciones remanentes se encuentran en la misma

concentración (104 UFC/mL), viéndose un incremento en la resistencia al calor y

un nivel de daño similar. Fernández et al.,1994, en su investigación observaron

que a temperaturas más leves el efecto del pH sobre la inhibición del

microorganismo es mucho mayor que a temperaturas más altas, pudiendo inferir

que existe una relación entre el pH y la temperatura en la inhibición de

microorganismos. Además, determinaron que el tiempo de contacto es un factor

importante para el efecto inhibitorio, teniendo que a mayor tiempo de contacto

mayor efecto bactericida.

Los resultados obtenidos a 60ºC, apoyan los resultados obtenidos por Fernández

et al., 1994, pues al comparar los valores D in vitro (tabla 16) y los del producto

(tabla 28), aunque no presenten gran diferencia, permiten observar que el pH no

tuvo una mayor influencia en la inhibición del microorganismo pues el tiempo de

contacto fue de 5 minutos en comparación con los 30 que sufrió en el tratamiento

a 55ºC. Evidenciándose estos hechos, al comparar las poblaciones supervivientes

de los tratamientos; en el producto la población se encuentra un ciclo logarítmico

encima que en la población a la cual se le aplico el tratamiento in vitro, no

obstante hay que tener en cuenta que la población inicial de esta última se

encontraba 1 ciclo por encima en el medio no selectivo y 2 en el selectivo.

En las figuras 32 y 33, se pueden observar las diferencias anteriormente

nombradas entre los tratamientos isotérmicos in vitro y en el producto a las 2

temperaturas evaluadas.

111

Figura 32. Comparación entre las curvas de supervivencia de L.monocytogenes

CETC 4032 en crema de calabacín e in vitro a 55ºC.

Figura 33. Comparación entre las curvas de supervivencia de L.monocytogenes

CETC 4032 en crema de calabacín e in vitro a 60ºC.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

55ºC in vitro

Sopa 55ºC

55ºC in vitro NaCl

sopa 55ºC NaCl

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6

Log

UFC

/mL

Tiempo (min)

60 in vitro

60 sopa

60 in vitro NaCl

60 sopa NaCl

112

7.3.2 Tratamientos isotérmicos en combinación con el A.E. clavo.

De acuerdo con los resultados obtenidos en el tratamiento isotérmico, se esperan

obtener 3 posibles efectos: aditivo, sinérgico ó antagónico, entre los componentes

del producto y el A.E.

De acuerdo a la revisión bibliográfica realizada y la experiencia del grupo

investigador de microbiología de alimentos de la UPCT, se determinó usar el

doble de la concentración del A.E. evaluado (0,01%), en el alimento. Al realizar

el tratamiento con esta concentración (los resultados no se muestran), no se

evidencio reducción de la población del microorganismo luego del tratamiento y

se determino usar la concentración máxima evaluada (0,05% v/v).

Los tratamientos a las dos temperaturas evaluadas se realizaron de manera

idéntica a los tratamientos in vitro, y las curvas de supervivencia, figuras 34, 35,

36 y 37, se determinaron aplicando el modelo Weibull. Los parámetros δ y p

calculados se presentan en las tablas 29 y 30.

113


un tratamiento isotérmico en crema de calabacín a 55ºC con 0,05% de aceite

esencial de clavo en medio de recuperación no selectivo. Resultados obtenidos

con la distribución de Weibull.



esencial de clavo en medio de recuperación selectivo. Resultados obtenidos con la

distribución de Weibull.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5

Log U

FC

/mL

Tiempo (min)

Log UFC/ml

LogNpred

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 1 2 3 4 5

Log U

FC

/mL

Tiempo (min)

Log UFC/ml

LogNpred

114


de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín expuesta

a un tratamiento isotérmico a 55ºC con una concentración de 0,05% de aceite

esencial de clavo.

δ p

BHIA 0,17 0,52

BHIA+NaCl 0,08 0,44



esencial de clavo en medio de recuperación no selectivo. Resultados obtenidos

con la distribución de Weibull.

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80 100

Log U

FC

/mL

Tiempo (seg)

Log UFC/ml

LogNpred

115



esencial de clavo en medio de recuperación selectivo. Resultados obtenidos con la

distribución de Weibull.


de supervivencia de L.monocytogenes CETC 4032 en crema de calabacín expuesta

a un tratamiento isotérmico a 60ºC con una concentración de 0,05% de aceite

esencial de clavo.

δ* p

BHIA 14,51 0,59

BHIA+NaCl 18,79 0,62

(*Valor en segundos)

Las curvas de supervivencia a 60ºC se ajustan de forma correcta, pudiéndose

observar una concavidad hacia arriba que coincide con el parámetro p obtenido

(p<1). Si se comparan los resultados de la tabla 30 con los de la tabla 25, se puede

establecer que la primera reducción decimal se da en un tiempo mayor en el

producto que en el tratamiento in vitro. A partir de lo anterior, se puede presumir

sobre la posibilidad de que algún(os) componente(s) del producto ofrece(n) cierto

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 20 40 60 80 100

Log U

FC

/mL

Tiempo (seg)

116

tipo de protección al microorganismo frente al tratamiento. Es necesario señalar

que en el tiempo 0 se obtuvo una reducción de 4 unidades logarítmicas en el

medio no selectivo y de 5 en el medio selectivo con respecto a la población inicial

inoculada (108 UFC/mL).

Cabe destacar que la población inicial en el producto se encontraba un ciclo

logarítmico por debajo, si se compara con la población inicial del tratamiento in

vitro. Para evidenciar esto de una manera más objetiva y apartando esta

diferencia, se calculo el tiempo de reducción de 3-Log, obteniéndose un tiempo

de 36,48 segundos en el tratamiento in vitro y de 1,5 minutos en el producto, la

recuperación del microorganismo se realizo en ambos casos en el medio de

recuperación no selectivo. Si se determina el tiempo de la misma reducción en un

medio selectivo, se obtiene que en el tratamiento in vitro se demora 1,86 minutos

y en el producto 1,82 minutos los cuales son valores muy semejantes, lo que

conlleva a suponer que el mecanismo de incremento en la termorresistencia en los

dos casos es similar, produciéndose el mismo efecto sobre el microorganismo; lo

cual es coherente con la teoría de la distribución de Weibull la cual indica que al

presentarse un valor p<1 la población superviviente aumenta su resistencia al

tratamiento disminuyendo la probabilidad de ser eliminadas (Van Boekel, 2002).

A 55ºC las curvas de supervivencia obtenidas por el modelo Weibull se ajustan

casi de una manera perfecta, y mucho mejor que las obtenidas a 60ºC. Las células

supervivientes, de acuerdo al parámetro p calculado, aumentaron su

termorresistencia durante el tratamiento, siendo su eliminación mas difícil (p<1).

Si se comparan los valores δ, se observa una amplia diferencia, pudiéndose inferir

resultados inexactos, debido a lo anterior se calculó el tiempo de reducción de 3-

Log, de manera semejante a lo obtenido a 60ºC.

Para el medio no selectivo los tiempos fueron semejantes con una diferencia

mínima (resultados no se muestran), indicando que el efecto sobre la población

fue el mismo en los dos casos y que el daño fue sub-letal permitiendo la

recuperación del microorganismo, caso contrario en el medio selectivo donde la

117

diferencia fue amplia obteniéndose una reducción en un tiempo de 1,36 minutos

in vitro y de 1 minuto en el producto, conllevando a deducir que los daños sobre

el microorganismo pudieron ser a nivel de inhibición enzimática lo cual afectó la

capacidad de crecimiento del microorganismo luego del tratamiento.

Periago et al., 2001 en su investigación con L.monocytogenes, indica que en

alimentos mínimamente procesados es necesaria una disminución de 6-log en los

patógenos alimentarios, nuestros resultados permiten proponer una aplicación de

un tratamiento isotérmico a 55ºC en combinación con A.E de clavo al 0,05%

logrando la reducción propuesta en un tiempo de 5,8 minutos, si el medio no

contiene ningún otro factor de inhibición y de 4,7 minutos si el medio contiene un

factor adicional de inhibición (factor de inhibición como la sal común o el pH). La

aplicación de un tratamiento térmico leve por un corto periodo de tiempo, no

producirá cambios significativos en las propiedades nutricionales del producto, y

la concentración de A.E. al ser tan baja disminuye el efecto de este en los cambios

de las propiedades organolépticas (olor, sabor, etc.), lo cual es uno de los

problemas prioritarios de los consumidores actuales.

118

8. Conclusiones

Los tratamientos isotérmicos a 55ºC no afectan de manera significativa la

población de L.monocytogenes CETC 4032.

La exposición de L.monocytogenes CETC 4032 a un aumento de temperatura

rápido hasta 55ºC y su posterior mantenimiento en condiciones isotérmicas fue

más efectiva en la termodestrucción que el tratamiento isotérmico.

El incremento de temperatura en los tratamientos no isotérmicos, debe ser

constante y lineal y debe estar en el rango de 1ºC/min y 10ºC/min, si se sobrepasa

este rango y/o se usa más de una velocidad de aumento de temperatura la

modelización de los resultados es más compleja y está expuesta a cometer

mayores errores de cálculo.

El aceite esencial de tomillo, presentó un alto efecto listericida en las dos

temperaturas ensayadas en base a la concentración mínima evaluada (0,01% v/v).

El aceite esencial de clavo presentó un efecto listericida igual que el de tomillo a

una concentración de 0,05% pero menor a una concentración de 0,01% en las dos

temperaturas evaluadas.

Los alimentos por sí mismos, pueden contener agentes bactericidas o inhibidores

de crecimiento, que dependiendo de las condiciones de tratamiento pueden aportar

efectos de adición, sinergismo ó de antagonismo.

Los alimentos en determinadas condiciones, como la crema de calabacín en un

tratamiento isotérmico a 60ºC, pueden ofrecer protección al microorganismo

frente a los efectos de los tratamientos térmicos y de los aceites esenciales.

La presencia de otro agente inhibidor como NaCl, pH, aw, entre otros incrementa

el efecto de los tratamientos al inhibir la recuperación y su posterior crecimiento

de las células dañadas térmicamente.

119

9. Recomendaciones

Sería interesante realizar los tratamientos no isotérmicos con velocidades de

aumento entre 1ºC/min y 10ºC/min y una temperatura inicial no inferior a 40ºC

para observar el comportamiento de L.monocytogenes CETC 4032 frente a los

tratamientos por separado y en combinación de los aceites esenciales para la

determinación del efecto y determinar que tratamiento es más efectivo si uno

isotérmico o uno no isotérmico.

Se debería estudiar el comportamiento del aceite esencial de tomillo, sobre los

alimentos para determinar si los resultados tan efectivos obtenidos in vitro se

mantienen a nivel in vivo.

Es necesario adicionar otro factor aparte del Af, para determinar el ajuste del

modelo predicho con los resultados experimentales para poder asegurar que el

modelo es aprueba de fallos y su extrapolación es segura.

Es necesario aplicar más de un modelo para determinar cual se ajusta mejor a los

resultados experimentales y su elección debe ser en base a los fenómenos que

presente el microorganismo en el tratamiento, como los hombros y las colas.

120

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