“efecto de una preinmunización con lactococcus lactis
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE MEDICINA
“Efecto de una preinmunización con Lactococcus lactis
expresando el antígeno E7 del VPH-16 sobre la
protección antitumoral inducida por adenovirus que
expresan E7, IL-2 y calreticulina/E7”
Tesis presentado por:
Blanca Rocío Rangel Colmenero,
como requisito parcial para optar al grado de
Doctor en Ciencias con Especialidad en Morfología.
Agosto del 2007
“Efecto de una preinmunización con Lactococcus lactis expresando el
antígeno E7 del VPH-16 sobre la protección antitumoral inducida por
adenovirus que expresan E7, IL-2 y calreticulina/E7”
Aprobación de la Tesis
_________________________________________________
Dra. Odila Saucedo Cárdenas Director
_________________________________________________
Dr. Roberto Montes de Oca Luna co-Director
_________________________________________________
Dr. Augusto Rojas Martínez co-Director
__________________________________________________
Dr. Julio Sepúlveda Saavedra Comisión de Tesis
__________________________________________________
Dra. Alma Yolanda Arce Mendoza Comisión de Tesis
_____________________________________ Dr. Dionicio A. Galarza Delgado Subdirector de Estudios de Posgrado
“Efecto de una preinmunización con Lactococcus lactis expresando el
antígeno E7 del VPH-16 sobre la protección antitumoral inducida por
adenovirus que expresan E7, IL-2 y calreticulina/E7”
Presentado por:
M.C. Blanca Rocío Rangel Colmenero
El presente trabajo fue realizado en el Departamento de Histología, Fac. de
Medicina, UANL y en el Centro de Investigación Biomédicas del Noreste, IMSS,
bajo la dirección de la Dra. Odila Saucedo Cárdenas y el Dr. Roberto Montes de
Oca Luna
FIRMAS
Dra. Odila Saucedo Cárdenas Dr. Roberto Montes de Oca Luna
Directora de Tesis Co-Director de Tesis
Esta Tesis está dedicada especialmente a lo más importante que
ha pasado en mi vida: MI FAMILIA y a esa segunda ilusión que
en camino está.
AGRADECIMIENTOS
Principalmente a Dios por permitirme la vida y la oportunidad de ser quien soy.
A mi esposo e hija por su comprensión y motivación.
A la Dra. Odila Saucedo Cárdenas y al Dr. Roberto Montes de Oca Luna mis
Directores de Tesis, que con sus brillantes consejos y asesoría me han guiado en este
difícil camino y se pudo lograr un buen trabajo de tesis.
Al mi comisión de Tesis Dr. Augusto Rojas Martínez, Dra. Alma Yolanda Arce
Mendoza y al Dr. Julio Sepúlveda Saavedra por su asesoría.
A CONACYT por el apoyo en este trabajo de Investigación y la aprobación de una
beca de posgrado.
Al Centro de Investigación Biomédicas del Noreste, IMSS, por su apoyo hacia este
trabajo de investigación.
A los Departamentos de Histología, Bioquímica, Inmunología y Hematología de la
Facultad de Medicina, UANL por permitirme realizar parte de esta investigación
dentro de sus instalaciones.
Al CINVESTAB por habernos facilitado el uso del Microscopio Confocal con
Fluorescencia.
Al Dr. Adrián J. Rosas Taraco, al M.C. Cristian Silva Platas, al Dr. Jorge Gómez
Gutiérrez y al Dr. Arturo Chávez por su amistad y consejos para mejorar en las
metodologías que se utilizaron en este trabajo.
A mis compañeros y amigos.
GRACIAS…
CONTENIDO TEMÁTICO
Resumen 1
Capítulo 1 Introducción 2
Capítulo 2 Antecedentes 5
2.1. Cáncer cérvico-uterino 5
2.2. Virus del Papiloma Humano 6
2.2.1. Biología del VPH 6
2.2.2. Patogénesis 8
2.2.3. Mecanismos de Evasión Tumoral 11
2.3. Respuesta Inmune 13
2.3.1. Calreticulina 15
2.4. Vacunas 17
2.4.1. Adenovirus 21
2.4.2 Lactococcus lactis 23
2.5. Modelo Animal para Cáncer cérvico-uterino 24
Capítulo 3 3.1. Justificación 25
3.2. Hipótesis 26
3.3. Objetivo 26
3.3.1. Objetivos Específicos 27
Capítulo 4 Material y Método 28
4.1. Ratones y Líneas Celulares 28
4.2. Vector Adenoviral 29
4.3. Preparación de Células Bacterianas 30
4.4. Preparación de Vectores Adenovirales 30
4.4.1. Producción Adenoviral 31
4.4.1.1. Preamplificación del adenovirus 31
4.4.1.2. Producción a gran escala del adenovirus 32
4.4.1.3. Purificación de Vectores Adenovirales 33
4.5. Detección de la expresión de E7 en Lactococcus lactis 35
4.6. Inmunización intranasal de los ratones con
Lactococcus lactis que expresa E7 del HPV-16 37
4.7. Inducción Tumoral en los ratones C57/BL6 38
4.8. Tratamiento terapéutico con los vectores adenovirales que expresan
E7, CRT/E7 e IL-2 39
4.9. Tratamiento combinado profiláctico y terapéutico 41
4.10. Evaluación del crecimiento Tumoral 41
4.11. Análisis de supervivencia 42
4.12. Sacrificio y Obtención de tejidos 42
4.13. Detección de IFN- 43
4.14. Análisis de citometría de flujo 43
4.15. Preparación de las piezas de tumor para su análisis histológico 44
4.16 Análisis morfológico de los cortes de tumor 45
4.17. Evaluación de la inducción de apoptosis en los tumores 45
4.18. Detección de linfocitos T CD8+ mediante inmunohistoquímica 46
Capítulo 5 Resultados 47
5.1. La Calreticulina incrementa dramáticamente el efecto antitumoral de un
adenovirus que expresa E7 47
5.2. La preinmunización intranasal con Lactococcus lactis-E7 potencía el efecto
Antitumoral de Ad-CRT/E7 48
5.3. El tratamiento con Lactococcus lactis-E7 y adenovirus-CRT/E7 produce
Un mayor porcentaje de ratones con regresión tumoral completa 53
5.4. Los tumores en regresión del tratamiento combinado de Lactococcus
Lactis-E7 y Ad-CRT/E7 presentan infiltración de linfocitos T CD8+ 54
5.5. Inducción de apoptosis en los tumores en regresión 56
5.6. Inducción de IFN gamma en los ratones con tumor en regresión 59
Capítulo 6 Discusiones 61
Capítulo 7 Conclusiones 65
Capítulo 8 Literatura Citada 66
Anexo I Preparación de soluciones 73
Resumen Curricular 79
INDICE DE FIGURAS
1. Esquema de Genoma Viral 7
2. Patogénesis del VPH oncogénico 9
3. Caracterización de la expresión de los genes del VPH en lesiones
benignas y malignas 11
4. Función de la calreticulina en el procesamiento de antígenos 16
5. Ratón de la cepa C57BL/6 28
6. Línea celular TC-1 28
7. Casete de expresión para CRT/E7 en el adenovirus y detección de
E7 y CRT/E7 mediante Western blot 29
8. Inmunización intranasal 37
9. Implante de células TC-1 39
10. Aplicación del tratamiento terapéutico 40
11. Análisis del efecto antitumoral de un adenovirus que expresa calreticulina
fusionada a E7 49
12. Análisis del efecto antitumoral de un tratamiento combinado de Ll-E7
Y adenovirus con CRT/E7 52
13. Porcentaje de ratones libres de tumor 53
14. Análisis histológico y por inmunofluorescencia de linfocitos T en los
tumores en regresión 55
15. Cuantificación de linfocitos T y NK en los tratamientos con regresión
tumoral por citometría de flujo en los bazos de ratones con tumor 57
16. Detección de apoptosis por ensayo de TUNEL en tumores en regresión 58
17. Detección de IFN- en los tumores en proceso de regresión 60
LISTA DE ABREVIATURAS
CaCu Cáncer cérvico-uterino
VPH Virus del Papiloma Humano
L1 Proteínas estructurales de la cápside viral
L2 Proteínas estructurales de la cápside viral
E6 Proteína del virus del papiloma humano
E7 Proteína del virus del papiloma humano
CTL Linfocitos T citotóxicos
NK Células asesinas naturales
CRT Calreticulina
VPH-16 Virus del Papiloma Humano tipo 16
ADN Acido desoxiribonucleico
% Porciento
80´s Ochentas
LCR Región de control larga del VPH
p53 Gen supresor de tumor
pRb Gen del retinoblastona
G1 Fase del ciclo celular
S Fase del ciclo celular
E2F-1 Factor de transcripción celular
DC Células dendríticas
MHC-1 Complejo mayor de histocompatibilidad clase I
Th Células T ayudadoras
TCD8+ Linfocitos T CD 8 positivos
TCD4+ Linfocitos T CD4 positivos
MHC-II Complejo mayor de histocompatibilidad clase II
HSP Proteínas de choque térmico
kDa Kilo Daltones
APC Células presentadoras de antígeno
TAP-1 Transportadores asociados en el procesamiento de antígeno tipo I
TAP-2 Transportadores asociados en el procesamiento de antígeno tipo II
VLPs Partículas parecidas a virus del papiloma
IL2 Interleucina 2
HEK 293 Tipo celular deficiente de E1A y E3A
E1A Gen temprano del adenovirus
E3A Gen temprano del adenovirus
DO Densidad óptica
PBS Buffer de fosfatos salino
UFC Unidades formadoras de colonias
CPE Efecto citopático
SFB Suero Fetal Bovino
DMEM Dulbeco´s modified eagle medium
rpm Revoluciones por minuto
ºC Grados centígrados
mM Milimolar
ul Microlitros
CM Cloramfenicol
ng Nanogramos
ml Mililitros
mm Milimetros
UV Ultravioleta
TC-1 Células tumorales línea TC-1
RESUMEN
M.C. Blanca Rocío Rangel Colmenero Fecha de Graduación: Agosto del 2007
Universidad Autónoma de Nuevo León
Facultad de Medicina
Título: “Efecto de una preinmunización con Lactococcus lactis expresando
el antígeno E7 del VPH-16 sobre la protección antitumoral inducida
por adenovirus que expresan E7, IL-2 y calreticulina/E7”
Número de páginas: 78 Candidato para el grado de Doctor en
Ciencias con especialidad en Morfología
Area de estudio: Morfología
Propósito y Método del Estudio. El cáncer cérvico uterino (CaCu) representa uno de los problemas más
graves de salud pública a escala mundial y se considera como la segunda causa de muerte por cáncer en la
mujer alrededor del mundo. En México es considerado como la primera causa de muerte por neoplasias en la
mujer. Más del 90% de los tumores de CaCu está asociado a VPH por lo que el control de la infección de este
virus es de suma importancia. Los objetivos de nuestro trabajo fue determinar si el adenovirus que expresa E7
fusionado a calreticulina (Ad-CRT/E7) posee una mayor actividad antitumoral que el que expresa E7 (Ad-
E7), y si este efecto se potencía con la preinmunización con Lactococcus lactis que expresa el antígeno E7.
Para cumplir con nuestros objetivos se estableció un modelo tumoral murino mediante la inoculación de
células TC-1 que expresan el antígeno E7. Posteriormente se aplicaron intratumoralmente los adenovirus Ad-
CRT/E7, Ad-E7 y Ad-IL2 y se midió el desarrollo del tumor en función del tiempo. Para los experimentos
combinados de L. lactis y adenovirus se realizó lo siguiente: (1) Preinmunización profiláctica vía nasal con L.
lactis que expresa el antígeno E7 adherido a su pared, (2) establecimiento del tumor con células TC-1, (3)
administración intratumoral de los adenovirus (Ad-CRT/E7 y Ad-E7), y (4) monitoreo del crecimiento
tumoral. Se registró la supervivencia y se midió la respuesta inmune celular.
Contribuciones y Conclusiones. Los ratones tratados con el Ad-CRT/E7 mostraron mayor inhibición del
crecimiento tumoral que la observada con los Ad-E7 y Ad-IL2. Además en el tratamiento combinado del L.
lactis-E7 y Ad-CRT/E7 la mayoría de los ratones presentaron una regresión tumoral total y un mayor
porcentaje de supervivencia que los otros tratamientos. Esto debido en parte a una mayor respuesta inmune
celular dado por una mayor infiltración de linfocitos T CD8+, apoptosis y una concentración elevada de IFN-
. Con nuestros resultados podemos concluir que: la calreticulina potencía notablemente el efecto
inmunogénico y antitumoral del antígeno E7, la preinmunización con L. lactis expresando E7 en su superficie
mejora el efecto terapéutico antitumoral y porcentaje de supervivencia y que el efecto antitumoral observado
correlaciona con la inducción de una respuesta inmune celular.
______________________________
Dra. Odila Saucedo Cárdenas
Directora de Tesis
2
Capítulo 1
INTRODUCCIÓN El cáncer cérvico uterino (CaCu) es la primera causa de muerte por neoplasia en la
mujer en los países en desarrollo, de allí la importancia de contar con una vacuna para el
control y tratamiento del mismo1,2.
En más del 99% de los casos de CaCu, el virus del papiloma humano (VPH) se ha
identificado como agente causal siendo el tipo 16 y 18 los más prevalentes por lo que la
producción de vacunas contra VPH se han dirigido hacia estos tipos de virus con el fin de
disminuir la incidencia mundial de CaCu2.
El conocimiento de la biología del VPH3-6 ha permitido establecer diferentes
estrategias para la producción de vacunas contra el CaCu. Las vacunas que se
comercializan hasta el momento son en su mayoría tratamientos profilácticos dirigidos a
producir anticuerpos neutralizantes contra proteínas estructurales L1 y L2 de la cápside
viral de VPH7-10. Y más recientemente ha sido introducida al mercado una vacuna
tetravalente, dirigida hacia los tipos VPH 6,11, 16 y 18. Más sin embargo, estas vacunas
son preventivas y no atacan el problema actual que tenemos en México: el alto número de
mujeres que ya presentan la enfermedad y que no existe un tratamiento efectivo, que
aumente la esperanza de vida para las mujeres afectadas por este mal.
Actualmente, varios grupos de investigación están trabajando en la obtención de
vacunas terapéuticas que se basan en las proteínas virales E6 y E7 y su administración en
3
modelos animales ha dado buenos resultados7,11-13, y algunas de ellas ya están en fase
clínica77.
Estudios en modelos animales han demostrado que la inmunización con las
proteínas E6 ó E7 del VPH-16 desencadena una buena respuesta inmune celular. Entre los
tipos celulares que se han encontrado en dicha respuesta están principalmente los linfocitos
T citotóxicos (“CTL” por sus siglas en inglés) también conocidos como CD8+ y las células
asesinas naturales (“NK” por sus siglas en inglés). La activación de ambas células,
converge en la señalización intracelular que activa las enzimas proteolíticas llamadas
caspasas, involucradas en el proceso de apoptosis que ocasiona la destrucción de las células
cancerosas14-16.
Por otro lado, con el fin de mejorar la respuesta inmune que se ha logrado hasta la
fecha, se están utilizando proteínas unidas al antígeno de interés para potenciar la respuesta
inmune. Una de estas proteínas, es la calreticulina (CRT), que se encuentra en el retículo
endoplásmico, donde tiene dos funciones principales: regular la homeostasis de Ca2+ y
actuar como chaperona en la presentación de antígenos17,18. Previos estudios han empleado
CRT unida a un antígeno del VPH-16 que puede ser E7 o E6, y han observado un
importante efecto antitumoral19-24.
Al diseñar una vacuna, hay que tener en cuenta el modo de presentar el antígeno, ya
que esto es un factor determinante para su efectividad. Actualmente los adenovirus son
vectores ampliamente usados para expresar proteínas recombinantes. Estos vectores son
4
construcciones artificiales en las que se realizan modificaciones en el genoma viral,
mediante el reemplazo de algunos segmentos con ADN de una fuente diferente.
Otros microorganismos utilizados como vectores son las bacterias probióticas como
es, Lactococcus lactis. Esta bacteria ácido láctica se ha estudiado extensamente y
manipulada para la producción de proteínas heterólogas25-32. La producción de este
microorganismo es sencilla, rápida y económica por lo que lo hace una herramienta ideal en
la elaboración de vacunas que se puedan utilizar en la población en general.
Nuestro grupo ha logrado expresar exitosamente el antígeno E7 utilizando como
vector L. lactis, y hemos demostrado que su administración por vía intranasal activa una
respuesta inmune celular específica para E733-34.
En el presente trabajo evaluamos la efectividad de una preinmunización con este L.
lactis expresando el antígeno E7 de VPH-16 en combinación con la aplicación terapéutica
intratumoral de un adenovirus que expresa E7 fusionado a la proteína CRT. Esta
combinación indujo una fuerte respuesta inmune específica contra el antígeno E7
provocando una inhibición significativa del desarrollo tumoral.
5
Capítulo 2
ANTECEDENTES
2.1. Cáncer cérvico-uterino
El cáncer cérvico-uterino se origina en la mucosa del cuello uterino, porción inferior
y estrecha del útero que desemboca en la vagina.
En los países desarrollados, el cáncer cervical es usualmente el cáncer más común y
puede constituir arriba del 25% de todos los cánceres en la mujer35. El cáncer cervical es
precedido solo por el cáncer de mama como la causa más común de muerte por cáncer en la
mujer en el mundo36. Las tasas de mortalidad por cáncer en México muestran una marcada
tendencia creciente en las últimas décadas. Los tumores malignos en México ocupan el
segundo lugar como causa de muerte en la población general y, dentro de éstos, el cáncer
cervical representa el tercer lugar como causa de defunción por neoplasias malignas y el
primer lugar si se toma en cuenta sólo el sexo femenino, únicamente antecedido por los
tumores de pulmón y estómago en primero y segundo lugar, respectivamente. Asimismo,
dicha neoplasia constituye 21.4% del total de las neoplasias malignas, 35% de las que
afectan a la mujer y 85% de las ginecológicas37. En 1994 en el estado de Nuevo León este
tipo de cáncer ocupó el segundo lugar en frecuencia de mortalidad por neoplasias
malignas38.
La asociación entre la infección genital del VPH y el cáncer cervical se demostró a
principios de los 80´s39. En 1996 la asociación de salud mundial reconoce al VPH como la
principal causa de cáncer cervical. Más de 200 tipos de VPH han sido agrupados en base a
6
la secuencia de DNA y alrededor de 85 genotipos están bien caracterizados. El virus del
papiloma humano infecta las células del epitelio basal de la piel y está clasificado como
tipo cutáneo y mucoso. El tipo cutáneo es epidermiotrópico y está dirigido a la piel de las
manos y pies. El tipo mucoso infecta la boca, garganta, tracto respiratorio o epitelio
anogenital. Basándose en la asociación con el cáncer cervical, los VPH se agrupan en tipos
de alto y bajo riesgo oncogénico. Los tipos de VPH de bajo riesgo son el 6, 11, 42, 43 y 44.
Los VPH de alto riesgo son 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 y 704.
Se han identificado alrededor de 30 tipos de VPH que son transmitidos por contacto sexual
que infectan primariamente el cérvix, vagina, vulva, pene y ano. Entre los tipos más
frecuente se encuentra el tipo 16 con un 50% de los casos y le siguen el tipo 18 con un
12%, el 45 con un 8% y el 31 con un 5%35,40. Los VPH han sido implicados por arriba del
90% de los casos de cáncer de células escamosas cervical alrededor del mundo40-42.
2.2. Virus del Papiloma Humano
2.2.1. Biología del VPH
Los papilomavirus son miembros de la familia Papovaviridae. El VPH es
relativamente pequeño de 55 nm de diámetro, tiene una cápside icosaédrica compuesto de
72 capsómeras que contienen dos proteínas de la cápside L1 y L2. Cada capsómera es un
pentámero de la proteína L1. Cada cápside del virión contiene algunas copias
(aproximadamente 12 por virión) de la proteína de la cápside menor L243.
El genoma del VPH consiste de una molécula de ADN circular de doble cadena,
conteniendo aproximadamente 7,900 pares de bases. Este genoma se divide en tres
7
regiones: una región de transcripción temprana que comprende los genes E1, E2, E4, E5,
E6 y E7; una región tardía compuesta de los genes L1 y L2 y una región larga de control
(“LCR” por sus siglas en inglés). La región temprana codifica proteínas reguladoras de la
transcripción y la replicación y dos proteínas importantes en el proceso de transformación
(E6 y E7); esta región se expresa en los queratinocitos proliferantes y no diferenciados. La
región tardía comprende las proteínas de la cápside viral y se expresa en los queratinocitos
diferenciados44. La región LCR es una región regulatoria no codificante de 100 a 400 pares
de bases, contiene el origen de replicación del ADN, uno o dos promotores, activador
transcripcional, represor de los sitios de unión a la proteína y el sitio de poliadenilación del
ARN; en este ocurren muchas interacciones complejas entre las proteínas reguladoras
virales y del hospedero4 (Fig. 1).
Fig. 1 Esquema del genoma adenoviral.
8
2.2.2. Patogénesis
Los VPH son virus epiteliotrópicos que infectan la capa basal de epitelios
queratinizados y mucosos. Sus efectos clínicos principalmente en forma de verrugas son el
resultado de la estimulación viral de la proliferación y su interferencia con la diferenciación
normal epitelial. Estas lesiones pueden observarse entre las 3 semanas y 8 meses después
de la infección. A pesar de que la mayoría de las lesiones causadas por los VPH son
benignas, existen ciertos tipos que están relacionados con el cáncer cervicouterino, debido a
esto, los diferentes genotipos de VPH se clasifican de acuerdo al riesgo oncogénico en: alto
(16, 18, 45 y 56), intermedio (31,33, 35, 51, 52 y 58) y bajo (6, 42, 43 y 44)5.
Aproximadamente 35 genotipos de VPH infectan el área anogenital. Virtualmente
todos los pacientes con infección por genotipos de bajo riesgo y la mayoría de infectados
con genotipos de alto riesgo, resuelven la infección. No obstante, se cree que las mujeres
que continúan infectadas por genotipos oncogénicos presentan finalmente displasia o
cáncer cervical. En el cáncer cervical se ha encontrado el VPH en el 99.7% de los casos. El
11.8% de la incidencia de cáncer en el mundo se debe a la infección por VPH siendo el
genotipo VPH-16 el virus más prevalente, seguido por el VPH-18. Por tal motivo, los
esfuerzos en la fabricación de vacunas contra VPH se han encaminado principalmente hacia
estos virus con el fin de disminuir la incidencia mundial de cáncer anogenital2.
Se asume que el ciclo de replicación del VPH empieza con la entrada del virus
dentro de las células del estrato germinativo del epitelio. Para que esto ocurra es necesario
la abración o microtrauma de la epidermis. La integrina α6 ha sido propuesta como el
9
receptor de las células epiteliales para el VPH-6 pero no obligatoriamente para el anclaje de
VPH-11 o VPH-33. El VPH-16 y VPH-33 se anclan a la superficie por la vía heparán-
sulfato celular del hospedero45. En la capa basal, la replicación viral se considera que es no
productiva y el virus se establece de forma episómica con un bajo número de copias, al
utilizar la maquinaria de replicación de la célula sintetizando una copia de su DNA
aproximadamente por ciclo celular, se le considera una lesión benigna. En las lesiones
malignas, este se integra en el ADN del huésped entre la región E1 y E2 viral, lo cual
ocasiona una desregulación en la expresión de las proteínas oncogénicas E6 y E7. Estas por
su parte, actúan bloqueando la función de los genes supresores de tumor p53 y el gen del
retinoblastoma (pRb), respectivamente, ocasionando la progresión prematura de la fase G1
a la fase S del ciclo celular, y por tanto la inmortalización celular (Fig. 2).
Figura 2. Patogénesis del VPH oncogénico. Los genes E6 y E7 del VPH codifican para
proteínas multifuncionales que se unen primariamente a las proteínas celulares p53 y pRB,
interrumpiendo sus funciones y alterando la regulación del ciclo celular y por lo tanto la
transformación celular.
10
El crecimiento celular es regulado grandemente por dos proteínas celulares, las
proteínas supresoras de tumor, p53 y pRB. El producto del gen E6 del VPH se une a p53 y
lo lleva a su rápida degradación por ubiquitinación. Esta degradación tiene el mismo efecto
que una inactivación por mutación. Como consecuencia, las actividades normales de p53
como son el arresto en G1, apoptosis y reparación del DNA son eliminadas6. El producto
del gen E7 del VPH se une a la forma fosforilada de las proteínas de la familia RB. Esta
unión rompe el complejo entre pRB y el factor de transcripción celular E2F-1, resultando
en la liberación de E2F-1, el cual permite la transcripción de genes cuyos productos son
requeridos por la célula para entrar a la fase S del ciclo celular. El gen E7 puede además
asociarse con otras proteínas mitóticas como la ciclina E3. Los productos del gen E2 son
proteínas unidas al DNA con las cuales se bloquea la transcripción de los genes E6 y E7 y
permiten que el producto del gen E1 se una al origen viral de replicación localizado en la
LCR. Esta unión inicia la replicación del genoma viral en la fase S del ciclo celular. El
número de copias genómicas es mantenido en un nivel constante en estas células y un bajo
nivel de transcritos son expresados. Después, se activan los promotores tardíos que activan
la cápside, L1 y L2. Las partículas virales son ensambladas en el núcleo y los viriones
completos son liberados cuando las capas queratinizadas del epitelio son liberadas. El gen
E4 participa en el proceso de maduración y liberación de las partículas del papilomavirus4.
Las lesiones benignas el VPH tienen un patrón específico de expresión génica. Los
genes tardíos (proteínas de la cápside viral) solo se expresan en las capas diferenciadas y
superficiales del epitelio mientras que los genes tempranos inician su expresión a medida
que ocurre la diferenciación del epitelio. La formación de las partículas virales infectantes
(viriones) en las capas más superficiales del epitelio asegura la transmisión de la infección,
11
al producirse la descamación de los queratinocitos infectados. En contraste, cuando ocurre
la transformación carcinomatosa, el ADN viral se integra al ADN celular, predominando la
expresión continua de los genes tempranos (particularmente de las oncoproteínas E6 y E7)
y se aborta la producción de partículas virales o viriones. Lo anterior ocasiona una
proliferación continua y descontrolada de los queratinocitos2 (Fig. 3).
Figura 3. Caracterización de la expresión de los genes del VPH en lesiones benignas y malignas.
2.2.3. Mecanismos de evasión tumoral
La coevolución del papillomavirus con las células de mamíferos, ha producido
mecanismos por el cual el papillomavirus puede evadir el mecanismo de la respuesta
inmune del hospedero específica y no específica. El patrón de infección, crónica o latente, y
la aparición de brotes con efectos citopáticos, es dependiente de las condiciones celulares
del huésped. Los procesos de evasión pueden ocurrir por diferentes vías; en ciertos casos
los virus presentan antígenos de superficie muy variables que conducen a síntesis de un
exceso de anticuerpos no neutralizantes, que pueden llegar a interferir con los que si tienen
PROLIFERACION
VIRIONES
DIFERENCIACION
ESTADO INFECCIOSO ESTADO TRANSFORMANTE
PROLIFERACION
SIN VIRIONES
GENES VIRALES
EXPRESADOS
L1 Y L2
E1 Y E2
E6 Y E7
12
esa capacidad de neutralización. Otro mecanismo de evasión se ha observado en ciertos
tumores, en los que la respuesta inmunitaria se evita mediante la depleción de la expresión
de moléculas del MHC. Muchas infecciones virales toman como diana a células inmuno
competentes como CD4+ y células de Langerhans, comprometiendo así la eliminación de la
infección por alteración de los mediadores en el montaje de la respuesta inmune 44. Una
ventaja que posee este virus es que no produce lisis celular por lo cual los antígenos virales
no parecen estar disponibles para ser presentados por las células presentadoras de antígenos
y por lo tanto se limita la inducción de CTL específicos46.
El patrón específico de expresión génica del VPH ocasiona bajos niveles de
expresión de las proteínas del papillomavirus en las células epiteliales basales infectadas y
aunado con la ausencia de infiltración y la lisis celular inducida por virus, se restringe la
oportunidad de la presentación efectiva de las proteínas del VPH a los inmunocitos por las
células dendríticas (“DC” por sus siglas en inglés)46.
Puntualizando, las proteínas E1 y E2 tienen un bajo nivel de expresión, además de
que se localizan en el núcleo donde son difícilmente reconocidas por el sistema
inmunológico. Las proteínas E6 y E7 además de estar bien localizadas en el núcleo y de
presentar un nivel bajo de expresión, este es suficiente para inducir proliferación y retrasar
el fenómeno de diferenciación. Las proteínas E4, L1 y L2 se localizan tanto en citoplasma
como en el núcleo y se expresan solo en los queratinocitos bien diferenciados, los cuales
son rápidamente descamados del epitelio, impidiendo su adecuado reconocimiento por el
sistema inmune46.
13
En general la gran mayoría de péptidos o antígenos de las células cancerosas son
pobremente inmunogénicos. Las células tumorales frecuentemente disminuyen la expresión
de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase I (“MHC-I” por sus siglas
en inglés) o inducen mutaciones en el gen de la β2-microglobulina como estrategia para
evadir su reconocimiento por parte del sistema inmune47.
2.3. Respuesta inmune
La inmunidad celular adaptativa ejerce una respuesta específica hacia el agente viral
injurioso y va a estar dada por las células efectoras específicas y por las células de memoria
que van a repeler un ataque posterior. A medida que la infección viral avanza, se dispara la
inmunidad adaptativa en la cual se activan los CTL, las células T ayudadoras (Th) y los
anticuerpos antivirales44.
La respuesta inmune humoral permite la mayoría de las veces detener la
diseminación de virus a otras células con la secreción de proteínas (anticuerpos) por los
linfocitos B, estos anticuerpos neutralizan los agentes extraños gracias a la unión específica
con un antígeno16,17. En este tipo de inmunidad adquieren importancia las
inmunoglobulinas y los receptores antigénicos de las células T. Las inmunoglobulinas son
glicoproteínas presentes tanto en el suero como en los líquidos tisulares, pueden ser
generados contra cualquier proteína viral y actúan activando el complemento produciendo
lisis celular y son mediadores de la activación de células efectoras citotóxicas48.
14
La respuesta inmune celular está caracterizada por la acción conjunta de linfocitos y
macrófagos cuyo fin es la destrucción o neutralización del agente extraño49. Las células T
reconocen antígenos asociados al MHC, de esta forma, las MHC-I y II actúan como
sistemas guías para las células T. Los antígenos son presentados por el MHC en la
superficie celular en forma de péptidos previamente procesados. Las células que procesan
el antígeno corresponden ya sea a células presentadoras de antígeno (“APC” por sus siglas
en inglés), profesionales o a células infectadas que expresan el antígeno viral48.
Los linfocitos T CD8+ y células T cooperadoras de tipo 1 (Th1), también conocidos
como CD4+, son los principales componentes de la respuesta inmune celular. Los CTL son
las principales células activadas inicialmente ante una infección viral y mediante la
expresión de MHC-1 identifican y eliminan a las células infectadas por el virus.
Básicamente cualquier proteína viral puede ser procesada para generar péptidos que son
transportados al retículo endoplásmico rugoso en donde se unen a moléculas MHC-I y a la
2-microglobulina y este complejo es transportado hacia la superficie celular para ser
reconocidas. Por otra parte los linfocitos CD4+ reconocen los antígenos expresados en
macrófagos y células B asociados con MHC-II. El complejo MHC-II/péptido antigénico es
reconocido por el receptor de la célula T y esta interacción no solo es inmuno específica
sino que, para que se produzca una adecuada presentación antigénica, se requiere la acción
de moléculas coestimuladoras que en caso de estar ausentes se produce un estado de
tolerancia inmunológica. Una vez que las células T son activadas, se liberan citocinas como
el interferón- (IFN-γ), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos
(GM-CSF, granulocyte macrophage colony-stimulating factor) y el ligando CD40 que
15
incrementa la función de presentación antigénica y es la señal activadora principal del
linfocito B48.
2.3.1 Calreticulina
La calreticulina es una proteína de choque térmico (“HSP” por sus siglas en inglés)
de 46 kDa que se encuentra en el retículo endoplásmico, donde tiene dos funciones
principales: regular la homeostasis de Ca2+ y actuar como chaperona17,18 al asociarse a los
péptidos y transportarlos dentro del retículo, se considera que juega un papel muy
importante en el procesamiento de antígenos50.
El retículo endoplásmico es un organelo intracelular esencial que juega un rol vital
en muchos procesos celulares como la síntesis, plegamiento y modificación
postranscripcional asociado a membrana, secreción, contracción-relajación, motilidad
celular, expresión génica, progresión del ciclo celular y apoptosis51-53.
Dentro del lumen de este organelo podemos encontrar una gran concentración de
proteínas involucradas en todos los aspectos de funcionamiento del retículo endoplásmico.
Muchas de estas proteínas se unen y almacenan calcio además de funcionar como
chaperonas. Ellas intervienen en el plegamiento y control de calidad de la síntesis de
nuevas proteínas54-56. Un grupo de estas proteínas son las HSP. Las HSP se encuentran en
el citosol y en el retículo endoplásmico y se ha visto que intervienen en la inmunidad
celular antígeno específica contra antígenos tumorales, antígenos virales y antígenos de
histocompatibilidad menor. Las bases para esta habilidad general en la respuesta inmune
16
consiste en la función de unirse a un gran repertorio de péptidos, incluyendo los péptidos
antigénicos de cualquier célula o tejido, para que después sea captado por las células
presentadoras de antígenos (“APC” por sus siglas en inglés) y los péptidos sean procesados
y presentados en su superficie por las moléculas del MHC I para estimular a los linfocitos T
CD8+ antígeno específicos. Se ha propuesto que las HSP transportan péptidos desde el
punto donde fueron generados en el citosol hasta el MHC I del retículo endoplásmico para
su presentación18, 50, 56-63.
La CRT pertenece a la familia de las proteínas de choque térmico que se ha visto se
asocia con péptidos libres en el lumen del retículo endoplásmico que son liberados por
transportadores asociados con el procesamiento del antígeno, TAP-1 Y TAP-2 (“TAP” por
sus siglas en inglés) y con moléculas de microglobulina β-2 y MHC clase I B218,22,50,56-59
(Figura 4).
Figura 4. Función de la calreticulina en el procesamiento de antígenos.
17
La unión de la CRT a un péptido in vitro, utilizada como tratamiento en modelos
animales de VPH, puede despertar una respuesta péptido específica de los linfocitos T
CD8+, dirigiendo a una respuesta antitumoral. Previos estudios han empleado calreticulina
unida a un antígeno del VPH-16 que puede ser E7 o E6, y han observado un importante
efecto antitumoral19-24.
Existen reportes en donde se señala que la CRT además de la función antes
mencionada, tiene un efecto antiangiogénico, lo que provoca una deficiencia en el aporte de
nutrientes que conlleva a un pobre desarrollo tumoral, y de allí su importancia como agente
antitumoral22,64 .
Previos estudios han empleado calreticulina unida a un antígeno del VPH-16 que
puede ser E7 o E6, y han observado un importante efecto antitumoral21-24
2.4. Vacunas
Con el objeto de mejorar el tratamiento de las distintas formas de expresión de la
infección por el VPH, se están investigando nuevas terapias, como la terapia fotodinámica,
las terapias génicas y el desarrollo de nuevos medicamentos inmunomoduladores derivados
del imiquimod. El principal objetivo es el desarrollo de vacunas que sean eficaces y
eficientes contra el VPH, pero esto se ve limitado debido a las dificultades para cultivar este
virus aunado a la falta de un modelo animal adecuado para su estudio, la especificidad de
especie de estos virus y la necesidad que tiene de transcribirse y replicarse en queratinocitos
diferenciados44.
18
Existen dos tipos de vacunas las profilácticas y las terapéuticas. Las primeras deben
ser aplicadas antes de la infección con la finalidad de producir anticuerpos neutralizantes
contra el VPH para prevenir la infección, así como el desarrollo de lesiones en individuos
infectados por el virus, mientras que las segundas se utilizan en los estados subsecuentes a
la infección, para evitar la replicación del virus, o bien, para controlar el crecimiento
tumoral cuando el VPH está integrado65.
Las vacunas profilácticas están dirigidas a producir anticuerpos neutralizantes
contra proteínas estructurales L1 y L2 de la cápside viral de VPH. El uso de proteínas de
fusión L1 y L2, que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes, ha demostrado
prevenir infecciones contra el VPH. Otra estrategia para producir respuesta inmune
neutralizante contra las proteínas de la cápside viral ha sido la producción por ingeniería
genética de proteínas ensambladas incapaces de infectar por si mismas a una célula viva
conocidas como partículas parecidas al virus del papiloma (“VLPs” por sus siglas en
inglés). Estas VLPs están compuestas solamente de las proteínas externas de membrana L1
o L1/L2. Las VLPs semejan viriones reales desde el punto de vista de su estructura y de su
morfología, pero con la ventaja de que no contienen ADN viral, no son infectantes y no
inducen transformación. Los vectores de expresión utilizados para este tipo de vacunas
incluyen células de insectos, levaduras y bacterias.
Las vacunas terapéuticas inducen inmunidad celular específica que reconocen y
atacan las células infectadas por el virus que expresan los antígenos virales en la superficie,
permitiendo la regresión de tumores malignos. Para este tipo de diseño de vacuna se
utilizan las proteínas E6 y E7 ya que estas son constantemente expresadas en las células
19
cancerígenas. Las vacunas terapéuticas que se han utilizado, han sido basadas en péptidos,
en proteínas, vectores virales, vacunas de ADN y vacunas basadas en células44,66.
Brevemente se describen a continuación cada una de ellas.
A) Vacunas basadas en péptidos. Los péptidos utilizados en estas vacunas son
sintetizados a partir de determinadas secuencias de proteínas virales. Estos péptidos actúan
como antígenos que se unen a las moléculas del MHC y activan los receptores de las
células T. Las proteínas virales que se han utilizado para este diseño de vacuna
corresponden básicamente a E6 y E7. Los péptidos derivados de estás proteínas se han
ligado a moléculas del MHC-I y específicamente al alelo HLA-A*0201.21. Los
inconvenientes o dificultades de esta técnica son la baja inmunogenicidad del péptido, la
restricción de las moléculas de MHC y la necesidad de definir epítopes para los CTL. Se
han sugerido soluciones a éstas dificultades tales como el aumento del tamaño del péptido,
la adición de moléculas coestimuladoras o la utilización de un ayudante poderoso44.
B) Vacunas basadas en proteínas. Estas vacunas utilizan como el nombre lo dice,
proteínas completas que incluyan todos los epítopes posibles y potencialmente
inmunogénicos para cada haplotipo de MHC. En este diseño, las células presentadoras de
antígenos o los macrófagos capturan el antígeno y lo desdoblan en péptidos que son
cargados en las moléculas MHC-I y MHC-II, a diferencia de las basadas en péptidos en
donde éstas son intercambiados en la superficie de células presentadoras de antígenos con
péptidos endógenos. Estas vacunas de proteínas purificadas inducirían tanto la producción
de anticuerpos como una respuesta inmune de células Th y de CTL.
20
C) Vacunas basadas en vectores virales. Para el desarrollo de este tipo de vacunas
se construyen vectores virales que portan genes virales específicos (E6 y/o E7). Estos
vectores son utilizados como vehículos de transporte de antígeno viral hacia el interior de la
célula blanco para estimular a los CTL contra antígenos virales específicos. De esta
manera, el antígeno es procesado y presentado por moléculas del MHC-1 induciendo tanto
la producción de anticuerpos como la producción de células T y la activación de CTL. Se
han utilizado virus como la Vaccinia y los Adenovirus. Estos tipos de vacunas no debe
emplearse en pacientes inmunosuprimidos, ya que requieren ser administrados en varias
ocasiones (como refuerzo inmunológico), la respuesta inmunológica humoral y celular
desencadenada por el reconocimiento de proteínas derivadas de los adenovirus o del virus
de la vaccinia limitarían su administración múltiple44.
D) Vacunas basadas en ADN. Las vacunas de ADN corresponden al uso de ADN
desnudo en plásmidos, el cual es inyectado, por vía intramuscular, intradérmica o
intravenosa, que permite la captura por las células presentadoras de antígenos como una
expresión antigénica sostenida. Lo anterior aumenta la eficiencia de la activación de las
células T y promueve el acceso del antígeno hacia la vía del procesamiento de las
moléculas MHC-I44.
E) Vacunas basadas en células. En este tipo de vacunas se manipulan las células
presentadoras de antígenos de tal forma que son cargadas con proteínas, péptidos o ADN de
antígenos tumorales conocidos (E6 y E7). Otra estrategia es la manipulación genética de
células tumorales aisladas del paciente. Dichas células se transfectan con genes de citocinas
inmunoestimuladoras o moléculas co-estimuladoras y posteriormente se reintroducen al
21
paciente, con el fin de producir una respuesta inmune antitumoral44. Otro método innovador
es la utilización de células procariotas (bacterias) que sirvan como vehículo para liberar el
antígeno E7 y así producir una respuesta inmune contra el HPV-16, en general se utilizan
bacterias seguras para el organismo como Lactococcus lactis o Streptococcus gordonii67-69.
2.4.1. Adenovirus
Al diseñar una vacuna, hay que tener en cuenta el modo de presentar el antígeno, ya
que esto es un factor determinante para su efectividad. Actualmente los adenovirus son
vectores ampliamente usados para expresar proteínas recombinantes.
Los vectores adenovirales son virus sin envoltura y con ADN de doble cadena que
han sido empleados extensamente en la terapia génica, tratamiento del cáncer y
enfermedades genéticas.
Estos vectores son construcciones artificiales en las que se realizan modificaciones
en el genoma viral, mediante el reemplazo de algunos segmentos con DNA de una fuente
diferente. Estas modificaciones permiten entre otras cosas, desactivar la capacidad de
replicación e infección del virus y la clonación de genes heterólogos (E6 y E7). El resto de
las propiedades genéticas, estructurales y funcionales del virus quedan conservadas. En
estos vectores adenovirales se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta 7.5 kb, se
obtienen altos títulos de replicación, pueden infectar un amplio rango de células y tejidos de
22
mamíferos y estos adenovirus en terapia génica se mantienen en forma episomal con lo cual
se reduce la mutagénesis insercional y las consecuencias inherentes a ello70-71.
Los adenovirus son deficientes en replicación y requieren de un sistema de
complementación que es la línea celular HEK293 (human embryonic kidney 293)
modificada para que produzca constitutivamente los elementos E1 virales, que son
suprimidos en el vector adenoviral70-71.
Aunque existen otros tipos de virus que se han estado empleando para tratamientos
clínicos (retrovirus, poxvirus, virus adeno-asociados y herpes), los adenovirus presentan
ciertas ventajas que determinan su selección para emplearlos en la producción de vacunas.
Los adenovirus presentan una menor patogenicidad, además pueden transducir células con
gran número de partículas virales, un extenso rango de infección en diferentes tipos de
células tanto en reposo como en división con una alta eficiencia y no se integra a los
cromosomas70-71.
Todas estas características hacen del adenovirus recombinante un eficiente vehículo
de liberación génica y excelente herramienta de investigación; aunque también tiene la
desventaja de que expresan varias proteínas virales que produce una respuesta inmune del
organismo. Debido a lo anteriormente descrito, más de una transducción no es
recomendable a menos de que la exposición inicial esté acompañada de una modulación
inmunológica para suprimir la respuesta inicial a las proteínas de la cápsula adenoviral para
que no se produzca una inactivación del vector y que puede causar inflamación o daño del
tejido70-71.
23
2.4.2 Lactococcus lactis
Otros microorganismos utilizados como vectores son las bacterias
probióticas como lo es Lactococcus lactis. Esta bacteria ácido láctica se ha estudiado
extensamente y ha sido manipulada para la producción de proteínas heterólogas 25-28. El uso
de L. lactis para producir y secretar proteínas heterólogas presenta grandes ventajas
comparado a las que actualmente se manejan (por ejemplo E. coli y cepas atenuadas de
Salmonella y Mycobacterium).
Lactococcus lactis es una bacteria acido-láctica gram positiva y que por no ser
patógenica es ampliamente utilizado en la elaboración de alimentos fermentados, además
de que algunas especies exhiben efectos pro-bióticos en humanos además de ser
considerados microorganismos grado GRAS (por sus siglas en ingles “generally recognized
as safe”)29-31. L. lactis es una bacteria no colonizante del tracto digestivo28,32, lo cual
disminuye el riesgo de obtener una tolerancia al antígeno como sucede con otras bacterias,
y además de que por si sola funciona como coadyuvante. Los datos experimentales y
análisis genómico indican que solo unas pocas proteínas son naturalmente secretadas por L.
Lactis, por lo tanto se aumenta el interés en el uso potencial de ésta en experimentos de
secreción de proteínas de interés biotecnológico. Por lo tanto L. Lactis ha sido
extensamente manipulada para la producción y exportación de proteínas heterólogas con
alto valor antigénico o enzimático. El anclaje de proteínas a la superficie celular de L. lactis
o la secreción proteica al medio, son de gran interés para un gran número de aplicaciones
biotecnológicas72.
24
En la actualidad se han publicado trabajos en donde se produce y secreta la proteína
E7 del HPV-16 en dicha bacteria para estimular una respuesta inmune específica contra E7
en modelos murinos33,69,73.
Otra ventaja importante, es que la producción de este microorganismo es sencilla,
rápida y económica por lo que lo hace una herramienta ideal en la elaboración de vacunas
que se puedan utilizar en la población en general.
2.5. Modelo animal para el Cáncer cérvico uterino
El VPH debido a sus particularidades biológicas para infectar células humanas, hace
que los establecimientos de modelos celulares y animales sean muy difíciles. La estrategia
que se a seguido para la implementación de los modelos que se utilizan en la actualidad, es
el uso de la línea celular tumoral TC-1 que son células de epitelio de pulmón de la cepa de
ratones singénicos C57BL/6 que han sido transformadas in vitro con los oncogenes E6 y E7
del VPH-16 y ras.
25
Capítulo 3
3.1. JUSTIFICACIÓN
El CaCu representa uno de los problemas más graves de salud pública a escala
mundial y se considera como la segunda causa de muerte por cáncer en la mujer alrededor
del mundo. En México, se ha presentado como el cáncer más frecuente en la población
femenina en la última década y es considerado como la primera causa de muerte por
neoplasias en la mujer1. Más del 90% de los tumores de CaCu está asociado a HPV por lo
que el control de la infección de este virus es de suma importancia. En el presente trabajo
desarrollamos un tratamiento antitumoral basado en el desarrollo de una respuesta inmune
mediante la expresión del antígeno E7 del HPV, el cual ya está demostrado que induce una
respuesta inmune celular.
Nuestro trabajo se basó en dos sistemas importantes: en el primero utilizamos un
vector adenoviral que expresa la fusión del antígeno E7 a la proteína calreticulina, la cual es
muy prometedora contra el desarrollo de tumores que expresan E7. El segundo se basó en
un sistema inocuo para la presentación del antígeno E7 como lo es el uso de bacterias
lácticas. Este sistema día a día pone de manifiesto la capacidad de Lactococcus lactis para
la expresión y entrega de antígenos con el resultado de la inducción de una respuesta
inmune. Además, como es un vector de producción segura, sencilla, rápida y económica, lo
convierte en una estrategia muy conveniente para este tipo de inmunización.
26
Hasta la fecha no se ha reportado un tratamiento combinado, donde se utilice una
preinmunización con una bacteria láctica recombinante para mejorar la respuesta dada por
un tratamiento adenoviral. Es por esto, que nuestro trabajo es original e innovador.
Nuestros resultados marcan la pauta para su aplicación en humanos, en donde al
extrapolarlos, se inmunizaría a la población con el lactococcus recombinante y cuando se
presentase el tumor se reinmunizaría con el adenovirus directamente al tumor.
3.2. HIPOTESIS
El adenovirus que expresa E7 fusionado a calreticulina posee una mayor actividad
antitumoral que el que expresa únicamente E7 y este efecto se potencía con la
preinmunización de un L. lactis que expresa el antígeno E7.
3.3.OBJETIVO
Determinar si el adenovirus que expresa E7 fusionado a calreticulina posee una
mayor actividad antitumoral que el que expresa E7, y si este efecto se potencía con la
preinmunización de un L. lactis que expresa el antígeno E7.
27
3.3.1. Objetivos específicos
1. Determinar si un adenovirus que exprese E7 fusionado a calreticulina posee un
mayor efecto antitumoral que otro que exprese únicamente E7.
2. Analizar si la inmunización con Lactococcus lactis que expresa la oncoproteína E7
del VPH mejora el efecto antitumoral del tratamiento con los adenovirus que
expresan E7 y calreticulina/E7.
3. Determinar si el efecto antitumoral de los diferentes tratamientos inducen una
respuesta inmune celular.
28
Capítulo 4
MATERIAL Y MÉTODO
4.1. Ratones y Líneas Celulares
Ratones C57BL/6 hembras de entre 6 a 8 semanas de edad fueron obtenidos del
Laboratorio Harlan (Fig. 5). La línea celular tumoral TC-1 fue proporcionada por el Dr.
Augusto Rojas del Laboratorio de Terapia Génica del Departamento de Bioquímica,
Facultad de Medicina, UANL (Fig. 6). Esta línea celular fue crecida en medio DMEM
suplementada con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) inactivado por calor y 100 U/ml de
penicilina-streptomicina. Las líneas bacterianas fueron L. lactis NZ9000 (L.lactis) crecida
en medio M17 (Difco) suplementado con 1% de glucosa y L. lactis E7 (L.lactis-E7) para el
cual se utilizó el mismo medio solo que con 10µg/ml de Cloranfenicol (CM) y 10ng/ml de
Nisina para la inducción del antígeno E7.
Figura 6. Línea celular TC-1
Figura 5. Ratón de la cepa C57BL/6
29
4.2. Vectores adenovirales.
Se utilizaron cuatro vectores adenovirales recombinantes deficientes de replicación.
Los adenovirus que expresan LacZ (Ad-LacZ), IL-2 (Ad-IL2) y E7 (Ad-E7) del VPH-16
fueron proporcionados por el Dr. Augusto Rojas y el adenovirus que expresa la fusión
calreticulina/E7 (Ad-CRT/E7) fue construido previamente en nuestro laboratorio (Fig 7).
A)
B)
CMV Poly AES
SpeI HindIII
CRT E7
LITR RITR
CMV Poly AES
SpeI HindIII
CRT E7
LITR RITR
18kDa
Ad
-CR
T/E
7
65kDa
Ad
-La
cZ
Ad
-La
cZ
Ad
-E7
CRT/E7
E7 18kDa
Ad
-CR
T/E
7
65kDa
Ad
-La
cZ
Ad
-La
cZ
Ad
-E7
CRT/E7
E7
Figura 7. Casete de Expresión para la CRT/E7 en el Adenovirus y detección de E7 y CRT/E7
mediante Western Blot. (A) Esquema del casete de expresión de la CRT/E7 bajo la regulación del
promotor (CMV), conteniendo además, una señal de encapsidación (ES), secuencia de poliadenilación
(Poly A), secuencias repetidas terminales invertidas izquierda y derecha (LITR o RITR
respectivamente). (B) Western blot mostrando la expresión de E7 y CRT/E7 en la línea celular de
cáncer de pulmón A549 infectada a un MOI de 100. El Ad-LacZ sirvió como control negativo. E7 se
detectó usando un anticuerpo anti-E7 del VPH de ratón como una proteína de 18 kDa y la CRT/E7
como una proteína de 64kDa.
30
4.3. Preparación de células bacterianas
A cultivos de L. lactis E7 de 50 ml previamente inducidos con Nisina en medio
M17/Glucosa1%/CM se les tomó la densidad óptica (DO) en un espectrofotómetro a una
longitud de onda de 600 nm para calcular el número de unidades formadoras de colonias
(UFC) con la fórmula DO x 5 x 1X108 = UFC/ml. Después se centrifugó el cultivo y la
pastilla se lavó 3 veces con buffer fosfato salino (PBS 1X) y se resuspendió en un volumen
exacto de PBS para tener una concentración de 1 X 109 UFC en 10 µl.
4.4. Preparación de los vectores adenovirales.
Para la producción a gran escala de un vector adenoviral se requiere la
preamplificación con una producción a pequeña escala. El objetivo de esta técnica es contar
con un mínimo de partículas virales para que en un corto tiempo se pueda lograr la cosecha
del vector.
Las preamplificaciones y producciones virales se llevan a cabo en la línea celular
HEK-293. La línea celular HEK-293 son células de riñón embrionarias humanas. Estas
células están transformadas con los genes tempranos del adenovirus E1A y E3A, de este
modo se complementa la carencia de los genes tempranos en los adenovirus recombinantes
y pueden formarse las partículas virales. Estas son liberadas al medio de cultivo por lisis
celular (efecto citopático) (“CPE” por sus siglas en inglés).
31
4.4.1. Producción adenoviral
En primer lugar, en una campana de flujo laminar se introducen los materiales de
trabajo como pipetas serológicas de volúmenes variables, pipetor, gradillas de tubos de 15 y
50 ml, tubos Falcon de 50 y 15 ml, bote de desechos con cloro al 3%, parafilm y pipetas
Pasteur. Posteriormente se prende la luz UV por lo menos 15 minutos y el medio DMEM
adicionado con 10% de Suero Fetal Bovino (SFB) se calienta en baño maría a 37º C.
4.4.1.1. Preamplificación del adenovirus
Previamente, se obtuvo un frasco T-75 para cultivo con una confluencia del 70%
con células HEK-293.
A 5 ml de medio DMEM/ SFB 10%, se le adicionaron 50 µl del virus (ya sea en
lisado crudo o purificado) y se mezclaron para asegurar su homogenicidad. Este medio con
virus se colocó como cambio de medio en el frasco a transducir, agregándose lentamente
por las paredes del frasco. Se incubó a 37ºC por dos horas ladeando el frasco cada 15
minutos. Posterior a esta incubación se adicionaron otros 5 ml de medio DMEM con SFB
y se incubó hasta observar el efecto citopático como a los 3 días aproximadamente. Y se
cosechó cuando se observó un 50% de células despegadas.
El producto a cosechar se transfirió en tubos Falcon de 50 ml utilizando una pipeta
de 10 ml. Para despegar completamente las células, se utilizó el mismo medio del frasco,
vertiéndolo encima de las células hasta lograr su separación. Se centrifugó el producto por
32
10 minutos a 2000 rpm a 4ºC y se descartó el sobrenadante hasta dejar 2 ml de medio para
resuspender la pastilla de células. Se almacenó a -70ºC.
El producto de la cosecha se descongeló en baño a 37º. Se realizaron dos
congelaciones y descongelaciones más a las mismas condiciones. Finalmente se centrifugó
por 5 min a 3000 rpm y se tomó el sobrenadante. A este sobrenadante se le llamó lisado
crudo y se almacenó a -70ºC.
4.4.1.2 Producción a gran escala del adenovirus.
Para la producción a gran escala se utilizaron 15 platos de 150 ml conteniendo un
cultivo de células HEK-293 con una confluencia del 100%. Se homogenizó todo el lisado
crudo obtenido de la producción a pequeña escala en 105 ml de medio DMEM/ SFB 10%
fresco. Este homogenizado de medio y virus se utilizó como cambio de medio para las 15
placas conteniendo el cultivo celular. Primeramente se desechó el medio viejo que
contenían y se les añadieron 7 ml de medio con el virus, se incuban durante 2 horas
ladeando los platos cada 15 minutos. Se completó a 20ml de medio por plato y se incubó
hasta observar el efecto citopático y punto de cosecha. La cosecha y la formación del lisado
crudo se realizaron de la misma forma antes descrita.
33
4.4.1.3. Purificación de vectores adenovirales.
Dentro de la campana de flujo laminar, se colocó en tubos de polialómero
(Beckman 14x89mm) 2.4 ml de CsCl densidad 1.4 g/ml + 2.4 ml de CsCl densidad de 1.2
g/ml (este último gota a gota por las paredes) a esto se le llama gradiente discontíuo. Se
agregó el lisado crudo lentamente por las paredes. Se tapó con aceite mineral, procurando
llegar al borde del tubo. Se calibró el peso de los tubos a una diferencia no mayor de 0.01g,
se metieron en la camisa y se atornilló. Se colocaron en el rotor SW 41. Se establecieron las
condiciones de corrida en la ultracentrífuga Beckman a 35,000 rpm a 4ºC por 1 hr y 20
min. Se llevó el rotor al área de cultivo y se manejaron los tubos dentro de la campana para
la recuperación de la primer banda viral que aparece en el punto de cambio de densidad
(suelen aparecer dos). La banda inferior corresponde a las partículas infecciosas, la superior
a las partículas defectuosas. La banda inferior se recuperó con pipetas Pasteur estéril y
bulbo, quitando la capa de aceite primero y después se aspiró la banda evitando tomar
cloruro de cesio en exceso. Se colocó en un tubo estéril de 5 ml.
Se prepararon nuevamente tubos de polialómero con 9.3 ml de CsCl a una
densidad de 1.35 g/ml cada uno, se agregó lentamente la banda recuperada del gradiente
discontínuo (1.5 ml máximo por tubo) y se tapó con aceite mineral estéril y se calibraron.
Se centrifugaron a 35000 rpm a 4º por 18 hrs, luego se sacaron los tubos con cuidado para
no perturbar la banda y se trabajaron dentro de la campana. Se recuperó la banda inferior
con pipeta Pasteur y bulbo quitando la capa de aceite primero. La banda recuperada se
colocó en un tubo de 5 ml estéril.
34
Se procedió a la diálisis para retirar los restos de CsCl, para lo cual se preparó 1.5 L
del buffer I (Tris pH 7.8 10mM, NaCl 140mM, MgCl2 1mM). Se humedecieron los casetes
Slide a Lyser en este buffer por 3 min. Se retiró del buffer y se verifica que no tenga fugas
la membrana. Se aspiró la banda viral con una jeringa y aguja (22G) estériles y se introdujo
el virus por uno de los orificios señalados en el casete. Se aspiró el aire necesario para que
la suspensión viral aparezca uniforme dentro de la membrana. Se colocó dentro del buffer I
y se dializó con agitación continua moderada por una hora en cuarto frío (4ºC). Se cambió
el buffer de diálisis una vez y se dializó por una hora más. Posteriormente se cambió el
buffer 1 por un buffer de diálisis II (Tris pH 7.8 10mM, NaCl 140mM, MgCl2 1mM,
Glicerol 10%) y se dializó 1 hora en agitación suave a 4º.
Terminada la diálisis se recuperó la banda desalada del casete con una jeringa de
10ml, primero se introduce aire para poder succionar toda la banda y se colocó en un tubo
estéril de 5 ml. Se hicieron alícuotas de 50 ul y se colocaron en crioviales de 2 ml y se
almacenaron a -70º.
A todos los vectores adenovirales se les calculó el título de partículas virales. Se
descongeló una alícuota del virus (100ul) a 4º y se prepararon dos diluciones; la # 1 con 52
l de buffer de lisis (SDS 0.1%, Tris- HCl pH 7.4 10mM, EDTA 1mM) + 52 l del virus, y
la #2 utilizando 168 l de buffer de lisis + 42 l del virus. Para los blancos se utilizó el
buffer de diálisis II. Se incubaron las muestras a 56º por 10 min, con la dilución #1 se
preparó la dilución #3 haciendo una dilución 1:5, la dilución #2 se diluyó 1:5 y 1:10 para
preparar las diluciones # 4 y #5 respectivamente. Se leyeron al espectrofotómetro las
35
diluciones #3, #4 y #5 (2 veces) a 260 nm. Para determinar el título del vector en cada
dilución, se multiplicó la absorbancia por el factor de dilución y el coeficiente de extinción:
(DO260)(dilución del virus)(dilución de la cubeta)(1.1x1012) = PV/mL. El promedio de las
cuatro lecturas correspondió a la concentración de virus en PV/mL.
Las soluciones virales fueron resuspendidos en un volumen exacto de PBS para
tener la dosis de 5 X 1010 PV/ml in 20µl.
4.5. Detección de la expresión de E7 en Lactococcus lactis.
Para determinar si el Lactococcus lactis expresaba y secretaba las proteínas E7, se
analizaron las muestras del sobrenadante de los medios de cultivo con crecimiento de las
cepas recombinantes, por inmunoblot utilizando anticuerpos específicos para ambas
proteínas.
Preparación de extractos proteínicos. Se obtuvo un cultivo de 2 ml a una DO600=0.6, se
centrifugó a 14,000 rpm a 4ºC por 5 minutos; la fracción del sobrenadante así como la
fracción celular se procesaron por separado para un análisis por Western Blot.
Western Blot.
SDS-PAGE. Se preparó el gel resolutivo a una concentración del 12% y posteriormente el
gel concentrador. Las muestras se calentaron a 99ºC por 3 minutos antes de cargar en el gel.
36
Transferencia. Se lavó el gel resolutivo en buffer de transferencia (Tris Base 50mM,
Glicina 380mM, Metanol 20%, SDS 0.01%). Se preparó la membrana PVDF colocándola
en metanol y posteriormente en agua. Se colocó adecuadamente papel filtro-membrana-gel
resolutivo-papel filtro y se realizó una transferencia en “semi-seco” durante una hora
utilizando el “Trans-blot” de Biorad.
Bloqueo. Se colocó la membrana de transferencia en solución de TBS (Tris 20mM pH7.5,
NaCl 137mM, Tween 0.5%) y 10% de leche. Se bloqueó toda la noche a temperatura
ambiente.
Incubación con Anticuerpos. Se lavó la membrana en TBS y después se colocó en una
solución con el primer anticuerpo en una solución de TBS y 2% de leche; se incubó 1 hora
a temperatura ambiente. Se realizaron nuevos lavados con TBS; y se incubó con proteína G
unido a fosfatasa alcalina y finalmente se reveló con CDP Star.
Revelado. El segundo anticuerpo se encuentra unido al sustrato de la fosfatasa alcalina, la
cual en presencia del revelador emitió una señal que fue captada en un film fotosensible.
37
4.6. Inmunización intranasal de los ratones con Lactococcus
lactis que expresa E7 del HPV-16
Se inmunizaron ratones de la cepa C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad, con 1x109
unidades formadoras de colonias (UFC) de Lactococcus lactis que expresa E7. La
administración intranasal de Lactococcus se realizó en 10 l con una micropipeta por las
fosas nasales de los ratones en tres dosis a los días 0, 14 y 28 días para inducir una
respuesta inmune contra la oncoproteína E7. (Fig. 8).
Figura 8. Inmunización intranasal.
Para preparar la dosis, la noche previa se hizo un preinóculo con 50 l de glicerol
stock de Lactococcus lactis en 5 ml de medio M17/Glucosa 1%/CM 10ng/ml y se incubó
toda la noche a 30ºC. Al día siguiente se pasó el preinóculo a un volumen mayor de medio
(dependiendo del número de ratones que se inmunizaron), se dejó incubando hasta que las
bacterias alcanzaron una densidad óptica de entre 0.6 a 0.8, enseguida se procedió a inducir
con nisina el cultivo a una concentración final de 10ng/ml por 3 horas. Posteriormente se
38
midió la densidad óptica alcanzada y se calculó el número de UFC/ml multiplicando la
densidad obtenida por 5 y esto por 108 (D.O. X 5x108). Este resultado se multiplicó por el
volumen con el que se trabajó para obtener el número total de UFC. Enseguida se procedió
a obtener la pastilla celular, centrifugando a 3000 rpm a 4ºC por 10 minutos. La pastilla se
lavó 2 veces con PBS y se resuspendió en el volumen exacto de PBS para aplicar la dosis
requerida en el ratón. Se debe de agilizar el proceso de la obtención de las bacterias y el
manejo en hielo para asegurar el buen estado de estas al ser utilizadas para el siguiente paso
de inmunización de los ratones.
4.7. Inducción Tumoral en los ratones C57BL/6
Las células TC-1 utilizadas para generar el modelo tumoral murino son células
tumorales que expresan el E7 del HPV-16. Estas células se cultivaron in-vitro en medio
DMEM/Suero fetal bovino 10% a 37ºC, 5% CO2 y 100% de humedad. Para la
implantación en el modelo animal, se colectaron las células lavando con PBS y aplicando
tripsina al 0.25%. Se cosecharon en un tubo de 50 ml con medio/SFB10%, se contó el
número de células en la cámara de Neubauer y se calculó el número total en base al
volumen final. Se centrifugaron a 3000rpm a 4ºC por 10 minutos y el botón celular se
resuspendió en un volumen adecuado de PBS para aplicar la dosis correcta.
El implante de las células tumorales en las ratones se realizó de forma subcutánea
en la pierna derecha con una dosis de 1x105 células en un volumen de 100 µL con una
jeringa de tuberculina con aguja de 29G (Fig. 9).
39
Se monitoreó el desarrollo tumoral diariamente para localizar a los ratones con un
tamaño aproximado de entre 5 a 7 mm para empezar con el tratamiento terapéutico.
Figura 9. Implante de células TC-1. A, Depilación de la zona. B, Zona depilada. C, Manipulación de un
ratón con un inmovilizador de acrílico. D, Inyección de las células TC-1 de forma subcutáneaen la pierna
derecha del ratón.
4.8. Tratamiento Terapéutico con los vectores Adenovirales
que expresan E7, E7/CRT e IL-2.
Una vez que los ratones desarrollaron el tumor se procedió al tratamiento
terapéutico con el vector adenoviral que expresa el gen de interés. Este vector se administró
A B
C D
40
con la inyección de 20 µl de la dilución correcta del los vectores directamente en el tumor
con una jeringa Hamilton con aguja de 29G, como se observa en la figura 10. El tamaño del
tumor inicial se anotó y se marcó el ratón en la oreja para identificarlo y poder realizar el
monitoreo del crecimiento tumoral.
Se utilizaron grupos de ratones necesarios con diferentes tratamientos dependiendo
de los objetivos.
Figura 10. Aplicación del tratamiento terapéutico. A, Tumor ya establecido. B, Inmovilización del ratón.
C, Aplicación de la dosis del vector adenoviral.
A B
C
41
4.9. Tratamiento combinado profiláctico y terapéutico
La dosis antes mencionada de L. lactis E7 y L. lactis NZ9000 (silvestre) se aplicó en
las mismas condiciones descritas anteriormente; una semana después de la última
inmunización, los ratones fueron inyectados subcutáneamente en la pierna derecha con 100
µl de PBS conteniendo 1 X 105 células TC-1. Posteriormente los ratones se monitorearon
constantemente hasta que el diámetro del tumor establecido oscilaba alrededor de los 6 mm,
para proceder a la aplicación intratumoral de 5x1010 PV/ml en 20 µl del vector adenoviral.
Las dimensiones de los tumores fueron medidas cada tercer día en dos direcciones
perpendiculares con un calibrador Vernier y el volumen de los tumores fue estimado por la
fórmula de un elipsoide (SD2)(LD)(0.5236) en donde SD es el diámetro menor y LD es el
diámetro mayor. También se monitoreó la supervivencia de los ratones hasta el día de su
muerte o sacrificio cuando los tumores superaban los 2 cm de diámetro.
4.10. Evaluación del Crecimiento Tumoral
Para evaluar el crecimiento de los tumores fue necesario sacar el promedio de los
diámetros día por día, sumando el diámetro menor mas el diámetro mayor entre dos (DP=
[Dmenor+Dmayor]/2). Los datos recolectados en cada observación (DPdia x) se dividieron
por el valor de DP al día de la transducción (DPdia0) y se multiplicaron por 100 para
obtener el índice de crecimiento relativo o ICR (ICR= [DPdía x/DPdía0] x 100). Los
valores de ICR de cada tumor por día se promediaron para cada grupo de tratamiento y se
determinaron los errores estándares.
Para los estudios de eficacia antineoplásica se agruparon y promediaron los ICR de
los animales que pertenecen a los grupos tratados con los vectores adenovirales y sus
42
controles. A este ICR se le resta 100 para obtener la proporción neta de crecimiento tumoral
(PNCT) en cada punto de la observación y se determinan los promedios y errores
estándares. Con estos datos se construyó una curva de crecimiento para determinar la
eficacia de los tratamientos y poder ver si existía una regresión tumoral o disminución del
volumen tumoral.
4.11. Análisis de Supervivencia.
Para llevar a cabo el análisis de supervivencia, se registró el tiempo de vida de los
ratones utilizados en este estudio. Registrándose la causa de muerte ya sea porque fueron
sacrificados debido a que el tamaño rebasó 25 mm o por la fuerte agresividad del tumor.
Con los datos de supervivencia de cada animal se construyó una curva de Kaplan Meier
para analizar la eficacia de la terapia para prolongar la supervivencia de los ratones.
4.12. Sacrificio y obtención de tejidos.
Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. La obtención de los tejidos
(bazo y tumor) se realizó en condiciones de absoluta esterilidad, dentro de una campana de
flujo laminar. El tumor se fijó con paraformaldehído al 4% (PFA). El bazo se colocó en
medio DMEM con SFB10%, se disgregó con el émbolo de una jeringa y una malla de acero
inoxidable estériles para homogenizar las células del bazo y posteriormente se pasaron a
través de un filtro de 30 µm para individualizar las células. Posteriormente se realizó un
conteo celular y viabilidad con el colorante azul de tripano y una cámara de Neubauer al
microscopio.
43
4.13. Detección de IFN-
Diez millones de células de bazo (1x107) de los diferentes tratamientos fueron co-
cultivadas con 1x106 células TC-1 tratadas previamente con mitomicina C (30µg/ml por 2
h) en placas de 6 pozos por 3 días. Posterior a la incubación se colectó el sobrenadante para
determinar los niveles de IFN- mediante la utilización de un kit de ELISA para IFN-
(RD systems) de acuerdo al protocolo recomendado por el proveedor.
4.14. Análisis de citometría de flujo.
Con los linfocitos obtenidos del tejido esplénico se realizó un análisis de los tipos de
células y su porcentaje. Para esta técnica es necesario separar 5x106 linfocitos en tubos
corning de 5 ml para citómetro, se centrífuga a 1200 rpm a 4ºC por 10 minutos, y se
elimina el sobrenadante. El botón celular se lava una vez con PBS y se vuelve a centrifugar.
A la pastilla celular se le aplican 10 µl de los anticuerpos fluorescentes anti-ratón CD4-
FITC (para detectar linfocitos T cooperadores), CD8-APC (para detectar linfocitos T
citotóxicos), CD49b-PE (para células NK) y un marcador de isotipos. Posteriormente se
incuban en oscuridad por 15 minutos a temperatura ambiente y se centrifuga para obtener el
botón y finalmente se resuspende en 1 ml de PBS. Las células se analizaron con un
citómetro de flujo para calcular la cantidad de cada una de las células en las muestras.
44
4.15. Preparación de las piezas de tumor para su análisis
histológico.
De los ratones que fueron sacrificados previamente para obtener los linfocitos, a la
par también se extrajo una porción del tumor y del bazo para ser procesados para su análisis
histológico. Las piezas se colocaron en una caja petri con PBS y se cortaron de
aproximadamente 8mm3 para cada órgano, la mitad de las piezas se colocaron en la
solución fijadora de paraformaldehido al 4% (PFA), la otra mitad se congeló en Tissue Tek
para su posterior uso.
Las piezas que se fijaron en PFA por 2 días, se procesaron para su inclusión en
parafina, para lo cual, el primer paso fue su deshidratación por cambios graduales de
etanoles de 1 hora en cada uno en el siguiente orden: PBS1X 2 veces, Etanol 30%, Etanol
50%, Etanol 70%, Etanol 96% y Etanol absoluto. Posteriormente se aclararon las piezas
pasándolas a las siguientes soluciones también por 1 hora: Etanol:Xilol 1:1, Xilol y Xilol.
Después se incluyeron en parafina líquida a 60ºC con dos cambios de 1 hora cada uno,
finalmente se colocaron las piezas en moldes de montaje, se les agregó parafina líquida y se
dejaron enfriar hasta su soldificación.
Las piezas incluidas en parafina se cortaron en un microtomo con un grosor de 6
micrómetros y se colocaron en laminillas superfrost de corning y las piezas congeladas se
cortaron en un criostato a un grosor de 10 micrómetros y se colocan en laminillas
superfrost.
45
4.16. Análisis morfológico de los cortes de tumor.
Para el análisis morfológico se utilizó la tinción de Hematoxilina y Eosina (HE).
Los cortes se desparafinaron e hidrataron para llevar a cabo una tinción de Hematoxilina y
Eosina, para lo cual los cortes en parafina son hidratados pasándolos por: Xilol 5 min dos
veces, Etanol absoluto 5 min dos veces, Etanol 50% 5 min, agua destilada 5 min por 2
veces, Hematoxilina 30 segundos, agua corriente 1 minuto, agua destilada 1 minuto,
alcohol ácido 1 minuto, agua destilada 1 minuto, Eosina 3 inmersiones, lavado con agua
corriente y agua destilada, etanol 96% 2 minutos, etanol absoluto 2 cambios de 2 minutos,
etanol:xilol 1:1 2 minutos y 2 cambios de xilol de 2 minutos. Los cortes una vez
deshidratados en xilol, se montaron con entellan y un cubreobjetos.
4.17. Evaluación de la inducción de apoptosis en los tumores.
Los cortes en parafina de los tumores de los diferentes tratamientos fueron
desparafinados y rehidratados para su utilización en la técnica de TUNEL con un kit de
detección de apoptosis (Trevigen) con el procedimiento recomendado por el proveedor. En
el cual previamente se hizo un tratamiento con proteinasa K (1 µl de PK en 50µl de H2O
desionizada) y se incubó por 30 minutos, posteriormente se lavaron las laminillas con H2O
desionizada y se sumergieron en solución bloqueadora por 5 minutos a temperatura
ambiente (45 ml de metanol + 5 ml de H2O2 30%), se lavaron con PBS y posteriormente se
sumergieron en el buffer TdT 1X por 5 min, para posteriormente cubrir con 50 ul de la
mezcla de reacción de marcaje y se incubó por 90 min a 37º y cámara húmeda. Después se
sumergieron en buffer stop TdT 1X por 5 min. a temperatura ambiente, se lavó con PBS, y
después se colocó la solución strip HRP y se incubó 10 min a 37º, se lavó con PBS y se
46
sumergieron en solución DAB de 2 a 7 min. Se lavó con H2O desionizada y se contratiñó
con verde de metilo, se deshidrataron y se montaron con entellan y cubreobjetos.
4.18. Detección de linfocitos T CD8+ mediante inmunohistoquímica
Los cortes en parafina de los tumores de los diferentes tratamientos se
desparafinaron y rehidrataron, después fueron bloqueados con suero de caballo al 1% en
PBS por 1 hora, se lavaron con PBS y se incubó por 2 horas a temperatura ambiente con el
anticuerpo anti ratón CD8-FITC (Milteny). Posteriormente se lavó y se montó la laminilla
con vectashield (Vector) y se analizaron en un microscopio confocal de fluorescencia
(Leica TCS SP5) con sistema de captura y análisis de imágenes, lampara UV y Laser.
47
Capítulo 5
RESULTADOS
5.1. La Calreticulina incrementa dramáticamente el efecto
antitumoral de un adenovirus que expresa E7.
Los tratamientos terapéuticos son de gran importancia debido a que la mayoría de
las pacientes empiezan su tratamiento en estadios avanzados del cáncer cérvico uterino.
Debido a esto, analizamos la eficacia antitumoral del Ad-CRT/E7 en ratones con tumores
inducidos por la línea celular TC-1. Después de que los tumores alcanzaron un diámetro
aproximado de 6 mm se administraron intratumoralmente una sola dosis de los diferentes
adenovirus Ad-CRT/E7, Ad-E7 y Ad-IL2, así como sus respectivos controles Ad-LacZ y
PBS. Se monitoreó el desarrollo del tumor en función del tiempo registrando el diámetro
menor y el diámetro mayor para calcular el volumen tumoral mediante la fórmula de un
elipsoide, y además se contabilizó la supervivencia. Los resultados se muestran en la Figura
11A en donde observamos que los grupos de ratones inmunizados con los adenovirus que
expresan E7 e IL2 (Ad-E7 y Ad-IL2) el crecimiento tumoral fue constante a través del
tiempo, con un volumen de 5000 a 6000 mm3 a los 28 días, y muy similar al que
presentaron los grupos control tratados con Ad-LacZ y PBS. En contraste, el tratamiento
con el Adenovirus que expresa E7 fusionada a calreticulina (Ad-CRT/E7) indujo una
regresión tumoral total en el 46% de los ratones (6/13) y en el 54% restante (6/13) el
desarrollo tumoral fue más lento, alcanzando en el mismo tiempo valores de 2000 mm3.
48
Al analizar el efecto de las inmunizaciones anteriores sobre la superviviencia de los
ratones encontramos que en los grupos control (Ad-LacZ y PBS) y en el tratado con Ad-
IL2 y Ad-E7, todos los ratones habían muerto para el día 70 posterior a la aplicación de los
Adenovirus. En contraste para ese mismo día, en el grupo de ratones en donde se aplicó el
tratamiento Ad-CRT/E7 encontramos 3 ratones vivos de los 13 utilizados (23%) los cuales
se mantuvieron con vida al menos durante un período de 300 días (Fig. 11B).
5.2. La preinmunización intranasal con Lactococcus lactis-E7 potencía el
efecto antitumoral de Ad-CRT/E7.
Una vez demostrado que el Ad-CRT/E7 es el que presenta un mayor efecto
antitumoral nos abocamos a determinar si una preinmunización con bacterias lácticas
expresando E7 en su superficie podría mejorar dicho efecto. Para esto diferentes grupos de
ratones se inmunizaron intranasalmente con una cepa de L. lactis que expresa E7,
posteriormente se dio el reto con las células tumorales TC-1 y finalmente se aplicó el
Adenovirus correspondiente. En este experimento nuevamente se utilizaron como controles
Ad-LacZ y PBS, y una cepa silvestre de L. lactis y se monitoreó el crecimiento tumoral y la
superviviencia de los ratones. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 12.
49
Figura 11. Análisis del efecto antitumoral de un Adenovirus que expresa calreticulina fusionada a E7.
Cinco grupos de ratones fueron inoculados subcutáneamente en la pierna derecha con 5x104 células TC-1.
Cuando los tumores tenían entre 6-7 mm de diámetro, se administró intratumoralmente los diferentes
Adenovirus a una dosis de 5X1010 PV en 20µL. Adenovirus y tamaño del grupo (n): Ad-CRT/E7 (n=13), Ad-
E7 (n=13), Ad-LacZ (n=7), Ad-IL2 (n=7) y PBS (n=7). (A) Crecimiento tumoral en función del tiempo. El
crecimiento tumoral fue monitoreado cada tres días, se calculó el volumen mediante la fórmula de un
elipsoide y se graficaron las medias de cada grupo. Las líneas verticales punteadas corresponden al error
estándar de cada grupo. El tratamiento con Ad-CRT/E7 mostró una diferencia estadísticamente significativa
(P< 0.05). (B) Curva de supervivencia. Se registró el porcentaje de ratones sobrevivientes por un periodo de
300 días.
b)
a)
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250 300
Días postransducción
%
Ad-E7 n=13
Ad-CRT/E7 n=13
Ad-LacZ n=7
Ad-IL2 n=7
PBS n=7
50
En la Figura 12A observamos que el grupo de ratones tratados únicamente con PBS
el crecimiento tumoral fue constante en función del tiempo alcanzando un volumen tumoral
de 6200 mm3 a los 28 días. Este comportamiento fue muy similar para los grupos en donde
se utilizaron los tratamientos combinados L. lactis-E7 + Ad-E7 y L. lactis + Ad-LacZ.
Nuevamente la mejor inhibición de desarrollo tumoral se observa en aquellos grupos en
donde se utilizó el Adenovirus que expresa la fusión Calreticulina-E7 (Ad-CRT/E7), con la
diferencia de que en el tratamiento donde se combinó con la cepa de Lactococcus lactis que
expresa E7 se obtuvo una mejor inhibición del crecimiento tumoral que combinándolo con
una cepa silvestre de L. lactis. observó un desarrollo tumoral homogéneo y constante en
todos los ratones muy similar al que presentó el control PBS, a diferencia de los grupos de
ratones en donde se utilizó el tratamiento L. lactis + Ad-CRT/E7 y L. lactis-E7 + Ad-
CRT/E7 en donde observamos regresión tumoral total en 4 de 12 ratones para el primer
tratamiento y 6/12 ratones para el tratamiento L. lactis-E7 + Ad-CRT/E7 en el resto de los
ratones de estos grupos encontramos un desarrollo tumoral pobre y lento, cabe resaltar que
en el ultimo tratamiento en donde se hace una preinmunización con L. lactis-E7 mas el Ad-
CRT/E7 mostró un menor desarrollo del volumen tumoral y mayor cantidad de ratones con
regresión tumoral total que el tratamiento en donde solo se utilizó L. lactis silvestre como
preinmunización mas el Ad-CRT/E7.
Al analizar la supervivencia de los ratones (Fig. 12B) observamos que en los
tratamientos combinados de L. lactis-E7 + Ad-LacZ, L. lactis + Ad-LacZ y el control PBS,
en donde en ninguno de ellos observamos un efecto antitumoral significativo, tampoco
observamos un efecto positivo en la supervivencia, ya que para el día 50 posterior a las
inmunizaciones ya habían muerto todos los ratones. Nuevamente encontramos
51
sobrevivientes en los grupos en donde utilizamos el Adenovirus que expresa la fusión de
Calreticulina-E7, con la gran diferencia que al combinarlo con un L. lactis que expresa el
antígeno E7 en su superficie se alcanzó un 70% de sobrevivientes los cuales se mantuvieron
con una regresión completa del tumor y sin problemas aparentes por al menos 300 días. El
grupo de ratones en donde se utilizó el tratamiento L. lactis silvestre + Ad-CRT/E7 tuvimos
un comportamiento de la supervivencia mejor que los controles inicialmente mencionados,
mas sin embargo para el día 100 solo quedó un 25% de ratones vivos y un 16.6% a los 300
días. De acuerdo con estos resultados podemos concluir que la preinmunización con L.
lactis-E7 potencía el efecto antitumoral del Ad-CRT/E7 al disminuir el desarrollo del
volumen tumoral y al aumentar la supervivencia.
52
Fig. 12. Análisis del efecto antitumoral de un tratamiento combinado de Ll-E7 y Adenovirus con
CRT/E7. Se inmunizaron intranasalmente cinco grupos de ratones con L. lactis-E7, L. lactis silvestre o PBS a
los días 0, 14 y 28. Después de una semana se inyectó s.c. células tumorales TC-1 en la pierna derecha.
Cuando los tumores tenían entre 6-7 mm de diámetro, se administró intratumoralmente los diferentes
Adenovirus a una dosis de 5X1010 PV en 20µL. Adenovirus y tamaño del grupo (n): L. lactis+Ad-CRT/E7
(n=12), L. lactis-E7+Ad-CRT/E7 (n=12), L. lactis silvestre+Ad-LacZ (n=7), L. lactis-E7+Ad-LacZ (n=7) y
PBS (n=7). (A) Crecimiento tumoral en función del tiempo. El crecimiento tumoral fue monitoreado cada
tres días, se calculó el volumen mediante la fórmula de un elipsoide y se graficaron las medias de cada grupo.
Las líneas verticales punteadas corresponden al error estándar de cada grupo. Los grupos de L. lactis+Ad-
CRT/E7 y L. lactis-E7+Ad-CRT/E7 fueron significativamente diferentes con una P< 0.05. (B) Curva de
supervivencia. Se registró el porcentaje de ratones sobrevivientes por un periodo de 300 días.
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200 250 300
Días Postransducción
% Ll+Ad-CRT/E7 Ll-E7+Ad-CRT/E7 Ll+Ad-LacZ Ll-E7+Ad-LacZ PBS
b)
a)
53
5.3. El tratamiento con Lactococcus lactis E7 y adenovirus-CRT/E7
produce un mayor porcentaje de ratones con regresión tumoral
completa.
Para hacer una correlación entre la sobrevivencia y la regresión tumoral graficamos
el porcentaje de ratones libres de tumor al día 94 del experimento de la figura 12B y los
resultados se presentan en un histograma de la Fig. 13. Podemos observar que los únicos
ratones que sobrevivieron al reto tumoral fueron los de los dos grupos que en común habían
recibido un tratamiento con el Ad-CRT/E7. Uno de estos grupos corresponde al tratamiento
de L. lactis silvestre + Ad-CRT/E7 el cual a este tiempo todavía contaba con un 22% de
ratones vivos, y más notablemente el grupo de L. lactis E7 + AdCRT/E7 contaba con un
70% de ratones vivos (Fig. 13) los ratones que tuvieron una regresión completa son los que
a final de cuenta sobrevivieron al final del experimento.
0
20
40
60
80
100
%
Ll-E7+Ad-E7 Ll-E7+Ad-IL2 Ll+Ad-LacZ PBS Ll+Ad-CRT/E7 LlE7+Ad-CRT/E7
Ratones Libres de Tumor
Figura 13. Porcentaje de ratones libres de tumor. Se utilizaron los resultados del experimento anterior y se
graficó el porcentaje de ratones libres de tumor al los 94 días posterior a la implantación de las células TC1.
54
5.4. Los tumores en regresión del tratamiento combinado de Lactococcus
lactis-E7 y Ad-CRT/E7 presentan infiltración de linfocitos T CD8+.
Como ya lo hemos mencionado la respuesta inmune celular está caracterizada por la
acción conjunta de linfocitos y macrófagos cuyo fin es la destrucción o neutralización del
agente extraño. Las células T citotóxicas (CD8+) representan una línea de defensa contra
infecciones virales y para eliminar céulas transformadas. Con el propósito de determinar si
el efecto antitumoral observado en nuestro modelo experimental era mediado por este tipo
de células, decidimos evaluar la cantidad de linfocitos T CD8+ infiltrados en el tejido
tumoral. Primeramente, mediante la técnica histológica de rutina con tinción HE se
revisaron cortes histológicos de los tumores con y sin regresión. En los tumores sin
regresión, que no tuvieron un efecto positivo a los tratamientos, encontramos una
celularidad uniforme de células transformadas en todos los cortes en combinación de una
vascularización notable. Un ejemplo de este comportamiento se muestra en la
microfotografía de la Fig. 14B correspondiente al corte de un tumor desarrollado en un
tratamiento control (L. lactis silvestre + Ad-LacZ) con abundante celularidad y
vascularización (flechas blancas). En contraste en los cortes de tumores en regresión de los
tratamientos que respondieron positivamente al tratamiento encontramos una disminución
de la vascularización y un infiltrado de células muy semejantes a linfocitos, con núcleos
redondeados, poco citoplasma y muy pigmentados; un ejemplo de este comportamiento lo
podemos observar en la microfotografía de la Fig. 14A la cual corresponde a un corte de
tumor en regresión del tratamiento combinado L. lactis-E7 + Ad-CRT/E7 en donde
podemos observar el infiltrado de células parecidas a linfocitos (puntas de flecha blancas) y
una vascularización deficiente.
55
Para comprobar que efectivamente el infiltrado celular correspondía a linfocitos se
procedió a realizar una inmunohistoquímica con fluorescencia utilizando anticuerpos anti-
CD8 marcados con FITC (anti ratón CD8-FITC). Con esta técnica encontramos en los
cortes de tumores sin regresión ausencia de células teñidas positivamente, a diferencia de
los cortes de tumores en regresión (Fig. 14C) en donde pudimos encontrar una gran
cantidad de células teñidas positivamente de color verde fluorescente (puntas de flecha
blancas) indicativo de la presencia de linfocitos CD8+.
Fig 14. Análisis Histológico y por Inmunofluorescencia de Linfocitos T en los tumores en regresión. (A) y (C) Secciones de tumores en regresión visualizados con tinción con Hematoxilina y Eosina e
inmunofluorescencia respectivamente; las puntas de flecha señalan linfocitos T infiltrados. (B) y (D)
Secciones de tumores sin regresión visualizados con tinción con Hematoxilina y Eosina e
inmunofluorescencia respectivamente, las flechas señalan vasos sanguíneos. A y B se observaron a 400X , C
y D a 600X .
A B
C D
56
Además llevamos a efecto una asociación entre el desarrollo tumoral y el porcentaje
de linfocitos T y NK. Esto se realizó por citometría de flujo analizando las células de bazo
de ratones de los diferentes tratamientos, utilizando anticuerpos anti ratón contra linfocitos
T (anti CD90-FITC) y contra linfocitos NK (anti CD49-PE). Encontramos que en los
ratones sin regresión tumoral el porcentaje de linfocitos T (0.3-3.79 %) y NK (0.27-0.43)
fue similar entre ellos (Fig. 16 B, C y D), mientras que en los ratones con regresión tumoral
el porcentaje de linfocitos T y NK fue significativamente mayor con valores de 18.88 % y
2.68 %, respectivamente (Fig. 15A).
Este gran aumento en la cantidad de células asociadas a la respuesta inmune celular
en los tumores de ratones que respondieron positivamente al tratamiento con regresión, nos
hace pensar en la participación preponderante de la respuesta inmune celular en la
eliminación del tumor.
5.5. Inducción de apoptosis en los tumores en regresión.
El mecanismo principal de la muerte celular producida por los linfocitos T
citotóxicos es la liberación de las proteínas perforinas y granzimas, en donde las primeras
forman canales acuosos que permiten el paso de las segundas que a su vez activarán las
caspasas responsables de inducir apoptosis en las células blanco. Otra señalización de
muerte por apoptosis ocurre cuando los linfocitos T citotóxicos expresan una proteína
denominada Fas ligando que se une a las proteínas Fas de las células blanco.
57
Figura 15. Cuantificación de linfocitos T y NK en los tratamientos con regresión tumoral por citometría
de flujo en bazos de ratones con tumor. Se obtuvieron esplenocitos de ratones que mostraron tumores con y
sin regresión. Se tomaron 2X106, se reaccionaron con los anticuerpos correspondientes para la detección de
Linfocitos T (anti CD90-FITC) y linfocitos NK (anti CD49-PE). En el tratamiento Ll-E7 + Ad-CRT/E7 en
donde encontramos regresión tumoral (A) observamos un aumento en el porcentaje de linfocitos T y NK
diferente a los demás que no poseen regresión tumoral (B, C y D).
2.3 0.34 PBS (sin regresión) D
0.3 0.27 Ll-E7+Ad-LacZ (sin regresión) C
3.79 0.43 Ad-E7 (sin regresión) B
18.88 2.68 Ll-E7+Ad-CRT/E7 (con regresión) A % Linfocitos T % NK Tratamiento
A
D C
B
58
Dada la infiltración de linfocitos observada y su participación en la inducción de
apoptosis, evaluamos la presencia de cuerpos apoptóticos en los tumores de los diferentes
tratamientos analizados, mediante un ensayo de TUNEL.
Al aplicar el ensayo de TUNEL a cortes de tumores sin regresión, es decir tumores
de ratones que no respondieron positivamente a los tratamientos, la presencia de células en
apoptosis fue muy baja. Un ensayo representativo se muestra en la Fig. 16B donde
observamos únicamente un cuerpo apoptótico (punta de flecha negra). Por el contrario en
cortes de tumores que mostraron regresión tumoral, es decir que si respondieron al
tratamiento, encontramos una gran cantidad de cuerpos apoptóticos. Un ensayo de TUNEL
representativo se muestra en la Fig. 16A donde se observa una gran cantidad de células
teñidas en color marrón indicativo de células en apoptosis (puntas de flecha color negro).
Estos resultados nos indican que uno de los mecanismos involucrados en el efecto
antitumoral de los tratamientos es a través de la inducción de apoptosis.
Figura 16. Detección de apoptosis por ensayo de TUNEL en tumores en regresión. Secciones de tumores
en regresión (A) y sin regresión (B) se sometieron a un ensayo de apoptosis utilizando el kit de TREVIGEN.
Las puntas de flecha señalan células en apoptosis. Amplificación 400X.
A B
59
5.6. Inducción de IFN gamma en los ratones con tumor en regresión
El IFN- es la principal citosina de activación para macrófagos y realiza funciones
importantes en el mecanismo de la inmunidad celular y es producida principalmente por los
linfocitos T CD8+, TH1 CD4+ y NK durante la respuesta inmune. Es por esto, que también
se evaluó la producción de IFN-, como un parámetro más de medición de inducción de
una respuesta inmune celular. Este experimento consistió en obtener linfocitos de bazos de
ratones de los diferentes tratamientos, exponerlos a las células tumorales TC-1 y medir su
capacidad de secreción de IFN- mediante un ELISA. La concentración de IFN- en los
grupos sin regresión tumoral Ll-E7+Ad-LacZ y Ll+Ad-LacZ fue casi nula y comparable a
la concentración de IFN- del grupo de ratones normales a los que no se le hizo ninguna
manipulación. En contraste en los tratamientos que presentaron un proceso de regresión
tumoral (Ll-E7+Ad-CRT/E7) la secreción de IFN- fue significativamente mayor en el
orden de los 1400 pg/ml (Fig 17). Además aún y cuando el tumor ya había desaparecido
(regresión total) se observó una producción significativa de IFN- en el orden de 750 pg/ml.
60
0
400
800
1200
1600
NORMAL Ll-E7+Ad-CRT/E7
regresión total
Ll-E7+Ad-CRT/E7
regresión
Ll+Ad-LacZ Ll-E7+Ad-LacZ
Concetración de INF gamma (pg/ml)
Figura 17. Detección de IFN- en los tumores en proceso de regresión. Se obtuvieron linfocitos de bazo de
ratones con tumores en regresión y sin regresión y se cocultivaron con células tumorales TC1. Se incubaron
por 3 días a 37 y se midió la concentración de IFN- en el medio de cultivo mediante un ensayo de ELISA.
En ratones con tumores en proceso de regresión la concentración de IFN- es mayor.
61
Capítulo 6
DISCUSIONES Los tratamientos que se manejan en la actualidad en contra del virus del papiloma
humano causante del cáncer cérvico uterino, se basan en dos estrategias principales: la
profiláctica y la terapéutica.
La primera estrategia se basa principalmente en crear inmunidad específicamente
contra las proteínas de la cápside viral como son la L1 y la L2 para evitar la entrada del
VPH al organismo. Esta estrategia ha tenido muy buenos resultados a la fecha, sin embargo
existe un gran número de personas que desafortunadamente ya han adquirido el virus del
papiloma humano y que además ya han desarrollado el cáncer cervicouterino. Para resolver
esta problemática se utiliza la segunda estrategia, en la que se genera inmunidad en contra
de las proteínas tardías encargadas de la transformación celular como lo son E6 y E7.
Nuestro principal interés fue establecer un tratamiento que previniera o atacara el
desarrollo tumoral, es decir, implementar un tratamiento combinado que fuera tanto
profiláctico como terapéutico, inovando en la forma de presentación del antígeno y
enfocándonos en evitar o atacar el desarrollo tumoral.
En la primera etapa de nuestro trabajo evaluamos el efecto antitumoral de un
adenovirus portando la proteína calreticulina fusionada a la proteína E7, en un modelo
murino comúnmente usado como modelo animal del cáncer cervicouterino. La
administración de Ad-CRT/E7 en ratones con tumor ya establecido dio como resultado un
62
efecto sorprendente en la regresión tumoral, es decir, observamos una disminución en los
diámetros analizados hasta llegar a la desaparición total, mientras que en el adenovirus que
expresa únicamente E7 todos los ratones murieron por consecuencia del desarrollo tumoral.
Estos resultados muestran el gran efecto adyuvante que esta siendo ejercido por la
Calreticulina de llevarse directamente el antígeno E7 al retículo endoplásmico que es donde
finalmente se combinan los epítopes de los antígenos con el MHC1. Por otro lado también
se ha observado que la calreticulina posee propiedades antiangiogénicas que también
podrían estar contribuyendo al efecto antitumoral64 al disminuir la vascularización y con
ello el aporte de nutrientes. De hecho en un trabajo realizado por Kim J.W. en donde se
utilizó inmunizó con DNA que expresa únicamente calreticulina, su efecto antitumoral fue
0% en comparación con 100% expresando Calreticulina-E720. Con los experimentos
realizados en este trabajo no podemos inferir en que medida la actividad antiangiogénica de
la Calreticulina pudiera estar contribuyendo en la inhibición del desarrollo tumoral. Los
hallazgos histológicos obtenidos muestran que los tumores en regresión poseen una
vascularización muy pobre, contrario a lo que se observa en los tumores con crecimiento
sostenido que poseen una vascularización notable.
En la segunda etapa se trabajó con la evaluación del tratamiento profiláctico
intranasal de L. lactis E7, para prevenir la formación de tumor en el modelo animal. Con
este tratamiento los resultados no fueron satisfactorios, ya que la mayoría de ratones
desarrollaron tumor y no hubo una diferencia muy grande con los controles utilizados. Cabe
mencionar que nuestros resultados se contradicen con los resultados reportados
previamente, los cuales mencionan que dicho tratamiento proporciona una protección
63
antitumoral casi del 35% con respecto a los controles78. La única diferencia es la cantidad
inoculada de células TC-1, que en nuestro trabajo correspondió al doble de células (100,000
células).
Cuando se pasó a la tercera etapa en donde se utilizó un tratamiento combinado,
tanto profiláctico con el L. lactis E7 así como terapéutico con Ad-CRT/E7, observamos un
aumento en el número de ratones con regresión tumoral total así como en la supervivencia
comparado con los resultados obtenidos con el tratamiento terapéutico utilizando
únicamente Ad-CRT/E7. Puesto que la aplicación intranasal de L. lactis-E7 induce la
producción de anticuerpos contra E734, es posible que la presencia de dichos anticuerpos
ayude a la eliminación del tumor a través de un mecanismo de Citotoxicidad mediada por
anticuerpos.
Otro resultado importante fue la asociación entre una respuesta inmune celular y la
regresión de los tumores. En el presente trabajo demostramos, mediante
inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para CD8+, que los tumores en regresión
presentaron una gran infiltración de linfocitos T citotóxicos. Además, los linfocitos del
bazo de estos mismos ratones, secretaron una cantidad significativa de IFN-al retarlos
contra las células tumorales que expresan E7. Por otro lado, este mismo aumento de
linfocitos T citotóxicos así como de células NK se observaron en los bazos de dichos
ratones con regresión tumoral.
64
Finalmente también encontramos que la regresión tumoral esta asociada a una
muerte celular por apoptosis. Es sabido que uno de los mecanismos mediante los cuales las
células citotóxicas ejercen su acción es a través de la inducción de apoptosis. El mecanismo
principal de la muerte celular producida por los linfocitos T citotóxicos es la liberación de
las proteínas perforinas y granzimas, en donde las primeras forman canales acuosos que
permiten el paso de las segundas que a su vez activarán las caspasas responsables de
inducir apoptosis en las células blanco. Otra señalización de muerte por apoptosis ocurre
cuando los linfocitos T citotóxicos expresan una proteína denominada Fas ligando que se
une a las proteínas Fas de las células blanco. En particular utilizando el ensayo de TUNEL
demostramos que en los tumores en regresión existe una gran cantidad de células en
apoptosis. Este efecto se puede correlacionar con la gran cantidad de linfocitos infiltrantes
los cuales podrían estar induciendo dicho efecto sobre las células tumorales.
La aportación principal de nuestro trabajo de investigación fue el demostrar que
podemos utilizar la bacteria láctica Lactococcus lactis expresando E7 en su superficie para
inducir una respuesta inmune profiláctica que en combinación con una terapia adenoviral se
genere un mayor efecto terapéutico en contra del desarrollo de tumores. La ventaja de
utilizar el lactococcus para inmunizar es que no se requiere la purificación del antígeno a
partir de la bacteria y ésta se puede administrar como tal. Por lo tanto esta bacteria puede
ser utilizada en esquemas profilácticos de inmunización contra cancer cérvico uterino en la
población general.
65
Capítulo 7
CONCLUSIONES
1. La calreticulina potencía notablemente el efecto inmunogénico y antitumoral del
antígeno E7.
2. La preinmunización con Lactococcus lactis expresando E7 en su superficie mejora
el efecto terapéutico antitumoral y porcentaje de supervivencia.
3. El efecto antitumoral observado correlaciona con la inducción de una respuesta
inmune celular.
66
Capítulo 8
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73
Anexo I
Preparación de soluciones
Acetato de aminio 5M
Disolver 385g de acetate de amonio en 800ml de H2O. Ajustar el volumen a 1 litro con
H2O, esterilizar por filtración.
Acetato de potasio 5 M pH 5.2
Disolver 49 g de acetato de potasio en agua destilada, ajustando el pH a 5.2 con ácido
acético glacial. Aforar a 100 ml.
Almacenar a temperatura ambiente.
Acetato de sodio 3 M pH 5.2
Disolver 24.61 g de acetato de sodio en agua destilada, ajustando el pH a 5.2 con ácido
acético glacial. Aforar a 100 ml.
Almacenar a temperatura ambiente.
Azul de Comassie
0.25g de azul brillante de Comassie R250 se disuelven en 90 ml de metanol al 50% y 10 ml
de ácido acético Glacial, filtrar esta solución.
74
Bicarbonato de Sodio 1M
Disolver 4.2g de NaHCO3 en 50ml de H2O
Buffer Citrato 0.01M
Diluir 1.05g de Ácido Cítrico monohidratado en 500ml de H2O y esterilizar por filtración.
Buffer de Fosfatos 0.2M pH 7.2-7.4
Mezclar 6.4 g de Fostato monobásico de sodio (NaH2PO4.H2O), 21.8g de Fosfato Dibásico
de Sodio (Na2HPO4), 1 ml de Tritón al 100X y aforar e 1L con H2O.
Buffer TAE 50X
Mezclar 242 g de tris, 57.1 ml de ácido acético glacial, y 100 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0.
Aforar a 1,000 ml con agua destilada. Diluir 50 veces (TAE 1X).
Almacenar a temperatura ambiente.
Buffer Tris-HCl 1 M pH 6.8
Disolver 7.2 g de tris en agua destilada, ajustando el pH a 6.8 con HCl concentrado. Aforar
a 60 ml.
Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
Buffer Tris-HCl 1.5 M pH 8.8
Disolver 10.89 g de Tris en agua destilada, ajustando el pH a 8.8 con HCl concentrado.
Aforar a 60 ml.
Esterilizar por autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
75
EDTA 0.5 M pH 8.0
Disolver 18.6 g de EDTA en agua destilada, y ajustar el pH a 8.0 con 2 g de perlas de
NaOH. Aforar a 100 ml.
Almacenar a temperatura ambiente.
Carbonato de Sodio 1M
Diluir 5.29g de Na2CO3 en 50 ml de H2O
Cloruro de Magnesio 1M
Disolver 203.3g de MgCl2.6H2O en 800 ml de H2O. Ajustar el volumen a 1L.
Cloramfenicol 100mg/ml
Diluir 100mg de Cloramfenicol en 1 ml de Alcohol absoluto, se utiliza colocando 10µl por
cada 100 ml de medio.
Cloruro de sodio
Disolver 292.2g de NaCl en 800 ml de H2O, ajustar el volumen a 1 litro. Esterilizar en
autoclave.
Medio M17 p/Lactococcus lactis
Resuspender 37.25g de medio M17 en 1 litro de H2O, mezclar y autoclavear 15 min a
121ºC a la par esterilizar glucosa al 50%, preparar medio M17 con Glucosa al 1% y CM al
10µg/ml (para el control no poner CM)
76
Fosfato de potasio monobásico 1 M
Disolver 135.5 g de fosfato de potasio monobásico en 1,000 ml de agua destilada.
Almacenar a temperatura ambiente.
Fosfato de potasio dibásico 1 M
Disolver 173.5 g de fosfato de potasio dibásico en 1,000 ml de agua destilada.
Almacenar a temperatura ambiente.
Glucosa 2 M
Disolver 18.02 g de glucosa en 50 ml de agua destilada.
Almacenar a temperatura ambiente.
Jugo azul 6X
(Azul de bromofenol 0.25%, Xilencianol 0.25%, Glicerol 30%)
Mezclar 25 mg de azul de bromofenol y 25 mg de xilencianol con 3 ml de glicerol. Aforar
con agua destilada a 10 ml.
Almacenar a temperatura ambiente.
SDS 10%
Disolver 10 g de SDS en 90 ml de agua destilada. Calentar a 68ºC para facilitar su
disolución.
Ajustar pH a 7.2 con HCl concentrado y aforar a 100 ml.
Almacenar a temperatura ambiente.
77
PBS 10X
Mezclar 80g de NaCl, 2g de KCl, 14.4g de Na2HPO4 y 2.4g de KH2PO4 y disolver los
reactivos en 800ml de H2O destilada ajustar el pH a 7.2 o 7.4 y aforar a 1 litro, esterilizar
por autoclave.
Paraformaldehido 4%
Diluir 40g de paraformaldehido con H2O destilada a 60ºC por 30 minutos, adicionar 100ml
de PBS 10X, ajustar el pH a 7.2, aforar con H2O a la cantidad deseada. Hacer alícuotas y
almacenar a -20ºC.
Tris 1 M
Disolver 121.1 g de tris base en 700 ml de agua destilada.
Ajustar pH con HCl concentrado como sigue:
pH HCl
7.4 70 ml
7.6 60 ml
8.0 42 ml
Aforar a 1,000 ml con agua destilada.
Almacenar a temperatura ambiente.
78
RESUMEN CURRICULAR
Blanca Rocío Rangel Colmenero
Candidato para el Grado de
Doctor en Ciencias con Orientación Terminal en Morfología
Tesis: “Efecto de una preinmunización con Lactococcus lactis expresando el antígeno E7
del VPH-16 sobre la protección antitumoral inducida por adenovirus que expresan E7, IL-2
y calreticulina/E7”
Campo de Estudio: Morfología
Datos Personales: Nacida en C. Madero Tamaulipas el 5 de Enero de 1978, hija de René
Carlos Rangel Lozano y Feliciana Colmenero Alonso.
Educación: Egresada de la Facultad de Ciencias Biológicas, de la Universidad Autónoma
de Nuevo León, con el grado obtenido de Biólogo, en 1999. Egresada de la Facultad
de Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León, con el grado de Maestría
en Ciencias con Especialidad en Morfología en el 2003.
Experiencia Profesional: Realización del servicio social en el Laboratorio de Virología de
la Facultad de Biología en 1998. Tesista de licenciatura en el departamento de citogenética,
Facultad de Medicina, UANL de 1998 al 2000. Tesista de Maestría en el Departamento de
Histología de la Facultad de Medicina, UANL del 2000 al 2003. Tesista de Doctorado en el
Departamento de Histología de la Facultad de Medicina, UANL del 2003 al 2007. Becario
en Investigación en el Centro de Investigaciones Biomédicas del Noreste-IMSS, de Marzo
de 2006 a Febrero del 2007.