efecto del estiércol de cuy, porcino y vacuno en la
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UNIVERSIDAD NACIONAL “PEDRO RUIZ GALLO”
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO
DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Efecto del estiércol de cuy, porcino y vacuno en la
biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel en terrarios
TESIS
Para optar el Título Profesional de:
LICENCIADO EN
BIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA-PARASITOLOGÍA
Presentado por:
Br. José Samuel Flores López
Br. Julio César Benites Santisteban
LAMBAYEQUE-PERÚ
2015
Efecto del estiércol de cuy, porcino y vacuno en la
biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel en terrarios
TESIS
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN
BIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA-PARASITOLOGÍA
APROBADO POR:
M.Sc. Clara Aurora Cueva Castillo
________________________
PRESIDENTE
Dr. Eduardo Julio Tejada Sánchez
_________________________
SECRETARIO
Lic. Julio César Silva estela
_________________________
VOCAL
Dra. Carmen Rosa Carreño Farfán
_________________________
PATROCINADORA
LAMBAYEQUE, PERÚ
2015
Agradecimiento
A la vida y a nuestra fé, que nos ha dado la fortaleza para
continuar cuando a punto de caer hemos estado; por
permitirnos culminar con éxito.
A nuestra familia por habernos formando con
buenos hábitos y valores que nos ayudó a salir
adelante en los momentos más difíciles.
A nuestra asesora de tesis, Dra.Carmen Carreño
Farfán, que gracias a su tiempo y dedicación
permitieron encaminar el trabajo de culminación
exitosa.
DEDICATORIA
A Dios por derramar sus bendiciones sobre mí y llenarme de su fuerza
para vencer todos los obstáculos desde el principio de mi vida.
A mis amados padres Manuel y María Margarita, por todo el
esfuerzo y sacrificio para brindarme todo el amor, la
comprensión, el apoyo incondicional y la confianza en cada
momento de mi vida, a ustedes todo mi amor.
A mis abuelitos Lorenzo, Celedina, Luis y Adelaida por ser fuente de
inspiración y por dejarme la herencia más importante; la familia,
aunque algunos de ellos no estén, siempre los tengo presente.
A mis hermanos José Manuel, Rosa Adelaida, Jorge Luis, Alex
Christian, quienes entienden mejor que nadie el esfuerzo que
amerita dedicarse a desarrollar un buen trabajo.
A mis sobrinos José, Anthony, Ana, Pedro, Marcos, Carlos y Milena
quienes son fuente de inspiración y superación para seguir adelante
y ser el ejemplo que ellos merecen.
A mis amigos por sus palabras de apoyo en todo momento del
desarrollo del proyecto, con quienes he compartido momentos
agradables durante mi vida universitaria.
CON RESPETO Y AMOR
Julio César Benites Santisteban
DEDICATORIA
Dedico de manera especial a mi profesora
Carmen Carreño pues ella fue el principal
cimiento para la construcción de mi vida
profesional, sentó en mí las bases de
responsabilidad y deseos de superación.
A mi padre, a mi madre y hermanos que son
personas que me han ofrecido el amor y la
calidez de la familia a la cual amo.
A mis amigos por sus consejos y apoyo en
todos los momentos de mi vida universitaria.
José Samuel flores López
Índice
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………….....1
II. MARCO TEÓRICO………………………………………………..………4
2.1 Antecedentes de la investigación………………………….…….....4
2.2 Base teórica……………………………………………………….......8
2.2.1 Petróleo………………………………………………………......….9
2.2.2 Biodegradación del petróleo…………………………………......14
2.2.3 Tecnologías de remediación……………………………….........19
III. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………….26
3.1 Material biológico………………………………………………..….26
3.2 Población y muestra de estudio……………………………….......26
3.3 Métodos…………………………………………………….……...…26
3.3.1 Variables en estudio………………………………………...……26
3.3.2 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis…...…26
3.3.3 Primera fase: Determinación de las características químicas,
microbiológicas y toxicidad del suelo experimental…………..27
3.3.4 Segunda fase: Efecto del estiércol en la biorremediación
del suelo……………………..………………………………….....37
3.3.5 Análisis estadísticos de datos………………………………...…49
IV. RESULTADOS………………………………………………………..…50
4.1 Características químicas, microbiológicas y toxicidad de suelo
contaminado con diésel………..……...........................................50
4.2 Características químicas, microbiológicas y toxicidad del
estiércol……………………………………………………….……....50
4.3 Efecto del estiércol en la biorremediación de suelo contaminado
con hidrocarburos de diésel……………………………………..…50
V. DISCUSIÓN……………………………………………………...............67
VI. CONCLUSIONES…………………………………………………...….75
VII. RECOMENDACIONES…………………………………………….…..76
VIII. RESUMEN……………………………………………………………....77
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………….…78
Índice de tablas
Tabla 1. Valores promedio de temperatura (C°) en Lambayeque, agosto
- noviembre de 2015………………...…………………….....……48
Tabla 2. Contenido de hidrocarburos totales, HTP y número más probable,
NMP, de microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos en suelo
contaminado con diésel…..…………………………………………….…51
Tabla 3. Nivel de toxicidad de suelo contaminado con diésel determinado en
Raphanus sativus L…………………………………………..……….…...51
Tabla 4. Características químicas, microbiológicas y toxicidad de estiércoles de
cuy, porcino y vacuno……………………………….…………….............52
Tabla 5. Bacterias heterótrofas aisladas en muestras de suelo, contaminado con
diésel………………………………………………………………..…….....54
Tabla 6. Tiempo requerido para la utilización de diésel como fuente de carbono y
energía por bacterias aisladas de suelo contaminado con diésel……56
Tabla 7. Unidades de actividad emulsificante alcanzadas por bacterias aisladas de
suelo contaminado con diésel……………………………..…..………57
Tabla 8. Bacterias degradadoras de petróleo seleccionadas para constituir el
consorcios……………………………………………………………...……58
Tabla 9. Características diferenciales de géneros de bacterias degradadoras de
hidrocarburos de petróleo…………………………………………...…….59
Tabla 10. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) durante la
biorremediación de suelo contaminado con diésel……….……………60
Tabla 11. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP
g-1) durante la biorremediación de suelo contaminado con
diésel………………….………………………..………………………..…..61
Tabla 12. Índice de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito” durante la
biorremediación de suelo contaminado con diésel……………………63
Tabla 13. Niveles de toxicidad de contaminantes durante la biorremediación de
suelo contaminado con diésel……………….………………………..….64
Tabla 14. Características del suelo contaminado con hidrocarburos de diésel y
biorremediado durante 60 días con estiércol de cuy + nutrientes,
2015…………………………………………………………….…………....66
Índice de figuras
Figura 1. Estructura química de diferentes componentes mayoritarios de un
crudo de petróleo……………………………………..…………....……10
Figura 2. Mecanismo de degradación aerobia de cicloalcanos…………...…16
Figura 3. Vía principal en el metabolismo microbiano de los hidrocarburos
aromáticos policíclicos………………………...………………………17
Figura 4. Diagrama de flujo de los ensayos de tratabilidad………….…………23
Figura 5. Fases del estudio de tratabilidad de un suelo contaminado por
hidrocarburos………………………...…………………………….…….24
Figura 6. Colección de suelo en los alrededores de servicentros de expendio de
diésel……………..……………………………………………………28
Figura 7. Suelo experimental distribuido en terrarios……………………………28
Figura 8. Contaminación del suelo experimental con diésel…………..………29
Figura 9. Bolsas con suelo experimental contaminado con diésel……….……29
Figura 10. Suspensión y diluciones de suelo contaminado con diésel…….…31
Figura 11.Caldo nutritivo para la cuantificación del número más probable de
microorganismos totales.…………………………………….…………31
Figura 12. Caldo BushnellHaas para la cuantificación del número más probable
de microorganismos hidrocarbonoclásticos…………………….……32
Figura 13. Prueba de germinación de Raphanussativus L. “rabanito”……..…34
Figura 14. Suelo contaminado con diésel en suspensión y en placas de Petri
para el ensayo de toxicidad………………………….…………………34
Figura 15. Vertido del sobrenadante de suspensión de suelo contaminado con
diésel…………………………………………….…………………..……35
Figura 16. Semillas de Raphanussativus L. “rabanito” en suelo experimental.35
Figura 17. Ensayo de toxicidad de contaminantes de suelo experimental…....36
Figura 18. Tratamientos para determinar el efecto del estiércol en la
biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos de
diésel……………………………………………………………………...38
Figura 19. Bacterias heterótrofas desarrolladas en agar nutritivo y agar Mac
Conkey……………………………………………………………………39
Figura 20. Cultivos de bacterias heterótrofas aisladas de suelo contaminado con
diésel…………………………………………………………………39
Figura 21. Caldo Bushnell Haas, inoculado con bacterias heterótrofas aisladas
de suelo contaminado con diésel………………………………..……41
Figura 22. Viraje del indicador púrpura de bromocresol al amarillo en caldo
Bushnell Haas……………………………………………………………41
Figura 23. Caldo extracto de levadura al 2 % de etanol inoculado con bacterias
heterótrofas aisladas de suelo contaminado con
diésel…………………………………………………………..………….42
Figura 24. Emulsión de petróleo con sobrenadante de caldo cultivado con
bacterias degradadoras…………………………………………………42
Figura 25. Fluxograma para la propagación del inóculo bacteriano por el método
de siembra a gran escala……………………..………………44
Figura 26. Inóculos madre, intermedio y definitivo de bacterias nativas
seleccionadas…………………….………………………………...……44
Figura 27. Mezcla de suelo experimental con estiércol de vacuno……….……46
Figura 28. Aplicación de úrea en suelo contaminado con diésel…………....…46
Figura 29. Aplicación de consorcio bacteriano en suelo contaminado con
diésel……………….…………………………………………………..…47
Figura 30. Remoción del suelo en proceso de biorremediación……………….47
Figura 31. Porcentaje de bacterias que utilizaron diésel como fuente de carbono
y energía………………………..…………………………...…55
1
I. INTRODUCCIÓN
El petróleo y derivados constituyen fuentes de energía y materia prima, que
el hombre aprovecha en su beneficio; no obstante, la contaminación de
ecosistemas terrestres y acuáticos por derrames de hidrocarburos de petróleo y
sus derivados es uno de los problemas más importes en la actualidad. En el
suelo, los hidrocarburos reducen o inhiben el desarrollo de la cobertura vegetal,
inducen cambios en la dinámica poblacional de la fauna, flora, biota microbiana
y contaminan por infiltración los cuerpos de agua subterránea1.
Los tratamientos para disminuir o eliminar los hidrocarburos del petróleo en
los ambientes contaminados son físico-químicos, térmicos y biológicos. Los
físico-químicos pueden realizarse en periodos cortos, con equipos accesibles;
no obstante, los residuos generados por las técnicas de separación deben
tratarse, y los fluidos de extracción pueden aumentar la movilidad de los
contaminantes, requiriendo tratamiento y sistemas de recuperación que
incrementan los costos. La factibilidad económica de los tratamientos térmicos
aumenta en función del equipo y energía requerida. Por su parte, los tratamientos
biológicos son beneficiosos al ambiente, de bajo costo y generalmente los
hidrocarburos son mineralizados; sin embargo, el proceso es lento y el número
de microorganismos puede no ser el adecuado, cuando las condiciones de suelo
son desfavorables1,2,3.
La biodegradación aumentada o biorremediación surge de la necesidad de
disminuir el impacto ambiental de los derrames de los hidrocarburos en los
diferentes ambientes, acelerando los procesos de biodegradación por la
actividad metabólica de plantas, hongos, algas y bacterias. Entre las estrategias
de biorremediación se encuentran la bioestimulación y bioaumentación. La
2
bioestimulación se define como la adición de nutrientes, principalmente fuentes
de nitrógeno y fósforo, agua y oxígeno para favorecer el crecimiento y desarrollo
microbiano. La bioaumentación es la adición de microorganismos endógenos o
exógenos previamente caracterizados e incrementados1,2.
Las actividades agrícolas y pecuarias generan residuos orgánicos como el
estiércol, cuya descomposición inadecuada crea condiciones para la
proliferación de vectores de agentes patógenos para el ser humano, además de
producir malos olores que deterioran el ambiente. El estiércol contiene
nutrientes, materia orgánica y microorganismos, que pueden ser utilizados para
la bioestimulación y bioaumentación en los procesos de biorremediación1; sin
embargo en la región Lambayeque no se ha investigado la utilización del
estiércol para acelerar el proceso, en un inicio a pequeña escala, con la
perspectiva que la tecnología generada pueda ser utilizada posteriormente a
gran escala, disminuyendo la contaminación del ambiente, con un proceso
sostenible y de bajo costo.
La biodegradación del petróleo se realiza por reacciones catalíticas de
enzimas oxigenasas, que incorporan uno o más átomos de oxígeno a moléculas
contaminantes. Los microorganismos oleofílicos adquieren energía y nutrientes
celulares, descomponiendo los hidrocarburos en ácidos grasos, que
rápidamente son metabolizados por otros microorganismos, formándose
finalmente dióxido de carbono y agua. El estiércol constituye una fuente de
carbono, nitrógeno y microorganismos que aceleran el proceso
biodegradativo1.Tecnológicamente, la biorremediación de hidrocarburos de
petróleo mediante la aplicación de estiércol, constituye una técnica de fácil
ejecución, además de bajo costo, por el acceso rápido al insumo remediador.
Desde el punto de vista económico, el uso de estiércol de animales en la
biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos tiene bajo costo de
operación, no implica gastos de equipo, materiales, productos y maquinaria
necesaria para los tratamientos físicos y químicos y puede aplicarse en el sitio
mismo de la contaminación, sin requerir el desplazamiento de los suelos
contaminados.
3
La investigación del efecto del estiércol en la degradación de
hidrocarburos en suelos contaminados con diésel permitirá su aplicación a
escala comercial en las áreas impactadas, validando tecnologías propias de
biorremediación, efectivas para la recuperación de áreas contaminadas,
disminuyendo los riesgos para la salud de los seres vivos en general y dándole
un valor agregado a los residuos. En este contexto, se planteó el siguiente
problema: ¿Cuál es el efecto de los estiércoles de cuy, porcino y vacuno sin y
con fertilizante químico en la biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel en terrarios?
El objetivo general de la investigación fue: Determinar el efecto de los
estiércoles de cuy, porcino y vacuno sin y con fertilizante químico en la
biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos de diésel en terrarios.
Los objetivos específicos fueron determinar las características químicas,
microbiológicas y toxicidad de suelo contaminado con diésel y de tres tipos de
estiércol, así como también determinar el efecto de los estiércoles de cuy,
porcino y vacuno en la población microbiana, toxicidad de los contaminantes y
concentración de hidrocarburos totales de diésel, HTD. La hipótesis planteada
fue: Los estiércoles de cuy, porcino y vacuno incrementan la biorremediación de
suelo contaminado con hidrocarburos de diésel en terrarios.
4
II. MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes de la investigación
Suelos contaminados con agua que acompaña al petróleo en su extracción,
con un contenido promedio de 19,56% de HTP, con sitios de acumulación
superficial y costras salinas fueron sometidos a biorremediación. Se inició el
tratamiento con laboreo agrícola, alternando trabajo en profundidad: labranza
profunda con cincel, subsolador y arado de discos, para descompactar y airear
los estratos subsuperficiales, con rastra de discos, para particular, airear y
homogenizar la carga contaminante, asegurando su biodisponibilidad como
sustrato degradable por la biota nativa. Transcurrido 1 año, el contenido
promedio de hidrocarburos se redujo a 3,25% expresado como HTP residual,
con incremento de la población microbiana hidrocarburolítica nativa desde 3,2 x
102 a 3,5 x 105 UFCg-1 de suelo seco2.
Con la finalidad de crear y adoptar una tecnología para la recuperación de
áreas afectadas por la actividad petrolera, inmediatamente después de
producido un derrame se recuperó la mayor cantidad de petróleo, mediante
bombeo con camiones cisterna. Luego, se delimitaron doce parcelas de 8x3 m,
equivalentes a cuatro tratamientos ubicados al azar con tres repeticiones cada
uno y consistentes en T1= testigo (sin fertilizante); T2= 30 unidades de nitrógeno
y 30 de fósforo (59 kgha-1 de úrea, 46% de N y 65 kgha-1 de fosfato diamónico,
18:46:0); T3= 60 unidades de N y 60 de P; T4= 90 unidades de nitrógeno y 90
de fósforo. Las dosis fueron divididas en cuatro aplicaciones incorporadas en un
laboreo con cincel hasta una profundidad de 20 a 30 cm, cada 30 días. Después
de 1 año los tratamientos con 60 y 90 unidades de N y P, biodegradaron el
petróleo 60% más que el testigo y T2 con 30 unidades de N y P3.
La eficiencia de biorremediación de suelo contaminado con petróleo se
investigó con seis cepas bacterianas. Se aplicó 1 Lm-2 del consorcio bacteriano,
se realizó la mezcla, con posterior arado y finalmente el trillado diariamente
5
durante el primer mes del tratamiento y semanalmente durante los meses
siguientes para oxigenar el sistema. Los análisis efectuados en campo
demostraron disminución en la concentración de hidrocarburos totales de
petróleo (HTP) desde 7,45 hasta 4,09%, lo que significó 40% de reducción del
contaminante en 16 días de tratamiento4.
La técnica de biorremediación se aplicó en un área impactada con 58
barriles de petróleo crudo de 14° API (petróleo pesado). El área fue humectada,
aireada y periódicamente mediante un tractor con arado de disco se adicionaron
úrea y diamino fosfato en la relación C:N=60 y C:P=800 (0,22 y 0,047 kgm-2 de
nitrógeno y fósforo). A los 369 días se obtuvo una reducción de 78,08 %, con
niveles inferiores a 10 000 mgkg-1 de HTP (1%), valor recomendado para suelos
contaminados por hidrocarburos por las normas internacionales. La
concentración de microorganismos heterótrofos durante todo el proceso fue de
106-108, favorable para la biodegradación. Los niveles de microorganismos
degradadores de hidrocarburos oscilaron entre 105 y 106hasta los 229 días,
superior al rango 103-104 recomendado en la literatura para que se efectúe la
biorremediación5.
La biorremediación de suelos contaminados requiere de ensayos de
tratabilidad, en una primera fase para evaluar las poblaciones microbianas, la
actividad metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los contaminantes
del suelo. En este contexto, se realizaron ensayos de biorremediación a largo
plazo, simulando diferentes condiciones de bioestimulación y bioaumentación en
microcosmos que contenían 2,5kg de suelo con 6cm de espesor. La
concentración inicial de HTP fue 11975 mgkg-1. La biodegradación de HTP
observada siguió una cinética bifásica, con un primer periodo rápido, los primeros
60 días y un segundo periodo lento entre los 60 días y el final (270-360 días). El
tratamiento básico: humedad de 60% de la capacidad de campo alcanzó 55% de
biodegradación a los 270 días. Por el contrario, los tratamientos con nutrientes
(N), tensioactivos (NS), bioaumentación (NI) y sustrato fácilmente asimilable
(NG) mostraron velocidades máximas de biodegradación de los HTP los
primeros 30 días y después de 60 días, se detuvo la biodegradación alcanzando
54% con N, 59% con NS, 63% con NI y 79% con NG a los 270 días6.
6
La biorremediación y bioestimulación incrementan la efectividad de la
biodegradación del petróleo. Se colectó suelo agrícola, se enriqueció en caldo
Palleroni y Acetato mineral y se sembró en agar King B y Cerebro corazón. Se
aislaron 58 colonias de bacterias, identificándose Pseudomonas, Acinetobacter,
Serratia, Hafnia, Enterobacter, Citrobacter, Staphylococcus, Bacillus,
Micrococcus y Listonella. La actividad emulsificante de las bacterias fue de 0,2–
4,9 UAE mL-1, seleccionándose Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
calcoaceticus y Bacillus spp. Estas bacterias se inocularon en cinco terrarios en
suelo contaminado con petróleo crudo y se aplicó con bioaumentación y
fertilización (T1), con bioaumentación (T2), fertilización (T3), suelo no tratado
(T4) y suelo con bicloruro de mercurio o control abiótico (T5). El mayor porcentaje
de reducción de hidrocarburos a los 90 días (71,4%) se alcanzó con T1, seguido
de T3 (66,7%), T2 (61,9%), T4 (52,3%) y T5 (28%), concluyéndose que la
reintroducción de microorganismos nativos tiene mayor efectividad en la
biodegradación de petróleo, cuando se aplica la bioestimulación7.
Con el objetivo de investigar la eficiencia del bioestímulo sobre un suelo
contaminado con diesel se colectaron muestras de suelo agrícola, se mezclaron
con 40000 ppm de diesel y se distribuyeron en tres tratamientos: suelo más
hidrocarburo o atenuación natural (A), bioestimulación (B) y suelo esterilizado
más hidrocarburo o control (C). Durante 4 meses se realizaron muestreos para
aislar bacterias identificándose molecularmente Bacillus sp., B. cereus,
Staphylococcus aureus, Enterobacter y Flavobacerium spp. en los tratamientos
con bioestimulación, así como Arthobacter y Sanguibacter soli en los
tratamientos con atenuación. La concentración de HTP mostró que la
estimulación fue la más eficiente en la remoción de petróleo, alcanzando 50%,
en comparación con 43% de la atenuación natural. Se demostró la eficacia de
las bacterias como degradadoras de hidrocarburos8.
La eficiencia de biorremediación de suelos contaminados con petróleo se
determinó en un estudio con bacterias nativas. En muestras de suelo
contaminado se obtuvieron 104 aislados, de los que 92,31% fueron Gram
negativos, necesitaron 2-10días para utilizar el petróleo como fuente de carbono
y energía y alcanzaron 0,010-0,924 unidades de actividad emulsificante. Para la
biorremediación del suelo contaminado (23 570 mg kg-1 HTP), se aplicó
bioestimulación y bioaumentación, para lo cual diez bacterias nativas
7
seleccionadas se incrementaron e inocularon (10%) independientemente y en
consorcios en terrarios con 4 kg de suelo y se aplicó nitrógeno y fósforo en la
proporción C:N:P de 100:10:1. Durante 90 días el pH fue de 7,3-8,3; con 1,2 x
103-1,7 x 107 UFC mL-1 de bacterias heterótrofas y 1x103-9x103 NMP mL-1 de
bacterias hidrocarbonoclásticas. Se obtuvo 45,3% en la eficiencia de la
biorremediación frente a los testigos con N-P y absoluto con 39,6 y 22,7 %9.
Los residuos de diversos procesos de la actividad humana como el aserrín
y el estiércol fueron investigados para la recuperación de suelos contaminados
con hidrocarburos, tomando como indicador plantas de Zea mays. Suelo de los
alrededores de los tanques de almacenamiento de petróleo en una refinería, fue
depositado en macetas de 1kg de capacidad, a razón de 700g de suelo
contaminado, 150g de estiércol y 150g de aserrín. Los tratamientos fueron 12,
con tres repeticiones, bajo un diseño completamente aleatorio y como planta
indicadora se sembró maíz, determinándose después de 60 días la altura, peso
foliar y radicular. El HTP inicial fue de 19800-21800mg kg-1, alcanzándose el
mayor porcentaje de reducción correspondiente a 25% con estiércol de vacuno,
más aserrín de bolaina. La altura de la planta (3680 cm), peso foliar (6,42 g) y
radicular (4,5g) fue mayor en las plantas con suelos contaminados y
biorremediados con estiércol y aserrín, demostrándose que el maíz es un buen
indicador de la reducción de la concentración de HTP1.
El efecto de la inoculación de consorcios bacterianos hidrocarbonoclastas
en combinación con cuatro fuentes de nitrógeno se investigó en plántulas de
Lolium perenne, durante la fitorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de petróleo. El experimento se condujo bajo un diseño
completamente aleatorizado con arreglo factorial 3x4x3 y 36 tratamientos bajo
cámara de crecimiento. Los factores fueron: tres fuentes de inoculación
(consorcios con pasto, consorcios sin pasto, con pasto), cuatro fuentes de
nitrógeno (urea, nitrato de amonio, sulfato de amonio y testigo sin N) y tres dosis
de contaminantes (5000 mgkg-1 de petróleo crudo, 10 000 mgkg-1 de diésel y sin
contaminante). Los consorcios bacterianos (2mL) se inocularon a los 8 días de
la siembra en la base de las plántulas. Después de 50 días el rango de
degradación de HTP fue 22-73,6%, correspondiendo el mayor porcentaje al
NH4NO3 en el consorcio con pasto contaminado con petróleo. El rango de
8
degradación de HTP fue de 36-85,2%, correspondiendo el mayor valor al
NH4NO3 - consorcio con pasto contaminado con diésel10.
2.2 Base teórica
La comunidad microbiana desempeña un papel importante en el flujo
de energía, transformación de nutrientes y reciclaje de elementos en el
ambiente11. La teoría de la Infalibilidad Microbiana, sostiene que todo compuesto
orgánico biológicamente sintetizado puede ser descompuesto por los
microorganismos12. En este contexto, los contaminantes como el petróleo,
pueden ser degradados por los entes biológicos hasta dióxido de carbono y
agua13.
En el suelo, los contaminantes orgánicos pueden ser transformados de
manera física, química y biológica. El proceso de transformación más importante
es el biológico o biodegradación6, cuyo objetivo ideal es la mineralización; sin
embargo, no siempre ocurre13. Algunos contaminantes solo son transformados
parcialmente, condición que implica la eliminación o reducción de su
peligrosidad. Por esta razón, se consideran, biotransformaciones primarias,
parciales y totales. En la biodegradación primaria, un cambio menor en una
molécula es suficiente para eliminar su toxicidad, ejemplo: la deshalogenación
de los insecticidas clorados. En la degradación parcial se lleva a cabo una
fragmentación del contaminante, tal que la estructura original de la molécula aún
se mantiene en los fragmentos, ejemplo, la hidrólisis de la celulosa a glucosa.
Por su parte, en la biodegradación completa, total o mineralización un
contaminante orgánico pasa a su estado más oxidado o inorgánico1,14.
El petróleo, compuesto mayoritariamente por hidrocarburos es
biodegradado en aerobiosis con mayor eficiencia, pero también en anaerobiosis.
Los contaminantes, que pueden ser degradados o transformados por los seres
vivos son susceptibles de ser eliminados mediante procesos de biorremediación.
La capacidad metabólica de las poblaciones microbianas frente a los
contaminantes de un suelo es el fundamento sobre el que se sustenta la
tecnología de la biorremediación12.
En un suelo con contaminación recurrente o con episodios previos de
contaminación, generalmente las poblaciones microbianas autóctonas se
9
seleccionan en favor de la metabolización del contaminante. Por esta razón, la
bioestimulación de la población microbiana autóctona, puede acelerar el proceso
de biodegradación de los contaminantes, siempre y cuando, éstos no sean
recalcitrantes, en cuyo caso se requiere la bioaumentación o inoculación de
microorganismos con capacidad degradativa especializada, propios del sitio
contaminado e incrementados en el laboratorio6,15. Los estiércoles contienen
materia orgánica y constituyen fuentes de nutrientes y microorganismos,
pudiendo ser utilizadas para la bioestimulación y bioaumentación en procesos
de biorremediación de ambientes contaminados1,11,12,13.
La bioinoculación es la incorporación de microorganismos comerciales en
un lugar, para biodegradar un contaminante. Este proceso es una técnica de
biorremediación; no obstante, la falta de adaptación de las poblaciones
microbianas exógenas, no garantiza su supervivencia, por lo que se prefiere la
bioaumentación. Con esta técnica, los microorganismos autóctonos son
aislados, caracterizados e incrementados en laboratorio y luego reintroducidos
en los ambientes contaminados14,15.
2.2.1 Petróleo
El término petróleo deriva del latín petroleum, formado por petra que
significa piedra y óleum aceite. El crudo de petróleo se caracteriza por ser un
líquido negro viscoso, constituido por miles de compuestos, básicamente de la
familia de los hidrocarburos (50-98%), cuya fórmula general es CnH2n+2. La
composición elemental de un crudo es C (84-87%), H(11-14%), S(0-8%), O(0-
4%), N(0-0,5%) y elementos traza como el níquel y el vanadio(<1% v/v)6. Los
principales componentes (Figura 1) se subdividen y purifican en cuatro
fracciones: saturada (57%), aromática (29%), resinas y asfaltenos (14%), es
decir: componentes saturados (alcanos acíclicos y cicloalcanos), insaturados
(aromáticos) y polares que incluyen las resinas y asfaltenos6,10,16.
10
La mayor parte del nitrógeno, oxígeno y azufre están asociados con
las resinas y asfaltenos, por lo que se les denomina compuestos NSO polares15.
Figura 1. Estructura química de los diferentes componentes mayoritarios de un
crudo de petróleo6.
11
Los hidrocarburos saturados, alifáticos o parafínicos se dividen en acíclicos
(normales o n-alcanos y de cadena ramificada o isoprenoides) y cíclicos
(naftenos y oleofinas), extendiéndose de 1 hasta 40 o más átomos de carbono;
pero normalmente se alcanza un máximo de 25, el cual disminuye a 15 a medida
que aumenta la madurez del petróleo15. La fracción aromática está constituida
por monoaromáticos, diaromáticos y policíclicos, HAP. La fracción de resinas
incluye agregados de piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos, sulfóxidos y
amidas. A su vez, los asfaltenos son agregados de HAP, ácidos nafténicos,
sulfuros, ácidos grasos, metaloporfirinas y fenoles polihidratados. El estudio más
detallado de los hidrocarburos de un crudo de petróleo, los agrupa en las
siguientes familias: parafinas volátiles (alcanos no ramificados y ramificados
hasta C10), parafinas no volátiles (alcanos lineales y ramificados entre C11–
C40), naftenos (cicloalcanos o cicloparafinas), oleofinas (alquenos) y aromáticos
(monoaromáticos y poliaromáticos). En un grupo aparte se consideran los
componentes de las resinas y asfaltenos6,17.
Las parafinas volátiles incluyen los n-alcanos y los isoprenoides, es decir
alcanos no ramificados y ramificados con un tamaño de C1-C10. Representan
hasta 30% del crudo de petróleo, constituyen la fracción más volátil del crudo y
por lo tanto la más susceptible de pérdidas por volatilización. La fracción gas
natural contiene principalmente C1-C5. Los isoprenoides volátiles, están
representados por el isobutano e isopentano, aunque también pueden llegar
hasta C10:2,6 dimetil octano. Las parafinas no volátiles, incluyen n-alcanos e
isoprenoides, es decir, alcanos no ramificados y ramificados entre C11-C40,
aunque también se han descrito cadenas más largas. Constituyen el 15-20% del
crudo no degradado. Los isoprenoides no volátiles varían de C12-C22 y
constituyen 1-2% del crudo, llegando a 15% en crudos degradados. Los
isoprenoides de interés en biorremediación son: el pristano (C19), fitano (C20),
farneseno (C15) y norpristano (C18). El pristano y fitano se han utilizado como
marcadores internos del grado de degradación de un crudo, no obstante,
actualmente se usan los hopanos6,10,17.
En la familia de los naftenos, cicloparafinas o cicloalcanos los compuestos
más abundantes son los ciclopentanos alquilados, que pueden llegar a
representar el 31% del crudo. Los compuestos mono y dicíclicos corresponden
12
al 50-55% de esta fracción, los tricíclicos al 20% y los tetracíclicos al 25%. Esta
familia también engloba a los hopanos. Por su parte, las oleofinas o alquenos se
encuentran en concentraciones traza en el crudo de petróleo; no obstante, son
importantes en los productos del refinado ya que se generan durante el proceso
de cracking, constituyendo hasta 30% en las gasolinas y 1% en los fueles1,6.
Los hidrocarburos aromáticos tienen estructuras basadas en la molécula de
benceno. Los anillos están fusionados en arreglos lineales, angulares o
agrupados y contienen al menos seis carbonos. Algunos hidrógenos pueden ser
remplazados por grupos alquilo. Todos son líquidos o sólidos a temperatura
ambiente y su punto de ebullición es 80°C. En los hidrocarburos monoaromáticos
se encuentran el benceno, su monoalquilado tolueno y dialquilado xileno,
formando los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) de gran importancia
ambiental por su volatilidad y toxicidad. La familia mayoritaria de hidrocarburos
diaromáticos en un crudo son el naftaleno y sus alquilados. Entre los
hidrocarburos poliaromáticos de tres anillos, se encuentran el fenantreno,
antraceno, fluoreno y sus derivados alquilados. Entre los poliaromáticos de más
de tres anillos, están el fluoranteno (tres anillos bencénicos y uno no bencenico),
pireno y criseno (cuatro anillos), pireno y benzo(a) pireno (cinco anillos
aromáticos) y coroneno con seis anillos6,14,16,18.
Las fracciones de resinas y asfaltenos son mezclas complejas constituidas
por núcleos policíclicos o naftenoaromáticos. Contienen cadenas
hidrocarbonadas con heteroátomos de oxígeno, nitrógeno y azufre o compuestos
NOS del petróleo. A veces están asociadas con pequeñas concentraciones de
metales como el vanadio y el níquel. Constituyen 10% en crudos ligeros o poco
degradados y hasta 60% en crudos muy degradados. Es la fracción más
recalcitrante a la biodegradación. Las resinas son estructuralmente similares a
los asfaltenos, pero tienen menor peso molecular, mayor tasa hidrogeno/carbono
y menor contenido de heteroátomos. En las resinas son importantes los tiofenos
o anillos aromáticos heterocíclicos con azufre y los carbazoles o anillos con
nitrógeno. Las resinas son sólidos amorfos, que difícilmente se disuelven en el
petróleo. A su vez, los asfaltenos están constituidos por moléculas grandes que
se dispersan en el petróleo como compuestos poliaromáticos, ácidos nafténicos,
sulfuros, fenoles polihídricos, ácidos grasos y metaloporfirinas6,16,19.
13
La composición de un crudo varía según su localización. Habitualmente,
todos los crudos de petróleo contienen alcanos de cadena lineal y ramificada de
C1-C40, naftenos y aromáticos. Se denomina crudo parafínico o ligero cuando
contiene elevada proporción de parafinas y asfáltico o pesado si predominan
naftenos, alcanos de cadena larga (C30-C45) y HAPs. Por ejemplo el crudo de
petróleo parafínico procede de Irán, Irak, Rumanía, Méjico y el asfáltico de
Venezuela y Baku6. El crudo puede presentarse sólido, líquido y gaseoso. Los
primeros cuatro n-alcanos son los gases metano, etano, propano y butano, los
13 siguientes con 5-15 carbonos son líquidos y los n-alcanos con más de 15
carbonos varían desde líquidos viscosos hasta ceras sólidas. Su color varía entre
ámbar y negro. En estado gaseoso es inodoro, con un peso específico de 0,75-
1,01gmL-1. En estado líquido, su densidad y peso específico son mayores que la
del agua y su viscosidad se expresa en grados API, equivalentes a 10 centipoise
a 37,8°C6,15,18,20,21.
La gravedad API, es una unidad implementada por el “Instituto Americano
del Petróleo” en 1921para clasificar líquidos con menor densidad que el agua.
Cuánto más grados API tenga un petróleo, mejor es su calidad22. De acuerdo
con la densidad API, la industria de hidrocarburos líquidos, clasifica el crudo en
extrapesado, con una densidad >1,0 gcm-3 y <10 grados API; pesado con 1,0-
0,92 gcm-3 y 10,0-22,3 grados API; mediano con 0,92-0,87 gcm-3 y 22,3 - 33,1
grados API; ligero con 0,87-0,83 gcm-3 y 31,1 - 39,0 grados API y superligero con
< 0,83 cmg-3 y >39,0 grados API10,18. También se considera crudo extrapesado
con <10 grados API, pesado con 10-21 grados API, medio con 22-29 grados API
y crudo ligero con > 29 grados API17.El petróleo de mayor calidad es el liviano,
suave o dulce (>26º API), el intermedio tiene 20-25º API y el pesado<20º API22.
En el proceso de refinado, el crudo se destila a temperaturas crecientes
obteniéndose cuatro fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados
medios (gasoil, aceites lubricantes) y un residuo que a su vez se destila al vacío
produciendo otros aceites más pesados, ceras y betún asfáltico. El gasóleo-
diésel forma parte de la fracción intermedia de destilación, lo que implica un
rango de puntos de ebullición de 185-345 °C. La mayoría de los hidrocarburos
del gasóleo están en rango C10-C18 encontrándose también C10-C25 pero los
más abundantes son los C15-C17. Está compuesto en promedio por 30% de
14
parafinas, 45% de cicloalcanos y 25% de aromáticos, entre los que predominan
el naftaleno y sus alquilados15.
Los hidrocarburos medidos principalmente como hidrocarburos totales de
petróleo (TPH O HTP) constituyen la mayoría de los componentes del petróleo
crudo y están conformados por cientos de componentes individuales10. El
término HTP se usa para describir un grupo de sustancias químicas derivadas
del petróleo crudo. Debido al gran número de hidrocarburos involucrados,
generalmente no es práctico cuantificar cada uno de ellos; sin embargo, si es útil
medir la cantidad total del conjunto de hidrocarburos que se encuentran en una
muestra de suelo contaminado porque sirve como indicador general del tipo de
contaminación17.
La fracción HTP se define como aquellos hidrocarburos del extracto
orgánico total (EOT) pertenecientes a las fracciones saturada (F1) y aromática
(F2) según el método 3611b de la EPA (US Environmental Protection Agency,
1996). En el proceso se fracciona EOT por cromatografía en columna de
alúmina. Las fracciones F1 y F2 se concentran mediante rotavapor y luego se
obtiene la fracción TPH analizable por gravimetría y la fracción para determinar
la concentración de TPH mediante cromatografía de gases acoplada a un
detector de ionización de llama GC-FID o mediante cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas, GC-MS. La concentración de TPH se
calcula aplicando la recta de calibración construida a partir de las áreas totales
de cromatogramas conteniendo distintas concentraciones de un estándar
comercial de hidrocarburos6.
2.2.2 Biodegradación del petróleo
La biodegradación es el proceso por el cual bacterias, hongos y otros
organismos utilizan los compuestos como fuente de carbono y energía, con
formación de dióxido de carbono y agua. Los alcanos lineales son los
hidrocarburos del petróleo más biodegradables debido a la simplicidad de su
estructura molecular; sin embargo, altas concentraciones de alcanos con 5–10
carbonos inhiben la degradación de muchos hidrocarburos, porque como
solventes rompen la membrana lipídica de los microorganismos. A su vez,
alcanos con 20 – 40 carbonos tienen muy baja solubilidad en agua, lo cual
15
interfiere en la biodegradación. En los alcanos las monooxigenasas incorporan
un átomo de oxígeno en el extremo terminal metilo y se forma un hiperóxido. El
NADPH2 dona sus electrones y reduce el átomo de oxígeno que quedó libre,
formándose agua más un alcohol primario, que posteriormente es oxidado hasta
acetaldehído, a su vez éste es oxidado hasta ácido graso, que finalmente es
degradado por β-oxidación sucesiva10,17,19.
Los hidrocarburos alicíclicos son más difíciles de degradar, como en el caso
de los alcanos ramificados. Los consorcios constituyen la mejor opción para la
degradación, por ejemplo: Nocardia sp. y Pseudomonas sp. juntos degradan el
ciclohexano. También se mencionan Gordonia y Xanthobacter, como
degradadores de cicloalcanos. En primera instancia (Figura 2), se observa una
hidroxilación formando caprolactona y después de una segunda hidroxilación se
rompe el anillo formando el ácido adípico10. Los cicloalcanos son menos
biodegradables que sus isómeros de cadena lineal, pero más biodegradables
que los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs). Generalmente son
degradados por ataque de oxidasas originando un alcohol cíclico que es
deshidrogenado en una cetona17,21.
La degradación de hidrocarburos aromáticos (Figura 3) que poseen como
estructura primaria la molécula de benceno, denominados BTEX, se lleva a cabo
mediante dos vías oxidativas: la activación del anillo y su ruptura6.
16
Figura 2. Mecanismo de degradación aerobia de cicloalcanos10.
17
Figura 3. Vía principal en el metabolismo microbiano de los hidrocarburos
aromáticos policíclicos6.
18
La activación de los aromáticos involucra la incorporación de oxígeno en
el anillo, esto es, una dihidroxilación del núcleo aromático por mono o
dioxigenasas. En la segunda fase, los dihidrodioles son oxidados para formar
derivados dihidroxilados como el catecol, los cuales son precursores de la
ruptura del anillo. La escisión puede ocurrir intradiol u orto para originar ácido
mucónico y extradiol o meta para formar el derivado de hidroxi–muconaldehídico
del ácido. Los sustitutos alifáticos de los compuestos aromáticos, posteriormente
son oxidados para formar ácidos grasos que son utilizados por microorganismos
en la síntesis celular y producción de energía18,19.
En la degradación aerobia de los HAPs por los hongos es característico la
introducción de un átomo de oxígeno mediante una monooxigenasa que
contiene el citocromo P-450 y la transformación a trans – dihidrodioles. Los
hongos lignolíticos pueden degradar e incluso mineralizar los HAP mediante el
conjunto de enzimas implicadas en la degradación de la lignina. Las bacterias
inician la oxidación del anillo aromático mediante la incorporación de dos átomos
de oxígeno catalizada por una dioxigenasa con formación de un cis- dihidrodiol,
a diferencia de los hongos que generan un trans-dihidrodiol y el anillo pierde la
aromaticidad. A continuación, una deshidrogenasa NAD+ dependiente,
reconstituye el anillo aromático, formando un catecol (diol). Los dioles son
moléculas a partir de las cuales se produce la ruptura del anillo aromático
mediante dioxigenasas estereoselectivas. La ruptura se puede dar entre los dos
grupos hidroxilos: orto – ruptura o adyacente a estos grupos: meta – ruptura6,10.
Muchos hongos oxidan los HAP vía citocromo P-450 monooxigenasa,
incorporando uno de los átomos de oxígeno molecular dentro de HAP,
formándose un arenóxido; mientras que otro átomo de oxígeno forma agua y
mediante la enzima epóxido hidrolasa propicia la ruptura del anillo formando
trans–dihidriol. Los arenóxidos al ser inestables también sufren rearreglos no
enzimáticas produciendo fenol que puede conjugarse con glucosa, ácido
glucurónico, sulfato o xilosa. Varios hongos por medio de enzimas como
peroxidasas y lactasas oxidan los HAP a quinonas propiciando la fusión del
anillo aromático y pocos reducen los HAP hasta dióxido de carbono10.
19
Los géneros de bacterias degradadoras de hidrocarburos de petróleo
incluyen: Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas,
Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia,
Comamonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Microbacterium, Micrococcus,
Moraxella, Mycobacterium, Nocardia, Paenibacillus, Pseudomonas, Ralstonia,
Rhodococcus, Sphingomonas, Streptomyces, Vibrio y Xanthomonas. Entre los
hongos degradadores se mencionan Aspergillus, Candida, Chrysosporium,
Cunninghamella, Fusarium, Mucor, Phanerochaete, Pleurotus, Penicillium,
Rhizoctonia, Rhodotorula, Saccharomyces, Syncephalastrum y Trichoderma,
entre otros2,6,9,10.
2.2.3 Tecnologías de remediación
La industria petrolera en su conjunto tiene impacto negativo en el
ambiente, donde la fase de explotación hasta la obtención de los petroquímicos,
considerándose los pozos de explotación, baterías de separación, complejos
procesadores de gas, centrales de almacenamiento y bombeo, redes de ductos
y piletas para el confinamiento de residuos sólidos y líquidos procedentes de la
perforación y mantenimiento de los pozos, transporte y distribución en general y
estaciones de servicio de combustible. Estas instalaciones presentan riesgos
inherentes de fugas de petróleo, diésel y gasolina por roturas de los ductos,
filtración de aguas aceitosas, daños en las estructuras de almacenamiento y
transporte y malas prácticas entre otros, generándose un impacto negativo en el
ecosistema22.
Los hidrocarburos ingresan al suelo por filtración o derrame de un tanque
de almacenamiento de petróleo o de un oleoducto y pueden propagarse
lateralmente en la superficie del suelo o pueden penetrar verticalmente por efecto
de la fuerza de gravedad y capilaridad. En el primer caso se favorece la
volatilización de los componentes de bajo peso molecular, pero se incrementa el
área contaminada y la fotoxidación de los hidrocarburos a compuestos polares
más tóxicos. En el segundo caso, a mayor profundidad, por lixiviación, se reduce
la disponibilidad de oxígeno para la biodegradación y se incrementa el riesgo de
contaminar la napa freática. La gran mayoría de hidrocarburos se desplaza
verticalmente en los suelos, a excepción de aquellos donde las condiciones
climáticas favorecen su saturación con agua o su congelamiento1.
20
Un derrame de petróleo implica una serie de cambios progresivos de sus
propiedades físico-químicas, atribuidos a la intemperización por evaporación,
disolución, dispersión, oxidación, emulsificación, sedimentación y
biodegradación. La intemperización es la pérdida de ciertos componentes del
petróleo a través de procesos naturales que comienzan una vez que ocurre el
derrame y continúan indefinidamente. La evaporación aumenta la densidad y
viscosidad, decrece la solubilidad en el agua, el petróleo se hace más pesado y
puede hundirse. A las 24 horas casi el 40% del petróleo se ha evaporado. En la
disolución, parte del hidrocarburo se disuelve en el agua. Los componentes más
ligeros son los más solubles en el agua y por tanto los más tóxicos19.
En la oxidación, los hidrocarburos se combinan químicamente con el
oxígeno atmosférico y se degradan; no obstante, el proceso es lento y solo una
pequeña cantidad de oxígeno penetra una mancha de petróleo. En la
emulsificación un líquido se dispersa en otro líquido en forma de pequeñas
gotitas, es decir, como suspensión. Muchos hidrocarburos absorben agua en
emulsiones que aumentan el volumen del contaminante en un factor de 3 – 4.
Por su parte, en la sedimentación suceden dos mecanismos: En el primero, el
hidrocarburo se intemperiza, incrementándose su densidad respecto al agua
circundante y por consiguiente se hunde. En el segundo mecanismo el
hidrocarburo se adhiere a las partículas suspendidas de agua19.
Las tecnologías de remediación representan una alternativa a la disposición
de residuos peligrosos no tratados. Pueden clasificarse con base a: i) estrategia,
ii) lugar en el que se realiza y iii) tipo de tratamiento. Las estrategias pueden
usarse separadas o en conjunto y son: destrucción o modificación de los
contaminantes, extracción o separación y aislamiento o encapsulación del
contaminante. Según el lugar, las tecnologías de remediación son in situ y ex
situ. Los tipos de tratamiento son biológicos, físico-químicos y térmicos. En el
tratamiento biológico o biorremediación la actividad metabólica de plantas,
hongos, algas, bacterias naturales o modificadas genéticamente, en condiciones
controladas, degradan, transforman o remueven los contaminantes a productos
inocuos1,8,19,22.
21
El fundamento bioquímico de la biorremediación está en la serie de
reacciones de óxido-reducción que se producen en la cadena respiratoria o
transportadora de electrones de la célula. La cadena la inicia el sustrato orgánico
o compuesto hidrocarbonado que actúa como donador de electrones, de modo
que la actividad metabólica de la célula consume y degrada el compuesto
hidrocarbonado. Los aceptores más comúnmente usados son el oxígeno pero
también, los nitratos, hierro III, sulfatos y dióxido de carbono en procesos
respiratorios y anaerobios, respectivamente21,23.
Las técnicas de remediación más importantes son la degradación natural y
la biorremediación in situ y ex situ. En la biorremediación in situ se incluye la
bioaumentación, bioestimulación y bioventing. En la biorremediación ex situ se
consideran landfarming, biopilas y compostaje. En la degradación natural o
atenuación, las fracciones volátiles se evaporan con rapidez, quedando los
componentes alifáticos y aromáticos de cadena más larga, los cuales son
oxidados por los microorganismos nativos del suelo hasta dióxido de carbono.
La bioaumentación consiste en la adición controlada de microorganismos de
acción dirigida, especialmente formulados y de ocurrencia natural para ayudar a
los que se encuentran naturalmente y promover la biodegradación. A su vez, la
bioestimulación es la activación de los microorganismos autóctonos
degradadores de hidrocarburos, mediante la adición de nutrientes y aceptores
de electrones al entorno contaminado, en función de las deficiencias. Por su
parte, en el bioventing, bioventeo o bioaireación se suministra aire al terreno,
para promover la actividad de los microorganismos presentes y degradar los
hidrocarburos17,22.
La técnica ex situ de landfarming es la más antigua y consiste en tratar el
suelo contaminado previamente excavado y trasladado a grandes superficies
abiertas, protegido en una base impermeable, donde se voltea y airea para
favorecer la actividad de las bacterias nativas. Con la técnica de biopilas o
bioceldas se forman montones de dimensiones variables con una mezcla de
suelo contaminado y materia orgánica y se airean de forma activa o pasiva. Por
su parte, en el compostaje el suelo contaminado se mezcla con paja, astillas de
madera u otro agente que le proporcione porosidad, para permitir un mejor flujo
22
de aire y el material es degradado en aerobiosis bajo condiciones controladas de
humedad y temperatura17,19.
La implementación de una tecnología de biorremediación (Figura 4) requiere de
etapas: i) investigación del emplazamiento en relación con los contaminantes, el
tipo de suelo y el entorno, es decir caracterización físico-química del suelo,
estudio geotécnico e hidrogeológico y análisis de riesgos, ii) desarrollo de
ensayos de tratabilidad a escala de laboratorio, iii) desarrollo de ensayos a
escala piloto e iv) implementación de la tecnología de biorremediación
seleccionada. Los ensayos de tratabilidad se definen como un conjunto de
experimentos a escala de laboratorio previos a la implementación de cualquier
tecnología de biorremediación. Su objetivo es determinar si un tratamiento es
apropiado para la descontaminación, requiriéndose caracterizar las poblaciones
microbianas y la biogradabilidad de los contaminantes del suelo, así como
también, se debe investigar la influencia de los parámetros físico-químicos y
biológicos que afectan la biodegradación6.
Los ensayos de tratabilidad o conjunto de experimentos a escala de
laboratorio, previos a la implementación de cualquier tecnología de
biorremediación representan una parte muy pequeña de los costos totales de
recuperación de cualquier emplazamiento; sin embargo, la información que
proporcionan es fundamental para aumentar la posibilidad de éxito. Primero se
debe realizar una caracterización físico-química y microbiológica (Figura 5),se
cuantificará la población microbiana degradadora de los contaminantes y su
proporción respecto a la heterótrofa del suelo contaminado. Asimismo, se
investigará si la población microbiana es metabólicamente activa o es activable
en condiciones de bioestimulación. Una vez caracterizado el suelo, los
contaminantes y la población microbiana, es necesario determinar la
biodegradabilidad mediante ensayos rápidos y en caso afirmativo investigar los
factores físicos-químicos y biológicos que afectan la biodegradación (Fase II) en
ensayos de microcosmos23.
23
Figura 4. Diagrama de flujo de los ensayos de tratabilidad6.
24
Figura 5. Fases del estudio de tratabilidad de un suelo contaminado por
hidrocarburos23.
25
En la fase I de los ensayos de tratabilidad se investiga la presencia de
poblaciones microbianas, la actividad metabólica real y potencial y la
biodegradabilidad de los contaminantes presentes en el suelo. En la fase II se
optimizan las condiciones físico-químicas (humedad, aireación, nutrientes
inorgánicos) y biológicas (posibilidad de inocular poblaciones microbianas
alóctonas) que pueden condicionar el proceso de biodegradación durante la
biorremediación de suelos contaminados. La información obtenida en la fase I
permite decidir en un corto intervalo si es factible la aplicación de la
biorremediación. La fase II permite establecer las condiciones óptimas de
biorremediación en procesos aeróbios8,23.
En el Perú, la normativa ambiental relacionada al manejo de los
hidrocarburos de petróleo, es propuesta por el Ministerio de Energía y Minas
(MEM), autoridad ambiental competente para la actividad del sector
hidrocarburos de acuerdo al DS N°053-99-EM del 28 de setiembre de 1999, Ley
orgánica de Hidrocarburos Nº 26221 del 13 de agosto de 1993 y sus normas
modificatorias Ley N° 26734 del 31 de diciembre de 1996 y Ley N° 27377 del 7
de diciembre de 2000. El artículo 872 de la ley Nº 26221 establece que las
personas naturales o jurídicas que desarrollan actividades de hidrocarburos
deberán cumplir con las disposiciones sobre protección al medio ambiente,
establecidas por el reglamento de protección ambiental de las actividades de
hidrocarburos DS N° 046-93-EM del 12 de noviembre de 1993 y normas
modificatorias: DS N° 009-95-EM del 13 de mayo de 1995, DS N° 053-99-EM del
27 de setiembre 1999 y DS N° 003-2002-EM del 27 de enero de 20021.
26
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material biológico
Suelo contaminado con hidrocarburos de diésel, bacterias degradadoras,
estiércoles de cuy, porcino y vacuno, semillas de Raphanus sativus L “rabanito”
3.2 Población y muestra de estudio
La población y muestra de estudio estuvo constituida por 30 unidades
experimentales de suelo contaminado con diésel, correspondientes a un diseño
completamente aleatorizado (DCA) con diez tratamientos y tres repeticiones24,25.
3.3 Métodos
3.3.1 Variables en estudio
Variable independiente: Estiércoles de cuy, porcino y vacuno.
Variable dependiente: Biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel.
3.3.2 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis
El estudio se realizó en dos fases, la primera descriptiva para determinar las
características químicas, microbiológicas y toxicidad del suelo experimental y de
los estiércoles y la segunda fase experimental para determinar el efecto de los
estiércoles en la biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos de
diésel en terrarios. En la contrastación de la hipótesis del estudio descriptivo se
utilizó el diseño de una sola casilla24,25 y en la segunda fase experimental un
diseño25completamente aleatorio (DCA).
27
3.3.3 Primera fase: Determinación de las características químicas,
microbiológicas y toxicidad del suelo experimental
a) Acondicionamiento del suelo experimental
En los alrededores de servicentros de expendio de diésel (Anexo 1),
se colectó suelo (Figura 6) totalizando 50 kg. El suelo fue secado a temperatura
ambiente y a la sombra, fue tamizado (2 mm) y luego mezclado con arena de río
y pajilla de arroz en la proporción 20:10:0,1 constituyendo el suelo experimental.
La mezcla fue distribuida en terrarios constituidos por bandejas de plástico de
0,33 x 0,22 m, con un área total de 0,0726 m2, a razón de 1,600 kg de suelo +
0,800 kg de arena + 0,008 kg de pajilla por terrario, cantidad de suelo
experimental suficiente (2,408 kg) para llenar el 70% de la capacidad del terrario
(Figura 7).
El suelo experimental de cada terrario fue depositado independientemente
en bolsas de polietileno de 25 x 30 cm, donde se agregó el 2% o 20 000 ppm de
diésel (0,048 L), se homogenizó durante 5 minutos y se mantuvo tapado para
evitar la volatilización y favorecer el equilibrio entre los hidrocarburos y las
partículas del suelo (Figuras 8,9), durante 7 días26.
b) Obtención de muestras de suelo experimental
Transcurridos 7 días del acondicionamiento, el suelo fue depositado en
los terrarios y en cada uno se colectó una muestra representativa de 100 g para
realizar el análisis químico y microbiológico y determinar la toxicidad de los
contaminantes del suelo en cada tratamiento por triplicado. La obtención de
muestras se realizó según el método del “cuarteo y amontonamiento”27. El
volumen del suelo del extremo inferior derecho se mezcló cinco veces con el
superior izquierdo, el inferior izquierdo con el superior derecho, el superior con
el inferior y el derecho con el izquierdo, formando un “montón” con el suelo en
cada cambio de posición. Una vez homogenizado el suelo se tomaron muestras
de 100 g en cada terrario y se depositaron independientemente en bolsas de
polietileno, debidamente identificadas.
28
Figura 6.Colección de suelo en los alrededores de servicentros de expendio de
diésel.
Figura 7. Suelo experimental distribuido en terrarios.
29
Figura 8.Contaminación del suelo experimental con diésel.
Figura 9. Bolsas con suelo experimental contaminado con diésel.
30
c) Análisis químico y microbiológico
En las muestras de suelo de cada terrario se colectaron 40 g y se
mezclaron entre sí para constituir una muestra compuesta de 1,2 kg con la que
se determinó la cantidad de hidrocarburos totales (HTD) en el laboratorio de la
empresa Quimpetrol Perú, EIRL, en Piura, mediante cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), utilizando un cromatógrafo de
gases modelo 6890N (NETWORK GC system) y un espectrómetro de masas
modelo 5975 inertXL (Agilent Tecnologyes).
Para el análisis microbiológico en cada muestra del suelo experimental se
tomaron por triplicado submuestras de 10 g y se determinó el número de
microorganismos totales y degradadores de hidrocarburos o
hidrocarbonoclásticos mediante la técnica del número más probable6,9. Las
submuestras de suelo se depositaron en frascos con 90 mL de solución salina,
NaCl 0,85 %, (p/v), obteniéndose suspensiones, con las que se realizaron
diluciones decimales hasta 10-7(Figura 10).
Para determinar el número más probable de microorganismos totales, se
inoculó por triplicado 1 mL de las diluciones 10-5, 10-6 y 10-7 en tubos de 150
x 20 mm conteniendo 5 mL de caldo nutritivo (Figura 11, anexo 2), incubándose
a 30°C, hasta por 10 días. Para determinar el número más probable de
microorganismos hidrocarbonoclásticos, 1 mL de las diluciones 10-4,10-5 y 10-6
se inocularon por triplicado en tubos con 5 mL de caldo Bushnell Hass (Figura
12) e inmediatamente después en cada tubo se vertieron 0,025 mL (25 µL) de
diésel como fuente de carbono. Los tubos se incubaron a 30°C, hasta por 10
días y la turbidez del medio de cultivo se consideró positivo a la presencia de
microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos, realizándose el cálculo
correspondiente (Anexo 3) según el método estándar28.
d) Toxicidad de contaminantes del suelo
La toxicidad de los contaminantes de las muestras de suelo investigado
se determinó por triplicado en submuestras de 10 g de cada terrario29,30.
31
Figura 10. Suspensión y diluciones de suelo contaminado con diésel
Figura 11. Caldo nutritivo para la cuantificación del número más probable de
microorganismos totales.
32
Figura 12. Caldo Bushnell Haas para la cuantificación del número más probable
de microorganismos hidrocarbonoclásticos.
33
Se utilizaron semillas de rabanito a las que previamente se les determinó
el porcentaje de germinación. En cinco placas de Petri, con papel esterilizado y
humedecido con agua esterilizada se depositaron 20 semillas por placa, se
taparon y se mantuvieron a temperatura ambiente (28 °C), humedeciéndolas
interdiariamente, hasta obtener el máximo de germinación, que fue 99
% después de 120 horas (Figura 13).
En el ensayo de toxicidad, en tres frascos de vidrio de 250 mL de capacidad
conteniendo 90 mL de solución salina esterilizada (NaCl 0,85% p/v), se
depositaron 10 g de suelo y se homogenizaron durante 20 minutos, obteniéndose
suspensiones del suelo contaminado. En simultáneo, en doce placas de Petri, se
depositaron 10 g del suelo correspondiente, se vertieron 12 mL del
sobrenadante de la suspensión previamente obtenida (Figuras 14,15) y con una
pinza se depositaron 25 semillas en cada placa (Figura 16). Éstas se cubrieron
con papel bond durante 120 horas, a 30°C y después de 48 horas, se vertieron
3 mL adicionales del sobrenadante, para mantener la humedad requerida.
A las 120 horas se contaron las semillas germinadas (Figura 17) y se midió
la longitud de las radículas emergidas. El porcentaje de germinación relativo
(PGR), crecimiento relativo de la radícula (CRR) e índice de germinación (IG)
fueron calculados9 según las siguientes fórmulas:
PGR =Número de semillas germinadas en el suelo testigo
Número de semillas germinadas en el testigo× 100
CRR =Longitud promedio de radícula en el suelo testigo
Longitud promedio de radícula en el testigo× 100
IG% = PGR X CRR
100
Donde:
PGR: Porcentaje de germinación relativo
CRR= Crecimiento relativo de radícula
IG= Índice de germinación
34
Figura 13. Prueba de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito”
Figura 14. Suelo contaminado con diésel en suspensión y en placas de Petri
para el ensayo de toxicidad.
35
Figura 15. Vertido del sobrenadante de suspensión de suelo contaminado con
diésel.
Figura 16. Semillas de Raphanus sativus L. “rabanito” en suelo experimental.
36
Figura 17. Ensayo de toxicidad de contaminantes de suelo experimental.
37
La fitotoxicidad se determinó con el criterio de interpretación30: IG ≥ 80 %
indica que no hay sustancias fitotóxicas o están en muy baja concentración, 80
% > IG > 50 % se interpreta como presencia moderada de estas sustancias y un
IG ≤ 50% indica una fuerte presencia de sustancias fitotóxicas, criterios
correspondientes a niveles de fitotoxicidad bajo, moderado y severo,
respectivamente.
e) Análisis químico, microbiológico y toxicidad de los estiércoles de
cuy, porcino y vacuno
El análisis químico de los estiércoles se realizó en el laboratorio de
Bromatología de la Facultad de Ciencias Biológicas, determinándose la
humedad (%) por el método gravimétrico de la estufa y la ceniza (%) por el
método de incineración directa. Después, se calculó el contenido de materia
orgánica, restando los porcentajes de materia orgánica y ceniza. El valor
obtenido se dividió entre 1,8 para calcular el porcentaje de carbono y el nitrógeno
se determinó por el método de Kjeldahl27. El análisis microbiológico y toxicidad
de los estiércoles de cuy, porcino y vacuno se realizó siguiendo la metodología
descrita en los ítems 3.3.3 c y d.
3.3.4 Segunda fase: Efecto del estiércol en la biorremediación de suelo
El efecto del estiércol en la biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos diésel en terrarios se determinó en un ensayo conducido bajo un
diseño experimental completamente aleatorio (DCA) con diez tratamientos y tres
repeticiones por tratamiento, con un total de 30 unidades experimentales
(Figura 18).
a) Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos
En los alrededores de servicentros de expendio de diésel se colectaron 54
muestras de suelo contaminado y las bacterias heterótrofas cultivables de las
muestras de suelo contaminado con diésel se enriquecieron9depositando 10 g
de cada una en 90 mL de caldo Bushnell Haas con 5 mL (5%) de diésel.
38
Figura 18. Tratamientos para determinar el efecto del estiércol en la
biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburos de
diésel.
Tratamientos
r1
r2
r3
T1: Estiércol de cuy
X
X
X
T2: Estiércol de porcino
X
X
X
T3: Estiércol de vacuno
X
X
X
T4: Estiércol de cuy + NP
X
X
X
T5: Estiércol de porcino + NP
X
X
X
T6: Estiércol de vacuno + NP
X
X
X
T7:Testigo sin estiércol, sin NP
X
X
X
T8:Testigo sin estiércol, con NP
X
X
X
T9:Testigo consorcio bacteriano + NP
X
X
X
T10:Testigo abiótico
X
X
X
39
Figura 19. Bacterias heterótrofas desarrolladas en agar nutritivo y agar Mac
Conkey.
Figura 20. Cultivos de bacterias heterótrofas aisladas de suelo contaminado con
diésel.
40
Después de la incubación a 30°C, durante 7 días, con agitación diaria
durante 10 minutos, se tomaron por triplicado alícuotas de 0,1 mL, se
sembraron mediante la técnica de agotamiento y estría en agar Plate Count y
Mac Conkey (Figura 19, anexo 2) y se incubaron a 30°C, durante 24 horas. Las
colonias desarrolladas en el agar Plate Count se agruparon según sus
características morfológicas y se seleccionó una representante de cada
morfotipo. A su vez, en el agar Mac Conkey se seleccionaron las colonias de
bacterias no fermentadoras de lactosa. Con todas las bacterias aisladas se
realizaron tinciones de Gram y se cultivaron en agar Tripticasa Soya (TSA) y
Bushnell Haas con 4 % de diésel, constituyendo los cultivos puros (Figura 20),
que después de la incubación se guardaron en refrigeración a 8 °C. Éstas
bacterias se investigaron, considerándose degradadoras a aquellas que
utilizaron el diésel como fuente de carbono y energía y alcanzaron unidades de
actividad emulsificante (UAE mL-1).
En la determinación del tiempo requerido para la utilización de petróleo
como fuente de carbono y energía9, cada bacteria cultivada en agar Bushnell
Haas con diésel, fue inoculada por triplicado en 5 mL de caldo Bushnell Haas
con indicador púrpura de bromocresol (Figura 21). A continuación, en cada tubo
se agregó 1% (0,05 mL ó 50 mL) de diésel, incluyéndose tres tubos con caldo de
cultivo no inoculado como testigo. La incubación se realizó a 30°C, hasta por 240
horas con agitación manual, diaria por 10 minutos y en simultáneo se investigó
el viraje del indicador del lila al amarillo (Figura 22), que se interpretó como
positivo para la utilización del diésel como fuente de carbono y energía. Cuando
se observó crecimiento bacteriano, pero no viraje del indicador se consideró un
tiempo mayor de 240 horas.
En la determinación del número de unidades de actividad emulsificante
(UAE)31,32,cada bacteria cultivada en agar Bushnell Haas con diésel, fue
inoculada por triplicado en 5 mL de cada extracto de levadura (Figuras 23, 24) y
se agregó 2% (0,1mL) de etanol, incluyéndose tres tubos con caldo de cultivo no
inoculado como testigo. La incubación se realizó a 30 °C, durante 96 horas, con
agitación manual diaria durante 10 minutos.
41
Figura 21. Caldo Bushnell Haas, inoculado con bacterias heterótrofas aisladas
de suelo contaminado con diésel
Figura 22. Viraje del indicador púrpura de bromocresol al amarillo en Caldo
Bushnell Haas.
42
Figura 23. Caldo extracto de levadura al 2 % de etanol inoculado con bacterias
heterótrofas aisladas de suelo contaminado con diésel.
Figura 24.Emulsión de diésel con sobrenadante de caldo cultivado con bacterias
degradadoras.
43
Los caldos se centrifugaron a 3500 rpm, durante 5 minutos, se tomaron 2
mL de cada sobrenadante y se depositaron en tubos de prueba, donde se agregó
2,2 % (44 µL) de diésel. Los tubos se taparon herméticamente, se agitaron
manualmente durante 5 minutos, hasta lograr una emulsión y se leyó la
absorbancia en espectrofotómetro digital de luz visible, GREETMED, a 540 nm.
Los valores de absorbancia se corrigieron con el testigo caldo extracto de
levadura–etanol y se realizó la conversión de la absorbancia de cada muestra a
unidades de actividad emulsificante por mililitro31, considerando 0,826 de
absorbancia como 1 unidad de actividad emulsificante por mililitro, UAE mL-1.
b) Obtención de consorcio de bacterias degradadoras de hidrocarburos
Las tres bacterias con el menor número de días para la utilización del
petróleo como fuente de carbono y energía y las dos bacterias con el mayor
número de unidades de actividad emulsificante (UAE mL-1), se seleccionaron,
constituyendo al consorcio de bacterias degradadoras de hidrocarburos de
diésel. La identificación del género de las bacterias se realizó en función de las
características morfológicas y fisiológicas según los manuales de Bergey de
Bacteriología Determinativa y Bacteriología Sistemática. Se determinaron las
características morfológicas de las colonias y las células y se realizaron pruebas
de catalasa, oxidasa, motilidad, reducción de nitratos, utilización del citrato,
hidrólisis, acidificación, óxido-fermentación, entre otras.
El inóculo de cada bacteria se obtuvo por el método de siembra a gran
escala9, trabajando con un inóculo madre, intermedio y definitivo (Figuras
25,26). Las bacterias seleccionadas se cultivaron en 3 mL caldo nutritivo, a 30
ºC, durante 24 horas. A continuación, se obtuvo un paquete celular cuya
concentración se estandarizó con el tubo 3 del nefelómetro de Mc Farland,
obteniendo una suspensión bacteriana con 9,0 x108 cel.mL-1. Para la
propagación 0,1mL de la suspensión bacteriana estandarizada se inoculó en
0,9mL de caldo Bushnell Haas con 5 % de diésel, se incubaron a 30 °C por 24
horas y constituyeron el inóculo madre.
44
Para la
0,1 mL 0,9 mL 9 mL 90 mL
Figura 25. Fluxograma para la propagación del inóculo bacteriano por el
método de siembra a gran escala.
Figura 26. Inóculos madre, intermedio y definitivo de bacterias nativas
seleccionadas.
0,1 mL 1 mL 10 mL
Madre Definitivo Intermedio Suspensión
45
El inóculo madre fue depositado en 9mL de caldo Bushnell Haas con diésel
incubándose a 30 °C por 24 horas para constituir el inóculo intermedio, el cual a
su vez fue inoculado en 90mL del mismo caldo Bushnell Haas, incubado en las
mismas condiciones y constituyó el inóculo definitivo en una cantidad de 100 mL
(Figura 26).
c) Proceso de biorremediación
El suelo de cada terrario fue mezclado con el estiércol de cuy, porcino o
vacuno (Figura 27), en la proporción 6:1, correspondiente a 2408 kg de suelo
experimental y 401,33 g de estiércol. Los nutrientes nitrógeno y fósforo se
aplicaron32 hasta alcanzar la relación C: N: P de 100: 10:1 (Anexo 4), para lo cual
se agregaron por terrario (Figura 28) 0,108 g de urea (46% N) y 0,00198 g de
fosfato diamónico (18% N, 46% P). En el testigo consorcio bacteriano se
aplicaron 120 mL (5%) del consorcio bacteriano por terrarios (Figura 29),
correspondiendo 24 mL a cada una de las cinco bacterias seleccionadas.
Inmediatamente después, el contenido de los terrarios se mezcló durante 5
minutos. Para facilitar la aireación, el suelo de todos los terrarios fue removido
dos veces por semana (Figura 30) y en simultáneo se realizaron riegos con
agua declorada hasta alcanzar 60% de la capacidad de campo6.
d) Condiciones meteorológicas
Durante la biorremediación se registraron las temperaturas máxima,
mínima y media, datos obtenidos por la estación meteorológica de la Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo ubicada en el fundo “El Ciénago” en Lambayeque. La
temperatura media mínima fue 21,0°C en agosto y la máxima de 23,4°C en
noviembre (Tabla 1).
e) Monitorización del proceso de biorremediación
El proceso de biorremediación se monitoreó durante 90 días,
determinándose a los 0 y 90 días la concentración de hidrocarburos totales de
diésel (HTD) y mensualmente el número de microorganismos totales e
hidrocarbonoclásticos y la toxicidad de los contaminantes, según la metodología
descrita en los ítems 3.3.3c y 3.3.3d.
46
Figura 27. Mezcla de suelo experimental con estiércol de vacuno.
Figura 28. Aplicación de úrea en suelo contaminado con diésel.
47
Figura 29. Aplicación de consorcio bacteriano en suelo contaminado con diésel.
Figura 30. Remoción del suelo en proceso de biorremediación.
48
Tabla 1. Valores promedio de temperatura (°C) en Lambayeque, agosto-
noviembre de 2015.
Meses
Temperatura
Máxima
Mínima
Media
Agosto
24,5
17,5
21,0
Setiembre
25,6
18,1
21,9
Octubre
25,9
18.4
22,15
Noviembre
26,0
20,8
23,4
49
La eficiencia (%) de la biorremediación del suelo contaminado con diésel
se calculó33 con la siguiente fórmula:
E = Si − Sf
Six 100
Donde:
E = Eficiencia de degradación de hidrocarburos de diésel (%)
Si = Concentración inicial de HTD
Sf = Concentración final HTD
3.3.5 Análisis estadísticos de datos
Los datos obtenidos en el proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel fueron ordenados en tablas y figuras. Se realizó el
análisis de varianza de los índices de germinación obtenidos y la superioridad
entre los tratamientos se determinó mediante la prueba múltiple de Tukey25,
con un nivel de significancia de 0,05. En el presente trabajo se utilizaron los
programas Microsoft Office Word y Excel 2013.
50
IV. RESULTADOS
4.1 Características químicas, microbiológicas y toxicidad de suelo
contaminado con diésel
El suelo contaminado con diésel presentó un contenido de hidrocarburos
totales, HTD de 22 987 mgkg-1 (Tabla 2); una población de 4,6x106 NMP g-1de
microorganismos totales que superaron a los 3,5x104 NMPg-1 de
microorganismos hidrocarbonoclásticos y un nivel severo de toxicidad en el
índice de germinación de rabanito (Tabla 3).
4.2 Características químicas, microbiológicas y toxicidad del estiércol
El estiércol presentó un contenido de carbono de 38,7 % (cuy), 40,5%
(porcino) y 42,7 % (vacuno); el nitrógeno fue de 1,98% (cuy), 3,35% (porcino) y
3,71% (vacuno) y la relación C:N fue 19,5 (cuy), 12,1 (porcino) y 11,5 (vacuno).
La población fue de 4,6x106 NMP g-1de microorganismos totales en los
estiércoles de porcino y vacuno y 1,1x107 NMPg-1 en el estiércol de cuy. A su
vez, la población de hidrocarbonoclásticos fue de 3,6x104 NMPg-1 en el estiércol
de vacuno; 3,9x104 NMPg-1 en el estiércol de porcino y 9,5x104 NMP g-1 en el
estiércol de cuy. En cuanto al nivel de toxicidad, fue bajo en todos los estiércoles
(Tabla 4).
4.3 Efecto del estiércol en la biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel
El efecto del estiércol en la biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos de diésel se determinó en la cinética de la población microbiana,
toxicidad de los contaminantes y concentración de hidrocarburos totales de
diésel (HTD), comparando los resultados con la aplicación en conjunto de los
estiércoles más fertilizante químico NP y con el testigo consorcio bacteriano
nativo.
51
Características Valores
HTD (mg kg-1)
22 987
Microorganismos totales (NMP g-1)
4,6x106
Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)
3,5x104
Características
Valores
Promedio elongación radicular (mm)
18,00
Porcentaje relativo de germinación (PGR)
77,78
Crecimiento relativo de radícula (CRR)
59,14
Índice de germinación (% IG)
46,00
Nivel de fitotoxicidad
Severo
Tabla 2. Contenido de hidrocarburos totales, HTP y número más probable, NMP,
de microorganismos totales e hidrocarbonoclásticos en suelo
contaminado con diésel
Tabla 3. Nivel de toxicidad de suelo contaminado con diésel determinado en
Raphanus sativus L.
52
Tabla 4. Características químicas, microbiológicas y toxicidad de estiércoles de
cuy, porcino y vacuno
Estiércol
Características Cuy Porcino Vacuno
Carbono (%)
38,7
40,5
42,7
Nitrógeno (%) 1,98 3,35 3,71
Relación C:N (%) 19,5 12,1 11,5
Microorganismos totales (NMP g-1) 1,1x107 4,6x106 4,6x106
Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) 9,5x104 3,9x104 3,6x104
Índice de germinación (%) 84,48 80,96 80,96
Toxicidad (nivel) Bajo Bajo Bajo
53
Para la obtención del consorcio, se aislaron bacterias heterótrofas del suelo
contaminado con diésel, obteniéndose 60 aislados en agar nutritivo y 52 en
agar Mac Conkey (Tabla 5). Entre los 112 aislados de bacterias, el 89,3 %
(100) utilizó el diésel como fuente de carbono y energía, durante 40-120 horas
(Figura 31, tabla 6) y alcanzaron 0,578 – 2,007 UAE mL-1 (Tabla 7).
Las tres bacterias que utilizaron el diésel como fuente de carbono y energía
en el menor tiempo: 40 horas y las dos que alcanzaron el mayor número de
unidades de actividad emulsificante: 1,569 – 2,007 UAE mL-1 se seleccionaron
para constituir los consorcios bacterianos. Los géneros de bacterias identificados
fueron Acinetobacter, Bacillus y Pseudomonas (Tablas 8,9).
La población de microorganismos totales en el suelo experimental, a los 0
días fue de <3x104 - 1,1x107 NMP g-1 (Tabla 10, anexos 5 al 8). Estos valores
se incrementaron en todos los tratamientos conforme transcurrió el tiempo,
alcanzando a los 60 días el valor máximo de >1,1x107 NMP g-1, a excepción de
T10, con el que se alcanzó 2,3x105 NMP g-1 a los 90 días. A los 30, 60 y 90 días
la población de microorganismos totales en T4 (estiércol de cuy + NP) fue
superior a T1 (estiércol de cuy). Por el contrario, a los 30 días la población en
T5 (estiércol de porcino + NP), así como en T6 (estiércol de vacuno + NP) fue
inferior a T2 (estiércol de porcino) y T3 (estiércol de vacuno).
La población de microorganismos hidrocarbonoclásticos fue de <3x103 –
4,3x104 NMP g-1 a los 0 días (Tabla 11, anexos 9 al 12). Estos valores se
incrementaron conforme transcurrió el tiempo, alcanzando a los 90 días, el rango
máximo de 1,1x106 - >1,1x106 en los tratamientos con estiércol (T1, T2, T3) y
estiércol + NP (T4, T5, T6); 1,1x106 en T7, T8 y T9 y 2,6x104 NMP g-1 en T10.
54
Tabla 5. Bacterias heterótrofas aisladas en muestras de suelo contaminado con diésel
Muestra Agar nutritivo Agar Mac Conkey código
J50 0484499 1 3 J32 0484525 1 1 J33 0484521 1 1 J54 0484498 1 1 J37 0484495 1 1 S29 0484517 1 1 S53 0484500 1 1 S52 0484501 1 1 S31 0484523 1 1 S51 0484500 1 1 J36 0484523 1 1 J37 0484522 1 1 J38 0484495 1 1 J15 0484477 1 1 J30 0484517 1 1 F48 0484494 1 1 F41 0484493 1 1 F49 0484494 1 1 F28 0484712 1 1 F27 0484411 1 1 L42 0484493 1 1 F40 0484492 1 1 F45 0484494 1 1 F10 0484467 1 1 F20 0484493 1 1 B46 0484473 1 1 B1 0484481 1 1 B34 0484526 1 1 B47 0484494 1 1 B13 0484473 1 1 B43 0484493 1 1 B44 0484494 1 1 B24 0484504 1 1 B26 0484507 1 1 B9 0484464 1 1 B3 0484473 1 1 B14 0484473 1 1 B6 0484466 1 1 B18 0484487 1 1 B21 0484495 1 1 S12 0484472 2 1 S25 0484510 1 1 S2 0484475 1 1 P23 0484501 1 1 P19 0484489 1 1 P16 0484481 2 1 P7 0484461 1 1 P4 0484470 1 1 P22 0484501 1 1 P39 0484493 2 1 P5 0484467 1 0 P8 0484466 1 0 P16 0484483 1 1 P7 0484464 1 1
55
Figura 31. Porcentaje de bacterias que utilizaron diésel como fuente de carbono
y energía.
89%
11%
Utilizaron diésel No utilizaron
56
Tabla 6. Tiempo requerido para la utilización de diésel como fuente de carbono
y energía por bacterias aisladas de suelo contaminado
Bacteria código
Tiempo (horas)
Bacteria código
Tiempo (horas)
J1 40 2a 120 J2 40 Y35 120
J23 40 10a 120 Y1 40 74a 120 Y3 40 J27 120
Y13 40 5a 120 Y15 40 94a 120 Y22 40 92a 120 Y44 40 Y5 120 Y46 40 M7 120 Y50 40 27a 120 J3 60 97a 120
J26 60 102a 120 J42 60 Y20 120 J48 60 J19 120 J51 60 118a 120 Y12 60 99a 120 Y21 60 Y26 120 Y43 60 72a 120 Y48 60 115a 120 J24 80 Y32 120 J25 80 98a 120 Y2 80 J50 120 Y4 80 133a 120 Y8 80 J36 120
Y11 80 122a 120 97a 100 128a 120 Y5 100 109a 120 Y6 100 172a 120 Y7 100 114a 120
Y23 100 32a 120 Y31 100 J29 120 Y39 100 47a 120 Y45 100 J49 120
146a 120 126a 120 M27 120 Y36 120 101b 120 134a 120 81c 120 142a 120 D22 120 28a 120 82c 120 155a 120 27c 120 J39 120 L25 120 J24 120 50c 120 9a 120 D7 120 M2 120 42c 120 J23 120 82a 120 S1 120 Y5 40 S3 120 Y6 40 S4 120 Y7 40 S5 120 Y8 40 S6 120 Y9 40 S7 120 J6 40 S8 120 J7 40 S9 120
57
Tabla 7. Unidades de actividad emulsificante alcanzadas por bacterias aisladas
de suelo contaminado con diésel
Bacteria código
UAE mL-1 Bacteria código
UAE mL-1
2a 2,007 Y22 0,705 Y5 1,569 J3 0,702
94a 1,350 J26 0,699 97a 1,315 Y15 0,699 74a 1,254 Y3 0,694 J27 1,246 J24 0,689 5a 1,169 Y1 0,688
Y35 1,168 J1 0,681 92a 1,164 J23 0,680 82a 1,116 Y46 0,675 M7 1,081 Y50 0,675 27a 1,072 J2 0,662 10a 1,029 Y21 0,662
102a 1,023 J42 0,656 Y20 0,995 J48 0,652 J19 0,991 J51 0,652
118a 0,980 Y12 0,646 99a 0,974 Y44 0,645 Y26 0,971 Y43 0,645 72a 0,971 Y8 0,640
115a 0,958 Y13 0,638 Y32 0,915 J25 0,638 98a 0,909 Y2 0,630 J50 0,885 Y4 0,627
133a 0,884 Y48 0,627 J23 0,848 Y11 0,626
122a 0,822 97a 0,624 128a 0,811 Y5 0,620 109a 0,798 Y6 0,619 172a 0,787 Y7 0,616 114a 0,787 Y23 0,615 32a 0,773 50c 0,615 J29 0,761 Y39 0,615 47a 0,751 Y45 0,612 J49 0,750 146a 0,609
126a 0,750 M27 0,604 Y36 0,748 101b 0,602
134a 0,741 81c 0,602 142a 0,737 D22 0,597 28a 0,730 82c 0,597
155a 0,728 42c 0,596 J39 0,724 L25 0,594 J24 0,722 Y31 0,591 9a 0,718 D7 0,589 M2 0,713 27c 0,588 J36 0,713 J4 0,588
113a 0,712 S3 0,587
Y5 0,711 S4 0,586
Y6 0,710 S5 0,585
Y7 0,709 S6 0,584
Y8 0,708 S7 0,583
Y9 0,708 S8 0,582
J6 0,708 S9 0,581
J7 0,708 S2 0,580
J8 0,706 S3 0,579
J9 0,706 S0 0,578
58
Tabla 8. Bacterias degradadoras de diésel seleccionadas para constituir el
consorcio
Género bacteriano
Degradación de diésel
Tiempo (horas)
UAE mL-1
Pseudomonas sp. J1 Acinetobacter sp. J23 Bacillus sp. Y3
40 0,615 40 0,848 40 0,578
Pseudomonas sp.2a 120 2,007
Acinetobacter sp.Y5 100 1,569
59
Tabla 9. Características diferenciales de géneros de bacterias degradadoras de hidrocarburos de diésel
Características
Acinetobacter sp. Pseudomonas sp. Bacillus sp.
Células Bacilos rectos Bacilos rectos Bacilos rectos
Tinción de gram - - + Motilidad - + + Oxidasa - + - Catalasa + + +
Descarboxilación de arginina - +
Hidrólisis de la gelatina - - Hidrólisis de la esculina - - Reducción de nitrato - + Descarboxilación de lisina + - Polimixina B (300UI) ND S Penicilina R ND Oxido-fermentación
Glucosa + +
Maltosa + -
Manitol - +
Sacarosa - -
Xilosa + +
Utilización del citrato - + +
Posición de la espora Central Acidez :
Glucosa +
Manitol +
Xilosa -
Arabinosa -
Hidrólisis de lecitina - Hidrólisis de almidón -
ND: No determinado, R: Resistente, S: Sensible
ND: No determinado, R: Resistente, S: Sensible
60
Tabla 10. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) durante la biorremediación de suelo contaminado
con diésel
Tratamientos NMP g-1/días
0 30 60 90
T1: Estiércol de cuy
1,1x107
>1,1x107
>1,1 x107
>1,1x107
T2: Estiércol de porcino
2,4x106
4,6x106
>1,1x107
>1,1x107
T3: Estiércol de vacuno
2,1x106
2,9x106
>1,1x107
>1,1x107
T4: Estiércol de cuy + NP
1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
T5: Estiércol de porcino +NP
2,1x106
2,9x106
>1,1x107
>1,1x107
T6: Estiércol de vacuno + NP
2,1x106
2,4x106
>1,1x107
>1,1x107
T7:Testigo sin estiércol, sin NP
9,3x105
4,6x106
>1,1x107
>1,1x107
T8:Testigo sin estiércol, con NP
9,5x105
>1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
T9:Testigo consorcio bacteriano + NP
1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
1,1x107
T10:Testigo abiótico
<3x104
6,1x104
1,2x105
2,3x105
61
Tabla 11. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) durante la biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos NMP g-1/días
0 30 60 90
T1: Estiércol de cuy
2,8x104
3,5x104
4,6x105
>1,1x106
T2: Estiércol de porcino
2,8x104
9,3x104
2,5x105
1,1x106
T3: Estiércol de vacuno
2,3x104
1,5x105
2,9x105
1,1x106
T4: Estiércol de cuy + NP
3,5x104
2,1x105
>1,1x106
>1,1x106
T5: Estiércol de porcino + NP
3,5x104
4,3x104
2,1x105
1,1x106
T6: Estiércol de vacuno + NP
3,5x104
9,3x104
2,1x105
1,1x106
T7:Testigo sin estiércol, sin NP
1,5x104
2,1x104
3,5x104
1,1x106
T8:Testigo sin estiércol, con NP
1,9x104
3,4x104
4,3x104
1,1x106
T9:Testigo consorcio bacteriano + NP
4,3x104
1,9x104
2,1x105
>1,1x106
T10:Testigo abiótico
<3x103
6,0x103
2,0x104
2,6x104
62
En el testigo consorcio bacteriano + nutrientes se observó que los
microorganismos hidrocarbonoclásticos (4,3x104 NMP g-1) disminuyeron a los
30 días a 1,9x104 y a partir de los 60 días aumentaron, alcanzando el máximo
de >1,1x106 a los 90 días.
A los 30 y 60 días la población de hidrocarbonoclásticos en T4 (estiércol de
cuy + NP) fue superior a T1 (estiércol de cuy). Por el contrario, la población T5
(estiércol de porcino + NP) así como T6 (estiércol de vacuno + NP) fue inferior a
T2 (estiércol de porcino) y T3 (estiércol de vacuno). A los 90 días el NMP de
hidrocarbonoclásticos fue igual a los tratamientos sin y con NP y en ambos casos
el estiércol de cuy superó al de porcino y vacuno.
El índice de germinación de rabanito osciló entre 50,61 a 55,02% en todos
los tratamientos (Tablas 12,13, anexos 13 al 16), valores correspondientes a un
nivel moderado de toxicidad de los contaminantes del suelo experimental, a
excepción de T10 testigo abiótico con 49% y un nivel severo de toxicidad. El
índice de germinación se incrementó, de tal manera que el nivel de toxicidad
disminuyó, conforme transcurrió el tiempo. A los 30 días el nivel de toxicidad fue
moderado en todos los tratamientos a excepción del testigo abiótico. A los 60
días el nivel de toxicidad fue bajo en T4 (estiércol de cuy + NP) y T9 (testigo
consorcio bacteriano) y moderado en los demás tratamientos. A los 90 días el
nivel de toxicidad fue bajo en los tratamientos con estiércol sin y con NP y testigo
consorcio bacteriano; no obstante, el nivel fue moderado en los testigos T7, T8
y T10.
A los 90 días el mayor índice de germinación (93,75) de rabanito
correspondió a T9 (testigo consorcio bacteriano), seguido de T4 (estiércol de cuy
+ NP) y T1 (estiércol de cuy) con 88,87 y 85,83 respectivamente. Los menores
índices de germinación se alcanzaron en los testigos T8 (63,53%) T7 (58,80%)
y T10 (56,19%).
63
Tabla 12. Índice de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito” durante la biorremediación de suelo contaminado con
diésel
* Significancia (α=0,05)
Tratamientos Índice de germinación (%)
0 30 60 90*
T1: Estiércol de cuy
55,02
68,60
70,20
85,83 b
T2: Estiércol de porcino
53,17
66,44
68,02
85,24 b
T3: Estiércol de vacuno
50,61
60,64
65,00
82,08 b
T4: Estiércol de cuy + NP
54,36
57,38
81,00
88,87 a
T5: Estiércol de porcino + NP
54,86
55,94
65,02
84,02 b
T6: Estiércol de vacuno + NP
53,52
57,38
63,04
81,03 b
T7:Testigo sin estiércol, sin NP
50,40
51,02
52,34
58,80 d
T8:Testigo sin estiércol, con NP
54,64
56,00
60,02
63,53 c
T9:Testigo consorcio bacteriano + NP
54,34
62,10
82,00
93,75 a
T10:Testigo abiótico
49,00
51,04
52,10
56,19 d
64
Tabla 13. Niveles de toxicidad de contaminantes durante la biorremediación de suelo contaminado con diésel
Tratamientos Nivel de toxicidad
0 30 60 90
T1: Estiércol de cuy
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
T2: Estiércol de porcino
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
T3: Estiércol de vacuno
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
T4: Estiércol de cuy + NP
Moderado
Moderado
Bajo
Bajo
T5: Estiércol de porcino + NP
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
T6: Estiércol de vacuno + NP
Moderado
Moderado
Moderado
Bajo
T7:Testigo sin estiércol, sin NP
Moderado
Moderado
Moderado
Moderado
T8:Testigo sin estiércol, con NP Moderado Moderado Moderado Moderado
T9:Testigo consorcio bacteriano + NP Moderado Moderado Bajo Bajo
T10:Testigo abiótico Severo Severo Moderado Moderado
65
El análisis de varianza de los promedios del índice de geminación,
demostró alta significancia y según la prueba múltiple de Tukey, el mayor valor
se alcanzó con T9, no diferenciándose significativamente de T4, pero sí de los
demás tratamientos (Tabla 12). Con el tratamiento T4 (estiércol de cuy + NP) la
toxicidad de los contaminantes del suelo experimental disminuyó desde un nivel
moderado hasta un nivel bajo a los 60 días, así como también se cuantificó un
HTD final de 4 200 mg kg-1, correspondiente a 81,7 % de eficiencia en la
biorremediación (Tabla 14), del suelo contaminado con hidrocarburos de diésel.
66
Tabla 14. Características del suelo contaminado con hidrocarburos de diésel y biorremediado durante 90 días con estiércol de
cuy + NP
Características Días
0 30 60 90
Microorganismos totales (NMP g-1)
1,1x107
>1,1x108
>1,1x108
>1,1x108
Microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1)
3,5x104
2,1x105
>1,1x106
>1,1x106
Índice de germinación (%)
54,36
57,38
81,00
88,87
Nivel de toxicidad
Moderado
Moderado
Bajo
Bajo
HTD (mg kg-1)
22 987
----------
------------
4 200
Eficiencia de biorremediación (%)
----------
----------
-----------
81,7
67
V. DISCUSIÓN
El análisis del suelo investigado demostró presencia de hidrocarburos
totales de diésel, HTD (Total diesel hydrocarbon, TDH), una población
microbiana y toxicidad de los contaminantes, coincidiendo con investigaciones
previas de suelos contaminados8,10,22. Los ensayos de tratabilidad o pruebas
realizadas a escala de laboratorio, previos a la implementación de cualquier
tecnología de biorremediación de suelo contaminado brindan información para
aumentar la posibilidad de éxito en la descontaminación. En la fase I se realiza
la caracterización físico-química y microbiológica del suelo contaminado, así
como también se determina la actividad metabólica microbiana y la
biodegradabilidad de los contaminantes. En la fase II se investigan las
condiciones óptimas para la biorremediación23.
El diésel se utilizó como contaminante del suelo porque este derivado del
petróleo tiene grandes probabilidades de derrames durante su traslado y
comercialización en las estaciones de servicio1,15,22. Los hidrocarburos de los
derivados del petróleo son los contaminantes más comunes en la naturaleza. Su
presencia ha sido detectada en componentes vivos e inertes de los
ecosistemas1. El diésel, derivado del petróleo es el combustible más utilizado en
la actualidad. Está constituido por 64,1% de parafinas; 31% de aromáticos y
4,9% de oleofinas, siendo más difícil de tratar que la gasolina o el gasoil26,34.
El contenido de HTD fue de 22 987 mg kg-1 superior a 20 000 mg kg-1
registrado15 para un suelo contaminado con gasoil y superior al rango 5950-
10 000 mg kg-1 reportado en suelos con diésel10,26. La fracción HTP en el petróleo
y HTD en el diésel se define como aquellos hidrocarburos del extracto orgánico
total pertenecientes a las fracciones saturada y aromática6, cuya concentración
sirve como indicador general del tipo de contaminación de un ambiente17,35,36. En
la presente investigación la concentración de HTD en el suelo fue menor de 50
000 mg kg-1 cumpliéndose con el requerimiento establecido para aplicar la
biorremediación1,37,38. Cuando la concentración del contaminante es alta se
puede inhibir el desarrollo microbiano y por tanto su capacidad de
68
metabolización. Si la concentración es muy alta, los microorganismos se
intoxican y mueren1,38.
En el suelo contaminado con diésel se cuantificó 4,6x106NMP g-1 de
microorganismos totales y 3,5x104 NMP g-1 de hidrocarbonoclásticos,
coincidiendo con investigaciones de suelo contaminado con petróleo
crudo6,7,8,33. También existen reportes de las poblaciones microbianas en
unidades formadoras de colonias, UFC g-1, considerándose un requerimiento de
más de 1x103UFC g-1 de suelo para una aceptable actividad degradativa13,37,
105-106UFC heterótrofos totales y 103-104UFC hidrocarbonoclásticos5,39 e
inclusive 106-108UFC hidrocarbonoclásticos23.
El conocimiento de la composición de la comunidad microbiana se requiere
para decidir en corto plazo si es factible la biorremediación23. Los
microorganismos totales o heterótrofos totales metabolizan como fuente de
carbono sustancias orgánicas y los microorganismos hidrocarbonoclásticos
degradan el petróleo como única fuente de carbono y energía1,6,9,36. Los
contaminantes del petróleo se localizan principalmente en el horizonte A del
suelo, que es el más superficial y donde se encuentra el mayor contenido de
materia orgánica que incluye a los microorganismos en general. Asimismo, los
suelos expuestos a la contaminación prolongada con hidrocarburos de petróleo
o de diésel constituyen un microhábitad adecuado para la evolución de especies
microbianas degradadoras o hidrocarbonoclásticas. El contaminante ejerce
presión sobre la población microbiana, seleccionándose aquellas capaces de
sobrevivir y adaptarse39.
La población de microorganismos totales fue superior a la de
hidrocarbonoclásticos, condición observada por diversos investigadores en
suelos contaminados9,33. En ecosistemas no contaminados las comunidades
microbianas degradadoras de hidrocarburos constituyen menos del 0,1% y en
ecosistemas contaminados alcanzan el 85% de microorganismos viables15. Un
ambiente contaminado con petróleo puede ser biorremediado cuando el
porcentaje de bacterias hidrocarbonoclásticas es igual o mayor al 50 % de los
heterótrofos, pudiendo alcanzar al 100%9.
69
El nivel de toxicidad del suelo investigado, fue severo en la germinación del
bioindicador Raphanus sativus L. “rabanito”. La inhibición de la germinación y
crecimiento vegetativo de las plantas en suelos contaminados con petróleo y
derivados ha sido demostrada en diversas investigaciones9,37,40,41. Los
hidrocarburos de petróleo ingresan en las semillas y alteran las reacciones
metabólicas o matan el embrión por toxicidad. La inhibición de la germinación
también está correlacionada con las propiedades hidrofóbicas de los
hidrocarburos, que evitan o reducen el intercambio de gases y agua, necesarios
en esta etapa1. Los hidrocarburos son los compuestos mayoritarios (50-98%) del
petróleo15y entre ellos los hidrocarburos aromáticos (HAPs) son considerados
contaminantes prioritarios por la Agencia de Protección Americana (EPA),
debido a su peligrosidad intrínseca, toxicidad aguda, teratogénica, mutagénica y
carcinogénica. Estos compuestos se bioacumulan y se biomagnifican8.
En el suelo contaminado con diésel se aislaron bacterias degradadoras
coincidiendo con previas investigaciones7,17,34,42 aunque también se pueden
aislar de agua de mar contaminada9, aguas residuales domésticas, refinerías de
petróleo y plantas químicas16 y de ambientes no contaminados como la rizósfera
de manglares10. En este último caso, las bacterias previamente deben ser
adaptadas al contaminante en condiciones in vitro.
Las bacterias heterótrofas cultivables se aislaron en agar nutritivo y Mac
Conkey. El agar nutritivo es un medio de cultivo para el aislamiento de
microorganismos pocos exigentes en lo que se refiere a requerimientos
nutricionales y no contiene inhibidores del desarrollo microbiano9. El agar Mac
Conkey es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias Gram
negativas y aerobias facultativas. Contiene cristal violeta y sales biliares como
inhibidores de las bacterias Gram positivas y facilita la diferenciación entre Gram
negativas fermentadoras y no fermentadoras de lactosa9,42. Entre estas últimas
se reportan eficientes degradadores de petróleo como Pseudomonas,
Acinetobacter y Burkholderia9,10,18,41.
Las bacterias heterótrofas aisladas se consideraron degradadoras de
diésel, porque en condiciones de laboratorio utilizaron el contaminante como
fuente de carbono y energía o demostraron actividad emulsificante9,10,32,41,42. Los
70
microorganismos aislados de suelo con derrames recientes y crónicos de
petróleo y que muestran crecimiento abundante en el contaminante son
considerados degradadores porque presentan actividad de peroxidasas y
oxigenasas que oxidan algunas fracciones del petróleo. La oxidación cambia las
propiedades de los compuestos, haciéndolos susceptibles a los ataques
secundarios y facilita su degradación a dióxido de carbono y agua37,43. En las
áreas impactadas con hidrocarburos de petróleo y derivados se encuentran
microorganismos seleccionados de forma natural por su cooperación metabólica
en el proceso degradativo1,6. Durante la biodegradación, aproximadamente 50%
del carbono en el petróleo es utilizado para formar la biomasa microbiana37.
Inmediatamente después de un derrame, los hidrocarburos más livianos,
es decir los que tienen 5-11 carbonos se evaporan3. Los n-alcanos de cadena
lineal y particularmente aquellos de 11-19 átomos de carbono constituyen la
fracción más fácilmente biodegradable a través de oxidaciones hasta alcoholes
primarios, luego aldehídos y finalmente ácidos carboxílicos, que son susceptibles
de ser escindidos a unidades de acetato por la vía beta oxidativa43. En los
aromáticos, la degradación se inicia con la oxidación del anillo, mediante la
incorporación de dos átomos de oxígeno, catalizada por una dioxigenasa. Se
forma un cis-dihidrodiol y el anillo pierde la aromaticidad. A continuación, una
deshidrogenasa NAD dependiente reconstituye el anillo aromático, formándose
dioles como el catecol, en los que se rompe el anillo originándose compuestos
metabolizables por el ciclo de Krebs39.
El tiempo mínimo requerido por las bacterias para la utilización del petróleo
fue 40 horas, mucho menor a 72 horas registradas por otros investigadores9,32.
Al respecto, se cultivó42 Pseudomonas aeruginosa con petróleo como única
fuente de carbono y energía y se observó crecimiento diauxico: la primera fase
a las 24-72 horas y la segunda a las 96-480 horas. En este contexto, la velocidad
de crecimiento disminuyó conforme transcurrió el tiempo, aspecto relacionado
con la mayor complejidad de las fracciones de petróleo. En la primera etapa se
degradaron las fracciones de petróleo más sencillas: n-alcanos y parafinas de
cadenas cortas, las cuales se metabolizaron por oxidaciones sucesivas a través
de la β-oxidación. En la segunda etapa se degradaron las fracciones más
71
pesadas: isoprenoides, alcanos de cadena de más de 20 carbonos, cicloalcanos
y aromáticos9,42.
Las bacterias hidrocarbonoclásticas presentaron actividad emulsificante,
alcanzando un máximo de 2,007 UAE mL-1, valor que se encuentra en el rango
0,75 – 3,66 UAE mL-1, mencionado por otros investigadores9,31,33. Cuando la
fuente de carbono es un sustrato insoluble como los hidrocarburos, los
microorganismos facilitan su difusión hacia el interior produciendo
biosurfactantes y bioemulsificantes que mejoran la biodisponibilidad de los
contaminantes8,44.
En los consorcios seleccionados se identificaron los géneros de bacterias
Gram negativas Acinetobacter y Pseudomonas y la Gram positiva Bacillus,
reportados previamente como eficientes hidrocarbonoclásticos7,8,10,31,37,41. Las
bacterias Gram negativas predominan en los ambientes contaminados con
hidrocarburos31,42, habiéndose identificado A. calcoaceticus, P. aeruginosa7, P.
putida, P. fluorescens y P. stutzeri37, pero también las Gram positivas B. cereus,
B. sphaericus, B. fusiformis, B. pumilus37 y B. brevis34.
La capacidad metabólica de las poblaciones microbianas frente a los
contaminantes de un suelo6,15, es el fundamento sobre el que se sustenta el
presente estudio de biorremediación o tecnología en la que los agentes
biológicos, principalmente los microorganismos utilizan los contaminantes como
alimento para su desarrollo y crecimiento, transformándolos en formas menos
tóxicas y en el mejor de los casos, mineralizándolos hasta dióxido de carbono y
agua7.
Existen factores que limitan la biorremediación de un suelo contaminado
como son la población microbiana, disponibilidad de nutrientes nitrógeno y
fósforo, además de la temperatura, pH, oxígeno, humedad, porosidad del suelo,
textura y permeabilidad entre otros7. Por esta razón, en el proceso de
biorremediación se aplicaron riegos, volteos y las estrategias de bioaumentación
y bioestimulación mediante la adición de estiércol2,7,9. La bioaumentación es la
adición de microorganismos degradadores seleccionados naturalmente en el
ambiente contaminado. Estos microorganismos se aíslan, caracterizan y
después se reintroducen para la degradación de los contaminantes8. En la
72
bioestimulación, la actividad microbiana es estimulada o incrementada por la
adición de nutrientes como el nitrógeno, fósforo y potasio39.
En la biorremediación del suelo contaminado con diésel se aplicó estiércol
como fuente de microorganismos y los nutrientes nitrógeno y fósforo,
equivalentes a las tecnologías de biorremediación y bioestimulación, pero con
menor costo, por la disponibilidad del insumo remediador1.
La temperatura ambiental en el proceso degradativo fue de 21-23°C;
valores inferiores al rango 30-40°C, considerado óptimo y en el que se intensifica
la actividad enzimática de los microorganismos, acelerando al máximo la
degradación. Cuando la temperatura es menor, la viscosidad del petróleo
aumenta, varía su solubilidad en agua y disminuye la volatilización de algunas
fracciones tóxicas para los microorganismos. Por el contrario, a temperaturas
mayores, la toxicidad de los hidrocarburos se incrementa, inhibiéndose la
actividad microbiana15,34.
Durante el proceso de biorremediación, el suelo fue removido para
favorecer la aireación. La biodegradación de hidrocarburos implica la oxidación
por oxigenasas, requiriéndose el oxígeno molecular para su actividad. Además,
la oxigenación facilita la volatilización de los compuestos tóxicos8,34,39. La
humedad se mantuvo en 60% de la capacidad de campo (cc), por cuanto una
humedad de 25-75% cc o masa de agua que admite el suelo hasta la saturación
es requerida para mantener la aerobiosis. La biodegradación en anaerobiosis
utiliza aceptores de electrones como los nitratos, sulfatos, carbonatos, ión férrico
(Fe3+) y mangánico (Mn4+); no obstante, el proceso es muy lento e inclusive
inexistente15,34,39.
La eficiencia de la biorremediación de suelo contaminado se determinó
directamente a través de la cuantificación de los HTP e indirectamente mediante
la cinética de la población microbiana y la toxicidad de los contaminantes del
suelo experimental33,34,41. Los estiércoles de cuy, porcino y vacuno
incrementaron la biorremediación del suelo contaminado con diésel,
observándose incremento de los microorganismos y disminución de la toxicidad
del suelo a los 60-90 días. De igual manera, se reportó la disminución del 25%
del HTP por efecto del estiércol de vacaza, cerdaza y aserrín en la
73
biorremediación de un suelo contaminado con 19 800 - 21 800 mg kg-1 de
petróleo.
La supervivencia y adaptación de los microorganismos degradadores
introducidos o autóctonos en el sitio contaminado es de gran importancia para el
éxito de la biorremediación, por lo que el monitoreo de los cambios en la
población es esencial para establecer y mantener las condiciones favorables7.Al
inicio de la biorremediación (0 días) a excepción del testigo abiótico, la población
de microorganismos totales fue 9,3x105–1,1x107 NMPg-1 y la de
hidrocarbonoclásticos de 1,5x104–4,3x104 NMPg-1, superando 9x103 NMPg-
1, reportados en un suelo contaminado con 23 612 mg kg-1 de petróleo crudo9.
Los microorganismos se incrementaron, alcanzando la máxima población
de heterótrofos totales a los 60 días y de hidrocarbonoclásticos a los 90. El
incremento también fue reportado en otras investigaciones2,9,32, alcanzando la
población total máxima de 106-107 a los 60 días. El aumento de la población
microbiana está asociado al mayor porcentaje de biodegradación, como se
observó en la biorremediación de un suelo contaminado con 50 mg kg-1. Los
máximos valores microbianos correspondieron a los 30 días, periodo en el que
se alcanzó 38,6% de degradación, en comparación con 28,1% a los 60 días y
4,7% a los 90 días34.
La aplicación de úrea y fosfato junto al estiércol de cuy aceleró el
incremento de la población microbiana, índice de germinación de rabanito y
disminución del nivel de toxicidad del suelo contaminado; sin embargo, este
efecto positivo no se observó cuando los fertilizantes químicos se adicionaron
junto a los estiércoles de porcino y vacuno. Los hidrocarburos de petróleo son
casi exclusivamente carbono y contienen muy pocos elementos como el N, P, K
y algunos minerales traza esenciales para la célula bacteriana8. Diversas
investigaciones3,6,7,9,10,15,23 han demostrado que la adición de fuentes de
nitrógeno y fósforo inorgánico generalmente tiene efecto positivo en la
biorremediación, incrementando las poblaciones microbianas y la tasa de
biodegradación de hidrocarburos en suelos contaminados; no obstante, la
proporción C:N:P debe ser en promedio 100:10:14,9,15,23 para evitar el exceso de
nutrientes que pueden causar toxicidad o se pierden por lixiviación15,23. En la
74
presente investigación el estiércol de cuy presentó 1,98% de nitrógeno, en
comparación con 3,35 y 3,71% de los estiércoles de porcino y vacuno,
diferencias a los que se pueden atribuir el efecto del estiércol de cuy, frente a los
de porcino y vacuno.
El índice de germinación de rabanito obtenido en el suelo biorremediado
con el testigo consorcio bacteriano fue mayor que el del estiércol + nutrientes,
resultado explicado por el requerimiento de poblaciones microbianas mixtas
seleccionadas naturalmente o en el laboratorio por sus eficientes capacidades
enzimáticas para la degradación de las mezclas complejas de hidrocarburos de
petróleo. Los microorganismos individualmente pueden metabolizar un rango
limitado de hidrocarburos, por lo que se prefieren los consorcios
microbianos8,39,45.
Los mayores índices de germinación de rabanito con un nivel bajo de
toxicidad a los 60 días correspondieron a T4 estiércol de cuy + nutrientes y T9
testigo consorcio bacteriano. La superioridad de los tratamientos se debe a que
la inoculación de microorganismos como los del estiércol (T4) o reintroducción
de microorganismos nativos o aislados previamente de un suelo contaminado
(T9) tiene mayor efectividad en la biodegradación de hidrocarburos de petróleo
o derivados cuando los microorganismos disponen de fertilizantes inorgánicos7.
En este contexto, la aplicación de estiércol de cuy +nutrientes es una alternativa
promisoria para la biorremediación de suelos contaminados con diésel.
75
VI. CONCLUSIONES
El suelo contaminado con diésel presentó un contenido de HTD de
22987mgkg-1, microorganismos totales (4,6x106NMPg-1), hidrocarbonoclásticos
(3,5x104NMP g-1) y un nivel severo de toxicidad, en el índice de germinación de
Raphanus sativus L. “rabanito”.
Los estiércoles de cuy, porcino y vacuno presentaron carbono (38,7-42,7%),
nitrógeno (1,98-3,71%), microorganismos totales (1,1x107-4,6x106NMP g-1),
hidrocarbonoclásticos (3,6x104-9,5x104NMP g-1) y un nivel bajo de toxicidad en
la geminación de rabanito.
Los estiércol de cuy, porcino y vacuno incrementaron la biorremediación del
suelo contaminado con hidrocarburos de diésel en terrarios, destacando el
estiércol de cuy más nutrientes con 81,7 % de eficiencia en la biorremediación.
76
VII. RECOMENDACIONES
Caracterizar a nivel molecular Pseudomonas spp. J1 y 2a, Acinetobacter
spp. J23 y Y5 y Bacillus sp.Y3.
Investigar dosis de estiércol de cuy más nutrientes en la biorremediación
de suelos contaminantes con hidrocarburos de petróleo.
Biorremediar suelo contaminado con hidrocarburos de petróleo en lotes
de explotación comercial, aplicando estiércol de cuy + nutrientes.
77
VIII. RESUMEN
La biorremediación es una tecnología que acelera la biodegradación de los
contaminantes en el ambiente. El objetivo de la investigación fue determinar el
efecto de los estiércoles de cuy, porcino y vacuno sin y con fertilizante químico
en la biorremediación de suelo contaminado con hidrocarburo de diésel. Se
colectó suelo en los alrededores de servicentros de expendio de diésel, se
mezcló con arena de río y pajilla (20:10:0,1), se acondicionó en terrarios, se
adicionaron 20 000 ppm de diésel y se realizó el análisis químico, microbiológico
y toxicidad en el índice de germinación de Raphanus sativus L. “rabanito”. El
ensayo fue conducido bajo un diseño experimental completamente aleatorio,
DCA, con diez tratamientos y tres repeticiones: T1 (estiércol de cuy), T2
(porcino), T3 (vacuno), T4 (cuy + NP), T5 (porcino + NP),T6 (vacuno + NP), T7
(testigo agua destilada), T8 (NP), T9 (consorcio bacteriano + NP), T10 (testigo
abiótico). El suelo experimental fue mezclado con el estiércol (6:1), los
fertilizantes úrea (46 % N) y fosfato diamónico (18% N – 46% P) se aplicaron
hasta alcanzar la relación C100:N10:P1 y el consorcio bacteriano se aplicó al 5%
por terrario. El proceso se monitoreó por 90 días. El suelo presentó un HTD de
22987mgkg-1, microorganismos totales (4,6x106 NMPg-1), hidrocarbonoclásticos
(3,5x104 NMPg-1) y un nivel severo de toxicidad. Los estiércoles presentaron
carbono (38,7-42,7%), nitrógeno (1,98-3,71%), microorganismos totales
(1,1x107-4,6x106NMPg-1), hidrocarbonoclásticos (3,6x104-9,5x104NMP g-1) y un
nivel bajo de toxicidad. Los estiércoles incrementaron la biorremediación del
suelo contaminado, destacando significativamente el estiércol de cuy más NP
con el que se alcanzó un HTD 4200mgkg-1, correspondiente a 81,7 % de
eficiencia en la biorremediación.
78
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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83
X. ANEXOS
84
ANEXO 1
Servicentros de la ciudad de Chiclayo donde se realizó el muestreo de suelos
contaminados con petróleo diésel
Nombre Ubicación
1. Lubricentro “El Rey”
2. Lubricantes Yesikar
3. Oleocentro Unión
4. Frenos de carros
5. Lubricantes San Pedro
6. Lubricante Adriánzen
7. Oleocentro Frank
8. Oleocentro del Norte
9. Lubricentro
10. Oleocentro
Av. Belaunde 1085
Av. Belaunde 1411
Av. Belaunde 1440
Av. Constitución 950
Av. Sáenz Peña 900
Av. Leguía 2330
Av. Leguía 2670
Calle Piura 440
Av. Av. México 840
Calle Nicolás de Piérola 382
85
ANEXO 2
Composición (gL-1) de medios de cultivo para el aislamiento de bacterias
heterótrofas9
Caldo nutritivo (gL-1)
Peptona
Extracto de carne
Agua destilada csp
Peptona
5,0
3,0
1000 mL
5,0
Agar Plate Count (gL-1)
Triptona
Dextrosa
Extracto de Levadura
Agar
Agua destilada
pH final
5
1
2,5
12
1000 mL
7
Agar Mac Conkey (gL-1)
Peptona de gelatina
Peptona de caseína
Peptona de carne
NaCl
Lactosa
Sales biliares
Rojo Neutro
Cristal Violeta
Agar agar
Agua destilada csp
pH
17,0
1,5
1,5
5,0
10,0
1,5
0,03
0,001
13,5
1000 mL
7,0
86
Caldo Bushnell Hass (gL-1)
KH2PO4
K2HPO4
(NH4)2SO4
MgSO4
Cl2Ca
FeCl3
Agua destilada csp
pH
1,0
1,0
1,0
0,20
0,02
0,005
1000 mL
7,0
Caldo extracto de levadura etanol (gL-1)
KH2PO4
K2HPO4
MgSO4
(NH4)2SO4
Extracto de levadura
Etanol
Agua destilada csp
pH
18,0
6,0
0,2
4,0
3,0
20,0 mL
1000 mL
7,0
87
ANEXO 3
Calculo del NMP para bacterias hidrocarbonoclásticas28
Donde:
(Tabla NMP/100mL) = valor dado en la tabla según el código.
Tabla NMP/100mL
88
ANEXO 4
Calculo de la concentración de úrea y fosfato diamónico requeridos para
alcanzar una relación C:N:P de 100:10:19
a) Cálculo de FDA (18%N – 46%P)
100 kg FDA 46 U/P
x 1 U/P
x = 2,174 kg FDA.ha-1
x = 0,217 g FDA.m2
Adición por terrario
0,217 g FDA 1 m2
x 70%(0,0726) m2
x = 0,011 g FDA
100 kg FDA 18 U/N
0,000011 kg FDA x
x = 0,00000198 kg N
x = 0,00198 g N FDA
b) Cálculo de Úrea (46%N)
100 kg úrea 46 U/N
x 10 U/N
x = 21,739 kg úrea.ha-1
x = 2,1739 g úrea.m2
Adición por terrario
2,174 g úrea 1 m2
x 70%(0,0726) m2
x = 0, 110 g N
0,110 g N (úrea) – 0,00198 g N (FDA)
x = 0, 108 g úrea
89
Anexo 5. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) al inicio del proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
111
323
332
1,1x105
2,9x106
1,1x107
T2: Estiércol de porcino
121
320
330
1,5x105
9,3x105
2,4x106
T3: Estiércol de vacuno
211
221
322
2x105
>1,1x107
2,1x106
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
320
321
332
9,3x105
1,5x106
1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
211
311
322
2x105
7,5x105
2,1x106
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
211
221
322
2x105
2,8x105
2,1x106
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
223
310
320
4,2x105
4,3x105
9,3x105
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
221
300
303
2,8x105
2,3x104
9,5x105
T9:Testigo consorcio bacteriano
311
322
332
7,5x105
2,1x106
1,1x107
T10:Testigo abiótico
000
000
000
<3X104
<3x104
<3x104
90
Anexo 6. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) a los 30 días del proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
111
333
333
1,1x105
>1,1x107
>1,1x107
T2: Estiércol de porcino
211
321
331
2x105
1,5x106
4,6x106
T3: Estiércol de vacuno
111
111
133
1,1x105
1,1x105
2,9x105
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
311
320
333
7,5x105
9,3x105
>1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
311
322
323
7,5x105
2,1x106
2,9x106
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
210
310
330
1,5x105
4,3x105
2,4x106
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
331
331
331
4,6x106
4,6x106
4,6x106
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
321
333
333
1,5x106
>1,1x107
>1,1x107
T9:Testigo consorcio bacteriano
333
333
333
>1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
T10:Testigo abiótico
000
010
011
<3x104
3x104
6,1x104
91
Anexo 7. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) a los 60 días del proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
222
323
333
3,5x105
2,9x106
>1,1x107
T2: Estiércol de porcino
222
333
333
3,5x105
>1,1x107
>1,1x107
T3: Estiércol de vacuno
322
333
333
2,1x106
>1,1x107
>1,1x107
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
332
333
333
>1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
221
332
333
2,8x105
1,1x107
>1,1x107
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
211
333
333
2x105
>1,1x107
>1,1x107
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
322
333
333
2,1x106
>1,1x107
>1,1x107
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
332
333
333
1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
T9:Testigo consorcio bacteriano
332
333
333
1,1x107
>1,1x107
>1,1x107
T10:Testigo abiótico
000
011
022
<3x104
3x104
1,2x105
92
Anexo 8. Número más probable de microorganismos totales (NMP g-1) a los 90 días del proceso de biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
311
322
333
7,5x105
2,1x106
>1,1x107
T2: Estiércol de porcino
320
322
332
9,3x105
2,1x106
1,1x107
T3: Estiércol de vacuno
211
331
333
2x105
4,6x106
>1,1x107
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
310
332
333
4,3x105
1,1x107
>1,1x107
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
110
322
333
7.3x104
2,1x106
>1,1x107
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
201
333
333
1,4x105
>1,1x107
>1,1x107
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
210
333
333
1,5x105
>1,1x107
>1,1x107
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
320
333
333
9,3x105
>1,1x107
>1,1x107
T9:Testigo consorcio bacteriano
211
333
333
2x105
>1,1x107
>1,1x107
T10:Testigo abiótico
210
222
300
1,5x105
3,5x105
2,3x105
93
Anexo 9. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) al inicio del proceso de biorremediación de
suelo contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
000
111
221
<3x103
1,1x104
2,8x104
T2: Estiércol de porcino
111
221
221
1,1x104
2,8x104
2,8x104
T3: Estiércol de vacuno
100
200
300
3,6x103
9,1x103
2,3x104
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
111
222
222
1,1x104
3,5x104
3,5x104
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
211
222
222
2x104
3,5x104
3,5x104
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
111
222
222
1,1x104
3,5x104
3,5x104
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
110
111
112
7,3x104
1,1x104
1,5x104
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
111
112
113
1,1x104
1,5x104
1,9x104
g T9:Testigo consorcio bacteriano
200
300
310
9,1x103
2,3x104
4,3x104
T10:Testigo abiótico
000
000
000
<3x103
<3x103
<3x103
94
Anexo 10. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) a los 30 días del proceso de biorremediación
de suelo contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
000
111
211
<3x103
1,1x104
3,5x104
T2: Estiércol de porcino
110
220
320
7.3x103
2,1x104
9,3x104
T3: Estiércol de vacuno
121
221
321
1,5x104
2,8x104
1,5x105
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
000
320
322
<3x103
9,3x104
2,1x105
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
000
300
310
<3x103
2,3x104
4,3x104
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
000
210
320
<3x103
1,5x104
9,3x104
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
000
110
220
<3x103
7.3x103
2,1x104
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
000
112
213
<3x103
1,5x104
3,4x104
T9:Testigo consorcio bacteriano
000
112
113
<3x103
1,5x104
1,9x104
T10:Testigo abiótico
000
001
002
<3x103
3x103
6,0x103
95
Anexo 11. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) a los 60 días del proceso de biorremediación
de suelo contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
220
330
331
2,1x104
2,4x105
4,6x105
T2: Estiércol de porcino
110
111
330
7.3x103
1,1x104
2,4x105
T3: Estiércol de vacuno
211
322
323
2x104
2,1x105
2,9x105
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
220
321
333
2,1x104
1,5x105
>11x106
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
000
111
322
<3x103
1,1x104
2,1x105
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
000
000
322
<3x103
<3x103
2,1x105
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
000
000
222
<3x103
<3x103
3,5x104
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
000
000
310
<3x103
<3x103
4,3x104
T9:Testigo consorcio bacteriano
000
100
322
<3x103
3.6x103
2,1x105
T10:Testigo abiótico
000
000
211
<3x103
<3x103
2,0x104
96
Anexo 12. Número más probable de microorganismos hidrocarbonoclásticos (NMP g-1) a los 90 días del proceso de biorremediación
de suelo contaminado con diésel
Tratamientos Lectura /días NMP g-1 / días
1 3 10 1 3 10
T1: Estiércol de cuy
000
100
333
<3x103
3.6x103
>1,1x106
T2: Estiércol de porcino
000
211
332
<3x103
2x104
1,1x106
T3: Estiércol de vacuno
000
233
332
<3x103
5,3x104
1,1x106
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
100
333
333
3.6x103
>1,1x106
>1,1x106
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
100
320
332
3.6x103
>1,1x106
1,1x106
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
000
310
332
<3x103
4,3x104
1,1x106
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
100
300
332
3.6x103
2,3x104
1,1x106
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
000
310
332
<3x103
4,3x104
1,1x106
T9:Testigo consorcio bacteriano
000
333
333
<3x103
>1,1x106
>1,1x106
T10:Testigo abiótico
100
200
203
3.6x103
9,1x103
2,6x104
97
Anexo 13. Germinación de semillas de Raphanus sativus L. al inicio del proceso de la biorremediación de suelo contaminado con
diésel
Tratamientos Promedio elongación radicular
(mm)
Porcentaje relativo de
germinación (PGR)
Crecimiento relativo de
radícula (CRR)
Índice de germinación
(%IG)
Nivel de fitotoxicidad
T1: Estiércol de cuy
59
84,0
65,5
55,02
Moderado
T2: Estiércol de porcino
57
84,0
63,3
53,17
Moderado
T3: Estiércol de vacuno
60
76,0
66,6
50,61
Moderado
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
68
72,0
75,5
54,36
Moderado
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
65
76,0
72,2
54,86
Moderado
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
57
76,0
70,4
53,52
Moderado
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
60
81.6
66,6
54,40
Moderado
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
66
74.5
73,3
54,64
Moderado
T9:Testigo consorcio bacteriano
68
71.9
75,5
54,34
Moderado
T10:testigo abiótico
60
74.2
66,6
49,00
Severo
98
Anexo 14. Índice de germinación de semillas de Raphanus sativus L. a los 30 días del proceso de la biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos
Promedio elongación radicular
(mm)
Porcentaje relativo de
germinación (PGR)
Crecimiento relativo de
radícula (CRR)
Índice de germinación
(%IG)
Nivel de fitotoxicidad
T1: Estiércol de cuy
71
87,0
78,8
68,60
Moderado
T2: Estiércol de porcino
71
84,3
78,8
66,44
Moderado
T3: Estiércol de vacuno
68
80,3
75,5
60,64
Moderado
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
68
76,0
75,5
57,38
Moderado
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
70
72,0
77,7
55,94
Moderado
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
68
76,0
75,5
57,38
Moderado
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
60
76,6
66,6
51,02
Moderado
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
69
73,1
76,6
56,00
Moderado
T9:Testigo consorcio bacteriano
65
86,0
72,2
62,10
Moderado
T10:testigo abiótico
69
66,6
76,6
51,04
Severo
99
Anexo 15. Índice de germinación de semillas de Raphanus sativus L. a los 60 días del proceso de la biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos Promedio elongación radicular
(mm)
Porcentaje relativo de
germinación (PGR)
Crecimiento relativo de
radícula (CRR)
Índice de germinación
(%IG)
Nivel de fitotoxicidad
T1: Estiércol de cuy
71
89,0
78,8
70,20
Moderado
T2: Estiércol de porcino
71
86,3
78,8
68,02
Moderado
T3: Estiércol de vacuno
71
82,4
78,8
65,00
Moderado
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
79
92,3
87,7
81,00
Bajo
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
77
92,8
70,0
65,02
Moderado
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
76
82,9
76,0
63,04
Moderado
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
68
84,6
61,8
52,34
Moderado
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
68
79,4
75,5
60,02
Moderado
T9:Testigo consorcio bacteriano
80
92,3
88,8
82,00
Bajo
T10:testigo abiótico
69
68,0
76,6
52,10
Moderado
100
Anexo 16. Índice de germinación de semillas de Raphanus sativus L. a los 90 días del proceso de la biorremediación de suelo
contaminado con diésel
Tratamientos Promedio elongación radicular
(mm)
Porcentaje relativo de
germinación (PGR)
Crecimiento relativo de
radícula (CRR)
Índice de germinación
(%IG)
Nivel de fitotoxicidad
T1: Estiércol de cuy
84
92,0
93,3
85,83
Bajo
T2: Estiércol de porcino
80
96,0
88,8
85,24
Bajo
T3: Estiércol de vacuno
80
92,4
88,8
82,08
Bajo
T4: Estiércol de cuy + nutrientes
87
92,0
96,6
88,87
Bajo
T5: Estiércol de porcino +nutrientes
80
94,6
88,8
84,02
Bajo
T6: Estiércol de vacuno + nutrientes
84
86,8
93,3
81,03
Bajo
T7:Testigo sin estiércol, sin nutrientes
63
84,0
70,0
58,80
Moderado
T8:Testigo sin estiércol, con nutrientes
65
88,0
72,2
63,53
Moderado
T9:Testigo consorcio bacteriano
81
96,0
90,0
93,75
Bajo
T10:testigo abiótico
71
71,3
78,8
56,19
Moderado