Universidad Puacuteblica de Navarra Nafarroako Unibertsitate Publikoa

ESCUELA TECNICA SUPERIOR NEKAZARITZAKO INGENIARIEN

DE INGENIEROS AGRONOMOS GOI MAILAKO ESKOLA TEKNIKOA

Efecto del tiempo de conservacioacuten y de la

temperatura en los paraacutemetros oxidativos de

carne de potro

presentado por

MARIA BENAVENT SANELEUTERIO

aurkeztua

MAacuteSTER EN TECNOLOGIacuteA Y CALIDAD DE LAS

INDURSTRIAS AGROALIMENTARIAS

TEKNOLOGIA ETA KALITATEA NEKAZARITZAKO ELIKAGAIEN

INDUSTRIETAN MASTERRA

Junio 2016

AGRADECIMIENTOS

Me gustariacutea agradecer al proyecto del INIA ldquoEstudio de la maduracioacuten y de la vida uacutetil del color

de la carne de potro Percepcioacuten y calidad comercial de la carne de potro mediante la valoracioacuten

del producto con consumidoresrdquo (RTA2012-00090-C03-01) del Centro Tecnoloacutegico de la Carne

por el que ha surgido este proyecto

Al Ministerio de Educacioacuten Cultura y Deporte por la beca de Colaboracioacuten en el departamento

de Produccioacuten Agraria que me han concedido

Agradecer a mis tutoras Vicky Sarrieacutes e Iosune Cantalejo por su dedicacioacuten y ayuda ofrecida A

Maria Joseacute Beriain por sus consejos

Al departamento de Produccioacuten Agraria y Tecnologiacutea de Alimentos por permitirme el uso de sus

instalaciones

Agradecer tambieacuten a Susana Garciacutea por ensentildearme las teacutecnicas empleadas y por su ayuda

Un agradecimiento especial a mi familia mis padres y a mi hermano y a Juanjo por apoyarme

durante este tiempo

Por uacuteltimo agradecer la ayuda y el apoyo de Olaia Urrutia Lara Martiacutenez Marta Ruiz y Amaia

Fernaacutendez

Muchas gracias a todosas

ABSTRACT

The aim of the present study was to optimize the meat oxidation techniques and to investigate

the effects of temperature and storage time on protein and lipid oxidation in foal steaks packed

under vacuum The meat was stored at 2 degC and 8 degC respectively during 0 4 8 and 12 days

Protein oxidation was measured by an estimation of carbonyl groups formed using the method

of Oliver et al (1987) Likewise lipid oxidation expressed as malonaldehyde content was

evaluated using the method proposed by Vyncke (1975) The results showed that the carbonyl

content significantly changed during the time of storage (P lt 005) with values of 245 nmol

carbonylsmg protein on day 12 This fact may suggest some degree of meat oxidation However

there were not differences in samples stored at two refrigeration temperatures (P gt 005)

Regarding lipid oxidation the results were not conclusive and further work is needed

Keywords

Foal meat protein oxidation lipid oxidation storage time refrigeration temperature

Resumen

El objetivo de este estudio fue la puesta a punto de las teacutecnicas de anaacutelisis de oxidacioacuten e

investigar el efecto de la temperatura y del tiempo de conservacioacuten sobre la oxidacioacuten proteica

y lipiacutedica en filetes de carne de potro envasados al vaciacuteo La carne se conservoacute a diferentes

tiempos (0 4 8 y 12 diacuteas) y a dos temperaturas de refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) La oxidacioacuten

proteica se midioacute empleando el meacutetodo de Oliver et al (1987) por el cual se cuantificoacute el

contenido de carbonilos proteicos La oxidacioacuten lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por

Vyncke (1975) cuantificando el contenido de malonaldehido formado Los resultados del

presente estudio mostraron que la cantidad de carbonilos varioacute significativamente a lo largo del

tiempo de conservacioacuten (P lt 005) con valores de 245 nmol carbonilosmg proteiacutena a diacutea 12 lo

que implicariacutea cierto grado de oxidacioacuten de la carne Sin embargo no se encontraron diferencias

entre las muestras conservadas a dos temperaturas de refrigeracioacuten (P gt 005) La evolucioacuten de

los carbonilos a lo largo del tiempo estudiado no sigue un patroacuten claro Finalmente los

resultados de la oxidacioacuten lipiacutedica no fueron concluyentes y seriacutea necesario profundizar en su

estudio

Palabras clave

Carne de potro oxidacioacuten proteica oxidacioacuten lipiacutedica tiempo de conservacioacuten temperatura de

refrigeracioacuten

IacuteNDICE

1 Introduccioacuten 1

2 Revisioacuten bibliograacutefica 2

21 Sector equino 2

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro 3

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro 4

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro 7

25 Oxidacioacuten de la carne 8

251 Oxidacioacuten proteica 8

Mecanismos 8

Reactividad de los carbonilos proteicos 11

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica 12

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos 12

Consecuencias 13

252 Oxidacioacuten lipiacutedica 14

Mecanismos 14

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos 15

Consecuencias 16

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten 16

3 Objetivos y planteamiento experimental 18

4 Material y meacutetodos 19

41 Disentildeo experimental 19

42 Sacrificio de los animales 20

43 Condiciones de almacenamiento 21

44 Meacutetodo analiacutetico 22

Oxidacioacuten proteica 22

Oxidacioacuten lipiacutedica 22

45 Anaacutelisis estadiacutestico 23

5 Resultados y Discusioacuten 24

51 Puesta a punto de las teacutecnicas 24

511 Oxidacioacuten proteica 24

512 Oxidacioacuten lipiacutedica 24

52 Oxidacioacuten proteica 24

53 Oxidacioacuten lipiacutedica 26

6 Conclusiones 29

7 Referencias 30

IacuteNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo 5

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros 6

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica 15

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso 19

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 25

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 26

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

AGRADECIMIENTOS

Me gustariacutea agradecer al proyecto del INIA ldquoEstudio de la maduracioacuten y de la vida uacutetil del color

de la carne de potro Percepcioacuten y calidad comercial de la carne de potro mediante la valoracioacuten

del producto con consumidoresrdquo (RTA2012-00090-C03-01) del Centro Tecnoloacutegico de la Carne

por el que ha surgido este proyecto

Al Ministerio de Educacioacuten Cultura y Deporte por la beca de Colaboracioacuten en el departamento

de Produccioacuten Agraria que me han concedido

Agradecer a mis tutoras Vicky Sarrieacutes e Iosune Cantalejo por su dedicacioacuten y ayuda ofrecida A

Maria Joseacute Beriain por sus consejos

Al departamento de Produccioacuten Agraria y Tecnologiacutea de Alimentos por permitirme el uso de sus

instalaciones

Agradecer tambieacuten a Susana Garciacutea por ensentildearme las teacutecnicas empleadas y por su ayuda

Un agradecimiento especial a mi familia mis padres y a mi hermano y a Juanjo por apoyarme

durante este tiempo

Por uacuteltimo agradecer la ayuda y el apoyo de Olaia Urrutia Lara Martiacutenez Marta Ruiz y Amaia

Fernaacutendez

Muchas gracias a todosas

ABSTRACT

The aim of the present study was to optimize the meat oxidation techniques and to investigate

the effects of temperature and storage time on protein and lipid oxidation in foal steaks packed

under vacuum The meat was stored at 2 degC and 8 degC respectively during 0 4 8 and 12 days

Protein oxidation was measured by an estimation of carbonyl groups formed using the method

of Oliver et al (1987) Likewise lipid oxidation expressed as malonaldehyde content was

evaluated using the method proposed by Vyncke (1975) The results showed that the carbonyl

content significantly changed during the time of storage (P lt 005) with values of 245 nmol

carbonylsmg protein on day 12 This fact may suggest some degree of meat oxidation However

there were not differences in samples stored at two refrigeration temperatures (P gt 005)

Regarding lipid oxidation the results were not conclusive and further work is needed

Keywords

Foal meat protein oxidation lipid oxidation storage time refrigeration temperature

Resumen

El objetivo de este estudio fue la puesta a punto de las teacutecnicas de anaacutelisis de oxidacioacuten e

investigar el efecto de la temperatura y del tiempo de conservacioacuten sobre la oxidacioacuten proteica

y lipiacutedica en filetes de carne de potro envasados al vaciacuteo La carne se conservoacute a diferentes

tiempos (0 4 8 y 12 diacuteas) y a dos temperaturas de refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) La oxidacioacuten

proteica se midioacute empleando el meacutetodo de Oliver et al (1987) por el cual se cuantificoacute el

contenido de carbonilos proteicos La oxidacioacuten lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por

Vyncke (1975) cuantificando el contenido de malonaldehido formado Los resultados del

presente estudio mostraron que la cantidad de carbonilos varioacute significativamente a lo largo del

tiempo de conservacioacuten (P lt 005) con valores de 245 nmol carbonilosmg proteiacutena a diacutea 12 lo

que implicariacutea cierto grado de oxidacioacuten de la carne Sin embargo no se encontraron diferencias

entre las muestras conservadas a dos temperaturas de refrigeracioacuten (P gt 005) La evolucioacuten de

los carbonilos a lo largo del tiempo estudiado no sigue un patroacuten claro Finalmente los

resultados de la oxidacioacuten lipiacutedica no fueron concluyentes y seriacutea necesario profundizar en su

estudio

Palabras clave

Carne de potro oxidacioacuten proteica oxidacioacuten lipiacutedica tiempo de conservacioacuten temperatura de

refrigeracioacuten

IacuteNDICE

1 Introduccioacuten 1

2 Revisioacuten bibliograacutefica 2

21 Sector equino 2

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro 3

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro 4

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro 7

25 Oxidacioacuten de la carne 8

251 Oxidacioacuten proteica 8

Mecanismos 8

Reactividad de los carbonilos proteicos 11

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica 12

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos 12

Consecuencias 13

252 Oxidacioacuten lipiacutedica 14

Mecanismos 14

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos 15

Consecuencias 16

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten 16

3 Objetivos y planteamiento experimental 18

4 Material y meacutetodos 19

41 Disentildeo experimental 19

42 Sacrificio de los animales 20

43 Condiciones de almacenamiento 21

44 Meacutetodo analiacutetico 22

Oxidacioacuten proteica 22

Oxidacioacuten lipiacutedica 22

45 Anaacutelisis estadiacutestico 23

5 Resultados y Discusioacuten 24

51 Puesta a punto de las teacutecnicas 24

511 Oxidacioacuten proteica 24

512 Oxidacioacuten lipiacutedica 24

52 Oxidacioacuten proteica 24

53 Oxidacioacuten lipiacutedica 26

6 Conclusiones 29

7 Referencias 30

IacuteNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo 5

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros 6

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica 15

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso 19

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 25

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 26

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

ABSTRACT

The aim of the present study was to optimize the meat oxidation techniques and to investigate

the effects of temperature and storage time on protein and lipid oxidation in foal steaks packed

under vacuum The meat was stored at 2 degC and 8 degC respectively during 0 4 8 and 12 days

Protein oxidation was measured by an estimation of carbonyl groups formed using the method

of Oliver et al (1987) Likewise lipid oxidation expressed as malonaldehyde content was

evaluated using the method proposed by Vyncke (1975) The results showed that the carbonyl

content significantly changed during the time of storage (P lt 005) with values of 245 nmol

carbonylsmg protein on day 12 This fact may suggest some degree of meat oxidation However

there were not differences in samples stored at two refrigeration temperatures (P gt 005)

Regarding lipid oxidation the results were not conclusive and further work is needed

Keywords

Foal meat protein oxidation lipid oxidation storage time refrigeration temperature

Resumen

El objetivo de este estudio fue la puesta a punto de las teacutecnicas de anaacutelisis de oxidacioacuten e

investigar el efecto de la temperatura y del tiempo de conservacioacuten sobre la oxidacioacuten proteica

y lipiacutedica en filetes de carne de potro envasados al vaciacuteo La carne se conservoacute a diferentes

tiempos (0 4 8 y 12 diacuteas) y a dos temperaturas de refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) La oxidacioacuten

proteica se midioacute empleando el meacutetodo de Oliver et al (1987) por el cual se cuantificoacute el

contenido de carbonilos proteicos La oxidacioacuten lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por

Vyncke (1975) cuantificando el contenido de malonaldehido formado Los resultados del

presente estudio mostraron que la cantidad de carbonilos varioacute significativamente a lo largo del

tiempo de conservacioacuten (P lt 005) con valores de 245 nmol carbonilosmg proteiacutena a diacutea 12 lo

que implicariacutea cierto grado de oxidacioacuten de la carne Sin embargo no se encontraron diferencias

entre las muestras conservadas a dos temperaturas de refrigeracioacuten (P gt 005) La evolucioacuten de

los carbonilos a lo largo del tiempo estudiado no sigue un patroacuten claro Finalmente los

resultados de la oxidacioacuten lipiacutedica no fueron concluyentes y seriacutea necesario profundizar en su

estudio

Palabras clave

Carne de potro oxidacioacuten proteica oxidacioacuten lipiacutedica tiempo de conservacioacuten temperatura de

refrigeracioacuten

IacuteNDICE

1 Introduccioacuten 1

2 Revisioacuten bibliograacutefica 2

21 Sector equino 2

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro 3

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro 4

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro 7

25 Oxidacioacuten de la carne 8

251 Oxidacioacuten proteica 8

Mecanismos 8

Reactividad de los carbonilos proteicos 11

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica 12

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos 12

Consecuencias 13

252 Oxidacioacuten lipiacutedica 14

Mecanismos 14

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos 15

Consecuencias 16

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten 16

3 Objetivos y planteamiento experimental 18

4 Material y meacutetodos 19

41 Disentildeo experimental 19

42 Sacrificio de los animales 20

43 Condiciones de almacenamiento 21

44 Meacutetodo analiacutetico 22

Oxidacioacuten proteica 22

Oxidacioacuten lipiacutedica 22

45 Anaacutelisis estadiacutestico 23

5 Resultados y Discusioacuten 24

51 Puesta a punto de las teacutecnicas 24

511 Oxidacioacuten proteica 24

512 Oxidacioacuten lipiacutedica 24

52 Oxidacioacuten proteica 24

53 Oxidacioacuten lipiacutedica 26

6 Conclusiones 29

7 Referencias 30

IacuteNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo 5

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros 6

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica 15

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso 19

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 25

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 26

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

IacuteNDICE

1 Introduccioacuten 1

2 Revisioacuten bibliograacutefica 2

21 Sector equino 2

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro 3

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro 4

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro 7

25 Oxidacioacuten de la carne 8

251 Oxidacioacuten proteica 8

Mecanismos 8

Reactividad de los carbonilos proteicos 11

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica 12

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos 12

Consecuencias 13

252 Oxidacioacuten lipiacutedica 14

Mecanismos 14

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos 15

Consecuencias 16

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten 16

3 Objetivos y planteamiento experimental 18

4 Material y meacutetodos 19

41 Disentildeo experimental 19

42 Sacrificio de los animales 20

43 Condiciones de almacenamiento 21

44 Meacutetodo analiacutetico 22

Oxidacioacuten proteica 22

Oxidacioacuten lipiacutedica 22

45 Anaacutelisis estadiacutestico 23

5 Resultados y Discusioacuten 24

51 Puesta a punto de las teacutecnicas 24

511 Oxidacioacuten proteica 24

512 Oxidacioacuten lipiacutedica 24

52 Oxidacioacuten proteica 24

53 Oxidacioacuten lipiacutedica 26

6 Conclusiones 29

7 Referencias 30

IacuteNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo 5

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros 6

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica 15

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso 19

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 25

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 26

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

45 Anaacutelisis estadiacutestico 23

5 Resultados y Discusioacuten 24

51 Puesta a punto de las teacutecnicas 24

511 Oxidacioacuten proteica 24

512 Oxidacioacuten lipiacutedica 24

52 Oxidacioacuten proteica 24

53 Oxidacioacuten lipiacutedica 26

6 Conclusiones 29

7 Referencias 30

IacuteNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo 5

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros 6

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica 15

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso 19

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 25

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 26

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

IacuteNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo 5

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros 6

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica 15

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso 19

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 25

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las dos temperaturas a lo largo del tiempo 26

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

IacuteNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 2

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 3

Figura 3 Perfil AG potros 7

Figura 4 Perfil AG vacuno 7

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys 9

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten 10

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) 11

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona 13

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA 16

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h 20

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece 21

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece 21

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi 21

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC 27

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC 27

ABREVIATURAS

AAA aacutecido α-aminoadiacutepico

AAS semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico

Cu cobre

DHA Aacutecido docosahexaenoico

DNPH dinitrofenilhidrazina

EEM error estaacutendar de la media

EPA Aacutecido eicosapentaenoico

Fe hierro

GC-MS cromatografiacutea de gases con espectrometriacutea de masas

GGS semialdehiacutedo γ-glutaacutemico

HPLC cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten

HPLC-DAD cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos

HPLC-FLD cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten detector de fluorescencia

HPLC-MS cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten acoplada a un espectroacutemetro de masas

HR humedad relativa

IR las ingestas recomendadas

LD Longissimus dorsi

Lys lisina

MAP envasado en atmosfera modificada

MDA malonaldehiacutedo

MUFA aacutecidos grasos monoinsaturados

OX-P oxidacioacuten proteica

PUFA aacutecidos grasos polinsaturados

ROS especies reactivas de oxiacutegeno

Tordf temperatura

TBA aacutecido tiobarbituacuterico

TBARS sustancias reactivas al aacutecido tiobarbituacuterico

TC tiempo de conservacioacuten

TCA aacutecido tricloroaceacutetico

P aacute g i n a 1 | 34

1 INTRODUCCIOacuteN

Un consumo regular de carne de caballo puede contribuir a la reduccioacuten el colesterol total y a la

ingesta de las lipoproteiacutenas de baja densidad (colesterol LDL) y a mejorar el iacutendice n-3n-6 y

aumenta el iacutendice n-3 (EPA + DHA) el aacutecido docosahexaenoico y el estado del hierro (Bo et al

2013)

Los consumidores demandamos productos bajos en grasa y en colesterol pensando en nuestra

salud cardiovascular Una buena opcioacuten es la carne de caballo que se caracteriza por tener una

baja cantidad de grasa bajo contenido de colesterol y altos niveles de hierro hemo que es el

que presenta una mayor absorcioacuten Las caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro revelan

que este tipo de carne puede ser considerada como una nueva alternativa en el consumo de

carne siendo considerada como una carne ldquodieteacuteticardquo (Badiani et al 1997) Por su contenido

en aacutecidos grasos poliinsaturados contenido de hierro y de glucoacutegeno la carne de caballo

presenta una mayor oxidacioacuten lo que supone una disminucioacuten de su vida uacutetil Seguacuten Sarrieacutes et

al (2014) en un estudio llevado a cabo con carne de potro vieron que el tiempo de conservacioacuten

de esta carne madurada era de 3 diacuteas a refrigeracioacuten en bandejas de polietileno y cubiertas con

film Por esto es necesario estudiar el comportamiento oxidativo de la carne que permitan

estudiar estrategias para aumentar su vida uacutetil

La oxidacioacuten lipiacutedica y proteica en la carne y derivados es una de las causas principales del

deterioro de la carne La oxidacioacuten lipiacutedica ha sido tradicionalmente maacutes estudiada que la

oxidacioacuten proteica en alimentos esta uacuteltima es uno de los temas maacutes innovadores de estudio

dentro del campo de quiacutemica de los alimentos El hecho que las proteiacutenas son objetivos de las

especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) se ignoroacute durante varias deacutecadas (Lund et al 2011)

En los lineales frigoriacuteficos de comercializacioacuten la carne se mantiene a una temperatura de 2 degC

en este estudio se emplearon dos temperaturas de refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para conocer su

efecto sobre la calidad de la carne y asiacute estudiar la posibilidad de mantenerla en rangos de

temperatura comprendidos entre 2 y 8 degC

El presente Trabajo Final de Maacutester forma parte de un Proyecto de investigacioacuten titulado

ldquoEstudio de la maduracioacuten y de la vida uacutetil del color de la carne de potro Percepcioacuten y calidad

comercial de la carne de potro mediante la valoracioacuten del producto con consumidoresrdquo Dicho

proyecto ha sido financiado por el Instituto Nacional de Investigacioacuten y Tecnologiacutea Agraria y

Alimentaria (INIA) cuya referencia es RTA2012-00090-C03-02 correspondiente a la

Convocatoria 2012 dentro del Subprograma de Proyectos de Investigacioacuten Fundamental

orientada a los recursos y tecnologiacuteas Agrarias en coordinacioacuten con las Comunidades

Autoacutenomas

P aacute g i n a 2 | 34

2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA

21 Sector equino

Los eacutequidos desde la antiguumledad se han considerado como productores de carne para la

alimentacioacuten humana No obstante en Espantildea histoacutericamente no se han contemplado los

caballos como animales destinados a la produccioacuten de carne Aunque tradicionalmente para la

produccioacuten de carne se ha usado todo tipo de ganado equino (caballar mular y asnal) hoy en

diacutea este subsector se sustenta baacutesicamente de la produccioacuten de caballos de aptitud caacuternica

(Magrama 2003)

La carne de caballo se produce en diferentes paiacuteses pero el nivel de produccioacuten es menor en

comparacioacuten con otros tipos de carnes En la Figura 1 se representa la produccioacuten de carne por

especies a nivel mundial el sector equino representa el 025 del total Seguacuten Faostat desde el

antildeo 1993 al 2013 los productores principales a nivel mundial son China Meacutejico Kazajistaacuten y

Rusia Respecto a la produccioacuten de carne equina en Navarra en el antildeo 2014 esta fue de 257412

Tm (canal) mientras que en el 2015 fue de 328914 Tm (canal) (Gobierno-Navarra 2016) Se

observa que hubo un incremento el uacuteltimo antildeo

El caballo de Burguete es un cruce de yeguas tipo Jaca con caballos franceses pesados como el

Bretoacuten Ardeneacutes y Comtois Esta raza se extiende fundamentalmente por la zona noreste de

Navarra Estaacute considerada por la FAO el MAGRAMA y por la Comunidad Foral de Navarra como

razas autoacutectonas en peligro de extincioacuten (BON)

El caballo Gallego de Monte es una denominacioacuten de la poblacioacuten equina explotada en reacutegimen

de libertad en los montes de Galicia y estaacute relacionada directamente con el caballo de Pura Raza

Gallega con el tronco Celta en comuacuten (Franco et al 2011)

En la Figura 2 se muestra la produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea durante los uacuteltimos 20

antildeos En Espantildea hay cada vez maacutes aceptacioacuten de la carne de equino entre los consumidores De

hecho su produccioacuten se disparoacute en los antildeos de la crisis econoacutemica aunque en 2013 la oferta se

redujo sensiblemente y lo mismo sucedioacute en 2014 Con respecto a la Produccioacuten Final Agraria

el sector aportoacute en 2014 el 01 y con respecto a la Produccioacuten Animal el 03 (en ambos casos

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 (Belaunzaran et al 2015)

P aacute g i n a 3 | 34

muy por encima de las cifras del antildeo 2013) En el antildeo 2014 se sacrificaron aproximadamente

46400 animales (un 9 menos que en 2013) y la produccioacuten de carne se situoacute en unas 11100

toneladas 600 tm menos que el antildeo anterior La regioacuten con mayor produccioacuten de carne de

equino en 2014 fue de nuevo Navarra con el 22 del total y tambieacuten mostroacute el mayor censo con

el 18 del total (Sainz et al 2016)

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro

Seguacuten el Coacutedigo Alimentario Espantildeol la denominacioacuten geneacuterica de carne incluye la parte

comestible de los muacutesculos de los boacutevidos oacutevidos suidos caacutepridos eacutequidos y cameacutelidos sanos

sacrificados en condiciones higieacutenicas Presentaraacute un olor caracteriacutestico y su color debe oscilar

del blanco rosaacuteceo al rojo oscuro dependiendo de la especie animal raza edad alimentacioacuten

forma de sacrificio y periodo de tiempo transcurrido desde que aqueacutel fue realizado En la calidad

de la carne influyen diferentes paraacutemetros y atributos como el pH el color la flora bacteriana

la capacidad de retencioacuten de agua la composicioacuten quiacutemica el nivel de oxidacioacuten lipiacutedica

propiedades de la textura atributos sensoriales etc Estos atributos no pueden considerarse

independientes ya que estaacuten muy relacionados entre siacute y su interaccioacuten proporciona las

caracteriacutesticas globales de la calidad de la carne (Sierra 2010)

En Espantildea hay dos sistemas de ganado para producir la carne de potro que difieren

principalmente en la edad del sacrificio uno es a los 16 meses y el otro a los 24 meses Seguacuten el

ldquoCatalogue de Classement des Eacutequideacutesrdquo del Office National Interprofessionnel du Beacutetail et des

Viandes se considera animal joven o potro a los animales menores de 1 antildeo y entre los 15-24

meses de edad pueden llegar ocasionalmente hasta los 30 meses Los animales adultos o

caballos se consideran a partir de 30 meses (ONIBEV 1979) Seguacuten Fagravebregas (2002) la carne de

potro incluye las canales de lechales y potros animales joacutevenes cuya carne es rosada con grasa

de color crema La carne de caballo incluye principalmente a canales de caballos y tambieacuten

adultos de asnos y mulas carne roja con grasa de color amarillo El color de la carne de caballo

depende de la edad asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo adulto tiene un tono

maacutes intenso

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 (FAO 2016)

P aacute g i n a 4 | 34

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro

La carne de caballo contiene entre 05 y 3 veces maacutes cantidad de glucoacutegeno que la carne de

ternera esto le proporciona un flavor maacutes dulce Por la cantidad de glucoacutegeno y de ATP la carne

de caballo conserva el grado de plasticidad y la elasticidad durante maacutes tiempo (Rossier 1993)

La maduracioacuten de esta carne alcanza un punto de maduracioacuten suficiente a los 4 - 5 diacuteas post-

mortem y por tanto el pH baja raacutepidamente Desde una perspectiva higieacutenico-sanitaria y por su

elevado contenido en glucoacutegeno aacutecido laacutectico y nitroacutegeno no proteico su periacuteodo de vida uacutetil

comercial es inferior al de la carne de vacuno (Fagravebregas 2002)

En la Tabla 1 se muestra la composicioacuten nutricional de la carne de caballo por 100 g y por racioacuten

(150 g) tambieacuten aparecen las ingestas recomendadas (IR) por diacutea para hombres y mujeres de

20 a 39 antildeos con una actividad fiacutesica moderada y el porcentaje que representa cada nutriente

por la toma de una racioacuten de carne seguacuten las recomendaciones diarias para un hombre Las

caloriacuteas aportadas por 100 g de carne de caballo no llegan a las 100 Cal en cambio la carne de

vacuno aporta sobre 120-200 Cal por 100 g Por tanto se puede decir que la carne de caballo

aporta menos caloriacuteas

En cuanto a las proteiacutenas la carne de potro se caracteriza por tener una mayor proporcioacuten de

proteiacutena que en ternera esta uacuteltima tiene 185 de proteiacutenas y la carne de caballo 21 Siendo

esta de un elevado valor bioloacutegico (40 de aminoaacutecidos esenciales) Su contenido se ve afectado

por el sexo el tipo de muacutesculo y por el sistema de produccioacuten La carne de potro es una fuente

de aminoaacutecidos esenciales El aminoaacutecido maacutes abundante es la lisina seguido de la leucina y la

arginina De los aminoaacutecidos no esenciales maacutes abundantes estaacuten el aacutecido glutaacutemico aacutecido

aspaacutertico y la alanina (Lorenzo and Pateiro 2013) En la Tabla 2 se observa la composicioacuten de los

aminoaacutecidos esenciales y no esenciales por g100 g de proteiacutena para potros en el muacutesculo

Longissimus dorsi

Los liacutepidos se encuentran en baja cantidad y representan aproximadamente el 2 de la

composicioacuten total de la carne Respecto a la composicioacuten de los aacutecidos grasos la carne de caballo

se caracteriza por tener un nivel alto de aacutecidos grasos insaturados de manera que los aacutecidos

grasos poliinsaturados (PUFA) predominantes son linoleico (n-6) que representa un 43 del

total de los PUFA y linoleacutenico (n-3) El oleico es el aacutecido graso monoinsaturado (MUFA) maacutes

predomiacutenate La carne de caballo tiene un bajo contenido de colesterol sobre un 20 menos si

se compara con otras carnes (Bo et al 2013) Sarrieacutes Murray Troy y Beriain (2006) encontraron

contenidos mayores de PUFA en potros joacutevenes en comparacioacuten con potros mayores

El nivel de grasa aumenta con la edad el peso y el sexo Los potros hembras tienen mayor

proporcioacuten de grasa en la canal Seguacuten Lorenzo y Sarrieacutes (2014) las hembras tienen 123 de

grasa y los machos 94 Respecto a la grasa de la canal en hembras encontraron 149 y en

los potros machos 158 La mayor diferencia entre machos y hembras es que el grado de grasa

es mayor en la canal de las hembras (Lorenzo et al 2014b)

P aacute g i n a 5 | 34

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo

100 g Racioacuten

(150 g)

IR

hombres

IR

mujeres Racioacuten

Energiacutea (kcal) 93 140 3000 2300 46

Proteiacutenas (g) 21 315 54 41 58

Liacutepidos totales (g) 22 33 100-117 77-89 33

AG saturados (g) 090 135 23-27 18-20 5

AG poliinsaturados (g) 065 0975 17 13 573

n-6 043 065 10 8 65

n-3 021 0315 33-66 26-51 955

AG monoinsaturados (g) 061 091 67 51 136

Colesterol (mg1000cal) 50-61 75-915 lt300 lt230 1335

Potasio (mg) 332 498 3500 3500 1422

Fosforo (mg) 200 300 700 700 4285

Sodio (mg) 44 66 lt2000 lt2000 33

Magnesio (mg) 23 345 350 330 10

Zinc (mg) 6 9 15 15 60

Hierro (mg) 4 6 10 18 60

Calcio (mg) 377 665 1000 1000 056

Selenio (microg) 3 45 70 55 643

Equivalentes de niacina (mg) 82 123 20 15 615

Riboflavina (mg) 01 015 18 14 83

Tiramina (mg) 007 011 12 09 917

Vitamina B12 (microg) 208 312 2 2 156

Fuente Badiani et al (1997) Bo et al (2013) Magrama (2016)

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

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42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 1 | 34

1 INTRODUCCIOacuteN

Un consumo regular de carne de caballo puede contribuir a la reduccioacuten el colesterol total y a la

ingesta de las lipoproteiacutenas de baja densidad (colesterol LDL) y a mejorar el iacutendice n-3n-6 y

aumenta el iacutendice n-3 (EPA + DHA) el aacutecido docosahexaenoico y el estado del hierro (Bo et al

2013)

Los consumidores demandamos productos bajos en grasa y en colesterol pensando en nuestra

salud cardiovascular Una buena opcioacuten es la carne de caballo que se caracteriza por tener una

baja cantidad de grasa bajo contenido de colesterol y altos niveles de hierro hemo que es el

que presenta una mayor absorcioacuten Las caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro revelan

que este tipo de carne puede ser considerada como una nueva alternativa en el consumo de

carne siendo considerada como una carne ldquodieteacuteticardquo (Badiani et al 1997) Por su contenido

en aacutecidos grasos poliinsaturados contenido de hierro y de glucoacutegeno la carne de caballo

presenta una mayor oxidacioacuten lo que supone una disminucioacuten de su vida uacutetil Seguacuten Sarrieacutes et

al (2014) en un estudio llevado a cabo con carne de potro vieron que el tiempo de conservacioacuten

de esta carne madurada era de 3 diacuteas a refrigeracioacuten en bandejas de polietileno y cubiertas con

film Por esto es necesario estudiar el comportamiento oxidativo de la carne que permitan

estudiar estrategias para aumentar su vida uacutetil

La oxidacioacuten lipiacutedica y proteica en la carne y derivados es una de las causas principales del

deterioro de la carne La oxidacioacuten lipiacutedica ha sido tradicionalmente maacutes estudiada que la

oxidacioacuten proteica en alimentos esta uacuteltima es uno de los temas maacutes innovadores de estudio

dentro del campo de quiacutemica de los alimentos El hecho que las proteiacutenas son objetivos de las

especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) se ignoroacute durante varias deacutecadas (Lund et al 2011)

En los lineales frigoriacuteficos de comercializacioacuten la carne se mantiene a una temperatura de 2 degC

en este estudio se emplearon dos temperaturas de refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para conocer su

efecto sobre la calidad de la carne y asiacute estudiar la posibilidad de mantenerla en rangos de

temperatura comprendidos entre 2 y 8 degC

El presente Trabajo Final de Maacutester forma parte de un Proyecto de investigacioacuten titulado

ldquoEstudio de la maduracioacuten y de la vida uacutetil del color de la carne de potro Percepcioacuten y calidad

comercial de la carne de potro mediante la valoracioacuten del producto con consumidoresrdquo Dicho

proyecto ha sido financiado por el Instituto Nacional de Investigacioacuten y Tecnologiacutea Agraria y

Alimentaria (INIA) cuya referencia es RTA2012-00090-C03-02 correspondiente a la

Convocatoria 2012 dentro del Subprograma de Proyectos de Investigacioacuten Fundamental

orientada a los recursos y tecnologiacuteas Agrarias en coordinacioacuten con las Comunidades

Autoacutenomas

P aacute g i n a 2 | 34

2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA

21 Sector equino

Los eacutequidos desde la antiguumledad se han considerado como productores de carne para la

alimentacioacuten humana No obstante en Espantildea histoacutericamente no se han contemplado los

caballos como animales destinados a la produccioacuten de carne Aunque tradicionalmente para la

produccioacuten de carne se ha usado todo tipo de ganado equino (caballar mular y asnal) hoy en

diacutea este subsector se sustenta baacutesicamente de la produccioacuten de caballos de aptitud caacuternica

(Magrama 2003)

La carne de caballo se produce en diferentes paiacuteses pero el nivel de produccioacuten es menor en

comparacioacuten con otros tipos de carnes En la Figura 1 se representa la produccioacuten de carne por

especies a nivel mundial el sector equino representa el 025 del total Seguacuten Faostat desde el

antildeo 1993 al 2013 los productores principales a nivel mundial son China Meacutejico Kazajistaacuten y

Rusia Respecto a la produccioacuten de carne equina en Navarra en el antildeo 2014 esta fue de 257412

Tm (canal) mientras que en el 2015 fue de 328914 Tm (canal) (Gobierno-Navarra 2016) Se

observa que hubo un incremento el uacuteltimo antildeo

El caballo de Burguete es un cruce de yeguas tipo Jaca con caballos franceses pesados como el

Bretoacuten Ardeneacutes y Comtois Esta raza se extiende fundamentalmente por la zona noreste de

Navarra Estaacute considerada por la FAO el MAGRAMA y por la Comunidad Foral de Navarra como

razas autoacutectonas en peligro de extincioacuten (BON)

El caballo Gallego de Monte es una denominacioacuten de la poblacioacuten equina explotada en reacutegimen

de libertad en los montes de Galicia y estaacute relacionada directamente con el caballo de Pura Raza

Gallega con el tronco Celta en comuacuten (Franco et al 2011)

En la Figura 2 se muestra la produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea durante los uacuteltimos 20

antildeos En Espantildea hay cada vez maacutes aceptacioacuten de la carne de equino entre los consumidores De

hecho su produccioacuten se disparoacute en los antildeos de la crisis econoacutemica aunque en 2013 la oferta se

redujo sensiblemente y lo mismo sucedioacute en 2014 Con respecto a la Produccioacuten Final Agraria

el sector aportoacute en 2014 el 01 y con respecto a la Produccioacuten Animal el 03 (en ambos casos

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 (Belaunzaran et al 2015)

P aacute g i n a 3 | 34

muy por encima de las cifras del antildeo 2013) En el antildeo 2014 se sacrificaron aproximadamente

46400 animales (un 9 menos que en 2013) y la produccioacuten de carne se situoacute en unas 11100

toneladas 600 tm menos que el antildeo anterior La regioacuten con mayor produccioacuten de carne de

equino en 2014 fue de nuevo Navarra con el 22 del total y tambieacuten mostroacute el mayor censo con

el 18 del total (Sainz et al 2016)

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro

Seguacuten el Coacutedigo Alimentario Espantildeol la denominacioacuten geneacuterica de carne incluye la parte

comestible de los muacutesculos de los boacutevidos oacutevidos suidos caacutepridos eacutequidos y cameacutelidos sanos

sacrificados en condiciones higieacutenicas Presentaraacute un olor caracteriacutestico y su color debe oscilar

del blanco rosaacuteceo al rojo oscuro dependiendo de la especie animal raza edad alimentacioacuten

forma de sacrificio y periodo de tiempo transcurrido desde que aqueacutel fue realizado En la calidad

de la carne influyen diferentes paraacutemetros y atributos como el pH el color la flora bacteriana

la capacidad de retencioacuten de agua la composicioacuten quiacutemica el nivel de oxidacioacuten lipiacutedica

propiedades de la textura atributos sensoriales etc Estos atributos no pueden considerarse

independientes ya que estaacuten muy relacionados entre siacute y su interaccioacuten proporciona las

caracteriacutesticas globales de la calidad de la carne (Sierra 2010)

En Espantildea hay dos sistemas de ganado para producir la carne de potro que difieren

principalmente en la edad del sacrificio uno es a los 16 meses y el otro a los 24 meses Seguacuten el

ldquoCatalogue de Classement des Eacutequideacutesrdquo del Office National Interprofessionnel du Beacutetail et des

Viandes se considera animal joven o potro a los animales menores de 1 antildeo y entre los 15-24

meses de edad pueden llegar ocasionalmente hasta los 30 meses Los animales adultos o

caballos se consideran a partir de 30 meses (ONIBEV 1979) Seguacuten Fagravebregas (2002) la carne de

potro incluye las canales de lechales y potros animales joacutevenes cuya carne es rosada con grasa

de color crema La carne de caballo incluye principalmente a canales de caballos y tambieacuten

adultos de asnos y mulas carne roja con grasa de color amarillo El color de la carne de caballo

depende de la edad asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo adulto tiene un tono

maacutes intenso

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 (FAO 2016)

P aacute g i n a 4 | 34

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro

La carne de caballo contiene entre 05 y 3 veces maacutes cantidad de glucoacutegeno que la carne de

ternera esto le proporciona un flavor maacutes dulce Por la cantidad de glucoacutegeno y de ATP la carne

de caballo conserva el grado de plasticidad y la elasticidad durante maacutes tiempo (Rossier 1993)

La maduracioacuten de esta carne alcanza un punto de maduracioacuten suficiente a los 4 - 5 diacuteas post-

mortem y por tanto el pH baja raacutepidamente Desde una perspectiva higieacutenico-sanitaria y por su

elevado contenido en glucoacutegeno aacutecido laacutectico y nitroacutegeno no proteico su periacuteodo de vida uacutetil

comercial es inferior al de la carne de vacuno (Fagravebregas 2002)

En la Tabla 1 se muestra la composicioacuten nutricional de la carne de caballo por 100 g y por racioacuten

(150 g) tambieacuten aparecen las ingestas recomendadas (IR) por diacutea para hombres y mujeres de

20 a 39 antildeos con una actividad fiacutesica moderada y el porcentaje que representa cada nutriente

por la toma de una racioacuten de carne seguacuten las recomendaciones diarias para un hombre Las

caloriacuteas aportadas por 100 g de carne de caballo no llegan a las 100 Cal en cambio la carne de

vacuno aporta sobre 120-200 Cal por 100 g Por tanto se puede decir que la carne de caballo

aporta menos caloriacuteas

En cuanto a las proteiacutenas la carne de potro se caracteriza por tener una mayor proporcioacuten de

proteiacutena que en ternera esta uacuteltima tiene 185 de proteiacutenas y la carne de caballo 21 Siendo

esta de un elevado valor bioloacutegico (40 de aminoaacutecidos esenciales) Su contenido se ve afectado

por el sexo el tipo de muacutesculo y por el sistema de produccioacuten La carne de potro es una fuente

de aminoaacutecidos esenciales El aminoaacutecido maacutes abundante es la lisina seguido de la leucina y la

arginina De los aminoaacutecidos no esenciales maacutes abundantes estaacuten el aacutecido glutaacutemico aacutecido

aspaacutertico y la alanina (Lorenzo and Pateiro 2013) En la Tabla 2 se observa la composicioacuten de los

aminoaacutecidos esenciales y no esenciales por g100 g de proteiacutena para potros en el muacutesculo

Longissimus dorsi

Los liacutepidos se encuentran en baja cantidad y representan aproximadamente el 2 de la

composicioacuten total de la carne Respecto a la composicioacuten de los aacutecidos grasos la carne de caballo

se caracteriza por tener un nivel alto de aacutecidos grasos insaturados de manera que los aacutecidos

grasos poliinsaturados (PUFA) predominantes son linoleico (n-6) que representa un 43 del

total de los PUFA y linoleacutenico (n-3) El oleico es el aacutecido graso monoinsaturado (MUFA) maacutes

predomiacutenate La carne de caballo tiene un bajo contenido de colesterol sobre un 20 menos si

se compara con otras carnes (Bo et al 2013) Sarrieacutes Murray Troy y Beriain (2006) encontraron

contenidos mayores de PUFA en potros joacutevenes en comparacioacuten con potros mayores

El nivel de grasa aumenta con la edad el peso y el sexo Los potros hembras tienen mayor

proporcioacuten de grasa en la canal Seguacuten Lorenzo y Sarrieacutes (2014) las hembras tienen 123 de

grasa y los machos 94 Respecto a la grasa de la canal en hembras encontraron 149 y en

los potros machos 158 La mayor diferencia entre machos y hembras es que el grado de grasa

es mayor en la canal de las hembras (Lorenzo et al 2014b)

P aacute g i n a 5 | 34

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo

100 g Racioacuten

(150 g)

IR

hombres

IR

mujeres Racioacuten

Energiacutea (kcal) 93 140 3000 2300 46

Proteiacutenas (g) 21 315 54 41 58

Liacutepidos totales (g) 22 33 100-117 77-89 33

AG saturados (g) 090 135 23-27 18-20 5

AG poliinsaturados (g) 065 0975 17 13 573

n-6 043 065 10 8 65

n-3 021 0315 33-66 26-51 955

AG monoinsaturados (g) 061 091 67 51 136

Colesterol (mg1000cal) 50-61 75-915 lt300 lt230 1335

Potasio (mg) 332 498 3500 3500 1422

Fosforo (mg) 200 300 700 700 4285

Sodio (mg) 44 66 lt2000 lt2000 33

Magnesio (mg) 23 345 350 330 10

Zinc (mg) 6 9 15 15 60

Hierro (mg) 4 6 10 18 60

Calcio (mg) 377 665 1000 1000 056

Selenio (microg) 3 45 70 55 643

Equivalentes de niacina (mg) 82 123 20 15 615

Riboflavina (mg) 01 015 18 14 83

Tiramina (mg) 007 011 12 09 917

Vitamina B12 (microg) 208 312 2 2 156

Fuente Badiani et al (1997) Bo et al (2013) Magrama (2016)

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 2 | 34

2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA

21 Sector equino

Los eacutequidos desde la antiguumledad se han considerado como productores de carne para la

alimentacioacuten humana No obstante en Espantildea histoacutericamente no se han contemplado los

caballos como animales destinados a la produccioacuten de carne Aunque tradicionalmente para la

produccioacuten de carne se ha usado todo tipo de ganado equino (caballar mular y asnal) hoy en

diacutea este subsector se sustenta baacutesicamente de la produccioacuten de caballos de aptitud caacuternica

(Magrama 2003)

La carne de caballo se produce en diferentes paiacuteses pero el nivel de produccioacuten es menor en

comparacioacuten con otros tipos de carnes En la Figura 1 se representa la produccioacuten de carne por

especies a nivel mundial el sector equino representa el 025 del total Seguacuten Faostat desde el

antildeo 1993 al 2013 los productores principales a nivel mundial son China Meacutejico Kazajistaacuten y

Rusia Respecto a la produccioacuten de carne equina en Navarra en el antildeo 2014 esta fue de 257412

Tm (canal) mientras que en el 2015 fue de 328914 Tm (canal) (Gobierno-Navarra 2016) Se

observa que hubo un incremento el uacuteltimo antildeo

El caballo de Burguete es un cruce de yeguas tipo Jaca con caballos franceses pesados como el

Bretoacuten Ardeneacutes y Comtois Esta raza se extiende fundamentalmente por la zona noreste de

Navarra Estaacute considerada por la FAO el MAGRAMA y por la Comunidad Foral de Navarra como

razas autoacutectonas en peligro de extincioacuten (BON)

El caballo Gallego de Monte es una denominacioacuten de la poblacioacuten equina explotada en reacutegimen

de libertad en los montes de Galicia y estaacute relacionada directamente con el caballo de Pura Raza

Gallega con el tronco Celta en comuacuten (Franco et al 2011)

En la Figura 2 se muestra la produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea durante los uacuteltimos 20

antildeos En Espantildea hay cada vez maacutes aceptacioacuten de la carne de equino entre los consumidores De

hecho su produccioacuten se disparoacute en los antildeos de la crisis econoacutemica aunque en 2013 la oferta se

redujo sensiblemente y lo mismo sucedioacute en 2014 Con respecto a la Produccioacuten Final Agraria

el sector aportoacute en 2014 el 01 y con respecto a la Produccioacuten Animal el 03 (en ambos casos

Figura 1 Produccioacuten de carne a nivel mundial por especies en 2013 (Belaunzaran et al 2015)

P aacute g i n a 3 | 34

muy por encima de las cifras del antildeo 2013) En el antildeo 2014 se sacrificaron aproximadamente

46400 animales (un 9 menos que en 2013) y la produccioacuten de carne se situoacute en unas 11100

toneladas 600 tm menos que el antildeo anterior La regioacuten con mayor produccioacuten de carne de

equino en 2014 fue de nuevo Navarra con el 22 del total y tambieacuten mostroacute el mayor censo con

el 18 del total (Sainz et al 2016)

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro

Seguacuten el Coacutedigo Alimentario Espantildeol la denominacioacuten geneacuterica de carne incluye la parte

comestible de los muacutesculos de los boacutevidos oacutevidos suidos caacutepridos eacutequidos y cameacutelidos sanos

sacrificados en condiciones higieacutenicas Presentaraacute un olor caracteriacutestico y su color debe oscilar

del blanco rosaacuteceo al rojo oscuro dependiendo de la especie animal raza edad alimentacioacuten

forma de sacrificio y periodo de tiempo transcurrido desde que aqueacutel fue realizado En la calidad

de la carne influyen diferentes paraacutemetros y atributos como el pH el color la flora bacteriana

la capacidad de retencioacuten de agua la composicioacuten quiacutemica el nivel de oxidacioacuten lipiacutedica

propiedades de la textura atributos sensoriales etc Estos atributos no pueden considerarse

independientes ya que estaacuten muy relacionados entre siacute y su interaccioacuten proporciona las

caracteriacutesticas globales de la calidad de la carne (Sierra 2010)

En Espantildea hay dos sistemas de ganado para producir la carne de potro que difieren

principalmente en la edad del sacrificio uno es a los 16 meses y el otro a los 24 meses Seguacuten el

ldquoCatalogue de Classement des Eacutequideacutesrdquo del Office National Interprofessionnel du Beacutetail et des

Viandes se considera animal joven o potro a los animales menores de 1 antildeo y entre los 15-24

meses de edad pueden llegar ocasionalmente hasta los 30 meses Los animales adultos o

caballos se consideran a partir de 30 meses (ONIBEV 1979) Seguacuten Fagravebregas (2002) la carne de

potro incluye las canales de lechales y potros animales joacutevenes cuya carne es rosada con grasa

de color crema La carne de caballo incluye principalmente a canales de caballos y tambieacuten

adultos de asnos y mulas carne roja con grasa de color amarillo El color de la carne de caballo

depende de la edad asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo adulto tiene un tono

maacutes intenso

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 (FAO 2016)

P aacute g i n a 4 | 34

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro

La carne de caballo contiene entre 05 y 3 veces maacutes cantidad de glucoacutegeno que la carne de

ternera esto le proporciona un flavor maacutes dulce Por la cantidad de glucoacutegeno y de ATP la carne

de caballo conserva el grado de plasticidad y la elasticidad durante maacutes tiempo (Rossier 1993)

La maduracioacuten de esta carne alcanza un punto de maduracioacuten suficiente a los 4 - 5 diacuteas post-

mortem y por tanto el pH baja raacutepidamente Desde una perspectiva higieacutenico-sanitaria y por su

elevado contenido en glucoacutegeno aacutecido laacutectico y nitroacutegeno no proteico su periacuteodo de vida uacutetil

comercial es inferior al de la carne de vacuno (Fagravebregas 2002)

En la Tabla 1 se muestra la composicioacuten nutricional de la carne de caballo por 100 g y por racioacuten

(150 g) tambieacuten aparecen las ingestas recomendadas (IR) por diacutea para hombres y mujeres de

20 a 39 antildeos con una actividad fiacutesica moderada y el porcentaje que representa cada nutriente

por la toma de una racioacuten de carne seguacuten las recomendaciones diarias para un hombre Las

caloriacuteas aportadas por 100 g de carne de caballo no llegan a las 100 Cal en cambio la carne de

vacuno aporta sobre 120-200 Cal por 100 g Por tanto se puede decir que la carne de caballo

aporta menos caloriacuteas

En cuanto a las proteiacutenas la carne de potro se caracteriza por tener una mayor proporcioacuten de

proteiacutena que en ternera esta uacuteltima tiene 185 de proteiacutenas y la carne de caballo 21 Siendo

esta de un elevado valor bioloacutegico (40 de aminoaacutecidos esenciales) Su contenido se ve afectado

por el sexo el tipo de muacutesculo y por el sistema de produccioacuten La carne de potro es una fuente

de aminoaacutecidos esenciales El aminoaacutecido maacutes abundante es la lisina seguido de la leucina y la

arginina De los aminoaacutecidos no esenciales maacutes abundantes estaacuten el aacutecido glutaacutemico aacutecido

aspaacutertico y la alanina (Lorenzo and Pateiro 2013) En la Tabla 2 se observa la composicioacuten de los

aminoaacutecidos esenciales y no esenciales por g100 g de proteiacutena para potros en el muacutesculo

Longissimus dorsi

Los liacutepidos se encuentran en baja cantidad y representan aproximadamente el 2 de la

composicioacuten total de la carne Respecto a la composicioacuten de los aacutecidos grasos la carne de caballo

se caracteriza por tener un nivel alto de aacutecidos grasos insaturados de manera que los aacutecidos

grasos poliinsaturados (PUFA) predominantes son linoleico (n-6) que representa un 43 del

total de los PUFA y linoleacutenico (n-3) El oleico es el aacutecido graso monoinsaturado (MUFA) maacutes

predomiacutenate La carne de caballo tiene un bajo contenido de colesterol sobre un 20 menos si

se compara con otras carnes (Bo et al 2013) Sarrieacutes Murray Troy y Beriain (2006) encontraron

contenidos mayores de PUFA en potros joacutevenes en comparacioacuten con potros mayores

El nivel de grasa aumenta con la edad el peso y el sexo Los potros hembras tienen mayor

proporcioacuten de grasa en la canal Seguacuten Lorenzo y Sarrieacutes (2014) las hembras tienen 123 de

grasa y los machos 94 Respecto a la grasa de la canal en hembras encontraron 149 y en

los potros machos 158 La mayor diferencia entre machos y hembras es que el grado de grasa

es mayor en la canal de las hembras (Lorenzo et al 2014b)

P aacute g i n a 5 | 34

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo

100 g Racioacuten

(150 g)

IR

hombres

IR

mujeres Racioacuten

Energiacutea (kcal) 93 140 3000 2300 46

Proteiacutenas (g) 21 315 54 41 58

Liacutepidos totales (g) 22 33 100-117 77-89 33

AG saturados (g) 090 135 23-27 18-20 5

AG poliinsaturados (g) 065 0975 17 13 573

n-6 043 065 10 8 65

n-3 021 0315 33-66 26-51 955

AG monoinsaturados (g) 061 091 67 51 136

Colesterol (mg1000cal) 50-61 75-915 lt300 lt230 1335

Potasio (mg) 332 498 3500 3500 1422

Fosforo (mg) 200 300 700 700 4285

Sodio (mg) 44 66 lt2000 lt2000 33

Magnesio (mg) 23 345 350 330 10

Zinc (mg) 6 9 15 15 60

Hierro (mg) 4 6 10 18 60

Calcio (mg) 377 665 1000 1000 056

Selenio (microg) 3 45 70 55 643

Equivalentes de niacina (mg) 82 123 20 15 615

Riboflavina (mg) 01 015 18 14 83

Tiramina (mg) 007 011 12 09 917

Vitamina B12 (microg) 208 312 2 2 156

Fuente Badiani et al (1997) Bo et al (2013) Magrama (2016)

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 3 | 34

muy por encima de las cifras del antildeo 2013) En el antildeo 2014 se sacrificaron aproximadamente

46400 animales (un 9 menos que en 2013) y la produccioacuten de carne se situoacute en unas 11100

toneladas 600 tm menos que el antildeo anterior La regioacuten con mayor produccioacuten de carne de

equino en 2014 fue de nuevo Navarra con el 22 del total y tambieacuten mostroacute el mayor censo con

el 18 del total (Sainz et al 2016)

22 Caracteriacutesticas generales de la carne de potro

Seguacuten el Coacutedigo Alimentario Espantildeol la denominacioacuten geneacuterica de carne incluye la parte

comestible de los muacutesculos de los boacutevidos oacutevidos suidos caacutepridos eacutequidos y cameacutelidos sanos

sacrificados en condiciones higieacutenicas Presentaraacute un olor caracteriacutestico y su color debe oscilar

del blanco rosaacuteceo al rojo oscuro dependiendo de la especie animal raza edad alimentacioacuten

forma de sacrificio y periodo de tiempo transcurrido desde que aqueacutel fue realizado En la calidad

de la carne influyen diferentes paraacutemetros y atributos como el pH el color la flora bacteriana

la capacidad de retencioacuten de agua la composicioacuten quiacutemica el nivel de oxidacioacuten lipiacutedica

propiedades de la textura atributos sensoriales etc Estos atributos no pueden considerarse

independientes ya que estaacuten muy relacionados entre siacute y su interaccioacuten proporciona las

caracteriacutesticas globales de la calidad de la carne (Sierra 2010)

En Espantildea hay dos sistemas de ganado para producir la carne de potro que difieren

principalmente en la edad del sacrificio uno es a los 16 meses y el otro a los 24 meses Seguacuten el

ldquoCatalogue de Classement des Eacutequideacutesrdquo del Office National Interprofessionnel du Beacutetail et des

Viandes se considera animal joven o potro a los animales menores de 1 antildeo y entre los 15-24

meses de edad pueden llegar ocasionalmente hasta los 30 meses Los animales adultos o

caballos se consideran a partir de 30 meses (ONIBEV 1979) Seguacuten Fagravebregas (2002) la carne de

potro incluye las canales de lechales y potros animales joacutevenes cuya carne es rosada con grasa

de color crema La carne de caballo incluye principalmente a canales de caballos y tambieacuten

adultos de asnos y mulas carne roja con grasa de color amarillo El color de la carne de caballo

depende de la edad asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo adulto tiene un tono

maacutes intenso

Figura 2 Produccioacuten de la carne de caballo en Espantildea del 1993 al 2013 (FAO 2016)

P aacute g i n a 4 | 34

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro

La carne de caballo contiene entre 05 y 3 veces maacutes cantidad de glucoacutegeno que la carne de

ternera esto le proporciona un flavor maacutes dulce Por la cantidad de glucoacutegeno y de ATP la carne

de caballo conserva el grado de plasticidad y la elasticidad durante maacutes tiempo (Rossier 1993)

La maduracioacuten de esta carne alcanza un punto de maduracioacuten suficiente a los 4 - 5 diacuteas post-

mortem y por tanto el pH baja raacutepidamente Desde una perspectiva higieacutenico-sanitaria y por su

elevado contenido en glucoacutegeno aacutecido laacutectico y nitroacutegeno no proteico su periacuteodo de vida uacutetil

comercial es inferior al de la carne de vacuno (Fagravebregas 2002)

En la Tabla 1 se muestra la composicioacuten nutricional de la carne de caballo por 100 g y por racioacuten

(150 g) tambieacuten aparecen las ingestas recomendadas (IR) por diacutea para hombres y mujeres de

20 a 39 antildeos con una actividad fiacutesica moderada y el porcentaje que representa cada nutriente

por la toma de una racioacuten de carne seguacuten las recomendaciones diarias para un hombre Las

caloriacuteas aportadas por 100 g de carne de caballo no llegan a las 100 Cal en cambio la carne de

vacuno aporta sobre 120-200 Cal por 100 g Por tanto se puede decir que la carne de caballo

aporta menos caloriacuteas

En cuanto a las proteiacutenas la carne de potro se caracteriza por tener una mayor proporcioacuten de

proteiacutena que en ternera esta uacuteltima tiene 185 de proteiacutenas y la carne de caballo 21 Siendo

esta de un elevado valor bioloacutegico (40 de aminoaacutecidos esenciales) Su contenido se ve afectado

por el sexo el tipo de muacutesculo y por el sistema de produccioacuten La carne de potro es una fuente

de aminoaacutecidos esenciales El aminoaacutecido maacutes abundante es la lisina seguido de la leucina y la

arginina De los aminoaacutecidos no esenciales maacutes abundantes estaacuten el aacutecido glutaacutemico aacutecido

aspaacutertico y la alanina (Lorenzo and Pateiro 2013) En la Tabla 2 se observa la composicioacuten de los

aminoaacutecidos esenciales y no esenciales por g100 g de proteiacutena para potros en el muacutesculo

Longissimus dorsi

Los liacutepidos se encuentran en baja cantidad y representan aproximadamente el 2 de la

composicioacuten total de la carne Respecto a la composicioacuten de los aacutecidos grasos la carne de caballo

se caracteriza por tener un nivel alto de aacutecidos grasos insaturados de manera que los aacutecidos

grasos poliinsaturados (PUFA) predominantes son linoleico (n-6) que representa un 43 del

total de los PUFA y linoleacutenico (n-3) El oleico es el aacutecido graso monoinsaturado (MUFA) maacutes

predomiacutenate La carne de caballo tiene un bajo contenido de colesterol sobre un 20 menos si

se compara con otras carnes (Bo et al 2013) Sarrieacutes Murray Troy y Beriain (2006) encontraron

contenidos mayores de PUFA en potros joacutevenes en comparacioacuten con potros mayores

El nivel de grasa aumenta con la edad el peso y el sexo Los potros hembras tienen mayor

proporcioacuten de grasa en la canal Seguacuten Lorenzo y Sarrieacutes (2014) las hembras tienen 123 de

grasa y los machos 94 Respecto a la grasa de la canal en hembras encontraron 149 y en

los potros machos 158 La mayor diferencia entre machos y hembras es que el grado de grasa

es mayor en la canal de las hembras (Lorenzo et al 2014b)

P aacute g i n a 5 | 34

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo

100 g Racioacuten

(150 g)

IR

hombres

IR

mujeres Racioacuten

Energiacutea (kcal) 93 140 3000 2300 46

Proteiacutenas (g) 21 315 54 41 58

Liacutepidos totales (g) 22 33 100-117 77-89 33

AG saturados (g) 090 135 23-27 18-20 5

AG poliinsaturados (g) 065 0975 17 13 573

n-6 043 065 10 8 65

n-3 021 0315 33-66 26-51 955

AG monoinsaturados (g) 061 091 67 51 136

Colesterol (mg1000cal) 50-61 75-915 lt300 lt230 1335

Potasio (mg) 332 498 3500 3500 1422

Fosforo (mg) 200 300 700 700 4285

Sodio (mg) 44 66 lt2000 lt2000 33

Magnesio (mg) 23 345 350 330 10

Zinc (mg) 6 9 15 15 60

Hierro (mg) 4 6 10 18 60

Calcio (mg) 377 665 1000 1000 056

Selenio (microg) 3 45 70 55 643

Equivalentes de niacina (mg) 82 123 20 15 615

Riboflavina (mg) 01 015 18 14 83

Tiramina (mg) 007 011 12 09 917

Vitamina B12 (microg) 208 312 2 2 156

Fuente Badiani et al (1997) Bo et al (2013) Magrama (2016)

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 4 | 34

23 Caracteriacutesticas nutricionales de la carne de potro

La carne de caballo contiene entre 05 y 3 veces maacutes cantidad de glucoacutegeno que la carne de

ternera esto le proporciona un flavor maacutes dulce Por la cantidad de glucoacutegeno y de ATP la carne

de caballo conserva el grado de plasticidad y la elasticidad durante maacutes tiempo (Rossier 1993)

La maduracioacuten de esta carne alcanza un punto de maduracioacuten suficiente a los 4 - 5 diacuteas post-

mortem y por tanto el pH baja raacutepidamente Desde una perspectiva higieacutenico-sanitaria y por su

elevado contenido en glucoacutegeno aacutecido laacutectico y nitroacutegeno no proteico su periacuteodo de vida uacutetil

comercial es inferior al de la carne de vacuno (Fagravebregas 2002)

En la Tabla 1 se muestra la composicioacuten nutricional de la carne de caballo por 100 g y por racioacuten

(150 g) tambieacuten aparecen las ingestas recomendadas (IR) por diacutea para hombres y mujeres de

20 a 39 antildeos con una actividad fiacutesica moderada y el porcentaje que representa cada nutriente

por la toma de una racioacuten de carne seguacuten las recomendaciones diarias para un hombre Las

caloriacuteas aportadas por 100 g de carne de caballo no llegan a las 100 Cal en cambio la carne de

vacuno aporta sobre 120-200 Cal por 100 g Por tanto se puede decir que la carne de caballo

aporta menos caloriacuteas

En cuanto a las proteiacutenas la carne de potro se caracteriza por tener una mayor proporcioacuten de

proteiacutena que en ternera esta uacuteltima tiene 185 de proteiacutenas y la carne de caballo 21 Siendo

esta de un elevado valor bioloacutegico (40 de aminoaacutecidos esenciales) Su contenido se ve afectado

por el sexo el tipo de muacutesculo y por el sistema de produccioacuten La carne de potro es una fuente

de aminoaacutecidos esenciales El aminoaacutecido maacutes abundante es la lisina seguido de la leucina y la

arginina De los aminoaacutecidos no esenciales maacutes abundantes estaacuten el aacutecido glutaacutemico aacutecido

aspaacutertico y la alanina (Lorenzo and Pateiro 2013) En la Tabla 2 se observa la composicioacuten de los

aminoaacutecidos esenciales y no esenciales por g100 g de proteiacutena para potros en el muacutesculo

Longissimus dorsi

Los liacutepidos se encuentran en baja cantidad y representan aproximadamente el 2 de la

composicioacuten total de la carne Respecto a la composicioacuten de los aacutecidos grasos la carne de caballo

se caracteriza por tener un nivel alto de aacutecidos grasos insaturados de manera que los aacutecidos

grasos poliinsaturados (PUFA) predominantes son linoleico (n-6) que representa un 43 del

total de los PUFA y linoleacutenico (n-3) El oleico es el aacutecido graso monoinsaturado (MUFA) maacutes

predomiacutenate La carne de caballo tiene un bajo contenido de colesterol sobre un 20 menos si

se compara con otras carnes (Bo et al 2013) Sarrieacutes Murray Troy y Beriain (2006) encontraron

contenidos mayores de PUFA en potros joacutevenes en comparacioacuten con potros mayores

El nivel de grasa aumenta con la edad el peso y el sexo Los potros hembras tienen mayor

proporcioacuten de grasa en la canal Seguacuten Lorenzo y Sarrieacutes (2014) las hembras tienen 123 de

grasa y los machos 94 Respecto a la grasa de la canal en hembras encontraron 149 y en

los potros machos 158 La mayor diferencia entre machos y hembras es que el grado de grasa

es mayor en la canal de las hembras (Lorenzo et al 2014b)

P aacute g i n a 5 | 34

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo

100 g Racioacuten

(150 g)

IR

hombres

IR

mujeres Racioacuten

Energiacutea (kcal) 93 140 3000 2300 46

Proteiacutenas (g) 21 315 54 41 58

Liacutepidos totales (g) 22 33 100-117 77-89 33

AG saturados (g) 090 135 23-27 18-20 5

AG poliinsaturados (g) 065 0975 17 13 573

n-6 043 065 10 8 65

n-3 021 0315 33-66 26-51 955

AG monoinsaturados (g) 061 091 67 51 136

Colesterol (mg1000cal) 50-61 75-915 lt300 lt230 1335

Potasio (mg) 332 498 3500 3500 1422

Fosforo (mg) 200 300 700 700 4285

Sodio (mg) 44 66 lt2000 lt2000 33

Magnesio (mg) 23 345 350 330 10

Zinc (mg) 6 9 15 15 60

Hierro (mg) 4 6 10 18 60

Calcio (mg) 377 665 1000 1000 056

Selenio (microg) 3 45 70 55 643

Equivalentes de niacina (mg) 82 123 20 15 615

Riboflavina (mg) 01 015 18 14 83

Tiramina (mg) 007 011 12 09 917

Vitamina B12 (microg) 208 312 2 2 156

Fuente Badiani et al (1997) Bo et al (2013) Magrama (2016)

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 5 | 34

Tabla 1 Composicioacuten nutricional carne de caballo

100 g Racioacuten

(150 g)

IR

hombres

IR

mujeres Racioacuten

Energiacutea (kcal) 93 140 3000 2300 46

Proteiacutenas (g) 21 315 54 41 58

Liacutepidos totales (g) 22 33 100-117 77-89 33

AG saturados (g) 090 135 23-27 18-20 5

AG poliinsaturados (g) 065 0975 17 13 573

n-6 043 065 10 8 65

n-3 021 0315 33-66 26-51 955

AG monoinsaturados (g) 061 091 67 51 136

Colesterol (mg1000cal) 50-61 75-915 lt300 lt230 1335

Potasio (mg) 332 498 3500 3500 1422

Fosforo (mg) 200 300 700 700 4285

Sodio (mg) 44 66 lt2000 lt2000 33

Magnesio (mg) 23 345 350 330 10

Zinc (mg) 6 9 15 15 60

Hierro (mg) 4 6 10 18 60

Calcio (mg) 377 665 1000 1000 056

Selenio (microg) 3 45 70 55 643

Equivalentes de niacina (mg) 82 123 20 15 615

Riboflavina (mg) 01 015 18 14 83

Tiramina (mg) 007 011 12 09 917

Vitamina B12 (microg) 208 312 2 2 156

Fuente Badiani et al (1997) Bo et al (2013) Magrama (2016)

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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effects of commercial carcass suspension (24 and 48 h) on meat quality in high oxygen modified

atmosphere packed beef steaks during chill storage Food Res Int 43277ndash284

Zakrys P I M G OrsquoSullivan E E OrsquoNeill and J P Kerry 2012 The effects of high oxygen

modified atmosphere packaging on protein oxidation of bovine M longissimus dorsi muscle

during chilled storage Food Chem 131527ndash532

P aacute g i n a 6 | 34

Tabla 2 Composicioacuten aminoaacutecidica en el muacutesculo Longissimus dorsi en potros

Aminoaacutecido esencial Composicioacuten aminoaciacutedica (g100 g proteiacutena)

Lisina 915 plusmn 022

Leucina 854 plusmn 018

Arginina 648 plusmn 075

Valina 532 plusmn 008

Isoleucina 523 plusmn 035

Treonina 509 plusmn 022

Histidina 460 plusmn 027

Fenilalanina 432 plusmn 009

Metionina 145 plusmn 026

Aminoaacutecido no esencial

Aacutecido glutaacutemico 1532 plusmn 021

Aacutecido aspaacutertico 961 plusmn 021

Alanina 597 plusmn 012

Glicina 437 plusmn 020

Serina 406 plusmn 010

Prolina 392 plusmn 018

Tirosina 346 plusmn 027

Fuente Lorenzo y Pateiro (2013)

En la Figura 3 se muestra el perfil de aacutecidos grasos para potros hembras de 16 meses y en la

Figura 4 se puede observar el perfil de aacutecidos grasos para vacuno La proporcioacuten de AG

poliinsaturados es mayor en el caso del potro Los aacutecidos grasos predominantes en el muacutesculo

LD del potro son saturados seguidos de los monoinsaturados y finalmente se encuentran los

poliinsaturados Sarrieacutes et al (2006) estudiaron el perfil de aacutecidos grasos en potros y

encontraron respecto a los aacutecidos grasos saturados que los potros de 24 meses mostraron

mayor proporcioacuten de miriacutestico y de pentadecanol pero no se observaron diferencias para el

palmitato Los potros de 24 meses mostraron una cantidad menor de esteaacuterico Estos animales

mostraron una concentracioacuten mayor de los aacutecidos grasos monoinsaturados siendo el oleico el

aacutecido graso que se encontroacute en mayor proporcioacuten (suponiacutean el 713 del total de MUFA

intramuscular) La proporcioacuten de los poliinsaturados difirioacute entre los dos sistemas de produccioacuten

(16 y 24 meses) los de 24 meses teniacutean concentraciones menores de aacutecido linoleico

araquidoacutenico y del total n-6 pero mayor proporcioacuten de n-6n-3 respecto a los potros de 16

meses

P aacute g i n a 7 | 34

24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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24 Caracteriacutesticas organoleacutepticas de la carne de potro

Las dos caracteriacutesticas organoleacutepticas maacutes importantes para el consumidor a la hora de comprar

carne de potro son la terneza y el color Lo que determina la terneza es la parte insoluble de las

proteiacutenas de la carne colaacutegeno las proteiacutenas miofibrilares y las fibras musculares Por otro lado

el color depende de la edad del caballo asiacute la carne de potro es maacutes rosada y la del caballo

adulto tiene un tono maacutes intenso Esto ocurre porque el contenido en pigmentos aumenta con

la edad (Fagravebregas 2002) La carne de caballo es rica en mioglobina y tiene alta capacidad de

combinarse con el oxiacutegeno y por lo tanto se acelera la oxidacioacuten de la oximioglobina de color

rojo brillante a metamioglobina de color marroacuten Tateo et al (2008) reportaron un valor de

mioglobina en el muacutesculo LD de 320 mgg En el trabajo de Sarrieacutes y Beriain (2005) en potros de

24 meses presentaron un contenido de mioglobina menor que los de 16 meses ( 171 vs 351

mgg de mioglobina) Estas circunstancias reducen la estabilidad del color rojo de la carne fresca

de caballo acortando la vida uacutetil (Badiani and Manfredini 1994) El color de la carne de caballo

depende ademaacutes del sexo y de la localizacioacuten del muacutesculo

Otro de los criterios de calidad organoleacuteptica es el color de la grasa de la canal que variacutea seguacuten

la cantidad de hierba o forraje que haya consumido el animal Un potro alimentado con poca

cantidad de hierba presentaraacute una canal con buen estado de engrasamiento y grasa de color

Figura 3 Perfil AG potros (Sarrieacutes et al 2006)

Figura 4 Perfil AG vacuno (Alzueta and Beriain 2000)

P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 8 | 34

crema mientras que un potro que consuma maacutes hierba tendraacute una canal maacutes magra la

coloracioacuten de la grasa maacutes amarillenta y la de la carne rosada oscura (Fagravebregas 2002)

25 Oxidacioacuten de la carne

Durante varias deacutecadas se ha estudiado la oxidacioacuten lipiacutedica de la carne esto ha permitido

conocer los mecanismos de oxidacioacuten de los aacutecidos grasos el impacto de esta oxidacioacuten y

algunas estrategias para frenarla No obstante tambieacuten se produce oxidacioacuten en las proteiacutenas y

las proteiacutenas caacuternicas sufren cambios que van a afectar a sus propiedades funcionales

El oxiacutegeno juega un papel fundamental en la degradacioacuten de varios constituyentes de los

alimentos porque estaacute involucrado en muchas reacciones como el crecimiento microbiano el

pardeaminto enzimaacutetico peacuterdida de vitaminas y la oxidacioacuten lipiacutedica (Caprioli et al 2009)

251 Oxidacioacuten proteica

El estreacutes oxidativo puede causar modificaciones reversibles o irreversibles en las proteiacutenas Las

modificaciones reversibles generalmente en los residuos de cisteiacutena pueden ser reparadas

mediante enzimas especiacuteficas como las glutaredoxinas o tioredoxinas (Lillig et al 2008) Las

modificaciones irreversibles no pueden ser reparadas de forma que las proteiacutenas inactivas se

acumulan o son degradadas Un ejemplo de modificaciones irreversibles es el caso de la

carbonilacioacuten de las proteiacutenas

Mecanismos

Como en el caso de los liacutepidos la oxidacioacuten proteica implica que los aacutetomos traspasen electrones

a otros aacutetomos o moleacuteculas en presencia de un agente oxidante como un radical libre Estos

radicales libres son moleacuteculas inestables que se forman como consecuencia de la reaccioacuten entre

metales de transicioacuten como el hierro o el cobre y diversas especies de oxiacutegeno como el peroacutexido

de hidroacutegeno e incluso el oxiacutegeno molecular El hierro hemiacutenico (mioglobina) tambieacuten induce la

carbonilacioacuten en proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez et al 2012a) Los radicales libres suelen actuar

sobre los aacutecidos grasos con dobles enlaces y en las proteiacutenas a las cadenas laterales de los

aminoaacutecidos Ademaacutes el radical libre produce una desaminacioacuten oxidativa en presencia de un

metal de transicioacuten que actuacutea como catalizador lo que provoca la peacuterdida del grupo amino y la

formacioacuten de un grupo carbonilo (Figura 5) El proceso de oxidacioacuten proteica tiene lugar sobre

la proteiacutena iacutentegra y no hace falta una proteoacutelisis previa Se desconoce si una proteiacutena

parcialmente degradada es maacutes o menos sensible a la accioacuten de los radicales libres (Esteacutevez et

al 2012a)

P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 9 | 34

Algunas especies reactivas de oxiacutegeno (ROS) como el superoxido (O2˙ ) hidroperoacutexido (HO2˙) y

el hidroxil (HO˙) y otras especies no radicalarias como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) o

hidroperoacutexidos (ROOH) son potenciales iniciadores de la oxidacioacuten proteica (Esteacutevez 2011)

Algunos componentes que estaacuten presentes en el tejido muscular como los liacutepidos insaturados

pigmentos hemo metales de transicioacuten y enzimas oxidativas son precursores potenciales o

catalizadores de la formacioacuten de ROS y juegan un papel importante en la iniciacioacuten de la

oxidacioacuten proteica del muacutesculo (Xiong 2000) Los objetivos de ROS suelen ser el esqueleto

peptiacutedico y el grupo funcional Como consecuencia se extrae un aacutetomo de hidroacutegeno y se forma

un radical proteico en el carboacuten central (P˙) (reaccioacuten 1) Este se convierte en un radical peroacutexido

(POO˙) en presencia de oxiacutegeno y capta un hidroacutegeno de una moleacutecula susceptible para formar

un peroacutexido de alquilo (POOH) (reacciones 2 y 3) Otras reacciones con ROS como el radical HO˙2

radical o metales de transicioacuten como el Fe2+ o Cu+ pueden formar un radical alcoxi (PO˙)

(reacciones 4 y 5) y su derivado hidroxilo (POH) (reaccioacuten 7) (Esteacutevez 2011)

PH + HO˙ rarr P˙ + H2O (1)

P˙ + O2 rarr POO˙ (2)

POO˙ + PH rarr POOH + P˙ (3)

POOH + HO2˙ rarr PO˙ + O2 + H2O (4)

POOH + M2+ rarr PO˙ + HOminus + M(n+1)+ (5)

PO˙ + HO2˙ rarr POH + O2 (6)

PO˙ + H+ + Mn+ rarr POH + M(n+1)+ (7)

Figura 5 Formacioacuten de un carbonilo proteico a partir de Lys (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

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42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 10 | 34

La formacioacuten de carbonilos a partir de las cadenas laterales de lisina treonina arginina y prolina

se suele atribuir a los sistemas de oxidacioacuten catalizada por metales Seguacuten este mecanismo las

formas reducidas de metales de transicioacuten reduciriacutean H2O2 para formar un reactivo intermedio

(radical hidroxilo OH˙) (reaccioacuten 8) Se ha demostrado que la combinacioacuten de metales de

transicioacuten con H2O2 tiene efecto pro oxidante en las proteiacutenas caacuternicas (Esteacutevez 2011)

Mn+ + H2O2 rarr HOminus + HO˙ (8)

Como consecuencia de la oxidacioacuten mediada por metales a partir de la treonina se forma el

aacutecido alfa-cetobutiacuterico de la lisina se forma el semialdehiacutedo α-aminoadiacutepico (AAS) y de la

arginina y la prolina se obtiene el semialdehiacutedo γ-glutaacutemico (GGS) El AAS y SGG se propusieron

originalmente como biomarcadores del dantildeo oxidativo de las proteiacutenas Estos semialdehiacutedos se

consideran los principales carbonilos debidos a la oxidacioacuten de proteiacutenas catalizada por metales

Representan entre el 50 y el 70 del total de carbonilos que se forman en la carne y en

productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012a) Por esto se podriacutean utilizar como marcadores de dantildeo

oxidativo en proteiacutenas de origen caacuternico (Armenteros 2010)

Hay otros mecanismos por los que se pueden formar carbonilos en proteiacutenas pero este es el

uacutenico que se ha demostrado que ocurre en alimentos (Esteacutevez 2011) La oxidacioacuten proteica

implica gran variedad de moleacuteculas susceptibles mecanismos y productos finales de oxidacioacuten

De este modo cada aminoaacutecido presenta una ruta especiacutefica de oxidacioacuten y da lugar a productos

de oxidacioacuten especiacuteficos en la Figura 6 se muestra las reacciones de oxidacioacuten de diferentes

aminoaacutecidos (Esteacutevez et al 2012a) A nivel aminoaciacutedico la oxidacioacuten provoca cambios

irreversibles en los grupos funcionales de los aminoaacutecidos originales para formar productos de

oxidacioacuten de naturaleza diversa como puentes disulfuro ditirosinas y carbonilos (Berlett 1997)

La carbonilacioacuten puede tener lugar en ausencia de oxidacioacuten lipiacutedica pero en sistemas complejos

como la carne la presencia de liacutepidos oxidados influye muy probablemente sobre la OX-P Los

radicales lipiacutedicos e hidroperoacutexidos que se forman en la oxidacioacuten lipiacutedica pueden iniciar la

oxidacioacuten de proteiacutenas adyacentes (Esteacutevez et al 2012b)

Figura 6 Modificacioacuten de las cadenas laterales de los aminoaacutecidos como consecuencia de las

reacciones de oxidacioacuten (Esteacutevez et al 2012a)

P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

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42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 11 | 34

Como consecuencia del estreacutes oxidativo in vivo hay carbonilos en los animales en una cantidad

basal pero estos se incrementan tras el sacrificio del animal y durante el almacenamiento y

procesado La curacioacuten las altas presiones las radiaciones ionizantes y los tratamientos

culinarios promueven la oxidacioacuten de proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten

de las proteiacutenas tambieacuten tiene lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten y en la

congelacioacuten de la carne o de los productos caacuternicos (Esteacutevez et al 2012b) El grado de

carbonilacioacuten depende de la temperatura de almacenamiento de congelacioacuten (Utrera et al

2014)

Reactividad de los carbonilos proteicos

Se sabe que los carbonilos participan en diferentes reacciones de importancia bioloacutegica La

fraccioacuten aldehiacutedo de los carbonilos proteicos pueden participar en varias reacciones i)

degradacioacuten oxidativa en el que el aldehiacutedo se oxida a aacutecido carboxiacutelico ii) la reaccioacuten con un

aldehiacutedo de otro residuo carboniacutelico unido a proteiacutenas para formar un producto de

condensacioacuten aldoacutelica iii) la reaccioacuten con un grupo amino de una aminoaacutecido de una proteiacutena

vecina (principalmente lisina) para formar un enlace covalente a traveacutes de la formacioacuten de base

de Schiff y iv) la reaccioacuten con un grupo α-amino de un aminoaacutecido libre para formar un aldehiacutedo

de Strecker a traveacutes de la degradacioacuten Strecker desaminacioacuten oxidativa y descarboxilacioacuten del

aminoaacutecido en la presencia de un compuesto carbonilo (Esteacutevez 2011) (Figura 7)

Figura 7 Reacciones de un carbonilo proteico (AAS) i) La oxidacioacuten del resto carbonilo ii)

Formacioacuten de una condensacioacuten aldoacutelica producto por la reaccioacuten con un AAS vecina iii)

Formacioacuten de una azometina (base de Schiff) por reaccioacuten con un grupo amino de un aminoaacutecido

P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 12 | 34

vecino iv) Implicacioacuten en la formacioacuten de un aldehiacutedo de Strecker por una degradacioacuten de tipo

Strecker de un aminoaacutecido libre (Esteacutevez 2011)

En condiciones de oxidaciones intensas la oxidacioacuten continua de AAS dariacutea lugar a la formacioacuten

de un producto final estable aacutecido α-aminoadiacutepico (AAA) La formacioacuten de AAA a partir de AAS

requiere la presencia de oxiacutegeno y un agente oxidante En sistemas bioloacutegicos varios metales

de transicioacuten y ROS podriacutean estar involucrados en la degradacioacuten oxidativa (Esteacutevez 2011) La

moleacutecula resultante se puede detectar faacutecilmente por HPLC o por GC-MS Pero las

investigaciones en relacioacuten al AAA como oxidacioacuten de proteiacutenas son escasas Sell Strauch Shen

y Monnier (2007) apuntaron que AAA puede ser un marcador maacutes fiable de la P-OX que su

precursor carbonilo

Tratamientos post mortem de la carne y oxidacioacuten proteica (Soladoye et al 2015)

Maduracioacuten y fermentacioacuten

La maduracioacuten incrementa la concentracioacuten de carbonilos proteicos y se produce una reduccioacuten

de los grupos sulfhidrilos que dependen de las condiciones de almacenamiento y del envase La

fermentacioacuten tambieacuten va a favorecer la oxidacioacuten proteica ya que se produce un descenso del

pH del medio aumentan los aacutecidos grasos libres y los aminoaacutecidos libres

Salado y curado

La sal tiene un efecto pro-oxidante en los liacutepidos de la carne y depende del perfil metaboacutelico del

muacutesculo con un efecto mayor en los musculos rojos en comparacioacuten con los blancos la grasa

total y el nivel de aacutecidos grasos polinsaturados Durante el curado tambieacuten se produce un

aumento de la oxidacioacuten en lomo y jamoacuten de cerdo aunque se ha visto que los nitritos tienen

una capacidad antioxidante frente a la oxidacioacuten proteica aunque Villaverde et al (2014)

observaron que los nitritos promoviacutean la formacioacuten de carbonilos en salchichas fermentadas

Trituracioacuten

La trituracioacuten o el fileteado aumenta el aacuterea de superficie de la proteiacutena y dantildear la

compartimentacioacuten celular y el sistema de defensa antioxidante esto hace que los diversos pro-

oxidantes queden en contacto directo con las proteiacutenas en presencia de oxiacutegeno molecular

haciendo a las proteiacutenas maacutes vulnerables al ataque de los ROS (Xiong 2000)

Almacenamiento a congelacioacuten

Estudios recientes han declarado que el almacenamiento a congelacioacuten aumenta la oxidacioacuten

proteica lo cual fue atribuido a la liberacioacuten de hierro cataliacutetico por la alteracioacuten de las

membranas celulares y la posible crioconcentracioacuten de solutos pro-oxidante alrededor de las

moleacuteculas de proteiacutena en la porcioacuten de agua descongelada en carnes congeladas (Utrera and

Esteacutevez 2013)

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten proteica en alimentos

Contenido total de carbonilos

La cantidad total de carbonilos es un indicador global de la oxidacioacuten proteica De forma rutinaria

se emplea la teacutecnica dinitrofenilhidrazina (DNPH) para cuantificar los carbonilos proteicos pero

esta teacutecnica no proporciona informacioacuten de las rutas de oxidacioacuten implicadas y tampoco la

naturaleza de los productos de oxidacioacuten

P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 13 | 34

El meacutetodo consiste en la reaccioacuten de los grupos carbonilos proteicos con 24-

dinitrofenilhidrazina (DNPH) para formar 24-dinitrofenilhidrazonas (Figura 8) La cantidad de

carbonilos se mide a 370 nm y se expresa como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando el coeficiente de extincioacuten molar de las hidrazonas (210mMcm) La concentracioacuten de

proteiacutenas se calcula midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando como estaacutendar albumina de

suero bovino

Carbonilos especiacuteficos

Se han desarrollado varios procedimientos para cuantificar los semialdehidos (AAS y GGS) en

muestras bioloacutegicas basados en la cromatografiacutea de gases acoplada a un espectroacutemetro de

masas (CG-MS) en la cromatografiacutea liacutequida de alta resolucioacuten con detector de diodos (HPLC-

DAD) o con detector de fluorescencia (HPLC-FLD) o acoplada a un espectroacutemetro de masas

(HPLC-MS) (Armenteros 2010)

Consecuencias

La OX-P tiene una influencia negativa tanto en la calidad sensorial como en el valor nutritivo de

la carne La repercusioacuten sobre la calidad de la carne se debe a que eacutesta contiene menos

aminoaacutecidos esenciales y se digieren con mayor dificultad ya que los enzimas digestivos se

pueden inactivar o se puede oxidar el sustrato y estas no reconocerlo Como no se digieren las

proteiacutenas el organismo no puede asimilar los aminoaacutecidos por otro lado las proteiacutenas oxidadas

pasan sin digerirse al intestino grueso doacutende se fermentan y producen compuestos

potencialmente toacutexicos (Esteacutevez et al 2012b)

Las proteiacutenas oxidadas pierden parte de sus propiedades funcionales como la capacidad de

retencioacuten de agua que es muy importante en la jugosidad de la carne fresca la capacidad de

formar geles necesaria para elaborar productos tratados con calor como el jamoacuten cocido y la

capacidad emulsificante que ayuda a retener la grasa en la elaboracioacuten de productos caacuternicos

(Esteacutevez et al 2012a) Todos estos factores afectan a la calidad de la carne y de los productos

caacuternicos Ademaacutes en productos caacuternicos procesados la oxidacioacuten provoca cambios en el color y

la textura (Esteacutevez et al 2012b)

La oxidacioacuten de las proteiacutenas tiene una influencia negativa sobre la terneza de la carne La

tenderizacioacuten de la carne que tiene lugar en el rigor mortis depende de las enzimas proteoliacuteticas

(calpaiacutenas y catepsinas) que actuacutean sobre las proteiacutenas miofibrilares esto provoca una carne

menos tierna y maacutes firme (Esteacutevez et al 2012a) Finalmente se obtiene una carne menos tierna

Figura 8 Reaccioacuten del grupo carbonilo con el DNPH para formar DNP-hidrazona (Esteacutevez et al

2009)

P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 14 | 34

y maacutes firme Seguacuten Lund Lametsch Hviid Jensen y Skibsted (2007) en la carne envasada en

atmosferas ricas en oxiacutegeno se produce un aumento de la dureza debido a la formacioacuten de

enlaces cruzados que provocan un incremento en la rigidez de la estructura miofibrilar

Los procesos tecnoloacutegicos aplicados a la carne como la curacioacuten las altas presiones

hidrostaacuteticas las radiaciones ionizadas o los tratamientos culinarios promueven la oxidacioacuten de

proteiacutenas y la formacioacuten de carbonilos La carbonilacioacuten de las proteiacutenas caacuternicas continuacutea

durante la refrigeracioacuten y congelacioacuten de la carne La congelacioacuten de la carne influye en la

capacidad de las proteiacutenas de la carne para retener el agua y la grasa (Esteacutevez et al 2012a)

Como indicaron Liu Xiong y Chen (2010) la formacioacuten de enlaces disulfuro como consecuencia

de la OX-P provoca la formacioacuten de una estructura muscular riacutegida e impide el hinchamiento de

la carne durante el marinado y la captacioacuten de agua

252 Oxidacioacuten lipiacutedica

La oxidacioacuten lipiacutedica es un aspecto importante a tener en cuenta durante el almacenamiento de

la carne El iacutendice de TBA proporciona una medida del grado de oxidacioacuten de grasas Se sabe que

los aacutecidos grasos poliinsaturados por el hecho de poseer varios dobles enlaces son susceptibles

a oxidacioacuten Los cambios bioquiacutemicos que ocurren durante la conversioacuten del muacutesculo en carne

como el descenso del pH y la ruptura de la estructura de las miofibrillas favorecen las

condiciones de oxidacioacuten Asiacute mismo los niveles de oxidacioacuten lipiacutedica en la carne pueden verse

influenciados por el tipo de alimentacioacuten del ganado

La oxidacioacuten de los liacutepidos es un proceso sumamente complejo que implica a numerosas

reacciones que dan lugar a una gran variedad de cambios fiacutesicos y quiacutemicos Los liacutepidos

musculares de los alimentos y en particular los compuestos fosfolipiacutedicos sufren una

degradacioacuten y producen un gran nuacutemero de compuestos volaacutetiles Sin embargo los

hidroperoacutexidos productos de la oxidacioacuten primaria no huelen y son insiacutepidos su degradacioacuten

conduce a la formacioacuten de una variedad de productos secundarios como aldehiacutedos

hidrocarburos alcoholes cetonas aacutecidos eacutesteres entre otros (Jayathilakan et al 2009) Los

productos secundarios y sobre todo los aldehiacutedos originan un amplio espectro de olores El

proceso de oxidacioacuten puede iniciarse o acelerarse por el oxiacutegeno la luz el hierro etc Por otro

lado la ceacutelula viva tiene la glutatioacuten peroxidasa que reduce los hidroperoacutexidos al compuesto

hidroxiacutelico pero esta reaccioacuten cesa cuando se sacrifica el animal

Mecanismos

La exposicioacuten al oxiacutegeno y la luz son los principales factores que originan la aparicioacuten de

fenoacutemenos oxidativos en la carne yo productos caacuternicos Las especies reactivas del oxiacutegeno

(ROS) actuacutean sobre los liacutepidos poliinsaturados de las membranas produciendo peacuterdida de fluidez

y lisis celular como consecuencia de la peroxidacioacuten lipiacutedica La peroxidacioacuten lipiacutedica se inicia

tras la abstraccioacuten de un aacutetomo de hidroacutegeno en la cadena hidrocarbonada de los aacutecidos grasos

poliinsaturados (reaccioacuten 1) En un ambiente aerobio se produce la interaccioacuten del radical

lipiacutedico (R˙) con el O2 dando lugar a la formacioacuten del radical peroxilo (ROO˙) (reaccioacuten 2)

Posteriormente se puede sustraer un nuevo H de otro liacutepido (reaccioacuten secuencial) para formar

un hidroperoacutexido lipiacutedico (ROOH) y un nuevo radical lipiacutedico que inicia de nuevo la secuencia de

propagacioacuten (reaccioacuten 3) El ciclo de propagacioacuten es interrumpido por las reacciones de

P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 15 | 34

terminacioacuten (reacciones 4-6) en las que se consumen los radicales Las interacciones

bimoleculares de radicales libres originan productos no-radicales muy estables (Rojano et al

2008) como el malodialdehido (MDA)

119877119867119896119894rarr 119877 + 119867 (1) Iniciacioacuten

119877 + 1198742 rarr 119877119874119874 (2) Propagacioacuten

119877119874119874 + 119877119867 rarr 119877119874119874119867 + 119877 (3)

119877 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 (4) Terminacioacuten

119877119874119874 + 119877119874119874 rarr 119877119874119874119877 + 1198742 (5)

119877 + 119877 rarr 119877 119877 (6)

En los alimentos con alto contenido de liacutepidos la etapa maacutes importante es la formacioacuten y

descomposicioacuten de los hidroperoacutexidos que generan una serie de compuestos oxidados como

cetonas aldehiacutedos alcanos y alquenos de bajo peso molecular y de alta volatilidad que a su vez

determinan el valor sensorial del alimento Este fenoacutemeno se denomina rancidez (Rojano et al

2008) El uso de antioxidantes puede retardar la rancidez pero no la detienen

Los agentes promotores e inhibidores de la oxidacioacuten se muestran en la Tabla 3 La reaccioacuten de

oxidacioacuten tambieacuten depende de la distribucioacuten de los liacutepidos en el alimento asiacute como de su aacuterea

de exposicioacuten (Badui 2006) Los metales de transicioacuten como el hierro cobre y cobalto pueden

catalizar la iniciacioacuten y aumentar la propagacioacuten de la autooxidacioacuten lipiacutedica

Tabla 3 Factores que influyen en la oxidacioacuten lipiacutedica

Promotores Inhibidores

Temperaturas altas Refrigeracioacuten Metales Cu Fehellip Secuestradores

Peroacutexidos de grasas oxidadas Antioxidantes Lipoxidasa Escaldado

Presioacuten de oxiacutegeno Gas inerte o vaciacuteo Luz ultravioleta Envase opaco Poliinsaturacioacuten Hidrogenacioacuten de aacutecidos insaturados

Fuente Badui (2006)

De los productos de la oxidacioacuten lipiacutedica secundaria los aldehiacutedos son compuestos clave ya que

reaccionan faacutecilmente con las proteiacutenas y pueden llegar a modificar sus caracteriacutesticas

organoleacutepticas y propiedades nutricionales

Meacutetodos para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en alimentos

La peacuterdida de los aacutecidos grasos soacutelo puede ser cuantificada en la uacuteltima etapa del proceso de

oxidacioacuten se puede cuantificar con el iacutendice del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) se fundamenta en la

deteccioacuten del malondialdehiacutedo (MDA) y de otros aldehiacutedos que se generan en la

descomposicioacuten oxidativa de los PUFA Los aldehiacutedos reaccionan con el aacutecido tiobarbituacuterico

P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 16 | 34

para rendir una especie cromoacutefora de color rosado que presenta un maacuteximo de absorcioacuten a 532

nm (Figura 9) El MDA es uno de los principales productos secundarios de la oxidacioacuten lipiacutedica

El meacutetodo TBARS se utiliza normalmente para medir los productos derivados de la oxidacioacuten

secundaria de los liacutepidos en sistemas musculares (Armenteros 2010)

No obstante el meacutetodo tiene alguacuten inconveniente como la falta de especificidad el TBA

reacciona con una variedad de aldehiacutedos no soacutelo con aquellos formados como resultado de la

peroxidacioacuten lipiacutedica el TBA produce compuestos amarillos con otros aldehiacutedos de forma que

la presencia de sacarosa y de aacutecidos interfiere en su medida y ademaacutes el MDA reacciona con

proteiacutenas lo cual reduce su concentracioacuten para su determinacioacuten (Badui 2006) Otros problemas

son que el MDA no es estable por largo periodos de tiempos que la teacutecnica es poco sensible a

bajas concentraciones de MDA (Navarro et al 2004)

Consecuencias

Los cambios asociados a la oxidacioacuten lipiacutedica constituyen la principal causa de deterioro de la

carne yo productos caacuternicos ya que provocan la aparicioacuten de olores y sabores desagradables y

la alteracioacuten del color y por lo que en general la calidad organoleacuteptica del producto Por tanto

producen una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne (Armenteros et al 2012) Asiacute mismo

dan lugar a una disminucioacuten del valor nutritivo de la carne y la generacioacuten de compuestos

potencialmente nocivos para la salud relacionados con el riesgo de padecer diversas patologiacuteas

Se cree que la ingesta de liacutepidos oxidados tiene un gran impacto sobre la salud del consumidor

y ademaacutes ciertos productos procedentes de la oxidacioacuten de liacutepidos estaacuten involucrados en el

desarrollo de enfermedades como el caacutencer y la cardiopatiacutea coronaria (Armenteros et al 2012)

253 Estrategias para combatir la oxidacioacuten

Hay diferentes estrategias para proteger las proteiacutenas del dantildeo oxidativo y asiacute mejorar la calidad

sensorial y el valor nutritivo de la carne y los productos caacuternicos Estas estrategias se dividen en

dos grupos estrategias ante mortem y post mortem (Esteacutevez et al 2012b) Las estrategias ante

mortem o nutricionales se aplican a traveacutes de la alimentacioacuten animal y consisten en enriquecer

los piensos en α-tocoferol y carotenoides incluyendo polifenoles en las dietas La alimentacioacuten

en extensivo mediante el uso de recursos naturales como bellotas y pasto contribuye a mejorar

la estabilidad oxidativa de las proteiacutenas caacuternicas y la calidad de la carne y productos caacuternicos

procesados Este fenoacutemeno se explica por el elevado contenido en tocoferoles de bellotas y

pasto

Las estrategias post mortem o tecnoloacutegicas se aplican directamente sobre el alimento

mediante dos procedimientos el primero es el envasado siendo un ejemplo el envasado al vaciacuteo

Figura 9 Reaccioacuten del aacutecido tiobarbituacuterico (TBA) con el MDA (Loacutepez et al 2014)

P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 17 | 34

que es efectivo para proteger a las proteiacutenas caacuternicas del dantildeo oxidativo El segundo es la

aplicacioacuten de ingredientes o aditivos con actividad antioxidante como por ejemplo los

compuestos fenoacutelicos que pueden actuar neutralizando radicales libres donando un aacutetomo de

hidroacutegeno y actuando como quelantes de metales e inhibiendo su accioacuten pro-oxidante Pero las

formas oxidadas de los compuestos fenoacutelicos promueven la desaminacioacuten oxidativa que lleva a

su carbonilacioacuten (Esteacutevez et al 2012b)

P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 18 | 34

3 OBJETIVOS Y PLANTEAMIENTO EXPERIMENTAL

Los objetivos del presente trabajo final de maacutester fueron

Puesta a punto de las teacutecnicas para determinar la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en

muestras de carne de potro

Estudiar la influencia de la temperatura (2 y 8 degC) y el tiempo de conservacioacuten (0 4 8 y

12 diacuteas) sobre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica en filetes de carne de potro conservados a

vaciacuteo

P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 19 | 34

4 MATERIAL Y MEacuteTODOS

41 Disentildeo experimental

Para este estudio se emplearon once potros cruzados entre la raza equina Caballo Gallego de

Monte y la raza equina Burguete de Navarra Los animales cruzados se criaron en la granja Marco

da Curra (A Coruntildea Galicia Espantildea) situado a 650 m de altitud Los potros nacieron entre los

meses de abril a julio de 2014 y fueron destetados a los 6 -7 meses Eacutestos fueron criados

libremente con sus madres de forma que pudieron pastar ad libitum y a continuacioacuten fueron

alimentados en pastos en pastoreo rotativo en campos con semillas La vegetacioacuten estaba

compuesta de semillas (Lolium perenne y Trifolium repens) y de hierba (Agrostis spp Lotus

corniculatus Holcus lanatus Bromus mollis Pseudoarrenatherum longifolium etc) Los potros

fueron terminados en pastoreo y durante un promedio de 104 diacuteas fueron alimentados con

pienso convencional (Tabla 4) que se fue incrementado gradualmente la cantidad de pienso

administrado hasta llegar a los 2 kg por animal y diacutea

Tabla 4 Ingredientes y composicioacuten quiacutemica y de aacutecidos grasos del pienso

Ingredientes ()

Avena 300 Maiacutez 155 Cebada 300 Soja 100 Salvado 80 Glicerol 40 CaCO3 10 CaHPO4 05 Sal 05 Nucleo vit 05 Salmocid 01

Composicioacuten quiacutemica ()

Proteiacutena bruta 131 Fibra bruta 63 Grasa bruta 32 Ceniza bruta 49 Lisina 06 Metionina 02 Calcio 07 Fosforo 05 Sodio 03 Magnesio 02

Composicioacuten de los aacutecidos grasos ()

C140 018 C160 1578 C180 210 C161 018 C181 3128 C182 4502 C183 299

P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 20 | 34

42 Sacrificio de los animales

Los potros se sacrificaron en el antildeo 2015 con 13 meses de edad (peso medio de 270 kg) Fueron

sacrificados en un matadero autorizado a 50 km de la explotacioacuten en una planta comercial Los

animales fueron aturdidos por el meacutetodo de la bala cautiva de acuerdo con la normativa vigente

de la UE (Directiva del Consejo de la Unioacuten Europea 95221EC) Despueacutes del sacrificio las canales

se enfriaron durante 24 h en una habitacioacuten convencional a 0 degC y un 98 de HR Una vez en la

sala de despiece (Figura 10 y 11) se extrajo el muacutesculo Longissimus dorsi de cada canal (Figura

12 y se cortoacute en filetes de 25 cm de grosor (Figura 13)

Figura 10 Media canal de potro cruzado Burguete x Gallego de Monte madurada 24 h

P aacute g i n a 21 | 34

Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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Figura 11 Recepcioacuten de las canales a la sala de despiece

Figura 12 Lomos obtenidos tras el despiece

Figura 13 Filete del Longissimus dorsi

43 Condiciones de almacenamiento

Los filetes de potro fueron cortados de manera aseacuteptica y se envasaron en condiciones de vaciacuteo

(99) (FRIMAQ V-900 Lorca Espantildea) Estos se separaron en dos grupos uno para mantenerlo

a 2 degC y el otro a 8 degC Para cada uno de los lotes se emplean 4 filetes para los 4 tiempos de

conservacioacuten correspondientes a los 0 4 8 y 12 diacuteas de estudio y se emplearon dos

P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 22 | 34

temperaturas (2 degC y 8 degC) de refrigeracioacuten para cada uno de los diacuteas de estudio Los filetes se

mantuvieron durante el tiempo de conservacioacuten a temperatura de refrigeracioacuten y

posteriormente se procedioacute a su congelacioacuten hasta la realizacioacuten del anaacutelisis

44 Meacutetodo analiacutetico

Oxidacioacuten proteica

Los carbonilos proteicos medidos como el contenido de carbonilos totales se cuantificaron

siguiendo el meacutetodo descrito por Oliver Ahn Moerman Goldstein y Stadtman (1987) y

modificado por Vuorela et al (2005) Las muestras de carne se homogenizaron en 20 ml de 06

M NaCl durante 60 s usando el Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) Se cogieron dos

aliacutecuotas del homogenizado (01 mL) y se transfirieron a viales Eppendorf Las proteiacutenas se

precipitaron con aacutecido tricloroaceacutetico (TCA) al 10 (1 mL) y se centrifugaron durante 5 min a

10000 g A uno de los pellets se le tratoacute con 2N HCl (1 mL) para cuantificar las proteiacutenas y al otro

con 24- dinitrofenilhidrazina (DNPH) al 02 en HCl 2 M (1 mL) para cuantificar los carbonilos

Las muestras se incubaron durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente agitaacutendose

cada 20 minutos Despueacutes se antildeadioacute TCA al 10 (08 mL) se agitaron en vortex (Vortex Mixers

ZX3 Velp Scientifica) durante 30 s y se dejaron reposar durante 15 min a una temperatura de 0

- 4 degC Se centrifugaron durante 5 min a 10000 g y se eliminoacute el sobrenadante El pelet se lavoacute

dos veces con 1 mL de etanol-acetato de etilo (11 vv) y se secoacute con N2 gas Finalmente el pelet

se disolvioacute con 15 mL de 20 mM fosfato soacutedico 6 M en un buacuteffer de hidrocloruro de guanidina

y se agitoacute y centrifugoacute durante 5 min a 10000 g para precipitar los fragmentos insolubles El

contenido de proteiacutenas se calculoacute con la absorbancia a 280 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con

detector de diodos Shimadzu UV-2101PC) usando como estaacutendar la albuacutemina de suero bovino

El contenido de carbonilos se expresoacute como nmol de carbonilos por miligramo de proteiacutena

usando un coeficiente de extincioacuten de 210 mM-1 cm-1 a 370 nm

Oxidacioacuten lipiacutedica

La estabilidad lipiacutedica se evaluoacute con el meacutetodo propuesto por Vyncke (1975) con alguna

variacioacuten Se cogioacute una muestra de 2 gramos y se picoacute se antildeadioacute 10 mL de TCA 5 y se

homogenizoacute con Ultra-Turrax (IKA T25 digital ULTRA-TURRAX) durante 1 min (11500 rpm) El

homogenizado se mantuvo a - 10 degC durante 10 min y se centrifugoacute a 5000 rpm durante 10 min

a 4 degC El sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-lab nordm 1246 sobre hielo Se cogioacute 1 mL del filtrado

y se hizo reaccionar con 1 mL de TBA al 002 M y se incuboacute en bantildeo de agua a 96 degC durante 40

min Se enfriaron los tubos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 4 minutos a 20 degC La

absorbancia se midioacute a 530 nm (Espectrofotoacutemetro UVvis con detector de diodos Shimadzu

UV-2101PC) Los valores de los TBARS fueron calculados a partir de una curva patroacuten de 11-33

tetraetoxipropano (TEP) y expresado como mg MDAkg muestra

P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 23 | 34

45 Anaacutelisis estadiacutestico

Para el anaacutelisis estadiacutestico de los resultados se realizoacute un anaacutelisis de la varianza (ANOVA) usando

el Modelo Lineal General mediante el programa IBM-SPSS versioacuten 23 para Windows para todas

las variables consideradas siguiendo el siguiente modelo

119884119894119895119896 = micro + 119879119894 + 119879119862119895 + (119879119909119879119862)119894119895 + Ɛ119894119895119896

donde

Yijk valores de oxidacioacuten proteica y lipiacutedica para los diferentes tiempos de conservacioacuten

y temperaturas

micro media de la poblacioacuten considerada

Ti efecto de la temperatura de refrigeracioacuten (i = 1 2 degC i = 2 8 degC)

TCj efecto del tiempo de conservacioacuten (j = 1 diacutea 0 j = 2 diacutea 4 j = 3 diacutea 8 j = 4 diacutea 12)

Ɛijk error residual aleatorio

Se completa el estudio mediante comparaciones muacuteltiples post hoc con el procedimiento HSD

de Tukey El nivel de significacioacuten utilizado es del 5 (P lt 005)

P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 24 | 34

5 RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

51 Puesta a punto de las teacutecnicas

511 Oxidacioacuten proteica

Se han modificado unos pasos de la teacutecnica original para su optimizacioacuten Cuando se tomaban

las aliacutecuotas de 100 microl de la muestra homogenizada se cogiacutea el volumen adecuado en una

micropipeta y se pesaba en una balanza de precisioacuten para comprobarlo ya que un miacutenimo error

en este paso suponiacutea grandes variaciones en los resultados finales

Se decidioacute incrementar la fuerza gravitacional de 5000 g a 10000 g ya que cuando se eliminaba

el sobrenadante parte del pelet era arrastrado con eacutel Al subir la fuerza centriacutefuga el

sobrenadante saliacutea limpio En el meacutetodo de referencia (Oliver et al 1987) especificaba poner

las centriacutefugas a 4 degC no obstante en la modificacioacuten de Vuorela et al (2005) no estaba

especificada Teniendo en cuenta otros trabajos que tambieacuten indicaban la centriacutefuga a 4 degC

(Tenas 2012) se optoacute por hacerlo a esta temperatura

Otra paraacutemetro que se modificoacute fue reducir el nuacutemero de lavados con etanol y acetato de etilo

ya que seguacuten Vuorela et al (2005) se podiacutean hacer 2 o 3 lavados se compararon los resultados

haciendo dos y tres lavados y teniendo en cuenta que los resultados no mostraron diferencias

se procedioacute a realizar en las muestras dos lavados

512 Oxidacioacuten lipiacutedica

Anteriormente el meacutetodo empleado en el laboratorio para determinar la oxidacioacuten lipiacutedica en

carne era el TBARS descrito por Tarladgis et al (1960) Para este experimento se empleoacute el

descrito por Vyncke (1975) del cual se han modificado algunos pasos

Debido a que la carne de potro es muy sensible a la oxidacioacuten a la hora de pesar la muestra se

dejaban los tubos en hielo y se homogenizaban con el hielo pero en lugar de 2 minutos el tiempo

empleado fue de 1 minuto a 11500 rpm Las revoluciones de la centrifuga se subieron de 3500

rpm a 5000 rpm para tener un pellet maacutes compacto y recoger mejor el sobrenadante El

sobrenadante se filtroacute con filtro Filter-Lab nordm 1249 que hace una raacutepida filtracioacuten ya que el poro

es de 20-25 micro sin embargo con este filtro el filtrado obtenido conteniacutea parte del precipitado

Por esto se cambioacute al filtro Filter-Lab nordm 1246 que es de filtracioacuten lenta con un poro de 1-3 microm

y se obteniacutea un filtrado limpio Por uacuteltimo antes de leer la absorbancia se hace una

centrifugacioacuten de 10000 rpm 4 min a 20 degC para precipitar por si hubiera alguacuten solido en

suspensioacuten

52 Oxidacioacuten proteica

Los resultados del presente trabajo muestran que no hubo efecto de la temperatura de

refrigeracioacuten (2 degC y 8 degC) para las muestras a todos los tiempos (P = 0983) Sin embargo el

tiempo de conservacioacuten siacute que mostroacute un efecto en la formacioacuten de carbonilos proteicos (P =

0013) Por uacuteltimo no se observoacute interaccioacuten entre el tiempo de conservacioacuten y la temperatura

(P = 0242)

P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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P aacute g i n a 25 | 34

La evolucioacuten del contenido de carbonilos durante el almacenamiento a diferentes temperaturas

se muestra en la Tabla 5 Las concentraciones iniciales de carbonilos fueron de 221 nmol

carbonilosmg proteiacutena En el diacutea 4 el valor fue de 186 que no difirioacute del valor de diacutea 8 (190

nmol carbonilosmg proteiacutena) pero estos dos fueron menores que en a diacutea 12 (245 nmol

carbonilosmg proteiacutena) y diacutea 1 La evolucioacuten de los carbonilos no mostroacute un patroacuten claro a lo

largo del tiempo de conservacioacuten Este aumento de los carbonilos en las muestras indicariacutea que

las reacciones oxidativas tuvieron lugar durante el almacenamiento a refrigeracioacuten

Tabla 5 Evolucioacuten de la oxidacioacuten proteica (nmol carbonilosmg proteiacutena) para las dos

temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio ab las letras diferentes indican diferencias estadiacutesticamente significativas (P lt 005) entre las filas

En general en los tejidos musculares no oxidados el contenido de carbonilos es de 1 nmolmg

proteiacutena mientras que en tejidos oxidados puede oscilar desde 2 hasta 14 nmolmg proteiacutena

dependiendo de varios factores como la iniciacioacuten de la oxidacioacuten el tipo de muacutesculo y la

solubilidad de la proteiacutena (Rowe et al 2004) Por tanto podriacuteamos decir que la carne analizada

tiene un cierto grado de oxidacioacuten Se debe considerar que al estar envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten disminuya Xiao et al (2011) vieron que en carne de pollo envasada al vaciacuteo la

oxidacioacuten proteica y lipiacutedica se reduciacutea significativamente Zakrys et al (2012) encontraron

diferencias en el contenido de carbonilos en carne de bovino (MAP y vaciacuteo) ya que el oxiacutegeno

en muestras de carne MAP favorece una mayor formacioacuten de enlaces disulfuro y la oxidacioacuten de

proteiacutenas Ademaacutes Zakrys et al (2010) y Zakrys et al (2008) observaron en carne de ternera

que la oxidacioacuten proteica aumentoacute con el incremento de oxiacutegeno y el tiempo de conservacioacuten

Por tanto cabe esperar que al aumentar el tiempo de conservacioacuten aumente la oxidacioacuten ya

que los carbonilos proteicos se forman principalmente por la interaccioacuten entre las proteiacutenas y

los aldehiacutedos formados como resultado de la oxidacioacuten de los liacutepidos (Esteacutevez 2011)

El meacutetodo usado en este trabajo es el maacutes empleado para medir la oxidacioacuten proteica no

obstante el reactivo DNPH no reacciona soacutelo con los grupos carbonilos de las proteiacutenas sino que

tambieacuten puede reaccionar con los grupos carbonilos de los liacutepidos dando lugar a una

sobreestimacioacuten en la concentracioacuten total de carbonilos procedentes de proteiacutenas (Armenteros

2010) Ademaacutes los carbonilos son moleacuteculas que pueden seguir reaccionando y dar lugar a

compuestos diferentes como el aacutecido carboxiacutelico o productos de condensacioacuten aldoacutelica lo cual

explicariacutea que los valores sean menores a diacutea 4 y 8 de conservacioacuten Nuestros resultados estaacuten

de acuerdo con lo reportado por Lorenzo y Goacutemez (2012) y Goacutemez y Lorenzo (2012) que no

encontraron una tendencia clara en el contenido de carbonilos para muestras de potro

envasadas al vaciacuteo De hecho Lorenzo y Goacutemez (2012) en carne de potro envasada al vaciacuteo

obtuvieron valores iniciales en similares a los observados en este estudio (227 nmolmg

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM P-valor

0 4 8 12

2 221 plusmn 056 203 plusmn 038 205 plusmn 020 215 plusmn 040 012 0678

8 221ab plusmn 056 186b plusmn 043 190b plusmn 023 245a plusmn 047 013 0009

P aacute g i n a 26 | 34

proteiacutena) y tambieacuten a diacutea 14 que fueron 265 nmolmg proteiacutena Asiacute mismo observaron que

durante la conservacioacuten el contenido de carbonilos inicialmente aumentaba y disminuiacutea

posteriormente Este comportamiento tambieacuten fue descrito por otros autores para otras carnes

Gallo et al (2012) obtuvieron valores similares para carne de pollo con una oxidacioacuten maacutexima a

los 6 diacuteas de conservacioacuten con un valor de 3 nmol carbonilosmg proteiacutena y luego con una

tendencia decreciente Salminen et al (2006) observaron en carne de cerdo envasada al vaciacuteo

que la cantidad de carbonilos variaba a lo largo del tratamiento de 04 a 3 nmol carbonilosmg

proteiacutena donde el valor maacutes alto se observoacute el diacutea 6 y luego disminuyoacute No obstante hay alguacuten

estudio que no encontroacute diferencias en el contenido de carbonilos a lo largo del tiempo de

conservacioacuten como Lagerstedt et al (2011) que trabajoacute en filetes de ternera envasados al vaciacuteo

Como se ha comentado el dantildeo producido por la oxidacioacuten proteica tiene diversas

consecuencias funcionales como la disminucioacuten de la capacidad de retencioacuten de agua

emulsificante en las propiedades de gelificacioacuten y puede contribuir en parte al deterioro de la

calidad de la carne y de productos caacuternicos (Xiao et al 2011)

53 Oxidacioacuten lipiacutedica

El proceso de enranciamiento es conocido como un serio problema durante el almacenamiento

de los productos caacuternicos Seguacuten Greene y Cumuze (1982) el valor de TBA que produce olores

anoacutemalos en carnes es de 2 mg MA kg para un panel sensorial Otros autores como Papadima

et al (1999) indican que los productos caacuternicos con valores de TBA superiores a 1 mg son

considerados rancios Maacutes reciente Wood et al (2008) indicaron valores liacutemites de 05 mg de

MDAkg de carne

En la tabla 6 se muestran los valores obtenidos para la oxidacioacuten lipiacutedica expresada como mg de

MDAkg de carne para las diferentes muestras a 2 degC y 8 degC y para los cuatro tiempos de

conservacioacuten Se obtuvieron valores muy altos para diacutea 0 de 050 mg de MDAkg de carne A diacutea

4 hubo una disminucioacuten de los valores para las dos temperaturas de refrigeracioacuten (039 mg de

MDAkg de carne) Los valores de malonaldehiacutedo a diacutea 8 se incrementaron respecto al diacutea 4 y

fue de 044 mg de MDAkg de carne y a diacutea 12 volvioacute a aumentar llegando a valores de 048 mg

de MDAkg de carne

Tabla 6 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica (mg de MDAkg de carne) para las dos temperaturas a lo largo del tiempo

Valores medios plusmn desviacioacuten estaacutendar (n = 11)

EEM error estaacutendar medio

Los valores obtenidos no se ajustan al patroacuten de comportamiento esperado para la oxidacioacuten

lipiacutedica en carne En otros trabajos en los que se determina la oxidacioacuten lipiacutedica por el mismo

meacutetodo (TBARS) en carne de potro (Goacutemez y Lorenzo 2012 Lorenzo y Goacutemez 2012 Lorenzo et

Temperatura (degC) Tiempo conservacioacuten (diacuteas) EEM

0 4 8 12

2 050 plusmn 012 039 plusmn 007 044 plusmn 008 045 plusmn 010 003

8 050 plusmn 012 039 plusmn 005 044 plusmn 005 049 plusmn 008 002

P aacute g i n a 27 | 34

al 2014a) se observoacute una tendencia creciente en la oxidacioacuten respecto el tiempo de

conservacioacuten con valores iniciales en torno a 01 mg de MDAkg de carne llegando a valores de

038 mg de MDAkg de carne para diacutea 14

En la Figura 14 y 15 aparece representada la evolucioacuten del MDA a lo largo del tiempo de

conservacioacuten para las muestras conservadas a 2 degC y 8 degC respectivamente Se observoacute una alta

variabilidad de los datos dentro de un mismo grupo tanto para las muestras a 2 degC como las de

8 degC Los valores atiacutepicos para las muestras conservadas a 2 degC fueron el potro nuacutemero 10 a diacutea

4 y los potros 10 y 11 a diacutea 12 Para las muestras refrigeradas a 8 degC los atiacutepicos fueron los potros

nuacutemero 5 y 10 a diacutea 12

Figura 14 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 2 degC

Figura 15 Evolucioacuten de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras conservadas a 8 degC

P aacute g i n a 28 | 34

Por causa de la alta dispersioacuten de los datos sobre todo para diacutea 0 y por la no homogeneidad de

ellos no se aplicoacute el anaacutelisis estadiacutestico Con estas figuras (14 y 15) se ve que el comportamiento

de la oxidacioacuten lipiacutedica para las muestras es muy diferente por tanto seriacutea necesario hacer un

estudio maacutes profundo En este experimento una de las posibles causas de los valores iniciales

elevados y del comportamiento observado podriacutea ser que otras moleacuteculas como aldehiacutedos

sacarosa etc hubieran interferido en la cuantificacioacuten Pero ademaacutes se debe considerar que

uno de los objetivos del trabajo fue la puesta a punto de la teacutecnica por esto se deberiacutea seguir

trabajando para contrastar estos resultados preliminares y dar unos resultados concluyentes

Otra consideracioacuten a tener en cuenta es que la carne de potro es muy rica en PUFA por la

alimentacioacuten que han seguido los potros (pasto) tambieacuten es rica en hierro y en mioglobina

moleacuteculas susceptibles de la oxidacioacuten lipiacutedica y que van a acortar su vida uacutetil Tambieacuten se debe

tener en cuenta que la carne de potro estaacute poco estudiada pero hasta el momento se ha visto

que hay mucha variabilidad de un animal a otro alimentado y criado en las mismas condiciones

Por otro lado algunos estudios encontraron interaccioacuten entre la oxidacioacuten proteica y la

oxidacioacuten lipiacutedica en carne de potro durante el estudio de la vida uacutetil (Goacutemez y Lorenzo 2012

Lorenzo y Goacutemez 2012) sin embargo otros autores (Armenteros et al 2009) no han

encontrado una correlacioacuten Por ello con unos resultados contrastados seriacutea interesante

estudiar la posible relacioacuten entre la oxidacioacuten proteica y lipiacutedica

P aacute g i n a 29 | 34

6 CONCLUSIONES

A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo y en las condiciones de este

experimento se concluye que

Se ha realizado la puesta a punto de la teacutecnica para determinar el contenido de carbonilos

proteicos (meacutetodo del DNPH) optimizando algunos aspectos tales como la reproducibilidad

de los datos obtenidos

Se ha hecho la puesta a punto del meacutetodo del TBARS modificando algunos pasos con el fin

de obtener lecturas maacutes precisas

El efecto de la temperatura sobre la oxidacioacuten proteica de la carne de potro no ha mostrado

diferencias significativas para las muestras almacenadas a 2 degC y a 8 degC para el nivel de

significacioacuten establecido Esto implicariacutea la posibilidad de mantener la carne en los lineales

de refrigeracioacuten de los establecimientos alimentarias a una temperatura mayor de los 2 degC

El efecto del tiempo de conservacioacuten en la oxidacioacuten proteica de la carne estudiada ha

mostrado un cambio en la cantidad de carbonilos proteicos formados aunque no se aprecioacute

una tendencia creciente Esto podriacutea deberse a que los carbonilos son moleacuteculas muy

reactivas y se pueden transformar en otros productos Los valores obtenidos mostrariacutean un

cierto grado de oxidacioacuten de la carne No obstante al final del tratamiento (diacutea 12) no se

apreciaron valores muy altos de carbonilos esto se podriacutea deber a que tenemos las

muestras envasadas al vaciacuteo y este tipo de envase reduce la oxidacioacuten tanto proteica como

lipiacutedica y por tanto aumenta la vida uacutetil en la carne

En cuanto a la oxidacioacuten lipiacutedica se deberiacutea seguir estudiando y profundizar maacutes ya que los

resultados obtenidos no siguen el patroacuten esperado y comparaacutendolo con otros estudios de

potro son muy altos a diacutea 0 y los valores tienen una alta variabilidad

P aacute g i n a 30 | 34

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