Autor: FERNANDO MENDEZEFECTOS DE BACTERIA TIPO RHIZOBIUM EN JITOMATE SALADETTE.

OBJETIVOS:

- Observar los efectos de la bacteria rhizobium meliloti obtenida de la raíz de alfalfa en jitomate saladette.

- Observar si la bacteria se muestra compatible con el jitomate.- Cualificar y cuantificar los cambios en cuanto a rendimiento físico de la planta de

jitomate infectada vs. Semillas normales.- Concluir si es beneficiosa la infección de la rhizobium melitoli en la producción de

jitomate.

INTRODUCCION:

El jitomate en México forma parte fundamental de la dieta de sus habitantes, a pesar de que un alto por ciento de los suelos mexicanos son pobres en nutrientes esenciales (Coronado et al., 1995), como el nitrógeno (N), necesario para la síntesis de proteínas y clorofila, por ello se requiere aplicar fertilizante nitrogenado. En general la reserva de N en la naturaleza como N2 es del 70%, aunque las plantas solo lo absorben y asimilan como amonio y/o nitratos, de ahí la necesidad de usar esta clase fertilizantes químicos (Alexander, 1980), los que aplicados irracionalmente, tienen un elevado costo, una acción desgastadora del suelo y contaminan el ambiente. Lo anterior obliga a buscar alternativas de solución que reduzcan su uso, pero que mantengan el rendimiento del cultivo vegetal.

Se considera que la fijación biológica del nitrógeno (FBN) es una de las alternativas mas viables para recuperar N en el ecosistema (Kimball, 1980), se ha estimado que 175 millones de toneladas/año se fijan biológicamente, del cual el 70% va al suelo (Burity et al., 1989) y de éste, el 50% proviene de asociaciones nodulares como las causadas por Rhizobium (Carrera et al., 2004; Long, 1989).

La FBN es una ventaja para las leguminosas ya que pueden tomar nitrógeno del aire a través de la simbiosis con Rhizobium (Luna y Sánchez-Yáñez, 1991; Sanaratne et al., 1987). Esta es una manera de reducir la cantidad del N derivado de fertilizantes al incrementar la proporción de N 2

fijado vía Rhizobium. Por eso se asegura el máximo beneficio de la asociación mediante el establecimiento de una bacteria que reúna cualidades de competencia y efectividad para fijar N2

en las raíces de la leguminosa. En los suelos agrícolas la asociación Rhizobium-leguminosa es la más importante fuente de N, pues se ha reportado que en las leguminosas noduladas, bajo determinadas condiciones ambientales (suelos pobres en este elemento), pueden fijar hasta los 100 kg N2/Ha/año (FAO, 1995). Este mecanismo provee la demanda del N para satisfacer las necesidades nutricionales más importantes de la planta.

El propósito de está revisión es proporcionar información esencial sobre la asociación Rhizobium-leguminosa y su potencial como inoculante en producción agrícola, en un marco del uso razonable de los recursos naturales sin daño ambiental.

Fijación biológica del nitrógeno.

La FBN es un proceso exclusivo de algunos procariotes para usar el N2 del aire y reducirlo a amoniaco con la enzima nitrogenasa, (Kimball, 1980) para la síntesis de proteínas. De acuerdo con el mecanismo bioquímico para obtener la energía que les permita fijar el N2 existen bacterias fotoautotróficas, quimiolitotróficas y heterotróficas de vida libre en el suelo, asociados o en simbiosis en las hojas y/o raíces de plantas. El ejemplo más conocido e investigado incluso

a nivel molecular (Vanderleyden y Pieternel, 1995), es la relación entre las leguminosas y Rhizobium. Aunque los dos simbiotes pueden supervivir independientemente, solo cuando la bacteria coexiste íntimamente con la leguminosa se da la fijación del N2 (Sandowsky et al., 1995).

Potencial de la asociación rhizobium-leguminosa

Bajo condiciones favorables, leguminosas como haba y chícharo pueden utilizar el 80-90% de sus requerimientos de nitrógeno a través de la fijación simbiótica, mientras que la soya obtiene del 40 al 60% (Sánchez-Yáñez, 1997). En experimentos realizados con R leguminosarum en haba, lenteja y soya se incrementó significativamente la nodulación, el peso seco de las leguminosas, su contenido en nitrógeno y su rendimiento (Carrera et al., 2004).

Los simbiotes

La bacteria Rhizobium es un bacilo corto algunas veces pleomorfico, Gram negativo, aerobio, no forma espora, móvil por flagelos perítricos o un solo flagelo lateral (FAO, 1995). Pertenece a la familia Rhizobiacea, este es un género heterótrofo, común en el suelo, su temperatura óptima de crecimiento en condiciones artificiales es de 25oC y su tolerancia al pH entra de 5 a 8. La base para su clasificación es su capacidad para nodular con leguminosas específicas (Kimball, 1980). El nódulo es una hipertrofia de la raíz, un órgano especializado donde se realiza la fijación del N2 (Sanaratne et al., 1987). Existen tres géneros de esta familia: Rhizobium, Bradyrhizobium (Badar y Moawad, 1991) y Azospirillum (Burity et al., 1989) de clara diversidad genética entre sí, por ello es bien conocido que los tres géneros están lejanamente relacionados (Vanderleyden y Pieternel, 1995).

Las leguminosas son angiospermas del phyllum Rosaseae y se clasifican en las subfamilias: Mimosoidea, Caesalpinoidea y Papilionoidea (Long, 1989), esta es una familia diversificada que incluye árboles, arbustos, plantas herbáceas y cultivadas para el consumo humano, la ganadería y la industrial (maderas, aceites), etc. Otras especies no cultivadas son importantes en la naturaleza, pero solo 20 especies de la familia Papilionoideae son de consumo humano. En las familias existen géneros que forman nódulos, pero el porcentaje de nodulación es diferente y dependiente de sus características genéticas, ya que el genotipo de la planta en las raíces, restringen la nodulación (Thies et al., 1992).

Simbiosis rhizobium-leguminosa

El establecimiento de la simbiosis para atrapar el N2 entre Rhizobium y la leguminosa es un proceso complejo, donde la formación de nódulos la captación del N2 se da en etapas sucesivas. Rhizobium induce en la leguminosa el desarrollo de nódulos en su raíz, los dos organismos establecen una cooperación metabólica, las bacterias reducen N2 a amonio (NH4), el cual exportan al tejido vegetal para su asimilación en proteínas y otros compuestos nitrogenados complejos, las hojas reducen el C02 en azúcares durante la fotosíntesis y lo transportan a la raíz donde los bacteroides de Rhizobium lo usan como fuente de energía para proveer ATP al proceso de inmovilizar N2.

La asociación se inicia con el proceso de infección, cuando las bacterias son estimuladas por los exudados radicales y proliferan lo que induce un alargamiento y curveado de los pelos radicales y posterior formación de una estructura tubular llamada cordón de infección (Long, 1989). Este se desarrolla en el interior del punto de adhesión a la bacteria y forma un canal en en interior del pelo. Rhizobium es conducido a través del cordón hasta la base del pelo (Burity et al., 1989). El cordón de infección atraviesa la pared de la célula cortical adyacente, ahí al perder la pared celular, se establece Rhizobium; después se engloba por la membrana plasmática del hospedero, lo que resulta en la formación del nódulo. Las bacterias y las células de la corteza radical se diferencian y comienza la fijación simbiótica del N2 y el intercambio metabólico fijado el N2, se

transporta rápidamente del nódulo al resto de la planta. La reducción de N2 molecular a amonio, se lleva a cabo por la nitrogenasa, que requiere ATP y de la leghemoglobina, una proteína globular cuya función es atrapar el oxígeno para facilitar el trabajo de la nitrogenasa, además de transferir 02 y estimular la oxidación de la reserva del carbono, cubrir el alto gasto de energía que Rhizobium requiere para incorporar el N2. La leghemoglobina es codificada por un gen de la leguminosa, esta proteína se localiza en el nódulo fuera de la bacteria y es distinta para cada tipo de Rhizobium.

Inoculación

A pesar de que Rhizobium es un habitante común en los suelos agrícolas, frecuentemente su población es insuficiente para alcanzar una relación benéfica con la leguminosa, o bien cuando los rhizobios nativos no fijan cantidades suficientes de N2 para las leguminosas es necesario inocular la semilla a la siembra y asegurar la fijación biológica del N2.

La utilización de un Rhizobium infectivo (capacidad de nodular) y efectivo (eficiencia para la fijación del N2) en la leguminosa, implica determinar la necesidad de inoculación. Para ello se corrobora la existencia del tipo de Rhizobium nativo en el suelo, su eficiencia para fijar N 2, la concentración de N del suelo y si la leguminosa elegida se siembra con frecuencia en la región para mantener su rendimiento. Lo ideal es seleccionar un Rhizobium altamente infectivo y efectivo para lograr una disminución máxima del fertilizante nitrogenado sin decremento en el rendimiento de la leguminosa.

En general, la inoculación se puede recomendar para una zona agrícola que se sembrará con una nueva especie de leguminosa. Para controlar la calidad de un inoculante de una leguminosa específica, es necesario mantener un número de Rhizobium de aproximadamente 106 bacterias/g de inoculante (FAO, 1995) y determinar si es específico para la leguminosa a prueba. Así, un producto microbiano o inoculante, debe por lo menos mantener la productividad de un cultivo agrícola con menos dosis de fertilizante nitrogenado y con ello un ahorro en el costo de producción, minimizar la contaminación de aguas superficiales y mantos acuíferos y por supuesto la conservación del suelo, en un esquema de producción sustentable.

Existen varios tipos de inoculantes, pero el más común es un soporte a base de turba impregnada con un cultivo bacteriano. A pesar de que desde 1880 los inoculantes han sido comercializados, como un producto biológico requiere de un riguroso control de calidad de tipo microbiológico que garantice el éxito esperado con la leguminosa seleccionada. Ya que un manejo inadecuado en su producción y manejo trae en consecuencia una baja efectividad al aplicarse en la leguminosa, debido a (Sánchez-Yáñez, 1997):

1. Deficiente preparación a nivel de laboratorio, manejo, almacenamiento a nivel de comercialización y aplicación del inoculante por parte de los fabricantes, comerciantes y agricultores.

2. Incompatibilidad del tipo de Rhizobium comercial y la leguminosa seleccionada. 3. Condiciones adversas para la infección y la actividad bacteriana, como concentraciones

elevadas de N, metales pesados y antagonismo microbiano nativo del suelo no de se pretende aplicar.

Actividad del Rhizobium nativo del suelo contra el introducido, en general por que los rhizobios autóctonos son infectivos, pero no son eficientes en la fijación de N2. Por lo cual para mejorar el rendimiento de soya y otras leguminosas, ha sido necesario seleccionar un nativo altamente infectivo y efectivo y ademas agregar pequeñas cantidades de fertilizante nitrogenado, aproximadamente 20 kg N/Ha, lo cual estimula la nodulación, para alcanzar hasta un 70-75% de nitrógeno fijado proveniente de la atmósfera (Thies et al., 1992); este fenómeno depende de la interacción entre los genotipos del hospedero y el tipo de Rhizobium, mientras que con altas

concentraciones de fertilizante nitrogenado, se inhiben la fijación simbiótica del nitrógeno (Tamez y Peña-Cabriales, 1989).

PROCEDIMIENTO:

1ª Parte ( extracción y propagación)- Se desenterraron plantas de alfalfa cuidando que la raíz no fuese dañada.- Las raíces se examinaron en busca de nódulos que nos indicaría la presencia de la

bacteria.- Los nódulos se extrajeron, se lavaron y se pulverizaron en agua destilada en una

campana de propagación.- Se preparo un medio de cultivo rico en nitrógeno para la propagación de la bacteria.- La solución de nódulos se embarró cuidadosamente formando zurcos en el medio de

cultivo, el medio de cultivo se cerró y selló.- La sepa se mantuvo durante una semana a 18C.

2ª Parte ( inoculación).- Se lavaron con hipoclorito .5M las semillas de jitomate.- Se enjuagaron con agua destilada.- Se preparó una solución de agua destilada con nuestra bacteria propagada en la cual se

introdujeron 20 semillas de jitomate durante 20 min.- Las semillas se secaron para quedar listas para la siguiente parte experimental.

NOTA: para mayor rendimiento se utilizaron semillas certificadas.

3ª parte (almácigo)- Las semillas se llevaron a germinar a un almácigo con agrolita donde serían

almacenadas hasta alcanzar 5cm de tallo.- Se preparo un control de semillas normales o sin infectar que fueron lavadas y puestas

en almácigo.4ª Parte (transplante a sistema hidropónico y control de crecimiento).

- Se prepararon cilindros de PVC con ventanas de 10cm x 10cm intermitentes a 120º, de manera de que se almacenaran individualmente las semillas, el sustrato fue arena, y se irrigó con sistema de goteo a gasto volumétrico de 2lt/dia con una solución ideal que contiene:

Nota: Los cilindros fueron pesados a manera de calcular el diferencial de biomasa entre los tipos de semilla.

COMPUESTO GRAMOSNitrato de calcio 23Nitrato de potasio 11.7Fosfato mono potásico 5.5Sulfato de magnesio 12

- Se dejaron crecer manteniendo un control semanal de longitud del tallo y cantidad de biomasa.

- El experimento se tomó 14 semanas.

Resultados.

Se extrajeron los nódulos y se llevaron a la campana de propagación para cultivar la bacteria rhizobium melitoli.

IMAGEN 1: Nos muestra la campana de propagación, la

cual avienta aire para que otros microorganismos no invadan nuestro medio de cultivo.

IMAGEN 2: Nos muestra los medios de cultivo en donde

se propagó la bacteria rhizobium melitoli. En ellos se observó una propagación efectiva, lo que los mostraba que efectivamente en los nódulos de alfalfa se encontraba la bacteria buscada.

IMAGEN 3. Aquí se almacenó el medio de cultivo para su propagación a 18C.

IMAGEN 4. Muestra que las semillas infectadas y las semillas control crecieron en una semana a 5cm de tallo, lo que no nos muestra aún ningún beneficio de la bacteria inoculada.

Las semillas fueron transplantadas en los cilindros hidropónicos para su crecimiento.

IMAGEN 5. Muestra la figura del cilindro hidropónico con las plántulas transplantadas a la tercera semana.

IMAGEN 6. Nos muestra uno de los cilindros hidropónicos donde se sembró la plántula ya con maduración de 8 semanas.

Los datos obtenidos en cuanto a longitud de tallo y cantidad de biomasa fueron los siguientes:

TABLA DE MEDIA DE LONGITUD EN CENTIMETROS DE SEMILLAS INFECTADAS.

SEMANAMEDIA (cm)

1 5,22 63 8,94 12,85 20,76 27,87 32,98 39,69 45,210 52,711 55,912 60,813 67,214 73,5

TABLA DE MEDIA DE LONGITUD EN CENTIMETROS DE SEMILLAS CONTROL.

SEMANAMEDIA (cm)

1 5,32 6,13 7,24 10,15 19,16 23,57 28,28 32,19 36,110 42,411 48,112 53,113 57,214 60,9

CRECIMIENTO

0

20

40

60

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

SAMANA

LO

NG

ITU

D E

N C

M

GRAFICO 1: Nos indica la forma en que el crecimiento se llevó a cabo, la línea superior pertenece a las semillas infectadas y la inferior a las semillas control.

SEMANA INFECTADAS CONTROL1 12 11,32 15 143 30 294 69 525 110 916 140 1207 190 1508 239 1939 298 23010 340 25411 389 29212 450 31013 520 35614 610 382

TABLA 3. Nos muestra la evolución de cantidad de biomasa medida en gramos tomada cada semana durante las 14 semanas.

BIOMASA EN GRAMOS

0100200300400500600700

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

SEMANA

GR

AM

OS

GRAFICO 2. Nos muestra el incremento de biomasa (sin contar los frutos obtenidos en la semana 12 y 13 respectivamente) la línea superior pertenece a las semillas infectadas y la inferior al control.

Se observo que las semillas infectadas con rhizobium obtuvieron una semana antes sus frutos con respecto al control, aunque a simple vista no resultaron ser mejores, ni peores. Aunque mostró un incremento en la producción de 1,2kg a 1,8kg en racimo.

IMAGEN 7. Nos muestra que se observo una alta calidad en los frutos obtenidos por los cultivos infectados con rhizobium.

DISCUSION DE RESULTADOS:

- La velocidad de crecimiento observado en los resultados por parte de las semillas infectadas es explicable ya que gracias a la fijación de nitrógeno extra por parte de la planta esta activa sus metabolismos, formando almidones que le permite incrementar su biomasa.

- Al observar que las platas infectadas obtuvieron productos más rápido y en mayor cantidad que las plantas control, se atribuye directamente a la fijación de nitrógeno ya que gracias a ella la planta puede llegar a formar las proteínas necesarias para la formación de frutos, además de que estos podrían contener un mayor índice nutrimental, pero eso solo se sabría al llevar los fruto a un análisis por electroforesis.

- Se escogió la técnica de hidroponía para asegurarnos que los dos tipos de plantas recibieran los mismos nutrientes en cantidad y variedad, y se observara si realmente la fijación de nitrógeno es más efectiva en las plantas infectadas, además de abrir la posibilidad de que las mismas lo tomaran del aire, siendo reducido a amonio por las bacterias rhizobium. Otro aspecto importante sería el no exponer a las plantas a otro tipo de bacterias contenidas en el suelo que alteraran el rendimiento.

- Al ser el tejido celular y las características físicas diferentes el jitomate de la alfalfa se piensa que el rendimiento no fue total, aún así gracias al alto índice de infección del rhizobium melitoli se pudieron observar resultados, aunque no se podrían llevar a nuevas generaciones de la planta a menos que se lleve a cabo otra inoculación en las semillas hijas, por lo tanto el rendimiento podría incrementarse modificando genéticamente el jitomate con los genes del rhizobium lo que nos ahorraría el proceso de inoculación y nos proporcionaría plantas capaces de fijar nitrógeno por ellas mismas.

- La planta infectada creó nódulos en contacto con la solución y se encontró mediante espectrofotometría que en sistemas hidropónicos la planta absorbió un 20% mas de nitratos que las plantas control, por lo que la formación de nódulos de rhizobium no solo absorben nitrógeno del aire sino también del sustrato en forma de nitratos.

CONCLUSION:- El efecto simbiótico del rhizobium en plantas de jitomate es claro según los resultados de la práctica, se logró observar un incremento en crecimiento y producción, por lo cual es lógico pensar en que el aprovechamiento de esta técnica traería grandes beneficios a la agricultura en nuestro país.

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