efectos de metal en expresiÓn de factores de …
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Profesor Patrocinante
Dr. Gudrun Kausel Instituto de Bioquímica y
Microbiología
Facultad de Ciencias
"EFECTOS DE METAL EN EXPRESIÓN DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN GLÁNDULA PITUITARIA DE
Cyprinus carpio "
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
ANDRÉS SEBASTIÁN ALEJANDRO PÉREZ BRIONES
VALDIVIA – CHILE
2012
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Gudrun Kausel por todo el tiempo que me brindó, por su paciencia y por
inculcarnos el amor a la ciencia. Al Dr. Jaime Figueroa por sus enseñanzas, anécdotas y buena
disposición.
A los integrantes de LabBMP, Denise, Tamara, Adolfo, Mary, Carlos, Matias, Pablo y
Danae por hacer del laboratorio un buen ambiente de trabajo. Muy en especial a mis amigos
Fernando que siempre me dio ánimo para continuar, a mi colega Guillermo que hicimos de
esta tesis una aventura y a Bárbara que en los mejores y peores momentos estuvo a mi lado.
Esta tesis está dedicada a mi madre y hermanos por quienes nunca dejaré de luchar.
Gracias al apoyo de toda mi familia que estuvo presente en el transcurso de la carrera, Norma,
Nancy, Lissete, Humberto, Rodolfo y Ana.
Esta tesis fue posible gracias al apoyo de Fondecyt 1070724.
i
INDICE GENERAL
1. RESUMEN 1
SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN 3
3. MATERIALES Y MÉTODOS 9
3.1 MATERIALES 9
3.1.1 Reactivos 9
3.1.2 Soluciones 10
3.1.3 Instrumentos 11
3.1.4 Kits 13
3.1.5 Animales de experimentación 13
3.2 MÉTODOS 13
3.2.1 Tratamiento de peces y preparación de muestras 13
3.2.2 Extracción y caracterización de ácidos nucleicos 15
3.2.2.1 Preparación de RNA total 15
3.2.2.2 Preparación de DNA plasmidial. 16
3.2.2.3 Cuantificación de ácidos nucleicos 17
3.2.2.4 Caracterización de ácidos nucleicos en geles de agarosa 17
3.2.3 Síntesis de cDNA 18
3.2.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 18
3.2.5 PCR en tiempo real 19
3.2.6. Clonamiento de un producto de PCR 20
ii
3.2.6.1 Reacción de ligación del producto de PCR en un vector
de DNA plasmidial 20
3.2.6.2 Preparación de células competentes JM109 20
3.2.6.3 Transformación de células competentes 21
3.2.6.4 Almacenamiento de clones bacterianos en glicerol 23
3.2.7. Preparación de anticuerpos mediante oligopéptido 23
3.2.7.1. Diseño del oligopéptido 23
3.2.7.2 Conjugación del péptido a hemocianina de
Concholepas concholepas 24
3.2.7.3. Inmunización de conejos y obtención de sueros 24
3.2.7.4 Inmunización de ratones y obtención del suero 25
3.2.8 Análisis de proteínas e inmunodetección 26
3.2.8.1 Extracción de proteínas totales 26
3.2.8.2 Cuantificación de proteínas 26
3.2.8.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida en
condiciones denaturantes 27
3.2.9. Inmunodetección en membrana 28
3.2.9.1 Dot-Blot 28
3.2.9.2 Western Blot 28
3.2.9.3 Inmunodeteccion en tejido con DAB 29
3.2.9.4 Inmunodetección en tejido con fluorescencia 30
iii
4. RESULTADOS 31
4.1 Obtención y caracterización de un anticuerpo anti-cMTF1 31
4.1.1 Análisis de secuencia aá deducida de MTF1 de carpa 31
4.1.2 Diseño de oligopéptidos para preparación de anticuerpo MTF1 40
4.1.3 Estimación del tamaño de las variantes de MTF1 in silico 42
4.1.4 Inmunodetección de variantes de MTF1 en proteína total 43
4.2 Inmunodetección de MTF1 en hipófisis de carpa 45
4.2.1 MTF1 inmunodetectado en la región PPD de hipófisis de
Cyprinus carpio 45
4.2.2 MTF1 co-inmunodetectado en células productoras de GH en
pituitaria de carpa 47
4.3 Efecto de Zn a la expresión de MTF1 y MT en hígado de Cyprinus carpio 49
4.3.1 Expresión de MTF1 y MT en respuesta a Zn en hígado de carpa 54
4.3.2 Efecto de Zn en la expresión de MTF1, MT, PRL y GH en hipófisis
de carpa 58
4.3.3 Análisis de expresión de otros factores hipofisiarios 62
5. DISCUSIÓN 68
6. BIBLIOGRAFÍA 83
iv
INDICE DE FIGURAS
Figura 1: Alineamiento de secuencias aminoacídicas derivadas de MTF1 de peces. 32
Figura 2: Esquema de variantes de MTF1 derivados de cDNA en Cyprinus carpio. 35
Figura 3: Diseño de oligopéptidos específico de MTF1 para la producción de
anticuerpo. 41
Figura 4: Variantes de MTF1 en diversos tejidos de carpa inmunodetectado por
Western Blot. 44
Figura 5: Inmunodetección de MTF1 en pituitaria de carpa. 46
Figura 6: Inmunodetección doble de MTF1 con GH o PRL en pituitaria de carpa. 48
Figura 7: Estandarización de partidores para la amplificación de MTF1. 51
Figura 8: Estandarización de partidores para la amplificación de β-actina. 52
Figura 9: Estandarización de partidores para la amplificación de MT. 55
Figura 10: Estandarización de partidores para la amplificación de Vtg. 56
Figura 11. Expresión de MTF1, MT y Vtg en hígado en respuesta a Zn por RT-qPCR. 57
Figura 12: Estandarización de partidores para la amplificación de GH. 59
Figura 13: Estandarización de partidores para la amplificación de PRL. 60
Figura 14: Efecto de Zn en expresión de MTF1, MT, PRL y GH en pituitaria de
carpas evaluado mediante RT-qPCR. 61
Figura 15: Estandarización de partidores para la amplificación de Sp1. 63
Figura 16: Estandarización de partidores para la amplificación de Pit1. 64
Figura 17: Estandarización de partidores para la amplificación de Rpx. 65
Figura 18: Estandarización de partidores para la amplificación de Ptx2. 66
Figura 19: Efecto diferencial de Zn en expresión de factores de transcripción en
Pituitaria de carpas. 67
v
INDICE DE TABLAS
Tabla I: Código genético. 37
Tabla II: Frecuencia de codones usados por carpa. 38
Tabla III: Uso de codones en C-termino de la variante MTF1. 39
Tabla IV: Oligonucleótidos gene específicos para el análisis RT-qPCR 56
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
o Amp: Ampicilina
o APS: Persulfato de amonio
o BME: β-mercaptoetanol
o BSA: Suero albumina bovina
o cDNA: DNA complementario
o dNTP: Desoxirribonucleótido trifosfato
o Ct (cycle threshold): Ciclo umbral
o DO: Densidad óptica
o GH: Hormona de crecimiento
o Ig: Inmunoglobulina
o LB: Medio de cultivo Luria Bertani
o MT: Metalotioneina
o MTF: Factor de transcripción de respuesta a metales
o PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
o PI: pars intermedia
o PPD: proximal pars distalis
o RPD: rostral pars distalis
o PRL: Prolactina
o SB: Buffer NaOH-ácido borico
o TA: Temperatura ambiente
o Taq: Thermus aquaticus
o TAE: Buffer Tris-acetato; EDTA
vii
o TE: Buffer Tris-HCl; EDTA
o Tm: Temperatura de melting
o VT: vitelogenina
o ZRF: factor de respuesta a Zn
1
1. RESUMEN
MTF1 es un factor de transcripción de respuesta a metales, crucial para la homeostasis de
metales pesados esenciales en el organismo. MTF1 fue inmunodetectado por primera vez con el
anticuerpo anti-carpa-MTF1 en la glándula pituitaria, en la región caudal de la proximal pars
distalis, colocalizando con algunas células que producen hormona de crecimiento (GH), pero
ausente en células productoras de prolactina (PRL) en la proximal pars distalis of Cyprinus
carpio. Además, variantes de tamaño fueron immunodetectadas en diversos tejidos. Análisis
comparativo por RT-qPCR reveló un incremento de metalotioneina (MT) en hígado de carpas
tratadas con Zn respecto a carpas control, un muy conocido biomarcador de exposición a metales
sugiriendo una correspondiente respuesta del organismo en el estudio individual. En pituitaria,
además fue encontrado un cambio no significativo de MT y MTF1. Al mismo tiempo un
incremento en la expresión de PRL, decrecimiento de GH, sin cambios en la expresión de los
factores de transcripción Pit1, Rpx, Sp1, relacionados con la regulación de estas hormonas
determinado mediante RT-qPCR. Claramente, un incremento significativo fue mostrado para
Ptx2, un factor de transcripción regulador de la expresión del gen de PRL junto con Pit1. Estos
efectos diferenciales destacan la importancia de los factores hipofisiarios en respuesta a metales y
sugieren que el análisis de factores en pituitaria en carpas macho adultas podría complementar
esquemas de biomonitoreo del ambiente acuático.
2
SUMMARY
MTF1 is a transcription factor responding to metal, crucial for homeostasis of essential heavy
metals in the body. For the first time MTF1 was immunodetected with anti-carp-MTF1
antibodies in pituitary gland in the caudal region of proximal pars distalis, colocalizing in some
of the cells that produce growth hormone (GH), but absent from prolactin (PRL) producing cells
in rostral pars distalis of Cyprinus carpio. In addition, size variants were immunodetected in
diverse tissues. Comparative RT-qPCR analyses revealed in liver of Zn treated respect to control
treated carp an increase of metallothionein (MT), a wellknown biomarker for metal exposition
suggesting a corresponding organismic response in the studied individuals. In pituitary, however,
no significant change of MT and MTF1 was found. At the same time expression of PRL
increased, GH decreased, without change of transcription factors Pit1, Rpx, Sp1, related to
regulation of these hormones determined by RT-qPCR. Clearly, a significant increase was shown
for Ptx2, a transcription factor regulating prl gene expression together with Pit1. These
differential effects highlight the importance of hypohyseal factors in response to metal assault
and suggest that analyses of pituitary factors in male carp might complement biomonitoring
schemes of aquatic environment.
3
2. INTRODUCCIÓN
Los peces teleósteos son una infraclase que agrupa a peces con esqueleto óseo. Dentro de
los teleósteos se encuentra Cyprinus carpio, un pez de agua dulce, de la familia cyprinidae,
presente en todos los continentes, cuyo hábitat principal son cuerpos de agua estancados o flujos
lentos, en general pantanosos. Es omnívoro y su alimentación se basa en insectos, crustáceos,
moluscos, y similares que extrae del fondo de los ambientes donde habita. El uso de Cyprinus
carpio para biomonitoreo, se basa en la comprensión de los mecanismos de regulación hormonal
del pez, y como estos reaccionan ante estímulos ambientales, para que a través de la medición de
estas variaciones hormonales sea posible censar alteraciones medioambientales, tales como,
presencia de contaminantes, alteraciones en las concentraciones de iones, cambios de temperatura
del agua, entre otras. Para esto, es de vital importancia estudiar la función de las “glándulas
maestras” de la regulación hormonal, el hipotálamo y la hipófisis (Pagoda y Hammerschmidt,
2009).
La hipófisis es una glándula endocrina, también conocida como pituitaria, cuya función es
secretar hormonas que regulan la función de otras glándulas. A su vez la hipófisis está sujeta al
control hormonal por parte del hipotálamo, formando el llamado eje hipotálamo-hipofisiario. En
la hipófisis se distinguen las partes lóbulo anterior o adenohipófisis, y lóbulo posterior, la pars
neuro-intermedia. En la primera se ubican las células que secretan la mayor parte de las
hormonas hipofisarias, entre ellos prolactina (PRL), hormona de crecimiento (GH), hormona
estimulante de tiroide (TSH) y somatolactina (SL), una hormona de la familia PRL-GH y
exclusivamente presente en peces (Pagoda y Hammerschmidt, 2009). De los factores del eje
hipotálamo-hipofisiario se ha mostrado variación estacional significativa en la expresión a nivel
4
transcripcional y traduccional de la hormona prolactina (PRL) en la glándula pituitaria de carpas
aclimatadas. Aquellas aclimatadas a la estación fría, mostraron una reacción claramente más baja
con respecto a las aclimatadas a la estación de verano (Figueroa et al., 1994, 1997), al igual que
la hormona de crecimiento (GH) (Figueroa et al., 2005). El desarrollo de las líneas celulares que
producen estas hormonas está bajo control del factor de transcripción específico de la pituitaria
Pit1, indispensable y regulador de la transcripción de los genes de PRL, GH, TSH-β, SL, y de su
propio gen (Dasen y Rosenfeld, 1999; Pagoda y Hammerschmidt, 2009). En la región promotora
del gen pit1 de Cyprinus carpio fue encontrada una secuencia conocida como elemento de
respuesta a metales (MRE) (Kausel et al., 2006), secuencia consenso (TGCRCNC) que
corresponde a una secuencia de unión del factor de transcripción regulado por metal, el MTF1
(Schaffner y Westin, 1988) sugiriendo que MTF1 podría modular la expresión de Pit1.
Consecuencia de esto también afectaría la expresión de las hormonas reguladas por Pit1, por esta
razón, también se medirá la expresión de hormonas hipofisarias frente al estimulo con zinc (Zn).
El Zn es un micronutriente esencial, su deficiencia causa retardo en el crecimiento,
inmunodeficiencia, y enfermedades neurológicas como la disgeusia (Prasad et al., 1983, 1998
and 2003; Koh et al., 2000). Muchas enzimas y factores de transcripción requieren Zn para
mantener su estructura y realizar sus funciones (Prasad et al., 1995; Vallee et al., 1995;
Murakami et al., 2008). Recientemente, se ha informado que el Zn también actúa como una
molécula de transducción de señales y segundo mensajero en mastocitos de ratón (Hirano et al.,
2008), recalcando la importancia del Zn. Por otro lado, un exceso de Zn resulta citotóxico
(Telford and Fraker, 1995; Koh et al., 1996; Ibs and Rink, 2003; Sensi and Jeng, 2004;). Por lo
tanto, es críticamente importante controlar fuertemente la concentración de Zn intracelular.
5
MTF1 es un factor de transcripción descrito por primera vez como un factor de unión a
MRE dependiente de Zn (Westin y Schaffner, 1988). En carpa se han descrito dos genes MTF1,
MTF1.1 y MTF1.2 (Ferencz y Hermesz, 2008) y una variante de splicing de MTF1.1, MTF1.1a
(Ferencz y Hermesz, 2009). En una línea celular de hígado de tilapia se encontró que bajo
condiciones de no exposición a metales MTF1 se encuentra mayoritariamente en el citoplasma,
pero frente a la exposición a metales se translocó al núcleo (Cheung et al., 2010) mediante una
señal de localización nuclear (NLS) (Schaffner et al., 2009). Además posee una señal de
exportación nuclear (NES), lo que permitiría un equilibrio de MTF1 en un estado activado y
desactivado. MTF1 contiene un dominio de unión a DNA tipo dedos de Zn con especificidad a
secuencias MRE (Andrews y Laity, 2007; Günther et al., 2012). Por otro lado Sp1 un factor de
transcripción implicado en remodelación de la cromatina, es capaz de reconocer secuencias ricas
en C,G de manera es capaz de unirse a secuencias MRE y modular la expresión de genes
implicados en respuesta a estímulos con metales (Andrews et al., 2008).
Los genes blanco de MTF1 mejor caracterizados y analizados son los genes de
metalotioneina [MT](Otsuka et al., 2007). Los MT pertenecen a una familia de proteínas
altamente conservadas que juegan un importante rol en la homeostasis de metales esenciales
(Zn2+
y Cu2+
) y en la detoxificación de metales pesados (Cd2+
, Pb2+
y As3+
) (Andrews et al.,
1990; Liu and Thiele et al., 1997; Liu et al., 1999). La unión de MTF1 al promotor de MT-I
potencia la transcripción del gen mt-I (Andrews et al., 1997).
Ratones knock out MTF1 mueren en el útero alrededor de los 14 días de gestación como
resultado de necrosis celular en el hígado, aunque ratones knock out en MT son viables. De
hecho, los ratones nulos en MT solo mostraron un fenotipo levemente sensible al Cd (Günes et
6
al., 1998). El hecho de que ratones sin MTF1 fueran letales a nivel embrionario fue evidencia
directa de que este factor de transcripción no solo es fundamental en homeostasis de metales, sino
que también juega un rol esencial en la diferenciación y desarrollo (Haroon et al., 2004).
Desde estas observaciones, se ha mostrado un gran interés en lograr definir el alcance de
la red de proteínas que son controladas por MTF1 y a través de esto poder entender sus funciones
biológicas. Claramente, estos experimentos con animales han revelado una tendencia hacia la
alteración en la expresión de factores de transcripción y genes de importancia clave para el
desarrollo (Hogstrand et al., 2008).
Ptx2 y Rpx son factores de transcripción expresados ontológicamente en forma temprana
en la hipófisis, directamente asociados a la formación de la glándula pituitaria. Mutaciones en
algunos de los factores de transcripción cruciales para el desarrollo de la pituitaria dan origen al
hipopituitarismo, una deficiencia de una o múltiples hormonas pituitarias (Cohen and Radovick,
2002). Rpx (Rathke's Pouch Homeobox), es un miembro del tipo paired-like, homeobox gen
originalmente descrito en Drosofila melanogaster (Cohen and Radovick, 2002). Es el marcador
específico más temprano conocido para el primordio de la pituitaria, sugiriendo que tiene un rol
en la determinación temprana o diferenciación de la pituitaria (Hermesz et al., 2003). Ptx2 es
miembro de la familia de proteínas Ptx, expresadas en patrones superpuestos en el desarrollo de
la pituitaria, regulan la proliferación y diferenciación celular de manera dosis dependiente (Dasen
y Rosenfeld, 1999; Scully et al., 2002; Cohen and Radovick, 2002; Zhu et al., 2005). La pérdida
de función de Ptx2 resulta en defectos de múltiples órganos, ambos tienen similares propiedades
de unión al DNA, tienen los mismos genes objetivos e interactúan con los mismos factores de
transcripción (Dasen y Rosenfeld, 1999; Quentien et al., 2006). Los estudios funcionales de los
7
síndromes asociados a mutaciones en los genes Ptx2 y Rpx, que incluyen knock out y sobre
expresión, muestran claramente que los dos factores de transcripción Ptx2 y Rpx, juegan un rol
importante en el desarrollo y funcionamiento de la glándula pituitaria, temporalmente antes del
factor de transcripción Pit-1 (Carriére et al., 2004; Zhu et al., 2005). Por eso, se aborda la
caracterización de estos factores pituitarios, que podrían jugar un rol importante en la
coordinación de la red de factores que responden a estímulos ambientales.
La presencia de transcritos de Ptx2 en las distintas regiones de la glándula pituitaria de
carpa sugiere una función en la regulación la expresión de genes específicos de estas regiones. En
la hibridación in situ la reacción de mayor intensidad se detectó en la PPD, lo cual sugiere que
Ptx2 podría estar involucrado en la regulación del gen GH que se expresa en esta región de la
pituitaria de carpa (Figueroa et al., 2005). Sin embargo, se correlaciona negativamente la
presencia de GH que es mayor en verano comparado con invierno y se necesitan estudios
funcionales para conocer la interacción y regulación en este modelo (Figueroa et al., 2005).
Al co-transfectar células que no expresan Pit-1 o Ptx2, con el promotor de PRL de rata o
humano frente el gen de luciferasa y con un vector que expresa Ptx2, o Pit-1, o ambos, se vio la
capacidad de activar este promotor y que Ptx2 y Pit-1 en conjunto lograban un fuerte sinergismo
en la activación de la expresión, mediada por el promotor de PRL (Amendt et al., 1998, 1999;
Quentien et al., 2002a, b). En la carpa se mostró la expresión de Ptx2 en las regiones PPD y PI de
la hipófisis donde se expresa el factor de transcripción Pit-1 que sugiere que estos factores
podrían interactuar en las células productoras de GH y SL (Kausel et al., 1999; Figueroa et al.,
2005; López et al., 2001). En cuanto a Rpx no hay estudios funcionales en adultos, sin embargo,
en el desarrollo se ha mostrado la interacción proteína-proteína, donde Rpx es capaz de formar
8
homodímeros y heterodímeros con el factor de transcripción Prop-1, reprimiendo la propiedad
activadora de Prop-1, cuando esto ocurre no hay activación de la expresión Pit-1 (Olson and
Rosenfeld, 2002; Olson et al., 2003).
Basados en los antecedentes bibliográficos entregados se propone como hipótesis general
de trabajo se plantea que, “la respuesta a estrés por metales implica cambios en la expresión
génica de factores de transcripción en pituitaria de Cyprinus Carpio”. Como objetivo principal de
esta tesis se pretende caracteriza MTF1 en pituitaria de carpa y revelar los efectos de Zn a
nivel transcripcional de factores hipofisiarios en Cyprinus carpio. Por lo tanto los objetivos
específicos de la presente tesis son:
1. Analizar aspectos morfofuncionales de MTF1 en pituitaria de carpa.
2. Evaluar la respuesta al tratamiento con Zn mediante la determinación de la
expresión del gen control (MT) en pituitaria e hígado de carpas tratadas con Zn y controles.
3. Evaluar la expresión de factores hipofisiarios, especialmente factores de
transcripción (MTF1, Pit1, Pitx2, Rpx, Sp1) en carpas tratadas con Zn y tratadas control.
9
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIALES
3.1.1 Reactivos
Del distribuidor Winkler Ltda. se adquirió acrilamida y bis-acrilamida, azul de coomasie G-
250, bálsamo de canadá, solución Chomczynsky, cloruro de litio (LiCl), cloruro de sodio (NaCl),
fosfato disódico de hidrógeno (Na2HPO4), fosfato de potasio diácido (KH2PO4), isopropanol,
SDS, TEMED, TRIS, Tritón X-100, Tween 20, xilol.
En Promega se adquirió el DNA ladder 100bp, cloruro de magnesio (MgCl2), dATP 100 mM,
dTTP 100 mM, dCTP 100 mM, dGTP 100 mM, enzima transcriptasa reversa M-MLV y su
tampón 5x, GoTaq DNA polimerasa (200 U/mL) y su tampón 5x verde, GoTaq Master Mix, T4
DNA ligasa.
En Merck (Darmstadt, Alemania), agua para cromatografía, alcohol etílico, ácido clorhídrico
(HCl), Cloruro de Zinc (ZnCl2), cloroformo, cloruro de potasio (KCl), cloruro de calcio (CaCl2),
glucosa, inhibidor de proteasa, metanol.
La hemocianina adquirida de Biosonda S.A. La agarosa, DNA ladder 1Kb fueron adquiridos
en Fermentas. Agar y caldo LB fueron adquiridos en MoBIO laboratories, Inc. El acido bórico se
adquirió de Sigma Chemical Co. El IPTG y X-gal fueron adquiridos del proveedor US
Biological.
10
3.1.2 Soluciones
o 3,3’-diaminobencidina (10mg/mL)
o Acetato de sodio 2 M pH 4,0.
o Cloroformo para preparación de RNA
o Cloruro de zinc (ZnCl2), 10mM
o Cloruro de calcio (CaCl2) 100 mM
o Cloruro de magnesio (MgCl2) 100 mM
o Fenol saturado: Fenol en Tris-HCl pH 7,4- 8,0 para preparación de DNA
o Fenol saturado en agua pH 5,0 para la preparación de RNA.
o Fluorescence Mounting Medium, DAKO
o Medio SOB: Peptona 2%; Extracto de levadura 0,5%; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM;
MgCl2, 5 mM
o Medio SOC: Peptona 2%; Extracto de levadura 0,5%; NaCl 10 mM; KCl 2,5 mM;
MgCl2, 5 mM; Glucosa 20 mM
o Medio LB: 1% peptona; 0,5% extracto de levadura; 1% NaCl pH 7,0
o Medio LB-Agar: LB, 1,8 % agar agar
o PBS 10x (phosphate buffered saline): Na2HPO4 101,4 mM; NaCl 1368,9 mM;
KH2PO4 17,6 mM; KCl 26,8 mM, pH 7,4; final 1x Na2HPO4 10,1 mM; NaCl
136,9 mM; KH2PO4 1,7 mM; KCl 2,6 mM, pH 7,4
o PBS-Tween: PBS 1x, 2 % v/v Tween 20
o PMSF (phenylmethyl-sulfonyl fluoride): PMSF 10mM en isopropanol
o Solución Bradford: 0,25 g Azul de Coomassie R250 en 90 mL metanol/agua (1:1
v/v) y 10 mL acido acético glacial
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o SB 20x (sodium boric acid solution): solución stock 20x: 200mM NaOH, ajustar a
pH 8,0 con ácido bórico (H3B03) aprox. pH 8,2; final 1x 10mM NaOH, pH 8,0
o Solución de bloqueo: Leche descremada al 5%
o Solución de desteñido: 25% metanol, 7% acido acético glacial en agua destilada.
o Solución de revelado: 20 mL de DAB 10 mg/mL en solución PBS 1x con 30 µL
H2O2 de la solución stock 30% v/v
o Solución de Chomczynski: Tiocianato de guanidina 4 M; citrato de sodio 25 mM
pH 7,0; sarcosil 0,25% y β-mercaptoetanol 0,1 M, fenol saturado levemente ácido
para la preparación de RNA.
o Tampón de corrida: 10x, Tris-HCl 25mM, glicina 192mM, SDS 0,1%; al diluir 1x:
adicionar tampón 10x y metanol (1:2 v/v)
o Tampón de elusión: 10mM Tris-HCl, pH 8,5
o Tampón de transferencia: Tris-HCl 25mM pH 8, glicina 192 mM, SDS 0,1% p/v
3.1.3 Instrumentos
o Agitador magnético, IKA Big Squid
o Autoclave Orthman
o Balanza, acculab V-1mg
o Camara, EOS Rebel Xsi, Canon
o Centrifuga, Refrigerated centrifuge SIGMA 2-16PK
o Espectrofotómetro, Hoefer Vision Life Science Spectrophotometer
o Espectrofotometro, NanoVue Spectrophotometer
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o Estufa, W.C Heraeus Hanau
o Fuente de poder, BioRad
o Fuente de poder, ENDURO
o Impresora, Laserjet1018, HP
o Microondas, fancy wt1700, Somela
o Micropipetas, Gilson Pipetman
o Microscopio, Axio Lab.A1, Carl Zeiss
o Microscopio Confocal, Olympus Fluoview FV1000
o pH metro, WTW inoLab pH 720
o Real time, Stratagene Mx3000p y MX3005p
o Scanner, DeskjetF2280, HP
o Shaker, LAB-LINE, INSTRUMENTS
o Sistema desionizador de agua Cole Palmer
o Sonicador, Ultrasonic processor
o Termociclador, Mastercycler personal, Arquimed y Termociclador de gradiente,
Multigene, LabNet
o TermoBloque, AccuBlock, LabNet
o Transiluminador Vilbert Loumart (TFX-20 M)
o Ultra-Turrax, T10 basic ULTRA-TURRAX – IKA
o Vortex, VX-200 Vortex Mixer
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3.1.4 Kits
o E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit, OMEGA
o Universal LSAB™+ Kit/HRP, Rabbit/Mouse/Goat, DAKO
o pGemT-Easy DNA cloning Kit. Fermelo S.A.
3.1.5 Animales de experimentación
Se utilizaron carpas (Cyprinus carpio) macho adultos de aproximadamente 1,5 kg, que
corresponden a individuos de aproximadamente 2 – 3 años (Billard, 1995). Los peces fueron
capturados, a comienzo de verano, con chinguillo en aguas de la cercanía de Valdivia. Las carpas
fueron trasladadas y aclimatadas por aproximadamente dos semanas en una piscina natural pozo
de agua del mismo ambiente a temperaturas y foto periodo natural cerca de Valdivia. Se
alimentaron del material orgánico que flotó en el pozo de tierra y no se aplicó ninguna nutrición
adicional.
3.2 MÉTODOS
Los métodos utilizados se basaron en Sambrook et al., 1989, a no ser que se especifique otra
fuente o modificación.
3.2.1 Tratamiento de peces y preparación de muestras
Se eligieron carpas macho, se dejaron de a cuatro en una jaula, un bidón con grandes agujeros
por donde tenían acceso al agua y luz en el pozo, se dejaron unos días para acostumbrarlos a esta
14
nueva condición. Al principio del tratamiento se registró de cada individuo la morfología, la
longitud y el peso y la temperatura del agua del pozo. Las carpas fueron inyectadas
intraperitonealmente durante tres días consecutivos, y sacrificadas en el cuarto día a la misma
hora por la mañana. Se trataron 8 carpas macho, cuatro de ellos fueron inyectados con ZnCl2
10 mM hasta 0,6 mg/kg de peso, y los otros cuatro individuos con un correspondiente volumen
de agua. Estos últimos fueron los “peces control”. Luego al cuarto día se extrajo sangre de la
vena caudal o directamente del corazón pasando la aguja heparinizada por las agallas, para la
preparación de DNA genómico según instrucciones del Kit DNA easy blood an tissue Kit
(Quiagen). Después se anestesiaron con un golpe en la cabeza y fueron sacrificados rápidamente
por decapitación. Se prepararon trozos de todos los órganos/tejidos de interés. Con un corte
horizontal sobre los ojos se abrió la cabeza, se extrajo la parte adiposa que rodea el cerebro hasta
dejarlo expuesto. Usando pinzas se cortaron los nervios ópticos y olfatorios para luego levantar y
dar vuelta al cerebro, y sacar los dos lóbulos del hipotálamo. De la cavidad ósea se extrajo
cuidadosamente la glándula hipofisiaria.
El tronco se cortó por la parte ventral del pez dejando visible la zona interior se dio paso
entre estomago e intestino, al hígado de color marrón, y se ubicó el riñón en la parte más dorsal
del interior del pez. Se prepararon trozos de hígado, riñón y corazón utilizando una pinza órganos
más duros como branquia, músculo, intestino fueron cortados con una tijera y tomados con pinza.
El tejido se sumergió en solución Chomczynski para preparación de RNA, en solución RIPA
para fría para la preparación de extracto proteico, en solución Bouin acuoso para fijarlo y
preparar muestras para la inmunohistoquímica o en nitrógeno líquido para su conservación a -
80 °C.
15
3.2.2 Extracción y caracterización de ácidos nucleicos
3.2.2.1 Preparación de RNA total
Las pituitarias, hipotálamos e hígados obtenidos en 3.2.2 y 3.2.3 se homogeneizaron, en un
potter con 800 μL de Solución de Chomczynski-fenol previamente enfriada y mantenida en hielo.
El homogenizado se trasladó a un tubo Eppendorf de 1,5 mL, se dejó en reposo por 5 min a TA y
se adicionó 200 µL de cloroformo, se agitó en vortex por 15 s y se dejó en reposo por 3 min a
TA. Se centrifugó a 12000 x g por 15 min a 4 °C, se trasladó la fase acuosa, que contiene el RNA
a un nuevo tubo, se adicionó 500 µL de isopropanol frío, y se mantuvo a -20 °C durante toda una
noche para la precipitación de RNA. El precipitado se sedimento por centrifugación a 12000 x g
por 15 min a 4 °C, con la posterior eliminación de la fase acuosa, el precipitado se lavó dos veces
con alcohol etílico 75% (v/v) preparado con agua estéril, se dejó secar el precipitado al aire por
10 min, el sedimento se resuspendido en 50 µL de agua libre de nucleasas, se cuantificó y se
guardó a -80 °C. La preparación de RNA de hígado incluyó un paso más para la eliminación de
glicógeno. Para eso el precipitado de RNA se resuspendió en 500 µL LiCl 4M que disuelve el
glicógeno, pero no disuelve al RNA. El RNA se recuperó por centrifugación a 10000 x g por 30
min a 4 °C, se descartó el sobrenadante, se lavó el sedimento de RNA una vez con etanol al 75%,
se dejó secar al aire y se resuspendió en agua libre de nucleasas. Se determinó la concentración
por espectrofotometría en NanoVue y se guardó a -80 °C. Una vez preparado, el cDNA se guardó
a -20 °C.
16
3.2.2.2 Preparación de DNA plasmidial
Las colonias bacterianas transformadas, de color blanco, fueron sembradas en 5 mL de LB
líquido con ampicilina 50 μg/mL y se incubaron toda la noche a 37 °C con agitación rotatoria a
150 rpm. Se tomó 1,5 mL de cultivo líquido y se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL para
ser centrifugado a 8000 x g durante10 min a TA.
El sedimento de células se resuspendió suavemente en 500 μL de solución I/RNAsa A
(PS001/AC117) (E.Z.N.A de OMEGA Plasmid Miniprep Kit II, modificado), se resuspendió y se
mezcló con 500 µL de solución II (PS002), cuidadosamente girando el tubo dos veces y
dejándose en reposo 5 min. Se agregó la solución III (PS003) del kit se mezcló cuidadosamente
dando vuelta al tubo varias veces. La gran cantidad de sal precipitó las proteínas y se observó un
precipitado que se eliminó por centrifugación a 13000 x g por 10 min a TA. Del sobrenadante se
extrajo el DNA plasmidial mediante columnas.
Se equilibró la Hibind DNA column con 100 μL de tampón de equilibrio (EQ2), para eso se
adicionó la solución y se centrifugó por 20 s y se descartó la solución que pasó por la columna.
De inmediato se adicionó el sobrenadante a la columna con su respectivo tubo colector y se
centrifugó a 13000 x g por 60 s a TA, se descartó el filtrado y se centrifugó lo que queda de
lisado repitiendo lo señalado anteriormente. Se agregó a la columna 500 μL de buffer HB
(PS009), se centrifugó a 13000 x g por 1 min a TA y se descartó el filtrado.
Se agregó a la columna 700 μL de solución DNA wash (PS010) y se centrifugó por 13000 x g
por 1 min a TA, luego se repitió este lavado. Estando la columna vacía se centrifugó a 13000 x g
por unos minutos para que evapore el resto de etanol de la solución de lavado y se secó el DNA
en la membrana. La columna se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 mL estéril, y para eluir el
17
DNA se agregó 80 μL de tampón de elusión (10mM Tris-HCl, pH 8,5; PDR048), se dejó en
reposo por un min y se centrifugó a 13000 x g por 1 min para eluir el DNA plasmidial.
3.2.2.3 Cuantificación de ácidos nucleicos
La determinación de la concentración de ácidos nucleicos se determinó midiendo la absorción
a 260 nm en el equipo NanoVue. Una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde a una
concentración de 50 μg/mL para ácidos nucleicos de doble hebra de DNA, 40 μg/mL para los
ácidos nucleicos de hebra simple RNA. También se midió la absorbancia a 280 nm a la cual
absorben los anillos aromáticos de proteínas. La razón DO260nm/DO280nm indica la pureza de la
preparación de ácidos nucleicos DNA puro DO260nm/DO280nm = 1,8 y RNA 2.0.
3.2.2.4 Caracterización de ácidos nucleicos en geles de agarosa
Para separar los fragmentos de DNA se utilizaron geles de agarosa en tampón SB 1x a
concentraciones (p/v), dependiendo del tamaño del fragmento de DNA esperado a fraccionar. Se
utilizó la concentración 1,2% para fragmentos de PCR y 1% para DNA genómico. Para la
reparación del gel se fundió la agarosa en solución SB 1x pH 8.0 en microondas, se dejó enfriar a
TA y se le agregó SYBER SAFE a una concentración final de 250x de la solución stock 10.000x,
para un gel de 30 mL se agregó 6 μL y se traspasó a un molde horizontal con peineta. El gel
solidificado se montó en la cámara de electroforesis tapado con solución SB 1x.
El fraccionamiento electroforético se realizó a 50 mA durante 30 a 50 min. Una vez
finalizada la electroforesis se visualizó el DNA por exposición a luz UV para estimar los tamaños
18
de los fragmentos de DNA separados en el gel de agarosa, se fraccionó paralelamente un estándar
de tamaño molecular de 1 kb o 100 pb.
3.2.3 Síntesis de cDNA
La primera hebra de cDNA se sintetizó en un volumen final de 20 μL. Se tomaron 5 μg de
RNA total, se agregó 0,5 μL de oligo-dT15 (500 ng/μL), y se llevó a 15 μL con agua libre de
nucleasas. Para eliminar posibles estructuras secundarias, se calentó a 70ºC durante 10 min y
luego se puso en hielo. Se agregó 1 μL de mix dNTPs10mM, 4 μl de 5 X tampón M-MLV-RT, se
incubó a 42ºC por 2 minutos y se agregó 1 μL de M-MLV-RT (200 U/μl), se mezcló suavemente
y se incubó durante 60 minutos a 42ºC. Luego de esta incubación se calentó a 70ºC por 15 min
para inactivar la enzima, y se almacenó a -20ºC.
3.2.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Las amplificaciones se realizaron a partir de cDNA de hígado, hipófisis e hipotálamo de
carpas machos, las condiciones frecuentemente utilizadas fueron las siguientes: En general se
utilizó un volumen de reacción de 20 μL, conteniendo 1X tampón Taq DNA polimerasa, 1,5 mM
de MgCl2, 0,2 mM Mix dNTPs, 5 U de taq DNA polimerasa, 1 μL de templado, 1 μL de cada
oligonucleótido (20 pmol/μL). Como templado se ocupó 50 ng DNA plasmidial, 100 ng DNA
genómico y 50 ng en cDNA de hipófisis. El programa utilizado constaba de una denaturación
inicial de 1 min a 94ºC, seguida por 30 a 35 ciclos de: 94ºC, por 30 s, 55ºC por 30 s, 72ºC por 30
s, y con una extensión final de 72ºC por 7 min, finalizando a 4ºC.
19
3.2.5 PCR en tiempo real
Las reacción de PCR en tiempo real se realizó a partir de cDNA para ello se preparó una
mezcla que contenía 85μL de GoTaq® qPCR Master Mix 2X, 54,5μL de agua libre de nucleasas,
y 4 μL del oligonucleótido sentido 0,1 μg/μL, más 4 μL del oligonucleótido antisentido
0,1 µg/μL. El volumen total fue suficiente para 16 reacciones, suficiente para realizar 8
reacciones de PCR gen específico, correspondientes a 4 carpas tratadas y 4 carpas control, con
sus duplicados, conteniendo cada tubo 9 μL de la mezcla preparada a la cual se le adiciona 1uL
de cDNA de cada muestra. Esto se realizó para cada gen que se deseó evaluar, considerando que
cada muestra de cDNA en reacción de PCR debió incluir el gen β-actina como normalizador. Los
oligonucleótidos fueron todos estandarizados a una temperatura de apareamiento de 55 °C,
resultando un programa de PCR que consta de una denaturación inicial de 5 min a 95 ºC, seguida
por 40 ciclos de: 95 ºC por 30 s, 55 ºC por 30 s, 72 ºC por 30 s, y con una extensión final de
72 ºC por 10 min, finalizando a 4ºC.
Los datos se extrajeron del Real Time MxPro, Stratagene. Cada perfil de amplificación se
evaluó manualmente y solamente se procesaron datos de una reacción con un singular producto
de amplificación evidenciado en un singular pico en la curva de disociación. Si la muestra del
cDNA resultó en un producto esperado con los partidores del gen control beta actina se procedió
a utilizar estos datos para normalizarlas con el resultado de la amplificación con partidores gen
específico. De los resultados Ct en forma tabular se calculó el promedió de los Ct normalizado de
las reacciones en duplicado. De estos datos, un Ct para cada gen de cada individuo, se calculó el
promedio con deviación estándar de las cuatro carpas tratados control y de las cuatro carpas
20
tratadas con Zn (Pfaffl, 2001). El student’s t-test reveló si existía una diferencia significativa
entre las muestras analizadas.
3.2.6. Clonamiento de un producto de PCR
3.2.6.1 Reacción de ligación del producto de PCR en un vector de DNA plasmidial
Los productos de PCR se ligaron al vector pGEMT-Easy (Promega) mediante la siguiente
reacción recomendada por el fabricante, en un volumen final de 10 μL:
2 μL de producto de PCR
1 μL de vector pGEMT-Easy (50 ng/μL)
5 μL de 2 X tampón Ligasa
1 μL de enzima T4 DNA ligasa (3 U/μL)
1 μL H2O nucleasa-free, Promega
Se incubó por 14 a 16 h a 4ºC para obtener una mayor eficiencia.
3.2.6.2 Preparación de células competentes JM109
A partir de una colonia aislada de la cepa JM109, se realizó un cultivo líquido en medio LB,
incubando durante toda la noche a 37ºC con agitación constante de 200 rpm. Este cultivo se
diluyó 1:100, se tomaron 100μL y se sembraron en 10 mL de medio LB, lo que se incubó a 37ºC
con agitación constante, hasta obtener el crecimiento del cultivo por turbidez midiendo OD a 600
nm de 0,4-0,6, que corresponde a la fase de crecimiento logarítmico. Para la preparación de
células competentes no se utilizó un cultivo de fase estacionario, porque durante la
21
transformación parte del DNA se podría adherir a células muertas y así bajar el rendimiento de la
obtención de clones. El cultivo se enfrió en hielo y todo el procedimiento se realizó en frio y con
soluciones y tubos previamente enfriados en hielo. Las células se colectaron por centrifugación a
245 x g por 12 min a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron para eliminar el
medio. Para eso se resuspendió el sedimento en 10 mL de MgCl2 100 mM frío, y se volvió a
centrifugar en las condiciones anteriormente mencionadas. Para preparar las células para la
introducción del DNA plasmidial se trataron con CaCl2. Para eso el sedimento se resuspendió en
15 mL de CaCl2 100 mM previamente enfriado, se incubó durante 20 min en hielo, para luego
repetir la centrifugación. Finalmente, el sedimento de células competentes se mantuvo
aproximadamente por una semana a 4 °C. Para almacenarlos hasta 6 meses se adicionó glicerol a
una concentración final 10 % (v/v) y se guardaron alícuotas a -80ºC.
3.2.6.3 Transformación de células competentes
Para realizar la transformación se utilizaron 50 μL de células competentes JM109 obtenidas
con 50 ng DNA plasmidial o 2 μL del producto de ligación obtenido, agregando el DNA
cuidadosamente a la solución de células competentes mezclando por suaves movimiento del tip.
Esta mezcla se incubó en hielo por 20 min, y luego se sometió a un shock térmico de 42ºC por 90
s. Inmediatamente se enfrió en hielo por 2 min, y luego se agregó 700 μL de medio SOC
previamente entibiado a 37ºC, y se dejaron unos minutos en el mesón a TA. Para estimular el
crecimiento se agitó a 150 rpm a 37ºC por 1,5 h. Como control de la calidad del antibiótico para
la selección se sembraron células sin transformación en una placa LB ampicilina y no se obtuvo
crecimiento. Como control de la eficiencia de las células competentes se transformó una alícuota
22
con 50 ng de DNA plasmidial sobreenrollado para obtener aproximadamente 104 - 10
5
colonias/µg. Para sembrar células JM109, aptas para la alfa-complementación, transformadas con
un producto de ligación con vector pGEM-T-easy, se sembró el cultivo en dos placa de LB agar
100 μg/mL de ampicilina las cuales fueron previamente impregnadas con 40 μL de X-gal al 5%
(p/v) y 4 μL de IPTG 50 mg/mL. En una placa se sembraron 100 µL y el resto en la segunda
placa y se incubaron invertidas toda la noche a 37ºC. Como resultado se obtuvo lo siguiente.
Células no transformadas, que no adquirieron DNA plasmidial no presentan crecimiento en
condiciones selectivas. Las colonias de células bacterianas transformadas presentaron color
blanco y azul, estas fueron capaces de crecer por haber adquirido el plasmidio que otorgó la
resistencia a ampicilina. Las colonias azules poseen el DNA plasmidial vector sin inserto, que
indica la presencia de la β-galactosidasa activa que degrada X-Gal y los productos de
degradación tienen color azul. Las células azules sintetizan las dos partes de la β-galactosidasa, la
parte alfa-péptido del amino-termino codificado en el vector y la parte C-terminal codificado en
el gen Δ15 en el genoma de la célula, que en conjunto forman el complejo activa de la enzima β-
galactosidasa y logran metabolizar el X-Gal. Las colonias blancas, son células bacterianas que en
el plasmidio adquirido se incorporó un inserto de DNA que interrumpió la parte codificante del
α-péptido del gen de la β-galactosidasa y por lo tanto no puede complementar el producto de la
parte del gen de la β-galactosidas (delta15) codificada en el genoma de la célula huésped y
solamente hay una β-galactosidasa parcial, inactiva, que no puede degradar el X-Gal.
3.2.6.4 Almacenamiento de clones bacterianos en glicerol
A partir de una colonia bacteriana aislada en placa se realizó un cultivo en el correspondiente
23
medio líquido. En el caso de bacterias transformadas con el vector pGEMT-Easy recombinante
se utilizó medio LB 50 μg/mL de ampicilina, se incubó a 37ºC toda una noche. Las células se
sedimentaron a 245 x g por 10 min, el sedimento se resuspendió suavemente en 500 μL de una
solución de: Tris-HCl 10 mM pH 8,0, y MgCl2 10 mM. Esta suspensión se pasó a un tubo
eppendorf estéril, y se agregó glicerol a una concentración final de 10 a 50% glicerol, se mezcló
bien por pipeteo, y se almacenó a -80ºC hasta su utilización. En el tubo se indicó el nombre del
clon, el medio para crecer el cultivo y la fecha y se anotó en la lista del LabBMP el lugar y
número de alícuotas.
3.2.7 Preparación de anticuerpos mediante oligopéptidos
3.2.7.1 Diseño del oligopéptido
De la proteína de interés se obtuvo las secuencias aminoacídicas deducidas del GenBank.
Primero se realizó un análisis comparativo de las secuencias aminoacídicas de la proteína
estudiada y se identificaron regiones altamente conservadas entre especies y regiones funcionales
para revelar en lo posible dominios de estructura tridimensional conocida. De la secuencia de la
proteína de carpa se graficó un perfil de hidrofilicidad con el programa
(http://www.vivo.colostate.edu/molkit/hydropathy/). Para la preparación de un anticuerpo se
eligió una región de alta hidrofilicidad que probablemente esté expuesta en la superficie de la
proteína. Se eligió una secuencia del oligopéptido de aproximadamente 15 amino ácidos que
contiene en lo posible una lisina en un termino del péptido para facilitar el crosslink con la
hemocianina. Una vez seleccionada la secuencia se comprobó la especificidad por BLAST contra
24
el banco de datos. Los oligopéptidos se sintetizaron en GenScript, USA y se recibieron
liofilizados.
3.2.7.2 Conjugación del péptido a hemocianina de Concholepas concholepas
El péptidos sintético se conjugó con hemocianina, (Bluecarrier, Biosonda) como carrier para
incrementar la respuesta inmune de acuerdo al siguiente procedimiento: el péptido liofilizado se
resuspendió en tampón borato de sodio 0,5 M pH 9.0 a una concentración de 8,8 μg/μL. Para eso
se agregó el tampón al tubo con el péptido liofilizado, se cerró y se pasó varios min por el
agitador en todas las orientaciones, se aplicó una centrifugación de corta duración para juntar la
solución en el fondo del tubo. De esta solución se tomaron 225 μL y se agregó 1 mg de
hemocianina (2,5 μL de solución stock 0,4 mg/μL) y 148 μL de agua estéril; luego se agregó muy
lentamente y con agitación 77 μL de de glutaraldehido 2,5% (v/v) preparado fresco de la solución
stock glutaraldehido; esta mezcla se dejó 14 horas en agitación a TA, para luego ser dializada en
una bolsa de diálisis de poros con exclusión de más de 10.000 kDa contra 0,15 M de NaCl por 6
h. Se recuperó la solución desde la membrana de diálisis, con un volumen teórico de 455 μL, lo
que arrojó una concentración teórica del péptido de 5 μg/μL.
3.2.7.3 Inmunización de conejos y obtención de sueros
Se utilizaron conejos blancos adultos, los que se mantuvieron en una jaula con agua de libre
acceso y se alimentaron diariamente. Antes de iniciar el experimento se extrajo sangre para la
obtención del suero pre-inmune. Para eso se rasuró una parte de la oreja con un bisturí del pelo,
se golpeó suavemente la oreja para producir vaso dilatación de la vena y de un pequeño corte se
25
obtuvieron algunas gotas de sangre en un tubo no heparinizado y la herida se apretó hasta su
cierre. La sangre coaguló en el tubo, se dejó a TA toda la noche y se traspasó el suero amarillento
a un tubo limpio. El suero se almacena a 4ºC. Los conejos fueron inoculados tres veces con una
dosis de 500 μg de péptido cada 3 semanas; para esto, se preparó una emulsión compuesta de
100 μL de péptido conjugado (500 μg) con 400 μL PBS 1x y con 500 μL coadyuvante de
Freund’s completo (incluye Mycobacterium tuberculosis 1 mg/mL inactivado) para la primera
inyección y parecido pero con co-adyuvante de Freunds’s incompleto para las siguientes
inyecciones; la emulsión de la solución acuosa con el coadyuvante se logró por sonicación. Para
eso, se agregó la solución en una jeringa de 3 mL y se sonicó en este recipiente a pulsos de 5 s a
máxima intensidad del equipo o hasta que la emulsión tomó una consistencia firme y de color
blanco. Al conejo se le cortó el pelo en el lomo y se aplicaron múltiples inyecciones subcutáneas
de aproximadamente 200 μL distribuidos sobre la mitad de la espalda. A los 21 días después,
para la segunda inmunización se aplicó inyecciónes subcutáneas sobre la otra mitad de la espalda
y otros 21 días después la tercera inyección intraperitonealmente. Unos cinco días después de la
última inyección se empezó a testear la inmunoreacción en sangre por inmuno-dot-blot. Si se
observó fuerte reacción se extrajeron de la vena de la oreja aproximadamente 20 a 30 mL de
sangre para la obtención del suero conejo anti-oligopéptido.
3.2.7.4 Inmunización de ratones y obtención del suero
Se consiguieron ratas adultas del Instituto de Fisiología de la Universidad Austral de Chile,
que se mantenía en el bioterio de acuerdo a las condiciones estipuladas en el Reglamento para la
mantención de animales de experimentación de la UACh. Antes del experimento se extrajo
26
sangre para la obtención del suero pre-inmune. Para eso se mantuvo la rata unos 15 min en una
caja con lámpara para generar vaso dilatación, se obtuvo una gotita de sangre por un corte en la
cola, y de la sangre coagulada se traspaso el suero en un tubo limpio. La rata se inyectó
subcutáneamente con una dosis de 0,2 mg de oligopéptido conjugado tres veces cada 14 días. La
solución se preparó de acuerdo a lo indicado en 3.2.9.3, la primera solución con adjuvante
completo de Freund y las siguientes con adjuvante incompleto Freund. El suero se caracterizó por
inmuno-dot-blot, Western Blot y por inmunocitoquímica.
3.2.8 Análisis de proteínas e inmunodetección
3.2.8.1 Extracción de proteínas totales
Se homogenizó el tejido, de una hipófisis o hipotálamo en el Potter, en caso de tejido
hepático u otro, unos 100mg de tejido, en 1 mL de RIPA mediante tres pulsos de 3 s con
ultraturrax, y posteriormente otros tres pulsos de 3 s con sonicador. Se centrifugó a 5000 x g por
5 min a TA, se recuperó el sobrenadante, se alicuotó y guardó en -80 °C.
3.2.8.2 Cuantificación de proteínas
Basado en el método de Bradford (Bradford et al., 1976), se fabricó una curva de calibración
con BSA entre 5 a 30 μg/mL en reactivo de Bradford. La solución Bradford fue preparada
mantenida en una botella oscura a TA. Para el ensayo se juntó la solución proteica con la
solución Bradford (1 mL), se mezcló, se incubó a TA por 10 min y se determinó la absorbancia
en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm. Se midió la muestra al mismo tiempo
con las muestras de la curva de calibración y el blanco
27
3.2.8.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes
El fraccionamiento de proteínas se realizó en geles de poliacrilamida SDS-PAGE (Laemmli,
1970) en aparatos BioRad. El gel separador se preparó con acrilamida-bisacrilamida 30% (p/v), a
una concentración final de 12%, tamponado con Tris-HCl 1,5 M, pH 8.8 y SDS 0,4% (p/v). El
gel espaciador se preparó a una concentración final de 5% (p/v) tamponado con Tris-HCl 0,5 M,
pH 6.8 y SDS 0,4% (p/v). Ambos geles fueron polimerizados con APS 0,06% (p/v) y TEMED
0,15% (p/v) de concentración final. Se montó el gel en el aparato tapándolo con tampón de
corrida 1x. Las muestras se prepararon aproximadamente 30 µg proteínas totales para un pocillo
con tampón de muestra final 1x y siempre fresco con 1 μl BME (14,4 M), las proteínas se
denaturaron calentándolas por 5 min a 95ºC en termobloque. Se limpiaron los pocillos, se
cargaron las muestras, se le aplicó una corriente de 70 mA hasta que el indicador del frente iónico
llegó al borde inferior del gel en aproximadamente 1 h. El gel se desmontó y se sumergió 30 min
en 3% (v/v) glicerol para aumentar su estabilidad y para evitar que se rompa durante los
próximos tratamientos. Para visualizar las proteínas se tiñó con azul de Coomassie (Sambrook et
al., 1989). Se incubó en solución de azul de Coomassie 1 h con agitación suave a TA y se destiñó
en solución de desteñido por varios horas y cambios de solución. Finalmente se secó entre papel
celofán que permite la difusión de líquido estirado en un marco a TA y se documentó con una
foto digitalizada. Como estándar de tamaño molecular se aplicó paralelamente el PageRuler
Plus
Prestained Protein Ladder con proteínas en el rango de 10 kDa hasta 250 kDa.
En paralelo se realizó un análisis in silico (http://web.expasy.org/compute_pi/) para la
obtención del tamaño teórico según las secuencias a disposición en la base de datos.
28
3.2.9 Inmunodetección en membrana
3.2.9.1 Dot-Blot
Para la rápida inmunodetección de una proteína en solución, se aplicó el Dot-Blot. En una
pequeña tira de membrana de nitrocelulosa se aplicaron muestras de proteínas especificas y
proteínas controles. Para inmunodetectar un anticuerpo especifico en el suero de un animal
inmunizado se aplicó en una pequeña tira de membrana de nitrocelulosa en un punto un volumen
de 1 μL del oligopéptido (aproximadamente 1 ng), un punto con 1 μL del oligopéptido
conjugado, como control negativo un punto con 1 µL BSA (10μg/μL), y 1 μL de extracto de
proteínas totales de tejido. Se prepararon varias tiras para ser incubadas con diferentes diluciones
del suero.
3.2.9.2 Western Blot
Para identificar una proteína especifica y evaluar el tamaño de la proteína se utilizó el análisis
Western Blot. Proteínas totales se fraccionaron en un gel SDS-PAGE, se desmontó el gel y se
procedió de inmediato a la electrotransferencia. Para eso se montó un sándwich entre un papel
3MM mojado y el gel en tampón de transferencia, la membrana de nitrocelulosa premojada en
solución de transferencia y aplicada sin atrapar burbujas, un papel 3MM mojado en solución de
transferencia, apretado suavemente entre un soporte e inserta entre con el gel hacia el electrodo
negativo y la membrana hacia el electrodo positivo, siendo todo esto sumergido en solución de
transferencia. La electrotransferencia se realizó con una corriente de 50 mA por al menos 15
horas a TA. Se desmontó el sistema, se abrió el sándwich cuidadosamente, se marcó con lápiz
29
grafito la posición de los pocillos en la membrana nitrocelulosa, se sacó el gel y la membrana se
mantuvo mojada y se traslado a una bolsa plástica. A la bolsa se agregó solución de bloqueo (5 %
p/v leche en polvo en PBS 1x) para bloquear los sitios inespecíficos y se incubó 30 min a TA.
Posteriormente se cambió a la solución de bloqueo con el primer anticuerpo, en general en una
dilución 1:1000. Luego se incubó durante una noche a TA. Al otro día se realizaron 3 lavados de
5 min con PBS-Tween 20 (PBS 1x con 2 % v/v Tween 20), con agitación suave a TA. Para
visualizar el complejo inmune se incubó con el segundo anticuerpo, el anticuerpo contra IgG de
conejo marcado con peroxidasa, a una dilución de 1:1000 por 4 h a TA. La membrana se lavó 3
veces con PBS-Tween 20 por 5 min y se reveló la actividad de la peroxidasa. Para ello se incubó
con solución de revelado (20 mL de DAB 10 mg/mL en solución PBS 1x con 30 μL H2O2 de la
solución stock 30% v/v), por 15 min, agregando a los 5 minutos de reacción 15 μL más de
perhidrol. La reacción se detuvo sumergiendo la membrana en agua. Se documentó el resultado
con una fotografía digital.
3.2.9.3 Inmunodetección en tejido con DAB
El tejido en cortes incluidos en parafina se desparafinó y rehidrató por inmersión en una
batería de xiloles y una serie decreciente de etanoles (2x 20min en xilol, 10 min en 100% - 98 % -
90 % - 80 % - 70 % - 60 % - 50 % etanol) y finalmente en PBS 1x. Para gastar la actividad de la
peroxidasa endógena y se trató con una mezcla de metanol 70% (v/v) perhidrol 3% (v/v) durante
10 min para inactivar las peroxidas endógenas; seguidamente se lavaron los cortes 3 veces
durante 5 min con PBS 1x. Seguidamente los cortes se cubrieron con una solución de bloqueo
(leche descremada 5%) por 30 min en cámara húmeda, después se incubó con el primer
30
anticuerpo diluido en solución de bloqueo a una razón 1:1000, durante 18h; se lavó 3 veces
durante 5 min en PBS 1x; se incubó con el segundo anticuerpo, una mezcla de inmunoglobulinas
biotiniladas compuesta por anti-IgG de ratón, conejo y cabra (Universal Dako LSAB®
+ Kit,
Peroxidase) durante 30 min, se lavó 3 veces durante 5 min en tampón PBS. Se continúo con la
incubación con estreptavidina conjugada a peroxidasa de Armoracia rusticana, por 30 min; se
lavó 3 veces durante 5 min en PBS. Para revelar, se preparó una solución de revelado que
contenía 20 mL de PBS 1x, 1 mL de 3,3’-diaminobencidina (10 mg/mL) y 15 μL de perhidrol,
permitiendo reaccionar por 5 min, luego se agrega 15 μL de perhidrol adicionales para completar
un tiempo total de 15 min de reacción. Finalmente los cortes de tejido se deshidrataron con una
batería de etanol creciente terminando en xilol y se montaron con bálsamo de Canadá.
3.2.9.4 Inmunodetección en tejido con fluorescencia
La metodología usada, es prácticamente la misma que se utilizó para inmunohistoquímica. El
bloqueo se realizó con el mismo tampón de bloqueo utilizado en las inmunodetecciones
anteriores, durante 30 min. Posteriormente se incubaron toda la noche en una cámara húmeda con
los mismos anticuerpos mencionados en 3.2.10 diluidos en solución de bloqueo (1:000). Después
de 3 lavados con PBS, cada uno de 5 min, se incubó por 2 h a TA con los segundos anticuerpos,
anti-conejo-IgG acoplado al fluoróforo Alexa Fluor 488 y anti-ratón-IgG acoplado a fluoróforo
Alexa Fluor 568 ambos diluidos 1:2000. Luego se lavó 3 veces con PBS y se monto con un
medio especial para fluorescencia (Dako Fluorescence Mounting Medium). Durante todo el
procedimiento se evitó la exposición a luz y las muestras se manipularon en una cámara húmeda.
31
4. RESULTADOS
4.1 Obtención y caracterización de un anticuerpo anti-cMTF1
4.1.1 Análisis de secuencia aminoacídica deducida de MTF1 de carpa
Las secuencias utilizadas corresponden a secuencias aminoacídicas deducidas a partir de la
secuencia nucleotídica del factor de transcripción MTF1 obtenidas del GenBank. Se realizó
alineamiento múltiple y una comparación entre la secuencia aminoacídica deducida de MTF1 de
Cyprinus carpio de 670 aa (AAS75816), Danio rerio de 593 aa (AAM08290), Takifugu rubripes
de 780 aa (CAB36904) y Oreochromis niloticus de 811 aa (AAP93663) (Figura 1).
El dominio de unión al DNA es de tipo Zn-finger, seis dedos de Zn tipo C2H2., resulta ser
conservada entre las especies comparadas, así como también la región de transactivación acídica
y gran parte de la región rica en serina y treonina. Más aún las señales de localización nuclear
(NLS) y exportación nuclear (NES), resultan ser idénticas entre los peces comparados en esta
tesis. La región correspondiente al dominio de transactivación rico en prolina hasta el primer
tercio del dominio de transactivación rica en serina y treonina, presentan una mayor divergencia
en la secuencia aminoacídica deducida (Figura 1). En Cyprinus carpio el dominio de unión al
DNA de MTF1 se encuentra entre los residuos 149 hasta el 327, al igual que en carpa, en
Takifugu rubripes se encuentra desde el residuo 159 hasta el 336 y en Oreochromis niloticus
desde el residuo 157 hasta el 334.
32
cMTF MGENGPLTQT AMLFEDEEED VDKLCREEDD EDKTARFEQD DDELISGPSS SSGRIYDRTT VLIEQDPIRL DEEGEE---- 76
zMTF MGENGPLSET AMLFEDEEED VDKLGREEED EDKMANFDKD GN-MISGPSS SSGTVYDRTT VLIEQDPIRL DEEGEE---- 75
fMTF MSGNGPHSEV PMYFEVEVGH LDQ--EDEEE EDDKIHFSKG DD-LIPETSS PSGRLYDRAT VLIERDPIRL DEEGEEEGHC 77
tiMTF MSENGPHTEA PMYFEVEVAP LER--DDEE- -DDKIHFGKD GD-LIAEPSS SSGRVYDRTT VLIERDPIRL DEEGEEEGHC 75
NLS
cMTF ----DGMAFG -EGEGD---- EGSLAFMCDP DGMSQGYIHH TISPDQIQFI INPGSTPMPR NIEGATLTLH SECPETKQRE 147
zMTF ----DGMTFL PEGEGD---- EGSLAFMGDP DGMSQGYIHH TISPDQIQFI INPGSTPMPR NIEGATLTLH SECPETKQRE 147
fMTF GGEDDGVTFL TEGEGDGDEE EGTLTFINDP DGMSQGYVHH TISADQIQFT INPGSTPMPR NIEGATLTLH SECPETKQRE 157
tiMTF GGDEDGVTFL TEGEGDGDEE EGSLAFMTDP DGMSQGYVHH TISPDQIQFT INPGSTPMPR NIEGATLTLH SECPETKQRE 155
F1 F2 F3 cMTF VKRYQCMFEG CTRTYSTAGN LRTHQKTHRG EYTFVCNQQG CGKAFLTSYS LKIHVRVHTK EKPFECDVQG CEKAFNTLYR 227
zMTF VKRYQCLFEG CTRTYSTAGN LRTHQKTHRG EYTFVCNQQG CGKAFLTSYS LKIHVRVHTK EKPFECDVQG CEKAFNTLYR 227
fMTF VNRYKCMFEG CTRTYSTAGN LRTHQKTHRG EYTFVCNQQG CGKAFLTSYS LKIHVRVHTK EKPFECDVQG CEKAFNTLYR 237
tiMTF VKRYQCMFEG CTRTYSTAGN LRTHQKTHRG EYTFVCNQQG CGKAFLTSYS LKIHVRVHTK EKPFECDVQG CEKAFNTLYR 235
F4 F5 cMTF LKAHQRLHTG KTFNCESEGC TKYFTTLSDL RKHIRTHTGE KPFRCDHDGC GKAFAASHHL KTHVRTHTGE RPFFCPSDGC 307
zMTF LKAHQRLHTG KTFNCESEGC TKYFTTLSDL RKHIRTHTGE KPFRCDHDGC GKAFAASHHL KTHVRTHTGE KPFFCPSDGC 307
fMTF LKAHQRLHTG KTFNCESEGC TKYFTTLSDL RKHIRTHTGE KPFRCDHDGC GKAFAASHHL KTHVRTHTGE KPFNCPSDGC 316
tiMTF LKAHQRLHTG KTFNCESEGC TKYFTTLSDL RKHIRTHTGE KPFRCDHDGC GKAFAASHHL KTHVRTHTGE KPFNCPSDGC 314
F6 NES rico en aá ácidos cMTF EKTFSSQYGL KSHIRGHDKG PACTVS-AHP LSEDANHSLC LSDLSLISTD SELQEN-HNS QGLDLNSVTP IRIFELMFQS 385
zMTF EKTFSSQYSL KSHIRGHDKG PSFTVS-GHP LSEDANHSLC LSDLSLISTD SELQEN-HNS QGLDLNSVTP IRIFELMFQS 385
fMTF EKTFSSQNSL KSHIRGHDKV QPFTVTLTHP ISEDANHSLC LSDLSLISTD SELRENLNNA QDLDLNNMTP VKIFERMFQS 397
tiMTF EKTFSSQYSL KSHIRGHDKG QSFSVSLTHP LSEDANHSLC LSDLSLISTD SELRENIHNA QNLDLNNTTP VKIFELMFQS 395
rico en prolinas cMTF PENSVSQDDP KTTDQPGEAF GLDPCPPSAS DG------FP PP-------- ---------- ---------- -SSSPVTSP- 429
zMTF PENSVSEDDP KPTESLAESF GLEPSPQSAP ADASTHPAFP QPPPSTCS-- ---------- ---------- -SSCSITAPA 442
fMTF PENSLSQDDA HPKESLAETF SLKNSTKPIA TDASSLISFS LDPTASS--- ---------- ---------- ----THTTTV 450
tiMTF PENSISQDDA HLGESLAERF SLETPTQPGV TETSSLISFS VNPTSSSSCS RNAAVMEASS QLNQSSSSQT STPASITANV 475
cMTF -EAQTPPTSQ PAPPP----- ---------A AGSSSLTP-- PTSSVSPEVP IAPSAPPAPS VAP-LFVAQP GSTATSASVT 491
zMTF QDAQTPPTTQ QAPPP----- ---------A VSSSSQTSSF PSAPPSSSQP AEVSSPSAPS ATQHYMMAQS VSSPSAASVS 508
fMTF NSTPALPFMQ LTGPQ----- -QPSVQAPNH IGPQHYVSLS PTFQHKESTI RTTSLQPPIP APPPVASVLT ATTASTDAVS 524
tiMTF STTQPPAFMQ LNGPQQISDV PQASVQPQNH VTPQQYVALP PTFLQQDSTT QTTPLPPPIT TPAPAP-ALT AT-APGPGPA 553
rico en serinas y treoninas
cMTF AEVTHTVPLA PPLPP--PPP PPP------- ------TITI APTLG-LQPS IVMSDQNRQW ILSSAASAQQ NPEQ----QG 551
zMTF SVPAGTAEVT AAVTHTVPLA APP------- ------TISI APTLG-LQPS LVMSDQNLQW ILSSAASAQQ NPEQ----QG 570
fMTF LVAAATTDTL AAVAQPVPLV NHPVPESGAS FPTTSATYTV TPTHNLLQPN LVMSDQNLQW ILSTAANSQQ NAEQ-AQQGA 603
tiMTF VVAATTTDAL APVAQPVPLA NNPGPNSGPG LATTPATITI APTQNLLQPS LVMSDQNLQW ILSSAANSQQ NPEQAAHQGA 633
cMTF PKVEKVFFTT AIPVGGHSGN AVQQIGLSLP VIIIKQEESC QCQCACRDSG KDKSTASS-- ----VEKTKT TSPPPAPPSL 625
zMTF PKVEKVFFTT AIPVGGNSG- ---MIGY*-- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 593
fMTF PKVEKVFFTT AIPMGGNAGN SVQQIGLSLP VIIIKQEESC QCQCACRDSA KEKNSKSSSS SMSAQKEPYT SKPLPSPLSQ 682
tiMTF PKVEKVFFTT AIPVGGNAGN SVQQIGLSLP VIIIKQEESC QCQCACRDSA KDKSAKSASS IVSAPAQQQP PEPPSPPLS- 712
cMTF PEDPPSEPAP DPVTPDPPAD G--------- ---------- ---------- ---------- ---------- -LDLLSPETT 655
zMTF ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
fMTF LPEPQHNPAN SPS-CCFPAS SAKVGEMRPG AHSSSS---- --AQTFSTVV GSTATIFPSS DGLANVGVSD FLSLQNPEAA 756
tiMTF --EPQHHSAT SSSSCCPPKS SSKVGEVTLE APSSSSSSSS STAQTFSTIV SSTATNPPSS DGLASMDVSD FLSLQSPETA 790
cMTF ANIEALLDQF PSGAP*---- ----- 670
zMTF ---------- ---------- -----
fMTF ANIEALLLVA EDINMATNCN AYKS* 780
tiMTF ANIEALLLVA DDFNMATDGN P*--- 811
Figura 1: Alineamiento de secuencias aminoacídicas derivadas de MTF1 de peces. C.
carpio (AAS75816), D. rerio (AAM08290), T. rubripes (CAB36904) y O. niloticus
(AAP93663). En corchetes se denotan los dominios dedos de Zn, de F1 a F6, y de transactivación
ricos en aa ácidos, rico en prolinas, y en serinas y treoninas. Las secuencias NLS, NES y clúster
de dimerización se muestran cuadros. Los (-) significan gap, el (*) es un codón stop.
33
Respecto a la secuencia NLS que en carpa corresponde a KQREVKR, en todas las especies
analizadas se encuentra al inicio del dominio de unión al DNA, y respecto a la secuencia solo T.
rubripes difiere en un residuo cambiándose la segunda lisina (K) por una asparragina (N)
respecto a C. carpio (Figura 1). En relación a la secuencia NES que en carpa corresponde a
LCLSDLSL se encuentra en un sitio muy conservado de la región de transactivación acídica de
los peces comparados, y no se observó diferencias en las secuencias entre ellos.
La región de transactivación acídica comprende 52 aa, ubicados desde el residuo 340 hasta el
residuo 391 en carpa. El análisis comparativo de las secuencias aminoacídicas deducidas de esta
región de MTF1 de carpa se comparó con las de otras tres especies, observándose una clara
similitud entre C. carpio y D. rerio con un 98% de identidad en este dominio, un 79% de
identidad con T. rubripes y un 85% de identidad con O. niloticus. En relación al dominio rico en
prolina lo componen 66 aa desde el residuo 412 hasta el residuo 477, de los cuales se obtuvo un
51% de identidad entre C. carpio y D. rerio, un 24% entre C. carpio y T. rubripes, y un 28%
entre C. carpio y O. niloticus. Finalmente el dominio rico en serinas/treoninas de MTF1 de C.
carpio compuesto por 76 aá desde el residuo 504 hasta el residuo 589, del alineamiento realizado
se observa que esta última región presenta una menor identidad pero que conserva ciertas serinas
y treoninas en esta región, resultando un 69% de identidad entre C. carpio con D. rerio, un 63%
de identidad con T. rubripes, 76% de identidad con O. niloticus, de las cuales se conservan las
treoninas 513, 519, 560, 561, la treonina 515 es reemplazada por una serina en D. rerio y las
serinas 529, 538, y la serina 539 es reemplazada por una treonina en T. rubripes.
Por otra parte, se encuentran disponibles las secuencias codificantes parciales de tres
variantes de MTF1 en Cyprinus carpio del trabajo realizado por Hermesz y Ferencz en los años
34
2008 y 2009, que describen por primera vez la secuencias de cDNA de las variantes de mtf1.1
(EU541410), mtf1.2 (DQ987534) y mtf1.1a (DQ987535). A partir de esas secuencias se deduce
las secuencias aminoacídicas MTF1.1 (ABL84982) de 563 aá, MTF1.2 (ABL84981), de 564 aá
descritos como variantes génicas y una variante trunca de MTF1.1, la MTF1.1a (ABL84983) de
412 aá (Figura 2).
Todas las variantes poseen intactos el dominio de unión al DNA y sus señales de localización
nuclear y de exportación nuclear. MTF1.1 y MTF1.2 se diferencian en ciertas mutaciones silentes
y no silentes. Las no silentes corresponden a 10 aa distintos a lo largo de la proteína, el primero
se encuentra ubicado antes del dominio de unión al DNA, el segundo está ubicado en el tercer
motivo de unión al DNA, los siguientes 4 se encuentran entre la región acídica y la región rica en
prolina, los tres siguientes están al final de la región rica en prolina y el último ubicado al inicio
de la región rica en serina y treonina, por último se observa en la región rica en serina/treonina la
deleción de un aminoácido, siendo MTF1.1 un aminoácido más pequeño (Hermesz y Ferencz,
2008).
Respecto a MTF1.1a, la secuencia aá es idéntica a la de MTF1.1 hasta el residuo 26 de la
región acídica, pero mtf1.1 al sufrir un splicing de 103 nucleótidos, se produce un corrimiento en
el marco de lectura a partir del residuo 27 de la región acídica, perdiendo entonces parte del
dominio de transactivación acídico y completos los dominios de transactivación rico en prolina y
rico en serina y treonina. Los restantes 64 aa que se codifican hasta el siguiente stop codon, se
corresponden a aminoácidos que en su conjunto, no poseen características de dominio
transactivador, constituyéndose una proteína trunca, que tiene el dominio de unión al DNA
intacto (Ferencz y Hermesz, 2009).
35
Figura 2: Esquema de variantes de MTF1 derivados de cDNA en Cyprinus carpio. Se
representa los dominios con características funcionales de la secuencia aá deducida del cDNA de
MTF1.2 (ABL84981, 564 aa), MTF1.1 (ABL84982, 563 aa) y MTF1.1a (ABL84983, 413 aa).
Los números en el esquema indican la cantidad de aá de cada sección, se indica con líneas rojas
la ubicación de aá que difieren entre variantes respecto al MTF1.1. Las cajas grises denotan los 6
dominios de unión al DNA motivo dedos de Zn, cajas blancas denotan los dominios de
transactivación, acídico, rica en prolina, rica en serina y treonina. La estrella negra señala la
ubicación de la señal de localización nuclear (NLS), la estrella gris indica la señal de exportación
nuclear (NES); la caja negra indica el cambio del marco de lectura de la proteína truncada que
resulta en una cadena de 64 aá sin homología ninguna con los dominios MTF1.
36
Con el objetivo de probar si es factible que estos últimos 64 aá de la proteína MTF1.1a se
traducen realmente en la carpa. Se realizó un análisis utilizando la secuencia nucleotídica de
MTF1.1a (DQ987535), se analizaron los correspondientes tripletes, para así evaluar si los
codones utilizados en esta región son los utilizados preferentemente en Cyprinus carpio. Para
realizar el análisis se utilizó el código genético, se seleccionaron los aá que son codificados por 6
codones: Leucina (L), Serina (S) y Arginina (R) (Tabla I). Se contabilizaron todos los tripletes
que codifican para estos tres aminoácidos y se realizo una comparación con el Codon Usage
Table (Tabla II), disponible para Cyprinus carpio. (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-
bin/showcodon.cgi?species=7962). Se seleccionaron los tripletes de uso más frecuentes en carpa,
que fueron 4 tripletes para lisina, 5 tripletes para serina y 4 tripletes para arginina. El análisis de
los 64 tripletes luego del cambio del marco de lectura, mostro que de los 17 lisinas presentes, 16
de ellos correspondían a codones de uso frecuente (94%), de las 7 serinas presentes 6 de ellos
eran codificados por codones de uso frecuente (86%) y de las 6 argininas, 4 de ellas eran
codificados por codones de uso frecuente (67%) (Tabla III).
37
Tabla I: Código genético. *aá condificados por seis tripletes.
38
Tabla II: Frecuencia de codones usados por carpa. Según el Kazusa DNA Research Institute
del análisis de 164321 codones en 415 secuencias codificantes. [triplete] [frecuencias: por
mil]([numero]).
39
Tabla III: Uso de codones en C-termino de la variante MTF1.1a. Distribución de uso de
codones para leucina, serina y arginina en los 192 pb de los 64 tripletes hacia el 3’ de MTF1.1a
Mayoritariamente están presentes los codones de uso preferencial en Cyprinus carpio.
40
4.1.2 Diseño de oligopéptidos para preparación de anticuerpos MTF1
Para la detección de MTF1 en carpa, se desarrollaron sueros policlonales a partir de la
inmunización con un oligopéptidos en conejo y ratón, respectivamente. Para ello, se analizaron
las secuencias aminoacídicas derivadas del factor de transcripción MTF1, buscando las regiones
de mayor hidrofilicidad. Estas regiones representarían eventuales buenos epítopes aptos para la
preparación de un anticuerpo específico, esperando su localización en la superficie de la proteína.
El tipo de análisis realizado es de Hoop-Woods (Hoop y Woods, 1981), que permite predecir
regiones antigénicas potenciales a través de una gráfica donde la abscisa corresponde al número
de aminoácido en la proteína de extremo amino a extremo carboxilo y el eje de las ordenadas
entrega valores asignados al nivel de hidrofilicidad para las distintas regiones de la proteína,
donde los valores mayor a 0 son hidrofílicos y menor a 0 más hidrofóbicos. Los hidrofílicos
tienen mayor probabilidad de estar expuestos en la superficie de la proteína en su forma nativa
(Figura 3, A). Un requisito para los péptidos es que deben contener al menos un residuo de lisina
(Lys), para que aporte su grupo ε-amino a la reacción de crosslinking con hemocianina. Se
eligieron dos epítopes, uno de ellos se ubica en la región más hidrofílica en el extremo amino de
la proteína, el péptido sintético de 14 aá inicia con la lisina 23 de la secuencia aá deducida de
MTF1 (Figura 3, A, B). Otro epítope se ubica en la región hidrofílica entre los residuos 220 al
233. El modelamiento de la región Zn finger basado en el Zn finger de ratón destaca la ubicación
en la estructura tridimensional MTF1 de carpa (Figura 3, C). Este motivo forma parte del tercer
dedo de Zn del dominio de unión al DNA. Con el objetivo de ubicar el epítope en la estructura
tridimensional de este factor de transcripción se recurrió a la herramienta SWISS MODEL,
encontrándose disponible la cristalografía del dominio de unión al DNA tipo Cys2-His2 dedos de
Zn de Mus musculus (MMDB: 53449; PDB ID:2I13) (Segal et al,. 2006).
41
Figura 3: Diseño de oligopéptidos específico de MTF1 para la producción de anticuerpo.
(A) Escala de Hopp-Woods para perfil de hidrofilicidad y antigenicidad de la secuencia aá
derivada de MTF1 de C. carpio (AAS75816, 670aa); se destaca en amarillo zona correspondiente
al oligopéptidos. (B) Oligopéptidos MTF1 específicos diseñados a partir de la secuencia aá
deducida. (C) Modelamiento del dominio de unión al DNA del tipo Cys2-His2 (MMDB: 53449;
PDB ID:2I13), en verde la estructura correspondiente a 4 motivos de dedos de Zn, en rojo la
localización del cMTF1220-233.
A
cMTF-123-36 KLCREEDDEDKTAR
cMTF-1220-233 KAFNTLYRLKAHQR
C
B
42
Se logró modelar 4 motivos completos de los 6 motivos dedos de Zn, F2, F3, F4, F5, y parte del F6
comprendiendo desde el aminoácido 162 al 324, la secuencia modelada mantuvo un 43.9% de
identidad entre el templado del banco de datos y el dominio de unión al DNA de MTF1 de
Cyprinus carpio. La ubicación del péptido resultó ser en una de las estructuras α-hélice de uno de
los dominios que coordinan Zn, en el tercer dedo de Zn (F3).
4.1.3 Estimación del tamaño de las variantes de MTF1 in silico
Se estudió el tamaño de la proteína completa según la información disponible en carpa ya que
se cuenta con la secuencia de cDNA que contiene la secuencia codificante completa de MTF1.
De los otros cDNA parciales se dedujo la secuencia aá parcial de variantes MTF1 en carpa. Se
aproximó el tamaño total de cada variante de acuerdo al tamaño de la secuencia codificante
completa, asumiendo que las partes faltantes son idénticas. Para ello se utilizó la herramienta
bioinformática “Compute pI/Mw” de Expasy, analizándose las secuencias para las variantes.
La secuencia cDNA completa de MTF1 disponible en GenBank se correspondería a una
proteína de 670 aá, de las variantes de MTF1 se encuentran disponibles solo las secuencias
parciales de cDNA que corresponderían a: MTF1.1 con 563 aá (61 kDa); MTF1.2 con 564 aá
(61 kDa); MTF1.1a 412aa (46 kDa).
4.1.4 Inmunodetección de variantes de MTF1 en extracto de proteínas totales
Luego del periodo de inmunización de los conejos (3 meses), se obtuvo los sueros inmunes y
estos fueron evaluados para determinar el titulo a través de ensayos de Dot-Blot. El suero anti-
43
cMTF123-36 presentó una reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) hasta la dilución 1:1000,
funcionó excelente en análisis Western Blot y en inmunocitoquímica. Al contrario, el suero
obtenido contra el péptido cMTF1220-233 no logró una inmunorreacción específica y se descartó se
usó. Por esto, los análisis fueron realizados utilizando el anti-cMTF123-36.
Para el análisis de Western Blot se fraccionaron aproximadamente 30 µg de extracto de
proteínas totales de distintos órganos de carpa, las cuales fueron cuantificadas por el método de
Bradford (Figura 4), en gel de poliacrilamida al 12% en condiciones denaturantes, que luego fue
inmunodetectado con anticuerpo anti-cMTF1 en una dilución 1:1000 y revelado con DAB.
El Western Blot reveló una reacción específica y diferencial en los distintos órganos,
inmunodetectándose proteínas de distintos tamaños. En cerebro e hipotálamo son observadas tres
bandas fuertemente marcadas de 114 kDa, 81 kDa, y 45 kDa, en hipófisis se observó la presencia
de dos bandas, una de 114 kDa y una de 81 kDa. En hígado y riñón se observa una banda de
81kDa. En intestino la banda de 81 kDa y la de 45kDa. Músculo presenta las bandas de 114kDa y
81 kDa. Corazón las bandas 114 kDa, 81 kDa, y 45kDa, por último en agalla que sólo se observa
la banda de 81kDa. De acuerdo a la secuencia aminoacídica derivada, la proteína de 81kDa
podría corresponder a las variantes MTF1.1 y MTF1.2 y la proteína de 45kDa podría
corresponder a la variante trunca MTF1.1a (Figura 5).
44
Figura 4: Variantes de MTF1 en diferentes tejidos de carpa inmunodetectado por Western
Blot. El analisis por Western Blot con proteinas totales fraccionadas en gel SDS-PAGE al 12%,
electrotransferidos y analizados con anti-cMTF1 (1:1000) reveló inmunorreacción específica en
distintos tejidos de carpa. Cerebro: 114 kDa, 81 kDa, 45 kDa; hipotálamo: 114 kDa, 81 kDa, 45
kDa; hipófisis: 114 kDa, 81 kDa; hígado: 81 kDa; riñón: 81 kDa; 36 kDa; intestino: 81 kDa, 56
kDa; 21 kDa; músculo: 114 kDa, 81 kDa; corazón: 114 kDa, 81 kDa; agalla: 81 kDa. Estándar de
utilizado SM1811 de fermentas
70
27
81 81
81
45
114
81
114
81
45
81
Cerebro
114
81
45
114
81
45
114
81
Hipotálamo Hipófisis Hígado Riñón
Intestino Músculo Corazón Agalla
7070
7070
70 7070 70
2727
27 27 27 27
45
4.2 Inmunodetección de MTF1 en hipófisis de carpa
4.2.1 MTF1 inmunodetectado en la región PPD de hipófisis de Cyprinus carpio
Con el objetivo de conocer la distribución de células que expresan MTF-1 en pituitaria, se
realizó inmunocitoquímica en cortes sagitales seriados de pituitaria de carpa. Para esclarecer con
precisión la localización de las regiones de la pituitaria en los cortes, se realizó también
inmunohistoquímica con anticuerpos anti-cPRL y anti-cGH de carpa.
En un esquema de la hipófisis (Figura 6, A), se pueden apreciar las distintas zonas que
conforman la hipófisis, indicando la localización de las células lactotropas, que producen PRL, en
la rostral pars distalis (RPD), las células somatotropas, que producen GH en la proximal pars
distalis (PPD) y la región de síntesis de somatolactina (SL) en la pars intermedia (PI). Como
control negativo se realizó la inmunohistoquímica sin la adición de anticuerpo primario, en el que
no se observó reacción específica en el corte (Figura 6, A). La especificidad de los anticuerpos se
corroboró en el análisis histoquímico, con anti-cPRL inmunorreaccionó la población de células
en RPD, la región de lactotropas (Figura 6, B) y con anti-cGH reaccionaron las células en la
región PPD donde se expresan GH (Figura 6, C).
En pituitaria, en el próximo corte seriado, con el anticuerpo anti-cMTF1 estandarizado en este
trabajo se observó una clara inmunoreacción en una subpoblación de células en la “región
caudal” del PPD (Figura 6, D (g)). Por otro lado, no se observó inmunorreacción con el anti-
cMTF1 en células lactotropas de la RPD, ni en PI donde se expresa SL, y se liberan los
neuropeptidos isotocina y vasotocina (Flores et al. 2007). Para revelar inequívocamente si las
células MTF1 positivas en PPD son las mismas células que expresan GH se realizó una
inmunocitoquímica doble.
46
Figura 5: Inmunodetección de MTF1 en pituitaria de carpa. (A) Control negativo sin
anticuerpo primario y esquema de la organización morfofuncional de la glándula pituitaria del
teleósteo C. carpio. Inmunoreacción en cortes sagitales de pituitaria carpa con anticuerpos
(1:1000) (B) anti-cPRL, (C) anti-cGH, (D) anti-cMTF-1. Los recuadros indican las zonas donde
fueron capuradas las imagenes para la realización de las inmunofluorescencias dobles de la
Figura 7.
Tallo
hipofisiarioRPD
PPD
PI
A C
c
d
D e
f
g
B
a
b
Control (-)GH
PRL MTF1
47
4.2.2 MTF1 co-inmunodetectado en células productoras de GH en pituitaria de carpa
Con el objetivo de establecer una relación morfofuncional entre MTF1 con células
productoras de GH y/o PRL, se realizó inmunofluorescencia doble en cortes de pituitaria de
carpa. Para la inmunodetección de MTF1 se utilizó un segundo anticuerpo acoplado al fluoróforo
ALEXA 488 (visualización verde) y para la detección de GH y PRL el anticuerpo acoplado a
ALEXA 568 (visualización roja).
Con microscopia confocal se realizó el análisis de inmunocitoquímica doble con anti-cMTF1
junto con anti-cPRL (Figura 7, A) y anti-cMTF1 junto con anti-cGH (Figura 7, B). Se muestra en
la primera fila como control negativo cortes incubados con anticuerpo secundario en ausencia del
anticuerpo primario en el cual no se observó reacción específica en la región RPD (Figura 7, A,
fila “control”) y en la región PPD (Figura 7, B, fila “control”).
En la inmuno-doble anti-cMTF1 con anti-cPRL (Figura 7, A) se analizó la región RPD y
PPD. En la región RPD, con anti-cMTF1 no se observa reacción específica (Figura 7, A, e). La
inmunorreacción fuerte con el anti-cPRL claramente destaca las células lactotropas en RPD y se
marcó claramente la señal en el citoplasma de las células (rojo), dejando oscurecido el núcleo
(Figura 7, A, a). En el solapamiento de las imágenes (e) con (a) muestra el que no hay
solapamiento entre MTF1 y PRL(Figura 7, A, e/a). En la región PPD (Figura 7, A, tercera fila)
destacó la región PPD donde se observó la mayor reacción con el anti-cMTF1 (Figura 7, A, g) y
la ausencia de células PRL positivas (Figura 7, A, b). La inmunorreacción con anti-cMTF1 en
PPD mostró una clara señal fluorescente en algunas células. El solapamiento de las imágenes
resultó solo en una marca verde correspondiente a la expresión de MTF1 en PPD (Figura 7, A,
g/b).
48
Figura 6: Inmunodetección doble de MTF1 con GH o PRL en pituitaria de carpa. Las
letras representan la ubicación indicada en la Figura 6. (A) Inmunofluorescencia doble de MTF-1
con anti-cMTF1 (verde) y PRL con anti-cPRL (rojo). (B) Inmunofluorecencia doble de MTF-1 y
GH con anti-GH (rojo). La región caudal corresponde a la Figura 6 D recuadro [g].
A
e a e/a
g b g/b
control
B
f c f/c
g d g/d
control
PPD
RPD
RPD
PPD
PPD
(caudal)
PPD
(caudal)
49
La análisis de colocalización con los anticuerpos anti-MTF1 y anti-cGH se realizó con más
detalle mediante inmunofluorecencia doble. Para ello, se capturaron imágenes en dos áreas de la
región de las células GH positiva en la PPD (Figura 6, C, c y d), una de ellas la región de PPD
donde también reaccionó con anti-cMTF1 (Figura 6, D, g) y la región donde solo se observa
reacción con anti-cGH (Figura 6, D, f).
Los controles sin anticuerpo primario no presentaron reacción (Figura 7, B control). En la
región “caudal” de PPD se detectó una fuerte reacción verde en el citoplasma de algunas de la
células (Figura 7, B, g). Esta misma región ahora visualizando el anti-cGH (rojo) se reveló una
fuerte reacción (Figura 7, B, d). La colocalización de la inmunorreacción contra MTF1 y GH se
corroboró en el solapamiento de las imágenes donde las células positivas presentan la coloración
citoplasmática amarilla (Figura 7, B, g/d). También fueron capturada imágenes en la región GH
positiva donde se observó ausencia de MTF1 mediante inmunocitoquímica, mostrándose ahora
por inmunofluorescencia que MTF1 está presente en menor cantidad (Figura 7, B, f), por otra
parte, también se detecta la reacción correspondiente a células GH positivas (Figura 7, B, c) el
solapamiento naranjo/amarillento del citoplasma de estas células de la región PPD revela el
solapamiento de células GH positivas con MTF1 (Figura 7, B, f/c).
4.3 Efecto de Zn sobre la expresión de MTF1 y MT en hígado de Cyprinus carpio
Carpas macho adulto capturadas en los alrededores de Valdivia y climatizadas en una piscina
natural de agua corriente y fotoperiodo natural, por a lo menos dos semanas, fueron inyectadas
con Zn (n=4) a una razón de 0,6 mg/kg de peso. Un grupo control de carpas (n=4) inyectados con
agua por tres días consecutivos, al cuarto día se extrajo el RNA de hígado y otros órganos,
50
evaluándose la presencia de transcritos de MTF1 con partidores dirigidos a la región presente en
todas las variantes descritas. La secuencia amplificada fue secuenciada comprobándose que
corresponde a MTF1 de carpa (Figura 8, A). Por lo tanto, el análisis de RT-PCR representa la
expresión a nivel de transcritos de MTF1 total, se comprobó mediante la curva de disociación, la
presencia de un producto de PCR único (Figura 8, B). Para evaluar el efecto de Zn, se evaluó el
gen metalotioneina (MT), el blanco de MTF1 más ampliamente estudiado. Todos los datos de
cada una de los cDNAs se normalizaron con el amplicón del gen β-actina correspondiente
(Figura 9). Todos los oligonucleótidos fueron estandarizados de tal modo que la temperatura de
alineamiento sea de 55 °C (Tabla IV), por lo que la reacción de qPCR puede ser realizado en una
misma instancia para todas las muestras posibles según el equipo disponible.
51
Figura 7: Estandarización de partidores para la amplificación de MTF1. (A) Secuencia
de MTF1 amplificado (307 pb) utilizando los partidores cMTF1-3s y cMTF1-4a cuya secuencia
se destaca en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p,
mediante el software MxPro.
52
Figura 9: Estandarización de partidores para la amplificación de β-actina. (A) Secuencia
de β-actina (282 pb) amplificado utilizando los partidores cβact-s y cβact-a cuya secuencia se
marca en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p, mediante
el software MxPro.
53
Tabla IV: Oligonucleótidos gen específico para el análisis RT-qPCR. Acc.No. es el número
de acceso de la secuencia en GenBank; numero que indica la posición respecto a esta secuencia;
numero correlativo del oligonucleotido sentido (s/f) y antisentido (a/r), y tamaño del producto de
amplificación en cDNA. *Corresponde a secuencia de Danio rerio.
Acc. No Pocisión OLIGONUCLEOTIDO AMPLICÓN
cβ-actina M24113 2942-3326s GGACCTGTATGCCAACACTG
282 pb
a GTCGGCGTGAAGTGGTAACA
cMTF1 AY574056 68-3743s GAATGGTCCTCTCACGCAGA
307 pb
4a GTCGGCGTGAAGTGGTAACA
cMT AF002162 92-2241s TGGAACTTGCAATTGTGGTG
133 pb
2a GGAGTTGCCCTTACACACG
cVtg AF414432 962-11351s CCTTGTTGCAAACAATGTGG
174 pb
2a GTGCCAACAGAAGGAAGAGC
cGH M27000 443-613f TGGGCATCAGTGTGCTCATC
171 pb
r TCTCGACTTTGTGCATGTCC
cPRL X12543 434-595f AGCTGCAGGACAACATCAAC
162 pb
r AACAGGACAGCAGGAAATGGA
cSp1 NM212662 1286-1356s GCCTGCACATGCCCCTACTG
109 pb
* a GAGACGTCTTCCCGTACACC
cPit1 AF132287 1092-52738s GGTGAAGATCTAGAGTCATG
350 pb
9a GATGCGGGTCTGGGAGATGC
cRpx EF051105 40-24511s CTGGATCTCCAGATGGCTTC
206 pb
12a TCCACTGAAGCACCACTGTC
cPtx2 EF051103 99-29611s GAGAGGAGATCGCTGTTTGG
198 pb
12a CAGCCCAGTTGTTGTACGTG
54
4.3.1 Expresión de MTF1 y MT en respuesta a Zn en hígado de carpa
Con el objetivo de comprobar que el estímulo con Zn genera una respuesta, se procedió a
medir la expresión utilizando partidores para la amplificación de MT (Figura 10, A) y
vitelogenina [Vtg] (Figura 11, A) en hígado de carpas tratadas y control. Para ello, se diseñaron
partidores para cada uno de estas secuencias codificantes, los cuales fueron estandarizados a una
temperatura de alineamiento de 55 °C, obteniéndose un producto único tanto para MT (Figura
10, B), como para Vtg (Figura 11, B).
Cada individuo tratado con Zn aumentó la expresión de MT respecto a los niveles detectados
en las carpas control. Como era esperado, el análisis por RT-qPCR muestra un aumento
estadísticamente significativo de expresión del gen mt en hígado de carpas macho inyectadas con
Zn respecto a las carpas control (Figura 12, B). También se midió la expresión del gen mtf1 en
hígado de carpas tratadas y control mostrándose un aumento significativo en la expresión de este
gen (Figura 12, A). Por otro lado, se midió la expresión del gen de Vtg, para probar si el
tratamiento genera reacción cruzada con este gen, mostrándose por qPCR que no hay diferencia
estadísticamente significativa entre la expresión de VTG en carpas tratadas con Zn respecto a las
carpas controles (Figura 12, C).
55
Figura 9: Estandarización de partidores para la amplificación de MT. (A) Secuencia de
MT (133 pb) amplificado utilizando los partidores cMT-1s y cMT-2a cuya secuencia se destaca
en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p, mediante el
software MxPro.
56
Figura 10: Estandarización de partidores para la amplificación de Vtg. (A) Secuencia de
Vtg (174 pb) amplificado utilizando los partidores cVtg-1s y cVtg-2a cuya secuencia se destaca
en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p mediante el
software MxPro.
57
Figura 11: Expresión de MTF1, MT y Vtg en hígado en respuesta a Zn por RT-qPCR.
En RNA total de hígado se evaluó la expresión a nivel de transcritos de los genes (A) mtf1 (B) mt
(C) vtg. El análisis fue realizado en duplicado y todos los datos fueron normalizados por la
expresión del gen β-actina. Los gráficos representan la cuantificación relativa al gen
normalizador (dR) de tres individuos controles (n=3) y tres tratados con Zn (n=3), las barras
indican el error estándar. (*) Test t-student’s, P<0,1 fue considerado significativo.
58
4.3.2 Efecto de Zn en la expresión de MTF1, MT, PRL y GH en hipófisis de carpa
Una vez establecido que las carpas responden al tratamiento, se procedió a realizar RT-qPCR,
para el análisis de MT y MTF en hipófisis de carpas tratadas con Zn y controles. Se utilizaron los
mismos partidores antes descritos, los cuales fueron estandarizados a una temperatura de
alineamiento de 55 °C y normalizados con el gen β-actina.
Para observar si la expresión de estos genes se ven influenciados por estímulos con Zn, se
procedió a evaluar la expresión en hipófisis de carpas tratadas y control por RT-qPCR. Para ello
se diseñaron partidores dirigidos para GH y PRL, cuya secuencia de amplificación de GH
(Figura 13, A) con el cual dio un producto único de amplificación. Y por otro lado, la secuencia
de amplificación de PRL (Figura 14, A) comprobando un producto único de amplificación
(Figura 14, B) y normalizados con la expresión del gen β-actina.
Los resultados no muestran una diferencia significativa en la expresión, para el gen de MTF1
(Figura 15, A), así como tampoco para el gen de MT (Figura 15, B) en hipófisis de las carpas
tratadas con Zn respecto a los controles. Se observó que ambas hormonas responden a estímulos
con metales pero de forma distinta, mostrándose un aumento estadísticamente significativo de la
expresión de PRL frente a estímulos con Zn respecto a controles inyectados con agua (Figura 15,
C). Por otro lado, la expresión de GH presenta una disminución estadísticamente significativa en
carpas tratadas con Zn respecto al grupo de carpas control (Figura 15, D).
59
Figura 12: Estandarización de partidores para la amplificación de GH. (A) Secuencia de
GH (171 pb) amplificado utilizando los partidores cGH-f y cGH-r cuya secuencia se destaca en
negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p mediante el
software MxPro.
60
Figura 13: Estandarización de partidores para la amplificación de PRL. (A) Secuencia
de PRL (162 pb) amplificado utilizando los partidores cPRL-f y cPRL-r cuya secuencia se
destaca en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p mediante
el software MxPro.
61
Figura 14: Efecto de Zn sobre la expresión de MTF1, MT, PRL y GH en pituitaria de
carpas mediante RT-qPCR. RNA total de pituitaria fue utilizado para evaluar estos genes. El
análisis fue realizado en duplicado y todos los datos fueron normalizados por la expresión del gen
β-actina. Los gráficos representan la cuantificación relativa al gen normalizador (dR) de tres
individuos controles (n=3) y cuatro tratados con Zn (n=4), las barras indican la error estándar. (*)
Test t-student’s, P<0,1 fue considerado significativo.
62
4.3.3 Análisis de expresión de otros factores hipofisiarios
Para tener un acercamiento de que otros factores podrían estar involucrados en la regulación
hipofisaria frente a respuesta a metales, se midió la expresión de Sp1 (Figura 16), Pit1 (Figura
17), Rpx (Figura 18), y Ptx2 (Figura 19) mediante RT-qPCR utilizando partidores específicos
para cada uno de ellos, los que fueron estandarizados a una temperatura de alineamiento de 55 °C
y normalizados con el gen β-actina.
El análisis comparativo de expresión entre carpas inyectadas con Zn respecto a las inyectadas
con H2O revela que Sp1, Pit1, y Rpx, no cambian la expresión a nivel de transcripción al
estimulo con Zn de forma significativa (Figura 20, A, B, C). Por otro lado se observó que Ptx2
aumentó significativamente su expresión frente a estímulos con Zn respecto a las carpas controles
(Figura 20, D).
63
Figura 15: Estandarización de partidores para la amplificación de Sp1. (A) Secuencia de
Sp1 (109 pb) amplificado utilizando los partidores cSp1-s y cSp1-a cuya secuencia se destaca en
negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p, mediante el
software MxPro.
64
Figura 16: Estandarización de partidores para la amplificación de Pit1. (A) Secuencia de
Pit1 (350 pb) amplificado utilizando los partidores cPit1-8s y cPit1-9a cuya secuencia se destaca
en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p, mediante el
software MxPro.
65
Figura 17: Estandarización de partidores para la amplificación de Rpx. (A) Secuencia de
Rpx (206 pb) amplificado utilizando los partidores cRpx-11s y cRpx-12a cuya secuencia se
destaca en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p,
mediante el software MxPro.
66
Figura 18: Estandarización de partidores para la amplificación de Ptx2. (A) Secuencia
de Ptx2 (198 pb) amplificado utilizando los partidores cPtx2-11s y cPtx2-12a cuya secuencia se
destaca en negro. (B) Curva de disociación realizada por el equipo Stratagene Mx3000p,
mediante el software MxPro.
67
Figura 19: Efecto diferencial de Zn sobre la expresión de factores de transcripción en
pituitaria de carpas. Se evaluó el nivel de trascrito de (A) sp1; (B) pit1; (C) rpx; (D) ptx2 en
pituitaria por RT-qPCR. El análisis se realizó en duplicado y todos los datos se normalizaron por
la expresión del gen β-actina. Los gráficos representan la cuantificación relativa al gen
normalizador (dR) de cuatro individuos controles (n=4) y cuatro tratados con Zn (n=4), las barras
indican el error estándar. (*) Test t-student’s, P<0,1 fue considerado significativo.
68
5. DISCUSIÓN
MTF1 es evolutivamente conservado desde mamíferos hasta insectos y ha sido caracterizado
de varias especies incluyendo humanos (Schaffner et al., 1994), ratón (Schaffner et al., 1993),
capibara (Schaffner et al., 2008), pez globo (Schaffner et al., 1999), pez cebra, trucha (Dalton et
al, 2000), tilapia (Chanet al., 2010) y mosca (Schaffner et al., 2001).
En diversos estudios se han realizado comparaciones de secuencias aminoacídicas de MTF1
en distintas especies, confirmando que los dominios de unión dedos de Zn posee la característica
de tipo Cys2His2 (Andrews, et al., 2006). También comparaciones en NES en el cual se ha
comprobado que existe un patrón conservado de 4 lisinas intercaladas por otros aminoácidos
(*L*L**L*L*) (Schaffner et al., 2009). Últimamente descrito el clúster de dimerización de
MTF1 en los que se observa un patrón de cisteínas en la que se encuentra una glutamina
conservada entre las primeras cisteínas (CQC*C*C) (Schaffner et al., 2012). Todos estos
dominios funcionales están presente en la secuencia amino acídica derivada del MTF1 de carpa.
En este trabajo se realizaron alineamientos de secuencias aminoacídicas de MTF1 de 4
especies de peces teleósteos, Cyprinus carpio, Danio rerio, Takifugu rubripes, Oreochromis
niloticus, que mostraron alta identidad con un 79% entre C. carpio y D. rerio, un 64% entre C.
carpio y T. rubripes, y 69% entre C. carpio y O. niloticus. Al comparar el dominio de unión al
DNA del MTF1 de carpa se observó frente a D. rerio un 98%de identidad, un 97% de identidad
frente a T. rubripes, y un 98% de identidad frente O. niloticus. La alta identidad entre estas
especies reflejan la gran importancia que posee este dominio en la funcionalidad de esta proteína,
ya que al ser un factor de transcripción es sumamente importante conservar la capacidad de
69
unirse al DNA y que la divergencia en la capacidad de unión está más apuntada a la secuencia
cis-regulatoria, el elemento de respuesta a metal [MRE] en la región promotora de los genes
blancos y no hacia la secuencia de la proteína en este dominio (Schaffner et al., 1993). Respecto
al NES en esta tesis no solo se observó que las lisinas características de esta región son
conservadas sino que son idénticas en número y espaciamiento entre sí en las especies
comparadas, siendo esta secuencia además una secuencia señal idéntica incluso con mamíferos
(Schaffner et al., 2009). Esta conservación destaca la importancia de poseer un mecanismo que
regrese al factor de transcripción al citoplasma luego de promoverla mediante el NES y estar en
“stand by” para reaccionar rápidamente a cambios de concentración de metal en la célula
(Schaffner et al., 2009). Por otro lado, el cassette de dimerización en C. carpio, T. rubripes, O.
niloticus, mostró secuencia idéntica, pero en D. rerio no está presente esta secuencia de
dimerización. Curiosamente, esta secuencia de dimerización está presente desde mamíferos hasta
peces, pero Danio rerio no la posee (Schaffner et al., 2012). Hasta ahora, hay solamente esta
única secuencia MTF1 publicada y podría ser que existe otro gen duplicado en el genoma como
se ha mostrado con múltiples teleosteos (Arends et al., 1998; Kausel et al., 2010; Liu et al.,
2012). Por lo tanto, es totalmente posible que otras variantes de MTF1 aun no se han descrito,
que si posean la región de dimerización en pez cebra. Otras regiones, han sido comparadas así
como NLS que presente solo una diferencia en T. rubripes en el penúltimo aminoácido, teniendo
una asparagina en vez de lisina (Chan et al., 2010).
En la región acídica se reveló una identidad respecto a C. carpio de 98% con D. rerio, un
79% con T. rubripes, y un 85% con O. niloticus, identidades que se encuentran por sobre la
media respecto a la identidad de la secuencia completa. Respecto a el dominio de transactivación
rico en prolina es donde se observa una mayor divergencia entre las secuencias analizadas,
70
obteniéndose un 51% de identidad con D. rerio, un 24% de identidad con T. rubripes, y un 28%
con O. niloticus, por lo tanto este dominio es el que presenta el de más baja identidad de los
dominios estudiados. Finalmente el dominio de transactivación rico en serina/treonina presenta
identidades de 69%, 63% y 76% con D. rerio, T. rubripes y O. niloticus, respectivamente. El
dominio que presentó más divergencia fue el de rico en prolina, mientras que el mas conservado
resultó ser la región acídica (Schaffner et al., 1995).
Variantes génicas de MTF1 han sido encontradas en carpa donde la expresión de MTF1.1 es
ubicua, y MTF1.2 presenta una expresión significativa sólo en cerebro (Ferencz y Hermesz,
2008). Las secuencias parecen ser idénticas excepto por ocho aminoácidos (Figura 2), pero la
expresión diferencial de estas variantes de MTF1 en tejidos indican que la regulación promotora
podría ser distinta, o podrían existir regulaciones post-transcripcionales diferenciales en estos
órganos que regulan la presencia de transcritos de MTF1 (Ferencz y Hermesz, 2008).
Por otra parte, una variante de splicing ha sido descrita, que resulta en una variante de MTF1
trunca de 413 aá, el MTF1.1a. Si bien MTF1.1a corresponde a una variante de splicing de
MTF1.1. MTF1.1 estuvo presente en todos los tejidos, pero la variante trunca MTF1.1a ha sido
encontradaen hígado, sugiriendo que la regulación de este gen también difiere de los anteriores
descritos (Ferencz y Hermesz, 2009).
En tilapia también fue descrita una variante corta de MTF1, llamada MTF1S (Chan et al.,
2010). El análisis de secuencia mostró que MTF1S posee intacto el dominio de unión al DNA, y
también las NLS, pero interesantemente no posee NES, ni dominios de transactivación, por lo
que este factor podría translocarse al núcleo en respuesta a estímulos con metales y unirse a
secuencias MRE, pero no podría promover la transcripción de genes. Más aún no podría retornar
71
al citoplasma ya que carece de la secuencia señal y solamente se detectó en el núcleo (Schaffner
et al., 1995; Chan et al., 2010). Por lo tanto el MTF1S parece ejercer un constante efecto
regulador negativo de la transactivación de genes en respuesta a metales. En las variantes de la
carpa están presentes todos estos elementos.
Se realizó una compilación resumida de las secuencias aminoacídica de MTF1 de carpa, y se
realizó un alineamiento entre ellas. Observándose que las tres variantes de MTF1 descritas en
carpa mantienen intactos el dominio de unión al DNA, NLS y NES, lo que sugiere que se pueden
translocar al núcleo, unirse a secuencias MRE, y volver al citoplasma tal como fue descrito en
tilapia y en varios mamíferos (Chan et al., 2010). Respecto a las regiones transactivadoras
MTF1.1 y MTF1.2 mantienen la estructura general de este factor de transcripción, una región
acídica, una región rica en prolina y una rica en serina y treonina. Sin embargo, en la variante
MFT1.1a el splicing alternativo que causa la eliminación de 103 nucleótidos, que no es un
múltiple de tres y por lo tanto debe cambiar el marco de lectura de la proteína. Como
consecuencia de esto la región acídica se hace más corta, las restantes regiones de transactivación
desaparecen y se genera un stop codón, quedando la secuencia amino acídica derivada de 413 aá.
El análisis de los tripletes usados por carpa, revela que los codones utilizados por MTF1.1a,
luego del cambio del marco de lectura, son los normalmente utilizados en la traducción de
proteínas en carpa, sugiriendo una alta probabilidad de que esta proteína sea expresadas.
Entonces, se esperaría que esta proteína se exprese y tenga función, ya que al poseer la NLS
podría translocarse al núcleo, como posee dominio de unión al DNA intacto podría reconocer
secuencias MRE, y con la secuencia NES puede volver al citoplasma (Schaffner et al., 1995).
Desde el punto de vista funcional, se ha visto que proteínas MTF1 mutantes que no poseen los
dominios de transactivación ricos en prolina y ricos en serina/treonina, puede transactivar la
72
expresión de MT in vitro solo con el dominio acídico, pero no sabemos si la variante MTF1.1a
sería capaz de transactivarla, ya que le falta parte de este dominio de transactivación por lo que se
requeriría un estudio funcional de esta variante (Schaffner et al., 1995).
En el caso de tilapia la variante corta, sin la señal de NES, siempre se encontró en el núcleo
(Chan et al., 2010). En la carpa la variante corta MTF1.1a mantiene las señales tanto de NLS y
NES y podría ubicarse en el citoplasma y responder al metal translocandose al núcleo. Además,
esta variante MTF1.1a no posee el cluster de dimerización, región que es necesario para ejercer la
función de estimular la transcripción de su gen blanco, lo que sugiere que no podría funcionar
como estimulador de la transcripción (Schaffner et al., 2012).
Basado en los alineamientos de las secuencias de MTF1 de Cyprinus carpio, se diseñaron
péptidos para la preparación de anticuerpos contra MTF1 de carpa. De los dos péptidos diseñados
sólo uno generó inmunoreacción por lo que se trabajó con el suero anti-cMTF123-36 a una dilución
de 1:1000. Este anticuerpo se caracterizó por Western Blot, con extracto de proteínas totales, en
las que reveló que MTF1 se encuentra en todos los tejidos analizados, correspondiendo con la
detección ubicua de mensajeros de MTF1 descritas por Schaffner et al., (2000). Se observó una
banda en todos los extractos de proteína de aproximadamente 81 kDa, que sugiere la presencia
del MTF1 del tamaño completo de 670 aá. Pero la presencia de las variantes en cerebro,
hipotálamo, pituitaria, hígado, riñón, corazón, músculo, branquia a intestino es diferencial. Dada
la similitud que presentan en tamaño la variante MTF1.1 y MTF1.2 de carpa no fue posible
determinar si se encuentra presente uno o el otro (Ferencz y Hermesz, 2008), por otro lado la
variante corta MTF1.1a si fue posible de diferenciar. Con esto se confirmó por primera vez la
presencia de variantes de MTF1 tejidos específicos en carpa.
73
Se observó una banda en todos los extractos de proteína de aproximadamente 81 kDa, que
sugiere la presencia del MTF1 del tamaño completo de 670 aá. A pesar que la secuencia aá
derivada de las variantes 1.1 y 1.2 hasta ahora contempla la secuencia parcial donde faltan
regiones en el carboxilo terminal y en el amino terminal, la gran conservación de las secuencias
deducidas respecto al MTF1 hacen pensar que la secuencia completa de cada una de las variantes
1.1 y 1.2 también correspondería a una proteína del tamaño de 81kDa. En la secuencia revelada
hasta ahora, solamente hay diferencias en algunas de los amino ácidos individuales y se esperaba
que el anti-cMTF1 inmunodetectara indiscriminadamente las variantes 1.1 y 1.2 visualizando una
banda del mismo tamaño. Sin embargo, se encontró mediante RT-PCR el mensajero de MTF1.1
en todos los tejidos analizados, y el mensajero de la variante MTF1.2 solamente en cerebro que
podría corresponder a la banda indicada en el Western Blot (Ferencz y Hermesz, 2008). Por otra
parte, se observó la presencia de una banda más pequeña, de aproximadamente 45 kDa, que
sugiere la presencia de MTF1.1a la cual no mostró inmunorreacción en todos los extractos de
proteínas, comprobándose que esta variante es probablemente de expresión tejido específica. En
hígado por ejemplo está descrito que MTF1.1a no expresa el mensajero (Ferencz y Hermesz,
2009) coincidiendo con los resultados con los de esta tesis, ya que también se observó la ausencia
de inmunodetección en hígado, y presencia en cerebro. Y por primera vez se describe la presencia
de MTF1.1a en hipotálamo (Figura 5).
Paralelo con la detección de las variantes MTF1.1, MTF1.2 y MTF1.1a se realizó
secuenciación de amplicones obtenidos de RNA total de riñón y cerebro de carpas no tratadas. Se
determinó expresión basal de MTF1.1 en hígado, riñón, corazón, músculo y cerebro. La
detección de mRNA de MTF1.2 fue solo en cerebro, no encontrándose en hígado, riñón, corazón,
músculo y cerebro. Por último, a partir del mRNA de MTF1.1a fue detectada expresión basal en
74
riñón, corazón, musculo y cerebro, pero no fue detectado en hígado (Ferencz y Hermesz, 2008,
2009).
En este trabajo se muestra que la variante corta, MTF1.1a, se encuentra tanto en cerebro
como en hipotálamo, pero no se evidencia la presencia de esta variante en hipófisis de carpa. En
riñón, además de la banda correspondiente a las variantes ubicua de 81 kDa de MTF1 se vio la
presencia de una banda de 36 kDa, mientras que en intestino se observan dos bandas una de 56
kDA y una de 21 kDa la cual podría corresponder a otras variantes tejido específicos de MTF1 en
carpa. Es poco probable que se trate de reacción inespecífica porque la inmunorreacción es limpia
y hay tejidos con una banda. Además, el anticuerpo está dirigido contra un epítope en la región
cerca del amino terminal de secuencia única de la proteína predicha de MTF1 y no contra un
epítope del dominio de unión al DNA que podría eventualmente tener reacción cruzada con otras
proteínas de la familia de proteínas con dedos de Zn.
La proteína de 114 kDa inmunodetectada con anti-cMTF1 en cerebro, hipotálamo hipófisis,
músculo y corazón podría corresponder a una forma de MTF1 parecida a la proteína ZRF de
116 kDa, aislada de proteínas nucleares de células HeLa por unión a secuencias MRE (Koizumi
et al., 1994). La ZRF se identificó como MTF1 por secuenciación de la parte amino terminal de
la proteína que mostró una secuencia idéntica con MTF1 de humano. Además, ZRF fue capaz de
transactivar MT en humano (Koizumi et al., 1999). El anti-cMTF1 está dirigido al oligopéptido
que representa el amino terminal de la secuencia amino acídica derivada de MTF1 de carpa. Todo
lo anterior sugiere que la proteína de 114kDa corresponde a una forma MTF1 especifica en la
carpa.
75
En otros estudios se ha logrado establecer que PRL se expresa en una región llamada RPD en
pituitaria de carpa (Figueroa et al.,1994). Por otra parte se ha mostrado que GH se expresa en la
región PPD de pituitaria (Figueroa et al., 2005). Mediante Western Blot se observó la presencia
de MTF1 en pituitaria de carpa, por lo que a continuación se realizó inmunohistoquímica para
detectar la ubicación celular de MTF1 en pituitaria de carpa.
Utilizando anticuerpos anti-cPRL y anti-cGH preparados en nuestro grupo de trabajo, se
detectó inmunoreacción en las regiones descritas de lactotropas con el anti-cPRL y en la región
de las somatotropas con el anti-cGH confirmando la especificidad de los anticuerpos. Los
resultados de la inmunodetección con el anticuerpo anti-cMTF1, revelaron reacción
específicamente fuerte en un grupo de células en la parte “caudal” de la PPD en la región donde
también se expresa GH. Al parecer el anti-cMTF1 no reaccionó en RPD donde se expresa PRL,
ni en PI donde se expresa SL. Por lo tanto, en pituitaria existen células específicas que expresan
MTF1 en una localización específica de PPD.
Para esclarecer como se relacionan las células inmunorreactivas con anti-cMTF1 con las
células inmunopositivas con el anti-cGH, se realizaron inmunohistoquímicas dobles utilizando
fluorescencia, revelando que existe una población de células que expresan fuertemente MTF1 y
estas mismas células también expresan GH. Pero además se observó que en otras regiones de
PPD también se expresa MTF1 pero de forma basal. Estos resultados indican que existe una
directa relación morfológica entre GH y MTF1 al menos es este grupo de células en la pituitaria,
ya que muestran una co-localización en la región caudal de PPD en pituitaria. Por otra parte,
respecto a MTF1 no se observó una colocalización con PRL, en los cortes de pituitaria
evaluados, indicando que no hay una directa relación morfológica entre MTF1 y PRL. Eso
76
sugiere que MTF1 podría estar implicado en la regulación de la respuesta a metal y en la
expresión de la hormona GH. Los resultados de este análisis del contexto celular de la presencia
de MTF1 en hipófisis sugiere una relación morfofuncional con las somatotropas, información
novedosa que complementa la detección de mensajeros en extracto de RNA total de la glándula
pituitaria.
En este trabajo se presentó un diseño experimental in vivo, para la búsqueda de
biomarcadores moleculares en el ambiente acuático, por lo que encontrar un diseño experimental
que utilice individuos vivos y que sean mantenidos en un ambiente natural que otorgue las mayor
cantidad de factores ambientales, es sumamente importante. Aquí las carpas se mantuvieron en
un pozo en condiciones de fotoperiodo, temperatura y alimentación natural, y tratadas como se
indica en Materiales y Métodos.
El diseño experimental presentado, implica experimentos con 8 peces, los cuales se
mantuvieron en un mismo pozo por a lo menos 2 semanas previo al tratamiento, cuatro peces
tratados con metal (Zn) y cuatro con vehículo (control), y luego sacrificados en una misma
mañana para reducir variaciones en los resultados. En otros diseños experimentales se evalúan la
respuesta a metales in vivo, entre ellos con carpas aclimatadas en estanques, temperatura y
alimentación controlada, en donde el metal (Cd2+
) es administrado diluyéndolo en el estanque
(Ferencz y Hermesz, 2008, 2009). También se han utilizando diseños experimentales en los que
se evaluó la respuesta a metales in vivo en respuesta a Zn utilizando tilapias mantenidas en
estanques a temperatura y fotoperiodo controlados (Chan, 2010). En todos estos casos se mostró
el aumento de la expresión de metalotioneina MT en hígado en respuesta a metal lo que es
77
indicativo de que MT constituye el gen marcador robusto para indicar un efecto biológico a
metal.
Para medir la respuesta al tratamiento en nuestro modelo, se utilizaron dos genes controles en
hígado de carpas tratadas con Zn y controles con H2O. Los resultados por RT-qPCR utilizando
partidores específicos para el gen mt y el gen vtg, indican que en estas condiciones de trabajo,
aumenta significativamente la expresión del gen mt, y no de la expresión de vtg, en carpas
tratadas con Zn respecto a las carpas controles inyectadas con H2O. Por lo tanto, en estas
condiciones no se observó reacción cruzada entre la vía de expresión MT con la vía de VTG.
Adicionalmente se midió la expresión del gen mtf1, mostrándose un aumento significativo en la
expresión de este gen en respuesta a Zn respecto a carpas control corroborando los resultados de
Danio rerio (Hogstrand et al., 2008). Por lo tanto, bajo estas condiciones de trabajo las
diferencias significativas en la expresión de MT y MTF1, indica que Zn está estimulando la
respuesta a metales en los individuos del estudio. La no variación de VTG, indica que no hay
reacción cruzada en estas condiciones, y que la activación de la respuesta a metales es específica,
no como en el caso de Oncorhynchus mykiss donde ocurre modulación de la expresión de mt y
vtg en respuesta a metal (Thompson et al., 2001). Interesantemente se ha visto que mediante
estímulos con 17β-estradiol en nuestro modelo utilizando este diseño experimental, aumentó
significativamente la expresión del gen vtg, y la expresión de mt no presentó variación bajo estas
condiciones en carpas (Valenzuela et al., 2012).
La expresión de MTF1 se ha observado mediante RT-PCR convencional en diversos tejidos,
entre ellos cerebro (Ferencz y Hermesz, 2008, 2009), pero hasta el momento no se ha evaluado la
expresión del gen mtf1 en hipófisis de carpa. En esta tesis fue descrito que MTF1 está presente
78
en hipófisis y que existe una región donde se destaca su presencia en la región caudal de PPD y
se ha establecido una relación morfofuncional con GH. Los análisis de RT-qPCR revelaron que
MTF1 no aumentó significativamente en pituitarias de carpas inyectadas con Zn respecto a la
expresión de MTF1 en pituitarias de carpas controles. No obstante, en estudios previos se mostró
mediante espectrometría de absorción atómica, que las concentraciones de Zn aumentó en
pituitaria luego de la exposición a Zn descrita en este trabajo que significa que el Zn aplicado por
inyección intraperitoneal logró acceder hasta la pituitaria. Lo que quiere decir que a los tiempos
evaluados y en las condiciones presentadas Zn no estimuló la expresión de MTF1 en pituitaria
contrariamente a lo sucedido en hígado (Hogstrandet al., 2008), paralelamente se evaluó la
expresión del gen mt en pituitaria, observándose algo parecido a lo ocurrido con MTF1, por su
parte MT no respondió a Zn en pituitaria de carpas inyectadas con Zn respecto a las carpas
control, coincidiendo en que si el factor de transcripción MTF1 no varió significativamente su
expresión, entonces el gen blanco tampoco cambio (Schaffner et al., 1993).
Se observó que la expresión de GH en pituitaria de carpa respondió al estímulo con Zn en las
condiciones presentadas, disminuyendo su expresión de manera significativa en pituitarias de
carpa inyectadas con Zn respecto a las carpas controles. Hasta ahora solamente se ha reportado la
baja de expresión de GH en musculo en respuesta a Zn en trucha (Ekinciet al., 2011). En lo
observado en la pituitaria en carpa, al parecer la modulación de la expresión de GH no es
dependiente de MTF1, puesto que no se observó un cambio significativo de MTF1 en respuesta a
Zn en pituitaria. Podrían estar implicado otros factores como indica Andrews et al., (2008).
Por otra parte la expresión de PRL mostró que responde a estímulos con Zn aumentando su
expresión en pituitarias de carpas inyectadas con Zn respecto a controles. Como MTF1 no parece
79
estar presente en las lactotropas y tampoco cambia su expresión en pituitaria en respuesta a Zn, y
podría ocurrir la modulación de PRL por otro mecanismo o la participación de otros factores. Por
ejemplo se ha mostrado que PRL posee la capacidad de unir el Zn lo que sugiere un mecanismo
por el cual el Zn es transportado de nuevo a la circulación mediante esta hormona (Sun et al.,
1996).
Otros factores de transcripción fueron evaluado frente a estímulos con metales Sp1, un factor
de transcripción relacionado con remodelación de cromatina y con afinidad a elementos cis-
regulatorios rico en GC y por lo tanto con afinidad por sitios MRE descrito como un regulador
negativo a la respuesta a metales (Koizumi et al., 2001), no respondió al estimulo con metal en
pituitaria de carpas inyectadas con Zn respecto a las carpas controles.
Pit1 el factor de transcripción específico de pituitaria, no varió su expresión, aunque cabe
señalar que se han encontrado dos genes funcionales de Pit1 (Kausel et al., 2006), no es conocido
si está ocurriendo expresión diferencial de estos genes en respuesta a metales. En la región
promotora de uno de los genes duplicados de pit1 de Cyprinus carpio se ha identificado in silico
un elemento de respuesta a metales (MRE) (Kausel et al., 2006), por lo que se postuló a pit1
como un gen que podría responder a metales mediante MTF1.Pero MTF1 no respondió a Zn en
pituitaria de carpa, y podría ser por eso que no fue modulada le expresión de Pit1. Para genes
duplicados existen los siguientes destinos; pérdida y pseudogenización, conservación de la
función, subfuncionalización y el desarrollo de una nueva función (Zhang, 2003), y a pesar de
que puede resultar un obstáculo al momento de proponer una vía de respuesta a una señal, la
posibilidad de estudiar la función de genes duplicados amplía las posibilidades de encontrar
80
nuevas funciones, principalmente en términos de regulación y la importancia de caracterizarlos
por separado en un organismo con el genoma duplicado como en el pez C. carpio (Elgar, 2004).
Rpx es un factor de transcripción el cual no tiene funciones claras en adultos, ya que es más
bien un factor de determinación temprana o diferenciación de la pituitaria (Hermesz et al., 2003),
no responde a metales en pituitaria de carpas inyectadas con Zn respecto a las carpas controles en
estas condiciones de trabajo. En el desarrollo Rpx se expresa antes de Pit1 y recién cuando baja la
expresión de Rpx aumenta la de Pit1, significa que Rpx es un regulador negativo de Pit1 (Pagoda
y Hammerschmidt, 2009). Consistente con esta observación, se encontró en pituitaria de carpas
adultas una alta expresión de Pit1 en verano y una baja presencia de mensajeros de Rpx, contrario
a lo ocurrido en invierno, observándose una baja presencia Pit1 y una alta presencia de Rpx
(Kausel et al., 2010). Por lo tanto coincide que ningún cambio en la expresión de Pit1 medido
por RT-qPCR tampoco registra cambios significativos de Rpx.
Por otra parte se observó que Ptx2 responde a estímulos con Zn, aumentando
significativamente su expresión en pituitaria de carpas inyectadas con Zn respecto a las carpas
controles. Hasta el momento no se ha mostrado alguna correlación entre metales y Ptx2,
desconociéndose el mecanismo por el cual se está estimulando su expresión, ya que MTF1 no
aumenta su expresión ni MT está siendo activado. En mamíferos se ha mostrado la unión de Ptx2
al DNA en la región 5’ del gen de PRL y la interacción proteína-proteína con Pit1, modulando en
sinergia la expresión de PRL (Amendt et al., 1998, 1999; Quentien et al., 2002; Quentien et al.,
2006). Se propone que la estimulación de la expresión de PRL se debe al aumento en la expresión
de Ptx2, el que podría estar implicado en la regulación de la expresión de PRL observado en las
carpas tratados con Zn y mediar el efecto del metal en lactotropas donde MTF1 parece ser
81
ausente. el cual se postula como un biomarcador de respuesta a metales en pituitaria de carpa,
como contaminante en el ambiente acuático, y como un factor de respuesta a Zn específico de
pituitaria.
Ptx2 también es capaz de transactivar los promotores humanos de PRL, GH y Pit-1 in vitro
(Pellegrini et al., 2002). Ptx2 se expresa en PPD de carpa, lo que sugirió una relación con la
modulación de GH, análisis por hibridación in situ revelaron una correlación inversa entre Ptx2,
alto en invierno, baja en verano y GH, alto en verano y bajo en invierno (Kausel et al., 2006). En
este trabajo se corroboró mediante RT-qPCR, que cuando aumentó la expresión de Ptx2, GH
disminuyó.
En el presente trabajo se presenta un modelo de trabajo in vivo para la caracterización de
biomarcadores de contaminación acuática con metales, utilizando individuos vivos,
contemplando las variables naturales del ambiente como es el fotoperiodo, temperatura y
alimentación natural. Se destacan los siguientes conclusiones.
Se caracterizó una recopilación de la información disponible de MTF1 en la base de
datos, respecto a los dominios de este factor así como de sus variantes en Cyprinus
carpio, observándose que el extremo amino de la proteína es altamente conservado.
Se caracterizó un anticuerpo anti-cMTF1, mostrando por primera vez la presencia de
MTF1 en pituitaria, además se mostró la presencia de las variantes de tamaño de
MTF1 en distintos órganos.
En pituitaria se mostró que en una zona de PPD existe una subpoblación celular que
marcó una clara presencia de MTF1.
82
Se estableció mediante técnicas inmunológicas relaciones morfofuncionales entre
MTF1 y GH. Los análisis de expresión por RT-qPCR indican que los efectos de Zn en
pituitaria de carpa parecen ser independientes de MTF1, por lo que otros factores de
transcripción podrían ser que responden a metales.
Claramente Ptx2 aumentó su expresión frente a estímulos con Zn, dándole a este
factor una posible función como regulador de metales en pituitaria.
Estos nuevos hallazgos contribuyen a esclarecer posibles vías de respuesta a metales en pituitaria
y a la búsqueda de nuevos biomarcadores de contaminación acuática, sugiriendo a Ptx2 como un
posible biomarcador de contaminación por metales.
83
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