ACTA ORTOP BRAS 13(1) - 2005 13

ARTIGO ORIGINAL

Trabalho recebido em : 14/01/04 aprovado em 16/12/04

Trabalho realizado no Departamento de Cirurgia e Ortopedia (DCO) da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) – Unesp

EMILIO CARLOS CURCELLI1, SÉRGIO SWAIN MÜLLER2, ANETE KINUMI UEDA3, CARLOS ROBERTO PADOVANI4,

FRANCISCO HUMBERTO DE ABREU MAFFEI5, WILLIAM SAAD HOSSNE6

1 - Professor Assistente2 - Professor Assistente Doutor3 - Professora Assistente Doutora - Departamento de Patologia4 - Professor Titular - Departamento de Bioestatística5 - Professor Titular6 - Professor Emérito

Endereço para Correspondência: Departamento de Cirurgia e Ortopedia –Faculdadede Medicina de Botucatu - Unesp, Campus de Rubião Júnior Cep: 18.618-970Botucatu - SPE-mail: curcelli@fmb.unesp.br

Efeito da heparina sódica e da enoxaparina na consolidaçãode fratura da tíbia no rato: avaliação clínica e

anatomopatológica e biomecânicaEffect of heparin-sodium and enoxaparin on rats tibial fracture healing:

clinical,anatomopathological, and biomechanical approach

RESUMO

Foi realizado estudo experimental em ratos para avaliar oefeito do anticoagulante na consolidação óssea, conforme cri-térios clínicos, anatomopatológicos e biomecânicos. Manual-mente, após perfuração do osso, foi produzida fratura aberta,na diáfise da tíbia direita, mantida sem imobilização, em 72 ra-tos machos da linhagem Wistar, com 60 dias de idade e pesomédio de 242 gramas. Doze horas após a fratura, foi iniciadotratamento anticoagulante, mantido por 28 dias. Via subcutâ-nea, um grupo recebeu heparina sódica na dose de 200UI/Kgde 12 em 12 horas, enquanto outro, recebeu enoxaparina nadose de 1mg/Kg de 12 em 12 horas, doses preconizadas paratratamento do tromboembolismo em humanos. O terceiro gru-po, controle, recebeu água destilada. Durante o experimento,os animais foram avaliados clinicamente e após 28 dias, sacrifi-cados. Nos animais dos três grupos, a evolução clínica foi se-melhante. Mediante análise anatomopatológica efetuada porestudo descritivo e quantitativo, foi observada presença de fi-brose, cartilagem e osso igualmente nos três grupos, semprecom predomínio de tecido ósseo. O estudo biomecânico, reali-zado por intermédio de ensaios de flexão, demonstrou coefici-ente de rigidez e carga máxima semelhantes nos três grupos.Nenhuma diferença clínica, anatomopatológica e biomecânicafoi encontrada, resultando todas as fraturas em consolidaçãode acordo com os critérios adotados, concluindo-se, portanto,que a heparina sódica e a enoxaparina nas doses, via e tempode administração utilizados não interfiriram na consolidação dafratura da tíbia do rato.

Descritores: Fraturasda tíbia; Cicatrização de feridas; Ratos decepas endogâmicas; Heparina; Heparina de baixo peso mole-cular; Biomecânica; Histologia.

SUMMARY

An experimental study in rats was accomplished to evaluatethe effect of anticoagulant on fracture union, according to clini-cal, anatomopathological, and biomechanical approaches. Ma-nually, after bone perforation, fracture was produced in the dia-physis of the right tibia, and maintained without immobilization in72 male rats of Wistar lineage, each 60 days in age with a me-dium weight of 242 grams. Twelve hours after the fracture, anti-coagulant treatment was initiated, and maintained for 28 days.One group received subcutaneous heparin-sodium in a dose of200 UI/kg every 12 hours, while another group received enoxa-parin in a dose of 1mg/kg every 12 hours, doses preconized fortreatment of thromboembolism in humans. The third group, thecontrol, received distilled water. During the experiment, the ani-mals were clinically evaluated and after 28 days, sacrificed. Inthe animals of the three groups, the clinical evolution was similar.By means of anatomopathological analysis made by descriptiveand quantitative study, the presence of fibrosis, cartilage, andbone was homogeneous among in the three groups, always witha prevalence of osseous tissue. The biomechanical study, ac-complished through a flexion test, demonstrated a stiffness rateand maximum load similar in the three groups. No clinical, ana-tomopathological, or biomechanical differences were found, re-sulting in consolidation of all the fractures in agreement with theadopted approaches, concluding that the heparin-sodium andthe enoxaparin in these doses, method, and time of administrati-on used did not interfere with the consolidation of tibia fracture inthe rat.

Keywords: Tibia fractures; Wound healing; Rats, Inbred strains;Heparin; Low molecular weight heparin, Biomechanics;Histology.

INTRODUÇÃO

Os anticoagulantes têm sido cada vez mais indicados comomedida terapêutica ou profilática da doença tromboembólica,em pacientes com fraturas(8). Considerando-se a freqüência comque se administram anticoagulantes em pacientes com fratu-ras, torna-se pertinente indagar se os anticoagulantes podemalterar o processo de reparação óssea.

Trueta(19) e Buckwalter & Cruess(3), em textos clássicos daliteratura traumato-ortopédica, afirmaram que os anticoagulan-tes retardam o processo de consolidação. Outros autores con-firmam esta hipótese(1,4,10,12,16,18,20) Entretanto, em outros estudos,não se encontrou interferência de anticoagulants no processode reparação das fraturas ósseas(2,5,13,14,17).

Considerando as divergências encontradas na literatura, estainvestigação foi desenvolvida com o objetivo de estudar, por

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No 27o dia pós-operatório, um rato dogrupo controle morreu., não sendo possí-vel identificar a causa da morte.Três ani-mais foram excluídos do experimento. Umdo grupo controle, por morte. Um do gru-po B (enoxaparina) e outro do grupo C (he-parina sódica), em virtude da quebra doosso no momento da dissecção.

Análise AnatomopatológicaNos oito animais do subgrupo A

1 (con-

trole), o calo de fratura apresentou tecidoósseo predominante em todos os animaise, em geral, em grande quantidade; ilhasde tecido cartilaginoso em cinco animais:dois, em pequena e três, em moderadaquantidade; áreas de fibrose em sete ani-mais, na maioria em pequena quantidade;

havia concomitância de tecido cartilaginoso, em cinco.O tecido ósseo mostrou-se, em geral, maduro ou em matu-

ração, com aspectos de ossificação endocondral, apresentan-do rima de osteoblastos e raros focos de osteoclastos. A neo-formação óssea localizava-se, principalmente, na região perifé-rica do calo, em continuidade com o periósteo do osso primá-rio; estava presente também em menor quantidade na regiãocentral. A proliferação de tecido ósseo foi sempre mais intensaquando, no local da fratura, as extremidades ósseas primáriasnão estavam justapostas. Nestes casos, o tamanho do calo defratura também foi maior.

O tecido cartilaginoso, quando presente, era maduro e semlocalização preferencial no calo.

Nos sete casos com fibrose, havia cinco de associação afragmentos ósseos necróticos e cinco em associação a granu-loma tipo corpo estranho a pêlos dos animais.

De permeio ao calo de fratura, havia também neoformaçãode medula óssea, normocelular, ao passo que a medula ósseado osso primário mostrou-se sempre hipercelular. Em ambas,foram observados vários focos de hemorragia e, em alguns ani-mais, presença de macrófagos com pigmentos de hemossiderina.

Em todos os animais, observaram-se extremidades ósseasprimárias viáveis, em continuidade com a neoformação óssea docalo e ausência de processo inflamatório inespecífico (Figura 2).

Nos calos de fratura dos animais tratados com enoxaparina,observaram-se predominância de tecido ósseo; tecido cartila-ginoso presente em apenas dois animais; um, com pequena, eoutro, com moderada quantidade; fibrose em cinco animais,predominantemente, em pequena quantidade.

Esse subgrupo demonstrou semelhanças com o controle,pela neoformação predominante de tecido ósseo no calo defratura, com proliferação preferencialmente periférica e presen-ça de ossificação endocondral. Houve também correspondên-cia entre a quantidade de tecido ósseo neoformado e o tama-nho do calo. Quanto à quantificação desta neoformação, foramobservados dois animais com pequena, três com moderada eos outros três com grande quantidade. Os tamanhos dos calosde fratura dos animais tratados com enoxaparina foram, em geral,menores do que os do controle.

O tecido cartilaginoso, maduro e de distribuição aleatória nocalo, foi observado em apenas dois animais, número menor queno controle.

Encontrou-se fibrose em cinco casos; em três, estava relaci-onada a processo granulomatoso a pêlos, lamelas córneas, te-cido necrótico e hemossiderina. Em um animal, a fibrose estavaassociada a mínimos fragmentos ósseos necróticos. As medu-las ósseas, tanto a preexistente (hipercelular) quanto a neofor-mada (normocelular), demonstraram morfologias semelhantesàs do subgrupo controle, com focos de hemorragia.

Em todos os animais observaram-se extremidades ósseasprimárias viáveis, em continuidade com a neoformação óssea eausência de processo inflamatório inespecífico (Figura 3).

meio de avaliação clínica, anatomopato-lógica e biomecânica, o efeito da hepari-na sódica e da enoxaparina na consoli-dação óssea, utilizando modelo experi-mental de fratura aberta em tíbia de rato.A presente investigação foi aprovadapela Comissão de Ética na Experimenta-ção Animal da Faculdade de Medicina deBotucatu, Unesp.

MATERIAL E MÉTODOForam utilizados 72 ratos machos da

linhagem Wistar, com 60 dias de idade,peso médio de 242g, fornecidos pelo Bi-otério Central da UNESP - Campus deBotucatu. Por sorteio, foram formadosseis grupos: A

1 e A

2, controles, que rece-

beram água destilada, B1 e B

2, enoxaparina e C

1 e C

2, heparina

sódica. Três grupos, compostos por oito animais cada, foramutilizados para o estudo anatomopatológico (A

1, B

1 e C

1) e ou-

tros três, de 16 animais cada, para estudo biomecânico (A2, B

2

e C2). Após sete dias de adaptação, foi produzida fratura aberta

na diáfise da tíbia. Para a realização da fratura, utilizando-se detécncas de assepsia e antissepsia, inicialmente foi feita perfura-ção no ponto médio da tíbia com broca de 1mm acoplada afuradeira elétrica. Após a perfuração a fratura foi completadamanualmente. Não foi utilizado qualquer tipo de imobilização. Aadministração das drogas foi iniciada 12 horas após a fratura erepetida a cada 12 horas, durante 28 dias. No grupo A (contro-le) os animais receberam 0,1ml/kg/dia de água destilada; nogrupo B, 2 mg/kg/dia de enoxaparina e no grupo C, 400 UI/kg/dia de heparina sódica. As drogas foram administradas por viasubcutânea. Não foram realizados testes para controle da co-agulação, em razão das alterações esperadas (com estas dro-gas e nestas doses) já serem conhecidas em nosso laboratório,a partir de dados da padronização do modelo disponíveis naliteratura e de outros trabalhos realizados em nosso serviço(6,9).

Após 28 dias da produção da fratura, os animais foram mor-tos com dose letal de pentobarbital sódico e a tíbia direita remo-vida. As análises efetuadas foram clínica, anatomopatológica ebiomecânica. As características histológicas dos calos de fra-tura foram descritas de acordo com a quantidade dos diferen-tes tecidos (fibrose, cartilagem e osso); dimensão do calo defratura; alinhamento das extremidades ósseas primárias presen-ça de necrose no local da fratura e nas extremidades ósseasprimárias; aspectos das medulas ósseas (primária e neoforma-da); presença de processo inflamatório (inespecífico e granulo-matoso tipo corpo estranho).

A quantidade dos diferentes tipos de tecidos foi classificadaem escala de 0 a 3 (0-ausente; 1-pequena quantidade; 2-mo-derada quantidade; 3-grande quantidade). O resultado foi sub-metido a teste estatístico não paramétrico de Friedman e Kruskal-Wallis.

Para a análise biomecânica foi realizado ensaio de flexão detrês pontos com a máquina universal de ensaios tipo eletrome-cânica do Laboratório Experimental do Departamento de Cirur-gia e Ortopedia da Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP.A carga foi aplicada até a ruptura do corpo de prova. Não foiutilizada pré-carga. O ensaio mecânico foi realizado conforme aseguinte padronização: célula de carga: 5000 N; sentido: com-pressão; velocidade de aplicação da carga: 30x10-3m/min;escalas:3000N(ordenada)e 2,5 m 10-3 (abscissa) (Figura 1 a-b).

RESULTADOAspectos ClínicosNão foram observadas diferenças no comportamento dos

animais nos três grupos. Não foram constatadas presença deinfecção, ou formação de hematoma no local de aplicação domedicamento.

A BFigura 1a-b- Ensaio de flexão até a rupturado corpo de prova.

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Nos animais tratados com heparinaforam encontrados no calo de fratura pre-domínio, em todos, de tecido ósseo neo-formado, em geral, em moderada quanti-dade; tecido cartilaginoso em quatro ani-mais um, em pequena e três, em modera-da quantidade; fibrose em sete animais,seis, com mínima ou pequena quantidadee um, em moderada quantidade.

Comparado aos dois subgrupos ante-riores, notou-se semelhança quanto aopredomínio de tecido ósseo, aos aspec-tos de ossificação endocondral e à locali-zação principal periférica. Porém, nos ani-mais desse subgrupo, a quantidade deosso neoformado foi, em geral, menor quenos do subgrupo controle e, também dosubgrupo tratado com enoxaparina. Quan-to ao tamanho dos calos de fratura, houvesempre correlação entre a quantidade detecido ósseo neoformado com o alinha-mento das extremidades ósseas, como ob-servado nos subgrupos anteriores. A mai-oria dos animais submetidos ao tratamen-to com heparina demonstrou calos ósse-os menores do que os dos subgrupos con-trole e da enoxaparina.

O tecido cartilaginoso mostrou-se se-melhante ao dos demais subgrupos no quese refere à sua maturação e distribuiçãoaleatória no calo. Esteve presente em qua-tro animais: um, em pequena e três em mo-derada quantidade, número semelhanteaos do controle (cinco) e maior do que nostratados com enoxaparina (dois casos).

A fibrose, também semelhante à dosoutros subgrupos, esteve, geralmente, re-lacionada aos fragmentos ósseos necróti-cos (quatro casos) ou aos granulomas tipocorpo estranho a pêlos, lamelas córneas ematerial necrótico (quatro casos).

Os aspectos das medulas ósseas, pre-existente (hipercelular) e neoformada (nor-mocelular), ambas com focos hemorrági-cos, foram equivalentes aos dos animaisdos subgrupos anteriores.

Em todos os animais foram observadasextremidades ósseas primárias viáveis e au-sência de inflamação inespecífica. (Figura 4).

A avaliação quantitativa dos diferentestipos de tecido encontrados no calo de fratura dos animais utili-zados para estudo anatomopatológico (subgrupos A-

1, B

1, C

1)

(Tabela 1).

Análise BiomecânicaOs dados referentes ao peso das tíbias dos animais utiliza-

dos para o estudo biomecânico (subgrupos A2, B2, C2) estãoapresentados na tabela 2. A Tabela 3 apresenta os dados obti-dos para carga máxima nos subgrupos A2, B2 e C2. Na Tabela4, os valores do coeficiente de rigidez nos subgrupos A2, B2 e C2.

DISCUSSÃOAs doses de heparina sódica e enoxaparina utilizadas neste

trabalho correspondem às preconizadas para tratamento datromboembolia em humanos(15) A administração dos anticoagu-lante foi iniciada 12 horas após a produção da fratura e mantidapor 28 dias, estando, portanto, os anticoagulantes presentesem praticamente todas as fases do processo de consolidaçãoóssea, excetuando-se a fase de remodelação.

Os animais foram mortos após tempoconsiderado suficiente para a consolidaçãodo osso, de acordo com Müller(11).

Análise ClínicaA uniformidade do comportamento dos

animais nos três grupos e, sobretudo, o fatode todos os animais apoiaram a pata afeta-da aproximadamente uma semana após arealização da fratura, mantendo evoluçãoclínica semelhante, possibilita inferir que, cli-nicamente, o tratamento anticoagulante nãointerferiu na consolidação do osso desdeas suas fases iniciais.

Análise AnatomopatológicaHam(7) identificou três fases no proces-

so de consolidação: granulação, prolifera-ção e remodelação, que podem estar pre-sentes simultaneamente, com predomíniode uma ou outra, dependendo do instantedo processo de consolidação.

A primeira fase, intitulada granulação,caracteriza-se pela formação do hematomae presença de células inflamatórias, inclu-indo leucócitos polimorfonucleares, macró-fagos e linfócitos. Com a regressão da res-posta inflamatória, o tecido necrótico e o ex-sudato são reabsorvidos e aparecem os fi-broblastos(3). Distúrbios nesta fase como,formação insuficiente de coágulo de fibri-na(18), presença mais persistente do hema-toma(8), hemorragia no local da fratura(1), for-mação de extenso hematoma com conse-qüente déficit de vascularização(16) e con-sistência mais fluida do hematoma(19), atri-buídos à ação dos anticoagulantes, pode-riam interferir no processo de consolidação.

Entretanto, Flatmark(5) não encontrou al-terações na formação de fibrina nos ani-mais tratados com anticoagulantes e neminterferência do tamanho do hematoma noprocesso de consolidação. Nosny et al.(13)

promoveram lise do coágulo interfragmen-tário e não encontraram alterações na con-solidação óssea.

A segunda fase, proliferativa, se carac-teriza pela marcante presença de célulasmesenquimais pluripotentes no local da fra-tura. Segundo a maioria dos autores, osanticoagulantes podem induzir alteraçõesna fase proliferativa da consolidação. Stin-

chfield et al.(18) encontraram diminuição do número de célulasda matriz óssea; Minola et al.(10), fibrose central e estágio cartila-ginoso mais prolongado; Aulisa(1), retardo na formação de novoosso e calo maior e mais intensamente dominado por cartila-gem; Rokkanen & Slätis(16), calo em maturação por tempo maisprolongado, com maior formação de cartilagem; Flatmark(5),abundante formação de tecido cartilaginoso; Dodds et al.(4), re-tardo da ossificação do calo de fratura, Nilsson & Granström(12),aumento da reação condróide; Wikesjo et al.(20), menor quanti-dade de tecido de reparação.

Excessiva formação de tecido cartilaginoso foi atribuída aodesvio da normalidade do processo de reparação(10), maior ex-tensão do hematoma ou à “alguma propriedade intrínseca” doanticoagulante(1) e à pobre vascularização(16). Flatmark(5)e Nils-son & Granström (12) não explicaram o fenômeno.

Neste experimento, os animais foram mortos na quarta se-mana após fratura. Não foi encontrado predomínio de tecidocondróide que pudesse evidenciar estágio cartilaginoso maisprolongado. Fibrose, cartilagem e osso foram encontrados si-

O

F

O

F

C

FI

Figura 2 - Tecido ósseo (O) em grandequantidade com ossificação endocondral.

Tecido cartilaginoso (C) em moderadaquantidade. Tecido fibroso em moderada

quantidade, maduro (F) e imaturo (FI) -(Alcian Ponceau, 25x - AO).

Figura 3: Tecido ósseo neoformado comossificação endocondral. Medula ósseanormocelular com focos hemorrágicos

(�) - (Alcian Ponceau, 33x - AO).

Figura 4 -Tecido ósseo neoformadocom ossificação endocondral. Medula

óssea normocelular com focoshemorrágicos (�)- (HE, 25x - AO).

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multaneamente em todos os subgrupos, com predomínio detecido ósseo.

Para a confirmação das observações do estudo descritivo,utilizou-se método que permitisse a quantificação dos tecidosdo calo, traduzindo em números a impressão subjetiva da des-crição histológica. Foi adotado método similar ao de Müller (11).

A análise estatística dos resultados demonstrou que em to-dos os subgrupos houve predomínio de tecido ósseo, e que aquantidade de tecido fibroso, cartilaginoso e ósseo foi seme-lhante comparando-se os subgrupos. Assim, não foi constata-da, histologicamente, nenhuma diferença na composição teci-dual do calo de fratura, com evidentes aspectos de consolida-ção, compatível com os trabalhos citados na literatura, com ex-ceção de Stinchfield et al.(19) e Dodds et al.(4).

Stinchfield et al.(18) e Dodds et al.(4) utilizaram ossos esponjo-sos em seus experimentos, diferentemente da maioria dos es-tudos citados e desta investigação, em que foram utilizados os-sos corticais. Como os ossos esponjosos apresentam área desuperfície, vascularidade e celularidade maiores que os corti-cais(3), talvez sejam mais susceptíveis à ação do anticoagulan-te, durante o processo de consolidação.

Análise BiomecânicaOs animais utilizados neste estudo apresentaram as mes-

mas características em relação à idade, sexo e peso corpóreo,variando somente o tratamento instituído a cada grupo. O pesodas tíbias fraturadas e utilizadas para estudo biomecânico foisemelhante nos três subgrupos, indicando que o tratamento nãointerferiu no peso dos ossos e que se fossem encontradas dife-renças nos testes biomecânicos, não poderiam ser atribuídasao fator peso dos ossos.

A velocidade aplicada, de 30mm/min, é considerada média.Ensaios realizados com velocidades médias ou baixas permi-tem maior segurança e possibilitam a acomodação progressivado corpo de prova, apoiado sem fixação, pois a própria cargafixa o material durante o ensaio.

Nesta investigação, optou-se pelo estudo das propriedadesmecânicas relativas à estrutura: carga máxima necessária à rup-tura e coeficiente de rigidez (constante K).

O valor da carga máxima é indicado pelo relatório de ensaioe corresponde ao limite de resistência do material antes da rup-tura. O valor do coeficiente de rigidez é calculado valendo-sedo diagrama carga-deformação, também fornecido pelo relató-rio de ensaio.

Os dados de carga máxima e coeficiente de rigidez são com-plementares. A análise baseada somente em uma dessas pro-priedades pode levar à errônea conclusão de que materiais di-ferentes apresentam as mesmas propriedades mecânicas, poismateriais de diferentes elasticidades podem exigir a mesma for-ça para a ruptura ou vice-versa. A associação dos valores dacarga máxima e do coeficiente de rigidez permite a avaliaçãomais precisa das propriedades mecânicas do material.

Flatmark(5) foi o único autor a realizar estudo biomecânicocomo critério para avaliar o efeito dos anticoagulantes na repa-ração óssea. Utilizando ensaio de tração, testou fraturas de rá-dio de coelhos em diversas fases do experimento e observouque, nos animais em tratamento anticoagulante, a rigidez doosso foi aumentando gradativamente até seis semanas apósfratura, quando se tornou semelhante à do grupo controle.

No presente experimento, constatou-se semelhança das pro-priedades mecânicas analisadas, indicando que não houve in-fluência dos anticoagulante na consolidação óssea, medianteestudo biomecânico.

CONCLUSÃOMediante a proposição, a metodologia aplicada e a análise

dos resultados obtidos nas avaliações clínicas, anatomopato-lógicas e biomecânicas, foi possível concluir que a administra-ção de enoxaparina e de heparina sódica, em ratos, não interfe-riu na consolidação óssea.

Tabela 3 - Média e desvio-padrãoda variável carga máxima (N) ob-tida nos três grupos experimen-tais, hipóteses testadas, estatís-tica calculada e comentários

Tabela 4 - Média e desvio-padrãoda variável coeficiente de rigidez(N/10-3m), obtida nos três gruposexperimentais, hipóteses testa-das, estatística calculada e co-mentários.

Tabela 2 - Média e desvio-padrãoda variável peso da tíbia (g) dosanimais, dos três grupos experi-mentais, hipóteses testadas, es-tatística calculada e comentários.

Tabela 1- Mediana, escores (mí-nimo e máximo) da quantidadede tecido presente no calo ósseoe resultados dos testes das com-parações de subgrupos e tipo detecido - subgrupos A

1, B

1, C

1.

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