UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

VANJA V. STOJANOVIĆ

Efekti ekstrakta kantariona (Hypericum

perforatum L.) na vijabilnost i proliferaciju

HeLa ćelija in vitro

M A S T E R R A D

Niš, 2012.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Efekti ekstrakta kantariona (Hypericum

perforatum L.) na vijabilnost i proliferaciju

HeLa ćelija in vitro

M A S T E R R A D

KANDIDAT: MENTOR:

Vanja V. Stojanović Prof. Dr Stevo Najman

Niš, Decembar 2012.

„Ĉovek je roĊen da radi, da trpi i da se bori, ko tako ne ĉini, mora

propasti“

Nikola Tesla

U svoj master rad uložio sam puno rada, vremena i strpljenja, ali

svakako da svoju neizmernu zahvalnost dugujem i ljudima oko sebe bez

kojih ne bih mogao da realizujem svoje zamisli.

Zahvaljujem se osoblju i Institutu za biologiju sa humanom genetikom,

Medicinskog fakulteta u Nišu na kojem je realizovan eksperimentalni deo

ovog master rada.

Posebno se zahvaljujem prof. dr Stevi Najmanu, čoveku koji mi je od

početka studija dosta pomogao u sticanju profesionalnih znanja, iskustava i

tehnika iz oblasti molekularne biologije, citologije, genetike i radu sa

laboratorijskim životinjama i koji se osim svog izuzetnog znanja i

profesionalnosti ističe i izvanrednim ljudskim kvalitetima, a meni je bila

čast da mi upravo on bude mentor pri izradi ovog master rada. Prof. dr

Stevo Najman mi je pružio veliku podršku i ogromnu pomoć prilikom

odabira teme, upućivanja u način rada, materijal i metode kao i tumačenju

rezultata, ali i tokom celog procesa realizacije.

Veliku zahvalnost dugujem i asistentkinji Jeleni Najdanović koja je

uložila veliki deo svog vremena i pružila mi ogromnu pomoć prilikom

eksperimentalnog dela rada i tumaĉenju dobijenih rezultata.

Naročitu zahvalnost dugujem porodici i prijateljima koji su bili uz

mene sve vreme i pružili mi veliku podršku.

Ovaj rad posvećujem mojim roditeljima s’ ljubavlju

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________

SAŽETAK

Cilj ovog rada bio je da se utvrde efekti ekstrakta kantariona (Hypericum perforatum

L.) na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro. U tu svrhu uraĊeno je ispitivanje

delovanja razliĉitih koncentracija ekstrakta kantariona u obliku komercijalnog preparata

Biosenzal®-a na HeLa ćelije. Ispitivane su efektivne doze Biosenzala od 0,625, 1,25%, 2,5%,

5%, 10% i 15%. Pošto je biosenzal alkoholni ekstrakt, odgovarajuće koncentracije etanola

sluţ ile su kao kontrola rastvaraĉa. Negativna kontrola su bile ćelije u ĉistom medijumu.

Pozitivna kontrola citotoksiĉnosti bio je saponin, a citostatiĉnosti 5-fluorouracil. Vijabilnost

ćelija na 24 sata i proliferacija ćelija na 72 sata su ispitivane pomoću MTT testa. Eksperiment

je ponovljen tri puta, a u svakom eksperimentu su uzorci testirani u tetraplikatu. Ustanovljena

je dozna zavisnost delovanja ekstrakta kantariona i na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________

ABSTRACT

The aim of this study was to determine the effects of St. John's wort (Hipericum

perforatum L.) extract on viability and proliferation of HeLa cells in vitro. For this purpose

was done the examination of the effects on HeLa cells caused by different concentrations of

hipericum extract in the form of commercial product of Biosenzal®. The effective doses of

Biosenzal which were examined are 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% and 15%. Since

Biosenzal is an alcoholic extract, the appropriate concentrations of ethanol were used as a

solvent control. Negative controls were cells in the pure medium. Positive controls of

cytotoxicity were cells in saponin and positive controls of the cytostatic effect were cells in 5-

Fluorouracil. Viability of cells after 24 hours and proliferation of cells after 72 hours, were

investigated by using MTT test. The experiment was repeated three times, and in each

experiment the samples were tested in quadruplicate. Dose dependence of effects caused by

hypericum extract on viability and proliferation of HeLa cells were determined.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________

SADRŽAJ:

1. UVOD ...................................................................................... 1 1.1 HIPERICUM PERFORATUM L. (KANTARION) ......................................... 1

1.2 HeLa ĆELIJSKA LINIJA ................................................................................ 6

1.3 PREGLED LITERATURE .............................................................................. 10

1.4 ĆELIJSKA KULTURA ................................................................................... 12

2. POSTAVLJANJE PROBLEMA I CILJ RADA ................. 14

3. MATERIJAL I METODE .................................................... 15 3.1 MATERIJAL ............................................................................... 15

3.1.1 HeLa ĆELIJE .......................................................................................... 15

3.1.2 BIOSENZAL .......................................................................................... 15

3.1.3 SAPONIN ............................................................................................... 15

3.1.4 FLUOROURACIL .................................................................................. 15

3.1.5 ETANOL .................................................................................................16

3.1.6 MEDIJUM .............................................................................................. 16

3.1.7 TRIPSIN – EDTA ................................................................................... 16

3.1.8 PBS ......................................................................................................... 17

3.1.9 MTT ........................................................................................................ 17

3.1.10 TRIPAN PLAVO (TRYPAN BLUE) ..................................................... 17

3.2 LABORATORIJSKA OPREMA .............................................. 18 3.2.1 INKUBATOR ........................................................................................ 18

3.2.2 MIKROSKOP ......................................................................................... 18

3.2.3 CENTRIFUGA ....................................................................................... 19

3.2.4 VIŠEKANALNI FOTOMETAR (ELISA READER) .......................... 19

3.3 METODOLOGIJA RADA SA ĆELIJAMA ............................. 20 3.3.1 ZAMENA MEDIJUMA ......................................................................... 20

3.3.2 BROJANJE ĆELIJA ............................................................................... 20

3.3.3 PASAŢA ĆELIJA ................................................................................... 22

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________

3.3.4 ZAMRZAVANJE ĆELIJA ..................................................................... 23

3.3.5 ODMRZAVANJE ĆELIJA .................................................................... 23

3.3.6 PRIPREMA RASTVORA ZA TESTIRANJE ....................................... 24

3.3.7 PRAVLJENJE RADNOG RASTVORA TRYPAN BLUE ................... 27

3.4 MTT TEST .................................................................................... 27 3.4.1 ESEJ VIJABILNOSTI / CITOTOKSIĈNOSTI ..................................... 29

3.4.2 ESEJ PROLIFERATIVNOSTI / CITOSTATIĈNOSTI ........................ 29

4. EKSPERIMENTALNI DIZAJN ......................................... 30

5. REZULTATI I DISKUSIJA ................................................. 32 5.1 CITOTOKSIĈNOST (VIJABILNOST) .................................... 33

5.2 CITOSTATIĈNOST (PROLIFERACIJA) ............................... 41

6. ZAKLJUĈAK ........................................................................ 49

7. LITERATURA .............................................................. ........ 50

8. BIOGRAFIJA ........................................................................ 54

KLJUĈNA DOKUMENTACIJA FAKULTETA .................... 55

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 1

1. UVOD

1.1 HIPERICUM PERFORATUM L. (KANTARION)

Hipericum perforatum L. (eng. St. John’s wort) ili u narodu poznat pod nazivom

kantarion (slika 1), ali i bogorodiĉina trava i gospino zelje je lepa biljka koja uglavnom raste

na sunĉanim padinama i suvim livadama ali i po ivicama borove šume. Vrsta pripada familiji

Hipericaceae. Naziv St. John's wort ili „biljka Svetog Jovana“ pod kojim je opštepoznata

dobila je zahvaljujući periodu cvetanja, oko datuma ovog praznika odnosno krajem juna i

poĉetkom jula meseca. Njegovi svetlo zlatni cvetovi ĉine ga jednom od najlepših biljnih vrsta

u biljnom carstvu. Dve neobiĉne karakteristike ĉine kantarion lakim za identifikaciju. Prvo,

kada se lišće drţ i prema svetlu, mogu se videti providne taĉkice kao da je lišće perforirano pa

otuda i latinski naziv „perforatum“. Inaĉe ove taĉkice predstavljaju ţ lezde sa sekretovanim

etarskim luĉenjem. Drugo, stabljika ima dve oštre ivice što je vrlo znaĉajna karakteristika.

Ĉeste su biljke sa okruglim ili ĉetvoroiviĉnim stabljikama dok su redje one sa dvoiviĉnim.

Hipericum perforatum je jedini predstavnik svoje familije sa dvoiviĉnom stabljikom (1).

Slika 1. Hipericum perforatum L. – Kantarion (2,3)

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 2

Druge dve podvrste imaju stabljike koje izgledaju tako da imaju krilasta pojaĉanja duţ

iviĉnih delova. Te podvrste su Hipericum quandrangulum odnosno ĉetvoroiviĉni Hipericum i

Hipericum tetrapterum odnosno ĉetvorokrilni Hipericum. Obe vrste su manje od Hipericum

perforatum-a, naseljavaju vlaţ ne livade i ne koriste se u medicinske svrhe.

Drogu kantariona, ĉine osušeni vršni delovi u cvetu. PotvrĊeno je da su pupoljci

cvetova najbogatiji sastojcima. Kantarion se sakuplja u poĉetnoj fazi cvetanja, preĉisti se i

brzo suši na temperaturi koja ne prelazi 40ºC. Do skora se herba dobijala od samoniklih

biljaka, ali poslednjih godina postoje zahtevi za gajenjem kantariona u Nemaĉkoj, Poljskoj i

Juţ noj Americi.

Svetle taĉke na listovima kantariona su sekretorne ţ lezde koje sadrţ e bezbojnu

teĉnost sastavljenu od isparljivih ulja i smole. Brojne male crne taĉke postaju vidljive nakon

boljeg pregleda ĉašiĉnih i kruniĉnih listića. Kada se protrljaju izmeĊu prstiju izlazi crveni

pigment. Ovaj pigment koji se nalazi kroz celu biljku je još jedna posebna osobina jer dosta

sadrţ i fotosenzitivnu supstancu. Ovaj fotosenzitivni uticaj je prvi put otkriven kod goveda

koja su konzumirala kantarion u velikim koliĉinama, a kod kojih se kasnije stvorila upale

koţ e na pojedinim mestima nakon duţ eg izlaganja suncu. U nekim sluĉajevima su se kod

goveda javile i opekotine i to ĉak i sa mehurovima. Sliĉne iritacije koţ e takoĊe se mogu

pojaviti i kod ljudi nakon intenzivne upotrebe kantariona i naknadne izloţe nosti intenzivnom

suncu. Fotodinamiĉka supstanca koja se nalazi u kantarionu zove se hipericin (slike 2 i 3).

Uĉinak hipericina je sliĉan uticaju hematoporfirina, sintetiĉkog proizvoda razgradnje

hemoglobina koji ima antidepresivno delovanje (1).

Slika 2. Trodimenzionalna struktura hipericina (4) Slika 3 Strukturna formula hipericina (5)

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 3

Osim hipericina, kantarion sadrţ i i brojne druge hemijski aktivne elemente i to:

etarsko ulje (0,1%), heterozide fenolkarbonskih kiselina i flavonoida (4-5%), kvercetin,

izokvercetin, rutin, hiperozid, amentoflavon, hlorogensku kiselinu, procijanidine i

kondenzovane tanine (6,5-15%), naftodiantronska jedinjenja (0,1-0,5%), pseudohipericin,

protohipericin, protopseduohipericin, derivate floroglucinola (hipertrofin i

pseudohipertrofin), ksantonska jedinjenja magniferinskog tipa, ugljovodonike (n-alkane),

alkohole (n-alkonole), triterpene i sterole. Ove supstance koje se javljaju imaju izraţ ene

uĉinke u inhibiciji monoamin oksidaze (MAO). In vitro ispitivanja su pokazala da ksantoni u

kantarionu imaju sliĉan efekat. Cela biljka (Hiperici herba) se priprema kao ĉaj, sveţ sok ili

ekstrakt sa procentom hipericina od 0,2-1 mg (6).

Farmakološka aktivnost kantariona je do danas ostala nedovoljno objašnjena uprkos

brojnim sprovedenim istraţ ivanjima. Na osnovu istraţ ivanja na ţ ivotinjama za kantarion je

utvrĊeno da ima svojstvo inhibiotora MAO (monoamin oksidaze). Ipak, te koncentracije

hipericina nisu odgovarajuće za primenu na ljudima. Istraţ ivanja su pokazala da je celokupno

dejstvo ekstrakta kantariona veće je nego dejstvo samo izolovanog hipericina. Rezultati

raznih eksperimenata potvrĊuju da kantarion pokazuje aktivnost, ali da ipak, antidepresivni

efekat kantariona podleţ e raznim diskusijama. Dokazano je da nedostatak svetlosti i

smanjenje nivoa melatonina u telu uzrokuju depresiju. Ova istraţ ivanja vode ka primeni

fototerapije u psihijatriji. Zbog fotosenzitivnosti, osobine koju kantarion poseduje, on bi

mogao biti upotrebljen za bolje iskorišćenje svetlosti (1).

Kantarion ima veliku primenu. Još su stari Grci i kasnije Paracelzijus upotrebljavali

kantarion u leĉenju psihiĉkih poremećaja. U narodnoj medicini se koristi kao antidijaroik

zahvljujući prisustvu tanina i diuretik zbog prisustva flavonoida. TakoĊe se koristi i za

leĉenje reumatizma, gihta, noćnog mokrenja u postelji i dr (7).

J. Tucakov (1971) je istakao da je „kantarionov zejtin“ vekovni lek za ljude i ţ ivotinje

i da je poslednjih godina ušao u nauĉnu medicinu, veterinu i kozmetologiju, ali i da se

kantarion oduvek u narodu cenio i upotrebljavao za leĉenje opekotina, posekotina,

hemoroida, zarašćivanje rana i kao antiseptik, protiv bolova jetre, ţ eluca, pojavu proliva i dr

(8).

Kantarionovo ulje (Oleum Hyperici) takoĊe se ĉesto koristi. Ovo ulje se priprema

posebnom tehnikom, a svrha je dobijanje aktivnog hipericina u što koncentrovanijem obliku.

Ulje je pogodno za internu upotrebu, ali se obiĉno koristi eksterno za leĉenje trauma i

mialgija. Macerat se pravi tako što se sveţ i cvetovi kantariona poliju uljem (obiĉno

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 4

maslinovim ili suncokretovim, slika 4). Boca u kojoj se pravi je ĉvrsto zapeĉaćena i

ostavljena u umereno toplom okruţ enju u periodu od 6 nedelja, a izloţ ena je direktnoj

sunĉevoj svetlosti. Proizvod, kantarionovo ulje, je lepa rubin-crvena teĉnost koja fluorescira

tamno crveno do crvenkasto ţ uto pod uticajem svetlosti (1).

Slika 4. Pravljenje kantarionovog ulja (9,10)

U Rusiji se kantarion upotrebljava u obliku tinkture ili infuza kao antiinflamantorno i

antiseptiĉno sredstvo kod katara creva, kolitisa, za ispiranje i mazanje desni i dr.

Kliniĉke studije su pokazale da kantarion ima blago sedativno, antidepresivno i

antianksiozno dejstvo. TakoĊe ima i antiflogistiĉno dejstvo zahvaljujući velikoj koliĉini

flavonoida koje sadrţ i. Precizirane su sledeće indikacije kantariona:

Unutrašnja upotreba:

Psihovegetativni poremećaji.

Blaga do umerena depresija.

Anksioznost, nervoza i uznemirenost.

Spoljašnja upotreba:

Leĉenje traumatskih povreda.

Leĉenje mialgija.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 5

Antidepresivni efekat kantariona danas je veoma dokumentovan. Dosta modernih

kliniĉkih ispitivanja su pokazala njegov antidepresivni efekat. Wagner (1995) je prikazao 26

kliniĉka ispitivanja koja su bila kompletno objavljena do sredine 1993. U ovim istraţ ivanjima

kantarion je bio uporeĊivan sa sintetiĉkim antidepresivima i placebo sredstvima. U odnosu na

sintetiĉka sredstva, frekvencija neţ eljenih efekata bila je mnogo manja kod kantariona, dok je

terapeutska efikasnost bila u nivou sintetiĉkih sredstava. U mnogim sluĉajevima kantarion je

doveo do poboljšanja kognitivnih sposobnosti. Iskustva su pokazala da je potrebno minimum

osam dana tretmana da bi se primetili pozitivni efekti, a uglavnom se koristi ĉetiri do šest

nedelja dok se ne ostvari puna efikasnost (1).

Iz svega moţ emo zakljuĉiti da kantarion (Hipericum perforatum L.) ima veoma

široku medicinsku primenu a shodno tome od njega se spravljaju preparati u raznim oblicima

(slika 5) koji se koriste na već opisane naĉine.

Slika 5. Preparati kantariona (11, 12, 13, 14)

U ispitivanjima sprovedenim u ovom radu korišćen je farmaceutski proizvod

kantariona BIOSENZAL® koji predstavlja kantarionov ekstrakt hipericina u alkoholnom

rastvoru, a ispitivan je njegov uticaj u razliĉitim koncentracijama na vijabilnost i proliferaciju

HeLa ćelija in vitro.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 6

1.2 HeLa ĆELIJSKA LINIJA

HeLa ćelije (slika 6) predstavljaju kancerski besmrtni tip ćelijske linije i najĉešće se

koriste u nauĉnim istraţ ivanjima (15). Ime su dobile u ĉast pacijentkinje koja se zvala

Henrieta Laks (Henrietta Lacks, 1920 – 1951) (slika 8.) iz ĉijeg su kancera grlića materice

(cervical cancer) (slika 7) ćelije prvi put izolovane 8. februara 1951. (16). Henrieta Laks

preminula je 4. oktobra 1951. od posledica kancera. Za razliku od mnogih drugih ćelijskih

linija, HeLa ćelije su veoma izdrţ ljive i imaju veliku moć deobe (17, 18).

Slika 6. HeLa ćelije (19, 20) Slika 7. Kancer grlića materice (21, 22)

Ĉovek koji je uzeo i poĉeo da gaji ove ćelije bio je Dţ ordţ Oto Gej (George Otto Gey,

1899 – 1970) (slika 9) i to neposredno pre smrti pacijentkinje Laks. Ovo je bila prva ćelijska

linija uspešno uzgojena u uslovima in vitro što je pruţ ilo veliku perspektivu budućim

nauĉnim istraţ ivanjima. Oto Gej je davao ćelijske linije i metode za kultivisanje ćelija

svakom nauĉniku koji je to traţ io, a sve za dobrobit nauke. Ovaj nauĉnik nije dobio

odobrenje Henriete Laks i njene porodice da moţ e da uzgaja ćelije, ali u to vreme dozvola

nije ni bila potrebna niti je bilo uobiĉajeno traţ iti je (23). Ćelije su potom komercijalizovane

iako nikada nisu patentirane u svojoj izvornoj formi. U to vreme, kao ni sada, pacijent se ne

mora obaveštavati o takvim stvarima jer materijal dobijen tokom operacija ili tretmana ostaje

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 7

u vlasništvu lekara ili biomedicinske ustanove (trenutno se u tu svrhu zahteva etiĉko

odobrenje i saglasnost pacijenata u Velikoj Britaniji). Ovo pitanje i sluĉaj Henriete Laks je

dospelo na sudu u Kaliforniji. Sud je doneo odluku da odbaĉeno tkivo i ćelije nisu više u

vlasništvu pacijenta i da mogu biti komercijalizovani (24). U poĉetku je reĉeno da će ime

ćelijske linije biti „Helen Lane“ ili „Helen Larson“ kako bi se zaštitila privatnost Henriete

Laks. Uprkos tome, njeno ime poĉelo da se pominje u štampi nekoliko godina posle njene

smrti. Za HeLa ćelije se kaţ e da su besmrtne, jer mogu da se u ćelijskoj kulturi pod

povoljnim uslovima dele neograniĉen broj puta. Postoje mnogi sojevi HeLa ćelija i one i

dalje evoluiraju u ćelijskim kulturama. Ipak, sve one, nastale su od istih tumorskih ćelija

uzetih iz tela Henriete Laks. Procenjuje se da broj ćelija koji je do sada umnoţ en, daleko

prevazilazi ukupan broj ćelija koji je saĉinjavao njeno telo (25).

Slika 8. Henrietta Lacks (26) Slika 9. George Otto Gey (27)

HeLa ćelije je pedesetih godina koristio Dţ onas Salk (Jonas Salk) radi testiranja

vakcine protiv deĉje paralize. Od tada se ove ćelije koriste u istraţ ivanjima kancera, AIDS-a,

efekata radijacije i toksiĉnih supstanci, mapiranju gena i u raznim drugim istraţ ivanjima (28).

Prema autoru Rebeki Sklut (Rebecca Skloot) do 2009. je objavljeno više od 60 000 nauĉnih

ĉlanaka raĊenih na HeLa ćelijama i taj broj konstantno raste za više od 300 meseĉno (24).

TakoĊe se koriste i za testiranje procesa infekcije parvovirus-om kod ljudi, pasa i maĉaka kao

i za ispitivanja delovanja virusa, na primer Oropouche virus (OROV), koji izaziva poremećaj

ćelija u ćelijskim kulturama i koji vrlo brzo nakon inficiranja izaziva virusnu indukciju

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 8

apoptoze (29, 30). HeLa ćelije se takoĊe koriste u istraţ ivanjima ekspresije papiloma virusa

E2 i apoptoze, ali i prouĉavanju virusa štenećaka i njegove sposobnosti da indukuje apoptozu

u HeLa ćelijskim linijama (31). Sposobnost ovog virusa da indukuje apoptozu moţ e biti od

kljuĉnog znaĉaja u razvoju tretmana tumorskih ćelija otpornih na radijaciju i hemoterapiju

(32). HeLa ćelije su izrazito pogodne za prouĉavanje ćelija kancera jer se umnoţ avaju

abnomarlno brzo ĉak i u poreĊenju sa drugim ćelijama raka (33). Ove ćelije kao i druge ćelije

raka, imaju aktivnu verziju telomeraze tokom ćelijske deobe što spreĉava skraćivanje

telomera a time i starenje i smrt ćelija (34). Na taj naĉin, ove ćelije zaobiĊu takozvani

Hayflick Limit koji oznaĉava ograniĉeni broj ćelijskih deoba dok kroz taj proces prolaze sve

normalne ćelije. Zahvaljujući horizontalnom transferu gena, humanog papiloma virusa 18

(HPV 18) koji je najĉešće integrisan u ćelije kancera grlića materice, genom HeLa ćelija je

znatno izmenjen od genoma ćelija Henriete Laks i to na razliĉite naĉine ukljuĉujući i broj

hromozoma. HeLa ćelije imaju 82 hromozoma sa po 4 kopije hromozoma 12 i po tri kopije

hromozoma 6, 8 i 17. Genom HeLa ćelija je neverovatno stabilan posle toliko godina

kultivacije. S toga, detektovane genetske promene verovatno su bile prisutne u prvobitnom

tumoru i reflektuju dogadjaje koji su od znaĉaja za razvoj raka grlića materice (24, 26, 35).

Zbog njihove dobre adaptacije u plejtovima i inkubatorima u ćelijskoj kulturi,

ponekad ih je teško kontrolisati. Dokazano mogu da kontaminiraju druge ćelijske linije što

istraţ ivaĉe prisiljava da mnoge rezultate proglase nevaţ ećim. Stepen kontaminacije izmeĊu

HeLa i ostalih tipova ćelija nije poznata jer je malo istraţ ivaĉa testiralo identitet ĉistoće već

uspostavljenih ćelijskih linija. Pokazalo se da je znaĉajan deo u linijama in vitro, a procene se

kreću od 10%-20%, kontaminiran HeLa ćelijama. Stenli Gartler (Stanley Gartler, 1967) i

Valter Nelson Ris (Walter Nelson-Rees, 1975) su prvi objavili kontaminaciju razliĉitih

ćelijskih linija od strane HeLa (36). Nauĉnik Majkl Gold (Michael Gold) pisao je o

kontaminaciji HeLa ćelijama u svojoj knjzi „Zavera ćelija“ (Conspiracy of Cells). On je to

opisao kao opšti problem koji se javlja ĉak i kod najboljih nauĉnika i u najboljim

laboratorijama i institutima, zbog ĉega mnogi prestaju time da se bave istraţ ivanjima u tom

smeru (37). Kontaminacija HeLa ćelijama umalo nije dovela do hladnog rata izmeĊu

Amerike i Sovjetskog Saveza pošto su na insistiranje predsednika Riĉarda Niksona (Richard

Nixon) Amerika i Sovjetski savez poĉeli da saraĊuju u istraţ ivanjima u borbi protiv raka.

Nelson-Ris objašnjava da je ljudski grešiti, da mnogi nauĉnici i istraţ ivaĉi nisu spremni da

bace svo uloţ eno vreme u istraţ ivanja, jer su najĉešće vremenski ili materijalno uslovljeni na

neki naĉin, da nauĉnici na mnogim poduhvatima prave greške i da svi imaju isti problem.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 9

Umesto da se fokusiraju na rešavanje problema, mnogi nauĉnici predstavljaju problem

kontaminacije jednostavno kao problem uzrokovan neljudskom greškom. Poslednji podaci

ukazuju na to da je unakrsna kontaminacija HeLa ćelijama i dalje glavni problem u ćelijskim

kulturama savremenih istraţ ivanja. Koliko je veliki problem kontaminacije HeLa ćelijama

govori i podatak da se na stranici ICLAC-a (The International Cell Line Authentication

Committee) kaţ e da je problem kontaminacije mnogo veći nego što mnogi o tome ţ ele da

govore (37).

Zbog svoje velike moći deobe, kao i razliĉitog broja hromozoma u odnosu na ljudske

ćelije, Li Van Valen (Leigh Van Valen) je HeLa ćelije opisao kao savremeni primer nastanka

nove vrste – Helacyton gartleri. Ćelijska linija je nazvana po Stenliju Gartler-u (Stanley M.

Gartler) koga je Van Valen povezivao sa otkrićem „neverovatnog uspeha nove vrste“ (38).

Njegov argument za specijaciju HeLa ćelija ogleda se u sledećim stavovima:

Hromozomska inkopatibilnost sa ljudskim ćelijama.

Ekološka niša HeLa ćelija.

Njihova sposobnost da opstanu i prošire se izvan kultivatora.

HeLa ćelije mogu biti definisane kao vrsta koja ima svoj liĉni klonalni kariotip.

Ipak, ova Van Valen-ova definicija nije opšte prihvaćena od strane istraţ ivaĉa i nauĉnika.

Van Valen je pored naziva vrste predloţ io i ime familije – Helacytidae roda Helacyton.

Klasifikacija HeLa ćelija prema Van Valenu mogla bi biti prikazana na sledeći naĉin (38):

Carstvo Nepoznato

Razdeo Nepoznato

Klasa Nepoznato

Red Nepoznato

Familija Helacytidae

Rod Helacyton

Vrsta Helacyton gartleri

Istraţ ivanje i rezultati predstavljeni u ovom radu baziraju se upravo na korišćenju

HeLa ćelijske linije.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 10

1.3 PREGLED LITERATURE

Publikovana su brojna istraţ ivanja u kojima su ispitivani uticaji hipericina na

vijabilnost i proliferaciju ćelija. U tu svrhu, ispitivani su i mehanizmi pomoću kojih hipericin

ostvaruje svoj citotoksiĉan i citostatiĉan efekat na pojedine ćelijske linije. Novija istraţ ivanja

sve više potvrĊuju znaĉajno mesto hipericina u apoptozi (slika 10), zahvaljujući ĉemu bi

mogao da naĊe primenu u terapiji nekih tumora (39, 40). Foks i saradnici ispitivali su

antiproliferativnu aktivnost hipericina na normalne, transformisane i maligne T-limfocite kao

i mogućnost njegovog korišćenja u terapiji limfoproliferativnih koţ nih bolesti (41).

PotvrĊeno je da je jedan od mehanizama kojim hipericin inhibira proliferaciju T-ćelija

indukcija apoptoze ili programirane ćelijske smrti. TakoĊe je potvrĊen dozno zavisni

inhibitorni efekat na rast ćelija adenoma, koji se ostvaruje inhibicijom protein kinaze C

(PKC) (42). Protein kinaza C, takoĊe poznata kao PKC, je familija enzima koji kontrolišu

dejstvo drugih proteina putem fosforilacije hidroksilnih grupa serinskih i treoninskih

aminokiselinskih ostataka tih proteina. PKC enzimi se aktiviraju signalima poput povećanja

koncentracije diacilglicerola ili Ca2+. PKC enzimi imaju vaţ nu ulogu u nekoliko kaskada

prenosa signala (43). Weller i saradnici (1997) su potvrdili da hipericin indukuje apoptozu na

sedam ćelijskih linija malignog glioma, uz dozno vremensku zavisnost i fotostimulaciju (7,

44). MeĊutim, ova indukcija apoptoze iskljuĉuje kao uzrok inhibiciju sinteze RNK i proteina,

a citotoksiĉnost hipericina ne dovodi u vezu sa inhibicijom protein kinaze C, niti indukcijom

faktora nekroze tumora α (Tumor Necrosis Factor α – TNFα) i CD95 liganada (7).

Slika 10. Apoptoza - Programirana ćelijska smrt (45)

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 11

Sa sigurnošću se moţe reći da hipericin povećava cititoksiĉni efekat mnogih

citostatika koji se koriste u terapiji tumora, meĊutim, to dejstvo je tkivno specifiĉno i ne

moţ e se objasniti jedinstvenim mehanizmom (7). Citotoksiĉni i citostatiĉni efekti hipericina

dokazani su brojnim in vitro na ciljanim ćelijskim linijama. Vandenboegaerde i saradnici

(1997) dokazali su da je citotoksiĉnost hipericina na HeLa ćelije u nanomolarnim

koncentracijama direktno povezana sa fotosenzibilizacijom. To je odliĉan primer

fotocitotoksiĉnosti a mehanizam kojim hipericin ostvaruje ovo dejstvo je inhibicija protein

kinaze C (7, 46).

Dokazano je metodom hemiluminiscencije da je hipericin antioksidans tj. da inhibira

stvaranje slobodnih radikala. TakoĊe je dokazano i da deluje inhibitorno na aktivnost

glutation reduktaze (7, 47, 48). Johnson i Pardini (1998) su kao kritiĉan trenutak za

ispoljavanje fototoksiĉnosti hipericina predoĉili oštećenje mitohondrija. Inhibicija glutation

reduktaze tj. izmena glutation pula koja pomaţ e citotoksiĉnost je još jedan od mehanizama

kojim se mogu objasniti antiproliferativna svojstva hipericina i veliki znaĉaj kiseonika u

ispoljavanju njegovih fototoksiĉnih efekata (48).

Atsuši Vada (Atsushi Wada), Tošijuki Sakaeda (Toshiyuki Sakaeda) i saradnici

(2002.) su ukazali na citotoksiĉan efekat hipericina na HeLa ćelije mehanizmom inhibicije

ekspresije MDR1 gena, odnosno njegovog produkta P-glikoproteina 1 (glikoprotein

permeabilnosti, P-gp, Pgp, protein otpornosti na višestruke lekove – multidrug resistance

protein) (slika 11). P-glikoprotein 1 je dobro poznati ABC-transporter (transportuje široki

opseg supstrata kroz ćelijsku membranu). On je ĉlan MDR/TAP familije gena. Oni su takoĊe

dokazali uz citotoksiĉan efekat samog hipericina i povećanje citotoksiĉnog efekta citostatika,

koji su u terapiji kancera korišćeni u kombinaciji sa ekstraktom kantariona, odnosno uz

sudejstvo hipericina (49).

Slika 11. P-glikoprotein pumpa – naĉin funkcionisanja (50)

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 12

1.4 ĆELIJSKA KULTURA

Savremena biomedicinska istraţ ivanja se sve više baziraju na korišćenju in vitro

kultura ćelija, tkiva i organa. Fundamentalna istraţ ivanja u biologiji ćelije, molekularnoj

biologiji, citogenetici, biohemiji, molekulrnoj genetici, fiziologiji, embriologiji, imunologiji,

hematologiji, onkologiji, neurologiji i drugim nauĉnim disciplinama, široko se koriste

metodama in vitro. Sliĉno je i sa raznim dijagnostiĉkim metodama, pre svega citogenetskim.

In vitro metode su nezaobilazne i u mnogobrojnim farmakološkim i toksikološkim

testiranjima. Prihvatanje Raselovog i Barĉovog principa 3R (smanjenje broja ţ ivotinja –

Reduction, usavršavanje ogledne procedure – Refinement i zamena oglednih ţ ivotinja

neanimalnim tehnikama – Replacement) za rad sa eksperimentalnim ţ ivotinjama i zahtevi

izdavaĉa nauĉnih publikacija da se poštuje etika rada sa ekperimentalnim ţ ivotinjama na

ovim principima, usmerila su raznovrsna istraţ ivanja prema in vitro metodama, kao zamenu

za in vivo metode (51).

Ćelijska kultura predstavlja ćelije, tkiva i organe u in vitro uslovima koji traju više od

24h i gde se ispituje ponašanje ćelija u kontrolisanim uslovima, što nije sluĉaj u organizmu.

In vitro metode imaju odreĊene prednosti, ali i nedostatke.

Prednosti metoda in vitro se ogledaju u sledećem:

Ne dolazi do varijacija koje postoje u organizmu.

Kontrola uslova sredine za rast ćelija unifomiše uzorak.

Kakteristike ćelija mogu biti saĉuvane tokom više generacija, tako da se dobija

dobra reproducibilnost eksperimenta.

Ćelije mogu biti izlagane supstancama u definisanim koncentracijama, odnosno

fiziĉkim agensima definisanog intenziteta.

Izbegavaju se legalni, moralni i etiĉki problemi vezani za eksperimente na

ţ ivotinjama.

Znatno niţ i troškovi ispitivanja.

Nedostaci metoda in vitro ogledaju se u sledećem:

Moraju se razviti standardizovane tehnike da bi se saĉuvale reproducibilne ćelije

za eksperimente.

Potrebno je vreme da se usvoje aseptiĉne tehnike.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 13

Male dimenzije uzorka, pa su potrebne osetljive metode za odreĊivanje promena.

Koliĉina materijala moţ e biti ograniĉena.

Scale-up je vrlo zahtevan.

In vitro uzorak ne mora biti identiĉan in vivo fenootipu ili genotipu.

Moţ e doći do dediferencijacije i selekcije ćelija i mnogi originalni ćelijski

mehanizmi mogu biti izgubljeni.

Kako bi uopšte bilo moguće razvijati i odrţ avati ćelijsku kulturu in vitro potrebno je

ispuniti odreĊene zahteve u pogledu tehniĉkih uslova i okruţ enja, neophodnih suplemenata i

medijuma, kao i opreme. Sve to regulisano je standardima a poznato je pod nazivom „Dobra

laboratorijska praksa” (GLP - Good Laboratory Practice). Pod GLP-om podrazumevamo i

pravila ponašanja, kao i mere predostroţ nosti koje se moraju primeniti pre, za vreme i posle

rada sa ćelijskom kulturom. GLP je postignut kada se svi postupci sprovode pod standardom

koji iskljuĉuje kontaminaciju bakterijama, gljivicama i mikoplazmom, kao i unakrsne

kontaminacije sa drugim ćelijskim linijama.

Radni prostor u radu sa ćelijama ĉine laminarni sterilni kabineti (komore), koji mogu

biti horizontalni i kabineti klase II. Horizontalni laminarni protoĉni kabinet omogućuje

najsterilnije uslove za ćelije, ali ne nudi zaštitu opereteru. Filtrira vazduh koji ulazi sa zadnje

strane kabineta i usmerava se napred, direktno na operatera. Najdublji deo kabineta je

najsterilniji. Kabineti klase II dizajnirani su da daju operateru zaštitu, kao i dobre sterilne

uslove. Vazduh je usmeren sa vrha kabineta prema dnu na radnu površinu. U radu je

neophodno da se nesterilni predmeti ne prenose preko sterilnih. Pošto je sterilni vazduh samo

unutar kabineta, njegova prednja strana nije sterilna. U rutinskoj upotrebi su ĉešći ovakvi

kabineti. Sa humanim ili primatskim ćelijama mora da se radi u ovom tipu kabineta. Ovakav

kabinet korišćen je i prilikom eksperimenata sa HeLa ćelijama prilikom izrade ovog rada.

Vrlo vaţ an uslov za rad u laboratoriji za ćelijsku kulturu je bezbednost lica koja rade

u tom prostoru. U tom smislu treba biti veoma obazriv i drţ ati se uputstava ukoliko se radi sa

kancerogenim, teratogenim, mutagenim ili bilo kojim drugim supstancama koje mogu

ugroziti zdravlje, a osim toga treba voditi raĉuna i o pravilnom odlaganju biomedicinskog

otpada (51). U eksperimentalnom delu ovog rada ispoštovani su svi detalji GLP-a, koji se

tiĉu bezbednosti, pravilnog rada sa ćelijama, obezbeĊivanja sterilnih uslova, ali i svih

neophodnih materijala i primenjenih metoda.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 14

2. POSTAVLJENJE PROBLEMA I CILJ RADA

U današnjoj medicinskoj praksi ulaţ e se mnogo napora u pronalaţ enju novih oblika

terapijskih indikacija i razvoju citostatika u borbi protiv malignih oboljenja. U tom smislu, a

na osnovu ranijih iskustava, uradiće se ispitivanje delovanja ekstrakta kantariona na HeLa

ćelije u kulturi in vitro. U tu svrhu koristiće se komercijalni preparat sa hipericinom

(BIOSENZAL® „Zdravlje“ Leskovac), kao ekstraktom kantariona (Hypericum perforatum

L.).

Eksperimentalni cilj ovog rada je da se utvrde efekti razliĉitih koncentracija ekstrakta

kantariona na vijabilnost i proliferaciju HeLa ćelija in vitro pomoću MTT testa.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 15

3. MATERIJAL I METODE

3.1iMATERIJAL

3.1.1 HeLa ćelije

HeLa ćelije su ćelije kancera grlića materice koje su prvi put ekstrahovane iz tela

pacijentkinje Henriete Laks i predstavljaju besmrtni tip ćelijske linije. Njihova izvanredna

sposobnost deobe omogućava nam da serijom pasaţ a dobijamo dovoljnu koliĉinu ćelija za

postavljanje eksperimenata. HeLa ćelije ĉuvaju se zamrznute u teĉnom azotu odakle se

odmrzavaju i kultivišu za potrebe eksperimenata (15, 33).

3.1.2 BIOSENZAL®

BIOSENZAL® predstavlja fitopreparat u obliku biljnih kapi farmaceutske kuće

„Zdravlje“ iz Leskovca. Kao aktivnu komponentu sadrţ i teĉni alkoholni ekstrakt nadzemnog

dela biljke kantariona (Extractum Hyperici herbe fluidum). Biosenzal štok sadrţ i 60%

etanola, sa hipericinom u koncentraciji od 0,8 mg% kao aktivnom komponentom (7).

3.1.3 SAPONIN

Saponini su posebna grupa glikozida koje u svom sastavu pored šećera imaju i

triterpenska ili steroidna jedinjenja (52). U ovom radu saponin je korišćen kao pozitivna

kontrola u eksperimentu citotoksiĉnosti u koncentraciji od 2 µg/ml.

3.1.4 FLUOROURACIL

5 Fluorouracil je hemoterapijski lek analog pirimidinu (53). U ovom radu korišćen je

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 16

kao pozitivna kontrola u eksperimentu citostatiĉnosti u koncentraciji od 1 µg/ml.

3.1.5 ETANOL

Etanol je organsko hemijsko jedinjenje koje ĉine ugljenik, vodonik i jedna OH-grupa i

jedan je od predstavnika alkohola. Vrlo ĉesto se koristi u laboratorijama jer je veoma dobar

organski rastvaraĉ (54). U našim eksperimentima korišćen je u odgovarajućim

koncentracijama kao kontrola rastvaraĉa.

3.1.6 MEDIJUM

Medijum je teĉnost u kojoj ćelije rastu i on se bira na osnovu tipa ćelija. Osnovne

karakteristike medijuma su:

Fiziološke (pH, osmolarnost).

Suprafiziološke (hormoni, hranjive supstance).

Nefiziološke (boje, antibiotici).

Svaka ćelijska linija koja se gaji ima svoje specifiĉne zahteve. HeLa ćelije se gaje u

DMEM-u (Dulbeco’s modified Eagle’s medium) sa 10% FCS-a (fetalnog goveĊeg seruma

koji sadrţ i neophodne faktore rasta potrebne ćelijama), L-glutaminom (koji se zbog svoje

nestabilnosti dodaje neposredno pre upotrebe) i kombinacijom antibiotika penicillin-

streptomicin (51).

3.1.7 TRIPSIN – EDTA

Ćelije je u trenutku pasaţ e ili postavljanja u bunarĉiće (velove) plejta neophodno

odvojiti od dna flaska u kome rastu i za ĉije su dno adherirane. Taj process odvajanja ćelija

od dna flaska radi se upotrebom tripsina a sam process se po njemu naziva tripsinizacija.

EDTA (eng. Ethylenediaminetetraacetic acid) je helator kalcijuma (vezuje jone kalcijuma -

Ca) nakon ĉega tripsin (proteinaza) moţ e da deluje na proteine okoćelijskog matriksa koji

povezuje ćelije. Tripsinizacija se radi veoma brzo i ne treba dozvoliti da Tripsin-EDTA

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 17

deluju duţ e od 3-5 min. Na fazno-kontrastnom mikroskopu se proverava da li su se ćelije

odvojile od dna, ili još uvek nisu. Ukoliko je potrebno, flask treba i mehaniĉki blago protresti

nekoliko puta kako bi se ćelije što pre odvojile i odmah nakon toga tripsinizaciju treba što pre

prekinuti dodavanjem Hanks-a (51).

3.1.8 PBS

Za odrţ avanje normalnih vrednosti PH u kulturama ćelija neophodno je koristiti

pufere. PBS (eng. Phosphate buffer solution – fosfatni pufer) se najĉešće koristi u biološkim

istraţ ivanjima za odrţ avanje PH sredine. On nije toksiĉan za ćelije pa zbog toga ima mnogo

namena. PBS moţ e da se upotrebljava kao rastvaraĉ nekih supstanci, kao i za ispiranje ćelija.

U našem sluĉaju, PBS smo kao rastvaraĉ koristili pri pravljenju MTT-a (51).

3.1.9 MTT

MTT je ţ uti prah koji se rastvara i njime deluje na ćelije u svrhu merenja njihove

metaboliĉke aktivnosti. Metaboliĉki aktivne ćelije menjaju strukturu ţ utih tetrazolijumskih

soli i stvaraju ljubĉasti formazan, koji se kasnije oĉitava na spektrofotometru i na osnovu toga

se donosi zakljuĉak o ćelijskoj aktivnosti. U ovom radu je korišćen rastvor od 5mg MTT/ml

PBS-a. Rastvor MTT-a se zamrzava, a neposredno pre MTT testa odmrzne. U velove za

izvoĊenje MTT testa se dodaje 20 mikrolitara MTT-a i 100 mikrolitara PBS-a (51).

3.1.10 TRIPAN PLAVO (TRYPAN BLUE)

Tripan plavo (eng. Trypan blue) je boja koja se u radu sa ćelijskim kulturama koristi

za selektivno bojenje ćelija. Prilikom pasaţ e ćelija neophodno je znati njihov broj u 1 ml

kako bi se znalo koja koliĉina suspenzije treba da se zaseje u novi flask ili postavi u

bunarĉiće plejta. Zbog toga se pravi preparat sa ćelijama koje se broje pod mikroskopom.

Kako je ćelijska membrana selektivno propustljiva, ţ ive ćelije ne usvajaju ovu boju.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 18

MeĊutim, kod mrtvih ćelija integritet membrane je narušen zahvaljujući ĉemu boja prodire u

ćelije i boji ih u plavo.

Boja Tripan plavo je dobila naziv po osobini da ubija tripanozome, parazite koji

izazivaju bolst spavanja.

Zahvaljujući ovoj boji na precizan naĉin moţ emo da odredimo broj ćelija koje

ispitujemo, a boja se sa sadrţ ajem u kojem su ćelije meša u odnosu 1:1, a zatim nanosi na

ploĉicu koja se potom posmatra pod mikroskopom (51).

3.2 LABORATORIJSKA OPREMA

3.2.1 INKUBATOR

Savremene biološke laboratorije su opremljene najraznovrsnijom laboratorijskom

opremom. Jedan od ureĊaja koji predstavlja standardnu opremu za rad sa ţ ivim ćelijama u

kulturi in vitro je inkubator. Inkubator je ureĊaj koji se koristi za rast i odrţ avanje

mikrobioloških i ćelijskih kultura. Inkubator odrţ ava optimalnu temperaturu, vlaţ nost i druge

uslove kao što je ugljen dioksid (CO2) i kiseonik (O2). U laboratoji za ćelijsku kulturu koriste

se takozvani CO2 i O2 inkubatori, u zavisnosti od toga koji gas se kontroliše u njemu. Postoje

i kombinovani inkubatori (51).

3.2.2 MIKROSKOP

Mikroskop je instrument koji uvećava prostom oku nevidljive ili slabo vidljive

objekte i razdvaja bliske taĉke na njima koristeći elektromagnetna talasna zraĉenja razliĉitih

talasnih duţ ina. Mikroskopom moţ emo videti sliku predmeta pod mnogo većim uglom od

onog kojim bi ga videli golim okom u normalnoj vidnoj daljini. Nauka istraţ ivanja malih

predmeta koja koristi ovakve instrumente naziva se mikroskopija, a termin „mikroskopski“

ima znaĉenje „veoma mali“odnosno slabo vidljiv golim okom (55).

Neizbeţ an u svakoj laboratoriji je svetlosni mikroskop (slika 12). Njega koristimo za

najjednostavnija posmatranja obojenih preparata, posmatranje struktura, brojanje ćelija itd.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 19

Njegova mana je osim slabijeg uvećanja i nemogućnost da se posmatraju neobojeni preparati,

a samim tim i ţ ive eukariotske ćelije - u našem sluĉaju HeLa ćelije.

Instrument zahvaljujući kome moţ emo da posmatramo ţ ive ćelije bez bojenja i

pratimo njihovu aktivnost, pokrovnost flaska itd. je faznokontrastni mikroskop (slika 13).

Faznokontrastni (FK) mikroskop koristi se prvenstveno za jednostavne mikroskopije

histoloških iseĉaka debljine 5-20μm, dobijenih rezanjem mikrotomom. (51,56).

Slika 12 Svetlosni mikroskop (56) Slika 13 Fazno-kontrastni mikroskop

3.2.3 CENTRIFUGA

Za razdvajanje bioloških ĉestica razliĉitih veliĉina koristi se centrifuga. U radu sa

ćelijama, neophodno je prilikom pasaţ iranja ćelije odvojiti (u našem sluĉaju HeLa ćelije) od

suspenzije nakon tripsinizacije. U tu svrhu koristi se centrifuga koja se podešava na 1200 rpm

u periodu od 10 min. Nakon centrifugiranja ćelije se izdvajaju na dno epruvete dok se iznad

nalazi supernatant (slika 23) koji se potom izbacuje pipetom (51, 57).

3.2.4 VIŠEKANALNI FOTOMETAR (ELISA READER) Višekanalni fotometar (eng. Elisa reader - Enzyme-linked immunosorbent assay

reader) je ureĊaj koji nam omogućuje ĉitanje apsorbanci formazana dobijenog u MTT testu.

Višekanalni fotometar koristi antitela i promenu boje za identifikaciju supstance. U našim

eksperimentima je raĊeno spektrofotometrijsko merenje redukcije MTT-a na talasnoj duţ ini

od 540 nm. Povećani intenzitet boje, odnosno veće vrednosti merenja ukazuju na veću

aktivnost ćelija (51, 58).

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 20

3.3 METODOLOGIJA RADA SA ĆELIJAMA

3.3.1 ZAMENA MEDIJUMA

U manipulisanju ćelijskim kulturama, izmeĊu ostalog i kod odrţ avanja HeLa ćelija,

uobiĉajeni postupak predstavlja zamena starog medijuma. Na taj naĉin uklanja se istrošeni

medijum i izbacuju mrtve ćelije, a ista koliĉina se dodaje na njegovo mesto kako bi se

obezbedili svi neophodni sastojci za normalno funkcionisanje i rast ćelija u flasku. Zamena

medijuma vrši se nakon 3-4 dana, a obavlja se u laminaru u sterilnim uslovima. Celokupan

postupak prilikom zamene medijuma radi se u blizini plamenika i što brţ e, kako se ćelije ne

bi predugo izlagale promenama uslova okruţ enja, a zatim se što pre vraćaju u inkubator (51).

3.3.2 BROJANJE ĆELIJA

Kako bismo znali koju koliĉinu suspenzije treba uzeti i zasejati u flask ili u bunarĉiće,

moramo znati sa koliko ćelija raspolaţ emo. Iz tog razloga neophodno je brojanje ćelija pod

mikroskopom i odreĊivanje gustine ćelija u suspenziji (51).

POSTUPAK:

1. Odmeriti 50 μl ćelijske suspenzije i 50 μl boje Trypan blue i saĉekati 5 minuta

(zbog dezintegrisane ćelijske membrane kod mrtvih ćelija, boja ulazi u njih i boji

ih plavo, dok se ţ ive ćelije ne boje i one ostaju ţ ućkaste).

2. Suspenzija ćelija u boji se nanosi na ivicu hemocitometarske komore (slika 14) u

kojoj se uzorak razliva i na taj naĉin sprema za brojanje u odgovarajućim poljima.

Mi smo brojanje vršili u Malassez komori.

3. U zavisnosti od gustine ćelija, bronjanje se vrši na svih 100 kavadrata ili na delu te

površine. Ako se broji na 10 kvadrata, brojanje se vrši po dijagonali kvadratne

meţ ice. Broje se samo samo ţ ive ćelije (slika 15). Na taj naĉin se dobija broj

ćelija u 10 kvadrata. Dalje preraĉunavanje broja ćelija vrši se na sledeći naĉin:

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 21

Dobijeni broj ćelija u 10 kvadrata x 10 x 2 x 1000 = Ukupan broj ćelija u 1 ml

Opšta formula za izraĉunavanje boja ćelija bi izgledala ovako:

Broj ćelija/ml = n x P x R x 1000

n – broj ćelija u P površini,

P – deo površine koja se broji (100 kvadrata/broj kvadrata za brojanje),

R – razblaţ enje,

Sa 1000 se mnoţ i da bi se dobio broj ćelija u 1 ml.

Uobiĉajeno je da se u 1 manji, T25 flask, zasejava 106, odnosno milion ćelija.

Primer:

Ako se u 5 ml nalazi 5 miliona ćelija, onda se po 1 ml sadrţ aja stavi u 5 flaska i u

svaki doda još po 4 ml medijuma da bi ukupan sadrţ aj u flasku bio 5 ml.

Slika 14. Hemocitometarska komora (59)

Slika 15. Ţive ćelije (neobojene) i mrtve ćelije (plavo obojene) (60)

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 22

3.3.3iPASAŢA ĆELIJA

Proces subkultivacije ćelija u ćelijskoj kulturi naziva se pasaţ a ćelija. Prilikom ovog

procesa u flaskove se presaĊuje manji broj ćelija zahvaljujući ĉemu im se obezbedjuju resursi

za deobu i rast (51).

POSTUPAK:

1. Uzeti 1-2 ml TRIPSIN+EDTA rastvora i dodati u flask kako bi se ćelije odvojile

sa njegovog dna.

2. Flask postaviti pod fazno-kontrastni mikroskop i proveriti da li su se ćelije

odvojile od dna. Ukoliko nisu saĉekati još 2-3 min da TRIPSIN – EDTA još malo

deluje. Ako se ćelije ne odvoje ni posle toga, flask malo protresti i u većini

sluĉajeva to je dovoljno da se ćelije odvoje. Kada se ni posle toga ćelije ne odvoje

postupak se ponavlja.

3. Kada su se ćelije odvojile sa dna flaska tripsinizaciju prekinuti dodavanjem

HANKS-a.

4. Nakon toga treba izvući sav sadrţ aj iz flaska: ćelije + HANKS + TRPSIN –

EDTA i staviti ga u sterilnu epruvetu gde se sadrţ aj resuspenduje.

5. Epruvetu zatim staviti na centrifugiranje i to na +4ᵒC kako se ćelije ne bi zalepile

za zid epruvete i centrifugiranje se vrši 10 min na 1200 obrtaja/min.

6. Nakon centrifugiranja izdvoje se 2 sloja - ćelije na dnu epruvete i supernatant koji

se odbacuje.

7. U epruvetu sa ćelijama dodati 2ml DMEM-a i to dobro resuspendovati.

8. Nakon toga pristupa se bojenju i brojanju i zasejavanju ćelija

9. Rezultat pasaţ e su prenešene i zasadjene ćelije u nekoliko flaskova ili plejtova

ukoliko se radi eksperiment, ili se pak ćelije spremaju za zamrzavanje.

3.3.4iZAMRZAVANJE ĆELIJA

Ponekad je potrebno ćelije skladištiti, odnosno odloţ iti ih za neku dalju upotrebu. To

se radi zamrzavanjem u teĉnom azotu, a ćelije se odlaţ u u kriovajlama sa specijalno

napravljenim medijumom za tu priliku. Za razliku od standardnog medijuma za kultivaciju

ćelija, takozvani freezing medijum, osim DMEM-a, seruma (FCS) i antibiotika sadrţ i i

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 23

DMSO (Dimethyl sulfoxide) koji ima ulogu „antifriz“ preparata koji štiti ćelije od

izmrzavanja, odnosno spreĉava izgradnju kristalića leda koji mehaniĉki razaraju ćelije (51-

50).

POSTUPAK:

1. Odmeriti 5 ml (10%) DMSO, 25ml (50%) FCS, 20ml DMEM-a i 0,5 ml

antibiotika penicillin/streptomycin (5000 IU/ml penicilin, 5000GU/ml

streptomicin).

2. Uraditi standardnu pasaţ u ćelija završno sa centrifugiranjem. Ćelije se

centrifugiraju 2 puta u standardnom medijumu.

3. Ukloniti supernatant i dodati 2 ml standardnog medijuma.

4. Prebrojati ćelije (toku brojanja ostatak ćelija se ĉuva na ledu).

5. Staviti 5x106 ćelija u kriovajlu na ledu i dopuniti do 2ml hladnim freezing

medijumom.

6. Kriovajle drţ ati u gradulno sniţ anim temperaturama (-20oC i -80 oC), pa staviti u

kontejner sa teĉnim azotom.

3.3.5iODMRZAVANJE ĆELIJA

Odmrzavanje ćelija iz teĉnog azota zahteva odreĊenu pripremu, odnosno poštovanje

zadatih koraka kako bi se ćelije iz stanja dubokog zamrzavanja mogle „oţ iveti“ i kako bi se

mogle koristiti u daljem radu (51).

POSTUPAK:

1. U epruvetu sipati 10-15 ml hladnog medijuma sa 20% FCS (duplo više nego u

standardnom medijumu za ĉuvanje ćelija). Posebno sipati još 20 ml standardnog

medijuma za ispiranje. Sve mora biti na hladnom, jer je DMSO toksiĉan na sobnoj

temperaturi. Spremiti sve što je potrebno: ĉašu sa ledom, 70% alkohol, papir za

brisanje, pipete i dr.

2. Izvaditi kriovajlu iz teĉnog azota, koristeći rukavice i štitnik za lice.

3. Raditi brzo odmrzavanje u vodenom kupatilu na 37ºC okrećući vajlu u krug kroz

vodu dok se ne odmrzne oko pola suspenzije.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 24

4. Izvaditi vajlu iz vodenog kupatila, ali nastaviti sa trešenjem dok se potpuno ne

otopi.

5. Paţ ljivo otvoriti vajlu na ledu, sadrţ aj uvući sterilnom pipetom i sipati preko

hladnog medijuma.

6. Sadrţ aj centrifugirati na 1000 rpm/min i temperaturi od 4ºC tokom od 5 minuta.

7. Isprati još jednom sa 10 ml medijuma, kako bi se uklonio sav DMSO i

centrifugirati. Lagano rasuspendovati.

8. Zasaditi ćelije u mali T25 ili veliki T75 flask sa odgovarajućom koliĉinom

medijuma koji sadrţ i duplu koliĉinu FCS i uobiĉajenu koliĉinu glutamina i

antibiotika. Saditi trostruko veći broj ćelija nego obiĉno.

9. Sledećeg dana promeniti medijum kao bi mrtve ćelije bile otklonjene.

10. U periodu od 1-4 dana, u odnosu na pokrivenost dna flaska, ćelije treba pasaţ irati

po uobiĉajenoj proceduri.

3.3.6 PRIPREMA RASTVORA ZA TESTIRANJE

U ovom eksperimentu korišćene su razliĉite koncentracije Biosenzala i alkohola.

Kako su ispitivane efektivne doze Biosenzala od 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%, bilo

je potrebno napraviti odgovarajuća razblaţ enja Biosenzala od štok rastvora. Razblaţ enje je

pravljeno medijumom, a pravljene doze su morale biti u duplo većim koncentracijama, jer su

ćelije već sadrţ ale 100 μl medijuma po velu što smanjuje efekat Biosenzala za polovinu. Ista

koliĉina od 100μl pravljene doze hipericina stavljana je u velove plejta, a razblaţ enja su

pravljena po šemi 1.

Tabela 1 Prikaz koncentracija Biosenzala, njihove efektvivne doze (desno) i procenat etanola

100% Štok Biosenzal = 60% etanol 50% Biosenzal = 30% etanol 30% Biosenzal = 18% etanol 15% Biosenzal = 9% etanol 20% Biosenzal = 12% etanol 10% Biosenzal = 6% etanol 10% Biosenzal = 6% etanol 5% Biosenzal = 3% etanol 5% Biosenzal = 3% etanol 2,5% Biosenzal = 1,5% etanol 2,5% Biosenzal = 1,5 % etanol 1,25 Biosenzal = 0,75% etanol 1,25% Biosenzal = 0,75% etanol 0,625% Biosenzal = 0,375% etanol

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 25

0. 100% B I O S E N Z A L ŠTOK 1. 300μl Biosenzal 0 + 700 μl Medijum = 1 ml 30% Biosenzal / alkohol 18%

2. 667μl Biosenzal 1. + 333μl Medijum = 1 ml 20% Biosenzal / alkohol 12% 1ml 3. 500 μl Biosenzal 2.+ 500 μl Medijum = 1 ml 10% Biosenzal / alkohol 6%

4. 500 μl Biosenzal 3. + 500 μl Medijum = 1 ml 5% Biosenzal / alkohol 3%

5. 500 μl Biosenzal 4. + 500 μl Medijum = 1ml 2,5% Biosenzal / alkohol 1,5%

6. 500 μl Biosenzal 5. + 500 μl Medijum = 1 ml 1,25% Biosenzal / alkohol 0,75% 7. 500 μl Biosenzal 6. + 500 μl Medijum = 1 ml 1,25% Biosenzal / alkohol 0,75% ___________________________________________________________________________

Šema 1. Postupak pravljenja razliĉitih koncentracija Biosenzal-a

Kako je Biosenzal alkoholni ekstrakt, ekvivalentne koncentracije etanola sluţ ile su

kao kontrola rastvaraĉa. U eksperimentu je 60%-ni etanol sluţ io kao osnova za pravljenje

manjih koncentracija dodavanjem odgovarajućih koliĉina medijuma i to po šemi 2.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 26

0. 60% E T A N O L 1. 300μl Etanol 0 + 700 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 18%

2. 667μl Etanol 1. + 333μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 12% 3. 500 μl Etanol 2. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 6%

4. 500 μl Etanol 3. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 3%

5. 500 μl Etanol 4.+ 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol 1,5%

6. 500 μl Etanol 5. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa /Alkohol0,75% 7. 500 μl Etanol 6. + 500 μl Medijum = 1ml Kontrola rastvaraĉa / Alkohol0,375% ___________________________________________________________________________

Šema 2. Postupak pravljenja razliĉitih koncentracija etanola

Zahvaljujući ovako pravljenim koncentracijama, na veoma precizan naĉin se moglo

odrediti dejstvo ekstrakta kantariona, kao i samog alkohola kao rastvaraĉa. UporeĊivanjem

delovanja razliĉitih koncentracija Biosenzala i alkohola mogla se utvrditi dozna zavisnost

ukoliko je prisutna.

Negativna kontrola su bile HeLa ćelije u ĉistom medijumu. Pozitivna kontrola

citotoksiĉnosti bio je saponin. Pozitivna kontrola citostatiĉnosti bio je 5 Fluorouracil (5 FU).

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 27

3.3.7iPRAVLJENJE RADNOG RASTVORA TRYPAN BLUE

POSTUPAK:

1. Priprermriti štok TRYPAN BLUE mešanjem 0,3 g boje i 100 ml destilovane

vode.

2. Napraviti hipertoniĉni HANKS mešanjem HANKS-a i 2,5g NaCl-a.

3. Radni rastvor TRIPAN BLUE se pravi mešanjem hipertoniĉnog HANKS-a i štok

TRYPAN BLUE-a u odnosu 1:3.

3.4 MTT TEST MTT Test je jedna od najprimenjivanijih metoda in vitro za ispitivanje vijabilnosti i

proliferacije ćelija. Test je zasnovan na redukciji tetrazolijumskih soli gde ţ uti tetrazolijum

MTT redukuju mitohondrijalne dehidrogenaze metaboliĉki aktivnih ćelija i stvaraju ljubiĉasti

formazan (slike 16 i 17). Rezultujući ljubiĉasti unutarćelijski formazan moţ e biti rastvoren

izoprpanolom, DMSO-om ili nekim drugim organskim rastvaraĉem. Nakon rastvaranja

formazana, apsorbanca boje moţ e se oĉitati spektrofotometrijskom metodom. Apsorbanca

obojenog rastvora se meri na talasnoj duţ ini od 550 nm. Redukcija je moguća samo kada su

enzimi reduktaze aktivni, tako da se ovim testom meri aktivnost ţ ivih ćelija. Na ovaj naĉin

moţ e se odreĊivati citotoksiĉnost razliĉitih medikamenata i materijala (51).

Slika 16. Izgled velova u plejtu pre i posle redukcije ţ ute soli i stvaranja formazana

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 28

Slika 17. Promena strukture ţ utih tetrazolijumskih soli i stvaranje ljubiĉastog formazana (61)

POSTUPAK:

1. Zasejati ćelije u plejt i nakon 24h tretirati, u našem sluĉaju Biosenzalom, uz

odgovarajuće kontrole.

2. Nakon inkubacije ćelija pod dejstvom odreĊenih koncentracija Biosenzala i

kontrolnih rastvora, iz svakog vela izvaditi celokupnu teĉnost i dodati 100 μl

radnog rastvora PBS-a i 30 μl MTT-a, a koji su prethodno zagrejani do 37 ºC.

3. Inkubacija u periodu od 4h.

4. Nakon perioda inkubacije pod dejstvom PBS-a i MTT-a, iz velova izvući svih 130

μl sadrţ aja i dodati po 100 μl izopropanola koji prethodno treba zagrejati do 37ºC.

5. Nakon dodavanja izopropanola plejt blago pomerati na tvrdoj podlozi kruţ nim

pokretima, kako bi se kristali formazana rastvorili i sadrţ aj potpuno

homogenizovao.

6. Nakon toga se na ELISA fotometru, oĉitava apsorbanca na 550 nm i potom

analiziraju dobijene tabelarne vrednosti.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 29

3.4.1iESEJ VIJABILNOSTI / CITOTOKSIĈNOSTI

Termin citotoksiĉnost se koristi da se opiše kaskada molekularnih dešavanja koji

onemogućavaju sintezu molekula i na taj naĉin uzrokuju funkcionalno i strukturno oštećenje

ćelija. Primena citotoksiĉnih medikamenata moţ e da izazove nekrozu ćelija gde se narušava

integritet ćelijske membrane i one umiru kao rezultat lize ćelija. TakoĊe, moţ e doći do

smanjenja ćelijske proliferacije (deoba i normalan rast) ili pojave apoptopze (genetski

programirana ćelijska smrt) (51).

Citotoksiĉne supstance mogu biti upotrebljene u terapeutske svrhe pri tretiranju

kancera u hemoterapiji (39, 40).

Citotoksiĉnost se moţ e meriti na više naĉina:

1. TBE (Trypan Blue Exclusion) test vijabilnosti na osnovu koga se procenjuje

integrite integritet ćelijske membrane gde boja Tripan blue ulazi samo u oštećene ćelije

ćelije i boji ih, dok ţ ive ćelije ostaju neobojene.

2. Merenje ATP-a u testu koji je zasnovan na luciferaznoj reakciji.

3. MTT testom, koji je korišćen za ispitivanje citotoksiĉnosti u ovom radu

U ovom radu vršeno je ispitivanje citotoksiĉnosti (vijabilnosti) na HeLa ćelije pod

uticajem hipericina. ZasaĊeno je 2x104 ćelija po velu i nakon 24h je raĊen MTT test.

3.4.2iESEJ PROLIFERATIVNOSTI / CITOSTATIĈNOSTI

Citostatiĉnost oznaĉava delovanje medikamenata i drugih materija na ćelije gde se

vrši supresija ili zaustavljanje njihovog rasta i deobe, odnosno razmnoţ avanja.

Ispitivanjem i merenjem citostatiĉnosti odredjenih materijala i ekstrakata se u stvari

meri njihov uticaj na rast i deobu ćelija. Vrši se delovanje na ćelije i onda se nakon perioda

inkubacije sprovodi MTT test. Na osnovu dobijenih vrednosti donosi se zakljuĉak o tome da

li odredjeni ekstrakt ili materijal ima citostatiĉan efekat na ćelije. (51)

U ovom radu vršeno je ispitivanje citostatiĉnosti (vijabilnosti) na HeLa ćelije pod

uticajem hipericina. ZasaĊeno je 0,5 x104 ćelija po velu i nakon 72h je raĊen MTT test.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 30

4. EKSPERIMENTALNI DIZAJN

U ovom radu je vršeno ispitivanje ekstrakta kantariona koji kao aktivnu supstancu

sadrţ i hipericin u koncentraciji od 0,8mg%, na citotoksiĉnost (vijabilnost) i citostatiĉnost

(proliferaciju) HeLa ćelija in vitro. U tu svrhu korišćen je komercijalni proizvod

BIOSENZAL® farmaceutske kuće „Zdravlje“ iz Leskovca koji predstavlja alkoholni rastvor

(7). UraĊena su 3 dozno zavisna eksperimenta.

TOK EKSPERIMENTA:

CITOTOKSIĈNOST (VIJABILNOST)

1. Odmrzavanje HeLa ćelija iz kriovajli.

2. Zasejavanje ćelija u flask.

3. Zamena medijuma do dostizanja ţ eljene pokrivenosti dna, obiĉno posle 24h.

4. Pasaţ a ćelija i zasejavanje 2x104 ćelija po velu u plejt.

5. Inkubiranje sa razliĉitim dozama Biosenzala i kontrolnim dozama.

6. Nakon inkubacije sprovoĊenje MTT testa.

7. Oĉitavanje apsorbanci formazana na fotometru.

8. Tumaĉenje i analiza dobijenih rezultata.

CITOSTATIĈNOST (PROLIFERACIJA)

1. Odmrzavanje HeLa ćelija iz kriovajli.

2. Zasejavanje ćelija u flask.

3. Zamena medijuma do dostizanja ţ eljene pokrivenosti dna, obiĉno posle 24h.

4. Pasaţ a ćelija i zasejavanje 0,5x104 ćelija po velu u plejt.

5. Inkubiranje sa razliĉitim dozama Biosenzal-a i kontrolnim dozama.

6. Nakon inkubacije sprovoĊenje MTT testa.

7. Oĉitavanje apsorbanci formazana na ELISA reader-u.

8. Tumaĉenje i analiza dobijenih rezultata.

NAPOMENA:

Prilikom eksperimenata korišćen je plejt sa 96 velova. Raspored velova u plejtu

prikazan je prema šemi 3.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 31

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Šema 3. Plejt sa 96 velova

Eksperimentalne doze Biosenzala od 0,625, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%, zatim

kontrole rastvaraĉa odnosno etanol u koncentracijama od 0,375%, 0,75%, 1,5%, 3%, 6%, i

9%, negativne kontrole u ĉistom medijumu, kao i pozitivne kontrole citotoksiĉnosti u 5FU i

citostatiĉnosti u SAP, postavljane su u tetraplikatu prema rasporedu prikazanom u šemi 4. K

oznaĉava kontrolu (negativnu) odnosno ĉist medijum, BS oznaĉava Biosenzal, A oznaĉava

alcohol odnosno etanol u odreĊenoj koncentraciji biosenzala, SAP oznaĉava saponin i 5 FU

oznaĉava 5 Fluorouracil.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A K K K K BS-15%

BS-15%

BS-15%

BS-15%

BS-10%

BS-10%

BS-10%

BS-10%

B BS-5%

BS-5%

BS-5%

BS-5%

SAP SAP SAP SAP BS-2,5%

BS-2,5%

BS-2,5%

BS-2,5%

C BS-

1,25% BS-

1,25% BS-

1,25% BS-

1,25% BS-

0,625% BS-

0,625% BS-

0,625% BS-

0,625% K K K K

D A-9% A-9% A-9% A-9% K K K K A-6% A-6% A-6% A-6%

E K K K K A-3% A-3% A-3% A-3% A-1,5% A-1,5% A-1,5% A-1,5%

F A-

0,75% A-

0,75% A-

0,75% A-

0,75% 5FU 5FU 5FU 5FU A-

0,375% A-

0,375% A-

0,375% A-

0,375%

G

H

Šema 4. Raspored tetraplikata u plejtu

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 32

5. REZULTATI I DISKUSIJA

Posle inkubacije HeLa ćelija sa hipericinom uraĊen je MTT test. Nakon oĉitavanja na

fotometru dobijeni su tabelarni podaci koji su sluţ ili kao osnova za izradu grafikona i

poreĊenje dobijenih vrednosti.

Na osnovu podataka 3 eksperimenta citotoksiĉnosti i 3 eksperimenta citostatiĉnosti

napravljeni su grafikoni koji prikazuju srednje vrednosti eksperimenata.

Ovi grafikoni daju pogled na proseĉne vrednosti vijabilnosti i proliferacije HeLa ćelija pod

dejstvom Biosenzala, odnosno njegove aktivne komponente hipericina.

U ovom poglavlju su korišćene sledeće skraćenice i znakovi u grafikonima:

K - Negativna kontrola, odnosno ĉist medijum

BS - Biosenzal u odgovarajućoj koncentraciji

SAP - Pozitivna kontrola citotoksiĉnosti, odnosno saponin

5FU - Pozitivna kontrola citostatiĉnosti, odnosno 5 Fluorouracil

ZELENA BOJA - Nivo ćelijske aktivnosti u kontrolnim uzorcima

(posmatrano kao 100%-na vrednost)

PLAVA BOJA - Efekat Biosenzala

CRVENA BOJA - Efekat doze alkohola ekvivalentne datoj koncentraciji

Biosenzala

LJUBIĈASTA BOJA - Efekat saponina / 5 Fluorouracil-a

Istraţ ivanja u ovom radu bazirala su se na ispitivanju citotoksiĉnosti (vijabilnosti) i

citostatiĉnosti (proliferacije) HeLa ćelija in vitro, pod uticajem ekstrakta kantariona

(Hipericum perforatum L.) koji kao aktivnu materiju sadrţ i hipericin u koncentraciji od

0,8mg%. Kao ekstrakt kantariona korišćen je Biosenzal, komercijalni proizvod farmaceutske

kuće „Zdravlje iz Leskovca“, a HeLa ćelijska linija odmrznuta je iz teĉnog azota. UraĊena su

3 dozno-zavisna eksperimenta gde su HeLa ćelije inkubirane u razliĉitim koncentracijama

Biosenzala i to u koncentracijama od 0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% i 15%. Kako je

Biosenzal alkoholni ekstrakt, ispitivane su kontrole rastvaraĉa, odnosno ekvivalentne koliĉine

alkohola u koncentracijama od 0,375%, 0,75%, 1,5%, 3%, 6%, i 9%. Kao negativne kontrole

zasejavane su HeLa ćelije u ĉistom medijumu. Pozitivne kontrole citotoksiĉnosti, odnosno

citostatiĉnosti bile su saponin i 5 Fluorouracil. Svaka od koncentracija kao i kontrole raĊene

su u tetraplikatu.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 33

5.1 CITOTOKSIĈNOST (VIJABILNOST)

Grafik 1. Grafiĉki prikaz vijabilnosti HeLa ćelija u eksperimentu citotoksiĉnosti

Na grafiku 1 uoĉava se smanjenje vijabilnosti HeLa ćelija sa povećanjem

koncentracija Biosenzala, odnosno rast citotoksiĉnosti Biosenzala sa povećanjem

koncentracija.

Neposredno pre dodavanja MTT-a, HeLa ćelije su posmatrane i fotografisane na

invertnom svetlosnom mikroskopu u softveru Axiocam. U cilju ispitivanja uticaja Biosenzala

na vijabilnost HeLa ćelija, ćelije su saĊene u gustini 2x104 po jednom bunaru sterilne ploĉe

za kultivaciju ćelija. Na slici 18, prikazan je izgled HeLa ćelija u negativnoj kontroli (Hela

ćelije kultivisane u DMEM-u sa 10% FCS-a). Uoĉava se epitelni fenotip ćelija koje nakon

deobe ostaju blizu jedne drugima tako da obrazuju karakteristiĉne epitelne ploĉe.

Konfluentnost, odnosno prektivenost dna bunara ćelijama je oko 90%.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 34

Slika 18. HeLa ćelije nakon 24h u ĉistom medijumu (negativna kontrola), PH 10x10

Ćelije koje su inkubirane 24h u 0,625%-tnom rastvoru Biosenzala, zadrţ ale su

epitelni fenotip i takoĊe prekrivaju oko 90% dna bunara deleći se tako da kćeri ćelije

postepeno obrazuju epitelne ploĉe (slika 19). PoreĊenjem izgleda HeLa ćelija u negativnoj

kontroli i nakon jednodnevne inkubacije u najblaţ em ekstraktu Biosenzala, mogli bismo da

zakljuĉimo da se ne uoĉavaju razlike u vijabilnosti ćelija u 0,625%-tnom ekstraktu u odnosu

na kontrolu što je u skladu sa podacima kasnije dobijenim oĉitavanjem vrednosti apsorbance

(89.9% u odnosu na kontrolu) (grafik 1).

Slika 19. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 0,625%, PH 10x10

U skladu sa vrednostima apsorbance za ekstrakte, u odnosu na negativnu kontrolu

(79.6% od kontrole) (grafik 7) je izgled ćelija u 1,25%-tnom rastvoru Biosenzala. Oĉuvan je

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 35

epitelni fenotip i karakteristiĉan rast HeLa ćelija (slika 20) uz neznatno smanjenje

konfluentnosti na oko 80%.

Slika 20. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 1,25%, PH 10x10

Uoĉljivije morfološke razlike primećene su na HeLa ćelijama kultivisanim u

koncentraciji Biosenzala od 2.5% u odnosu na komercijalni proizvod. Epitelni fenotip je

oĉuvan, ali su velike epitelne ploĉe „razbijene” na manje te je meĊućelijski prostor širi no pri

inkubaciji ćelija u bunarima sa niţ im koncentracijama ispitivanog ekstrakta (slika 21).

Slika 21. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 2,5%, PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 36

Pri inkubaciji HeLa ćelija sa 5%-tnim rastvorom Biosenzala, mikroskopiranjem su

utvrĊene još oĉiglednije promene u odnosu na kontrolu (slika 18). U svakom vidnom polju

primećen je znaĉajno manji broj ćelija nego u svim niţ im koncentracijama. Osim ćelija

epitelnog fenotipa, uoĉene su i mrtve, zaokrugljene ćelije, usled ĉega je procenjeno da je

konfluentnost bila oko 50% (slika 22). U saglasnosti sa ovim rezultatima su i vrednosti

apsorbance oĉitane na fotometru.

Slika 22. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 5%, PH 10x10

Na slici 23 prikazan je izgled ćelija nakon inkubacije sa 10%-tnim rastvorom

Biosenzala. Retke su ćelije epitelnog tipa, dominiraju mrtve i apoptiĉne ćelije što potvrĊuje i

vrednost apsorbance redukovanog MTT-a (39.2%, grafik 1). Uoĉeni su i kristali hipericina

(slika 23).

Slika 23. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 10%, PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 37

Konaĉno, najkoncentrovaniji rastvor Biosenzala spušta vrednost aporbance na 16.1%

u odnosu na kontrolu. Naše fotografije potvrĊuju citotoksiĉno dejstvo ovog tipa rastvora na

HeLa ćelije. Nisu uoĉene ili su bile retke (do 5 po vidnom polju) vijabilne ćelije epitelnog

tipa, retke su apoptiĉne ćelije, a dominiraju okrugle, mrtve ćelije (slika 24).

Slika 24. HeLa ćelije nakon 24h u BS-u 15%, PH 10x10

Budući da sam preparat Biosenzal sadrţ i 60% etanola, ćelije su inkubirane i sa

razliĉitim koncentracijama etanola. Efektivne koncentracije etanola u bunarima odgovarale su

efektivnim koncentracijama etanola u razliĉitim razblaţ enjima rastvora Biosenzala. Ovakvi

bunari predstavljali su kontrolu rastvaraĉa. PoreĊenjem morfologije HeLa ćelija koje su rasle

u 0,375% (slika 25), 0,75% (slika 26), 1,5% (slika 27) i 3%-tnom etanolu (slika 28) sa

morfologijom HeLa ćelija u koje inkubirane u medijumu (slika 18), nisu uoĉene znaĉajne

razlike u gustini ćelija. Epitelni fenotip je zadrţ an, a jedino delimiĉno izĉezava

karakteristiĉan epitelni rast te nema obrazovanja epitelnih ploĉa ili se formiraju manje

epitelne ploĉe. Rezultati MTT testa u skladu su sa našim zakljuĉcima izvedenim na osnovu

mikroskopiranja HeLa ćelija u sterilnim ploĉama za kultivaciju ćelija (grafik 1).

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 38

Slika 25. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 0,375% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Slika 26. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 0,75% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Slika 27. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 1,5% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 39

Slika 28. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 3% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Prve uoĉljive razlike uoĉene su pri posmatranju bunara u kojima je ćelijama dodavan

6%-tni etanol. Retke su adherirane epitelolike ćelije, konfluentnost smanjena na oko 50%, a

dominiraju apoptiĉne i mrtve ćelije (slika 29). MeĊutim, veća je gustina ćelija u ovim

bunarima no u onim gde su ćelije rasle u 10%-tnom rastvoru Biosenzala (slika 23) što bi

znaĉilo da sam Biosenzal u 10%-noj koncentraciji ima citotoksiĉno dejstvo.

Slika 29. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 6% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Budući da nema ţ ivih ćelija nakon jednodnevne inkubacje u 9%-tnom etanolu

(slika 30), kao ni pri inkubaciji u 15%-tnom Biosenzalu, zakljuĉujemo da se citotoksiĉno

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 40

dejstvo Biosenzala u ovoj koncentraciji pripisuje samom efektu alkohola zbog ĉega ova i više

koncentracije Biosenzala nemaju komercijalnu primenu.

Slika 30. HeLa ćelije nakon 24h u etanolu 9% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Kao pozitivna kontrola za ispitivanje uticaja citotoksiĉnosti Biosenzala korišćen je

saponin u koncentraciji od 2 µg/ml. Dobijena je vrednost apsorbance 11,74% u odnosu na

kontrolu. Na fotografijama bunara sa saponinom (slika 31) uoĉavaju se iskljuĉivo mrtve

ćelije kao i u bunarima gde su inkubirane ćelije u 15%-tnom rastvoru Biosenzala (slika 24).

Slika 31. HeLa ćelije nakon 24h u Saponinu 2 µg/ml (pozitivna kontrola), PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 41

5.2 CITOSTATIĈNOST (PROLIFERACIJA)

Grafik 2. Grafiĉki prikaz proliferacije HeLa ćelija u eksperimentu citostatiĉnosti

Na grafiku 2 uoĉava se smanjenje proliferacije HeLa ćelija sa povećanjem

koncentracija Biosenzala, odnosno rast citotoksiĉnosti Biosenzala sa povećanjem

koncentracija.

Nakon 72-ĉasovne inkubacije ćelija u rastvorima Biosenzala razliĉite koncentracije,

pod mikroskopom je posmatran efekat Biosenzala na proliferaciju HeLa ćelija, te je i u ovom

sluĉaju naĊena analogija izmeĊu rezulata dobijenih nakon primenjenog MTT testa i

morfologije ćelija. Nakon 3 dana rasta ćelija u medijumu (slika 32), budući da su ćelije sejane

u gustini 0,5x104 po bunaru, konfluentnost ćelija je bila oko 50%. Uoĉene su manje epitelne

ploĉe i karakteristiĉna morfologija HeLa ćelija.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 42

Slika 32. HeLa ćelije nakon 72h u ĉistom medijumu (negativna kontrola), PH 10x10

Posmatranjem izgleda ćelija koje su rasle u 0,625% (slika 33), 1,25% (slika 34) i

2,5%-tnom (slika 35) rastvoru Biosenzala, takoĊe su uoĉeni karakteristiĉan rast i morfologija

HeLa ćelija. Kada je konfluentnost u pitanju, uoĉeno je dozno zavisno smanjenje

konfluentnosti-sa porastom koncentracije Biosenzala, smanjuje se konfluentnost HeLa ćelija

u svakom bunaru.

Slika 33. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 0,625%, PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 43

Slika 34. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 1,25%, PH 10x10

Slika 35. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 2,5%, PH 10x10

Prve jasnije morfološke razlike u poreĊenju na negativnu kontrolu (slika 32) uoĉenu

se u bunarima sa 5%-tnim rastvorom Biosenzala (slika 36). Ćelije prekrivaju tek oko 30%

dna bunara, retke su adherirane ćelije epitelnog tipa, najbrojnije su apoptotiĉne i mrtve ćelije.

Uoĉljivi su i kristali Biosenzala kao i mrke nakupine koje potiĉu od boje rastvorenog

Biosenzala. Ova koncentracija ima vrednost apsorbance 47.5% u odnosu na kontrolu (grafik

2) što je u skladu sa rezultatima dobijenim posatranjem morfologije HeLa ćelija.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 44

Slika 36. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 5%, PH 10x10

Biosenzal u 10%-tnoj koncentraciji dalje inhibira proliferaciju HeLa ćelija te se opaţ a

konfluetnost od oko 30% pri ĉemu su ćelije uglavnom apoptotiĉne ili mrtve (slika 37).

Slika 37. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 10%, PH 10x10

Najkoncentrovaniji rastvor Biosenzala potpuno zaustavlja proliferaciju ćelija te nakon

tri dana rasta ćelija u 15%-tnoj koncentraciji nisu uoĉene vijabilne već samo mrtve ćelije u

bunarima (slika 38).

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 45

Slika 38. HeLa ćelije nakon 72h u BS-u 15%, PH 10x10

Na slikama 39, 40 i 41 (etanol 0,375%, 0,75% i 1,5%) ne uoĉavaju se znaĉajne razlike

u rastu HeLa ćelija u odnosu na kontrolu (slika 32). Prve znaĉajne razlike uoĉene su pri rastu

ćelija u 3%-tnom etanolu gde su pre svega u centru vidnog polja razbijene epitelne ploĉe,

smanjena konfluentnost, retke adherirane ćelije, dominiraju apoptiĉne, a oko 20% je mrtvih

ćelija (slika 42).

Slika 39. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 0,375% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 46

Slika 40. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 0,75% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Slika 41. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 1,5% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Slika 42. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 3% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 47

U bunarima u kojima su zasejane ćelije rasle u prisustvu 6%-tnog alkohola ţ ivih ćelija

nema, dominiraju apoptiĉne i mrtve ćelije (slika 43). 9% alkohol potpuno zaustavlja

proliferaciju ćelija te se uoĉavaju samo mrtve ćelije (slika 44).

Slika 43. HeLa ćelije nakon 72h u etanolu 6% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Slika 44. HeLa ćelije nakon 72h u Alkoholu 9% (kontrola rastvaraĉa), PH 10x10

Pozitivna kontrola za citostatiĉnost bio je 5 Fluorouracil (5 FU) u koncentraciji od

1µg/ml. ĉija je vrednost apsorbance u odnosu na kontrolu bila 42.2%. Fotografija ćelija

inkubiranih u 5 FU potvrĊuju inhibitorno dejstvo 5 FU-a na proliferaciju HeLa ćelija (slika

45).

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 48

Slika 45. HeLa ćelije nakon 72h u 5 FU 1 µg/ml (pozitivna kontrola), PH 10x10

U savremenim biomedicinskim istraţ ivanjima svakodnevno se ulaţ u napori u razvoju

novih metoda i medikamenata koji bi mogli biti upotrebljeni u leĉenju malignih oboljenja.

Već smo naglasili da je potvrĊeno dejstvo kantariona (Hipericum perforatum L.) kao

antidepresiva. Ipak osim u toj primeni mogu se naći i brojni literaturni podaci o ispitivanjima

njegovog citotoksiĉnog i citostatiĉnog dejstva, na ĉemu je bilo bazirano i ovo istraţ ivanje.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 49

6. ZAKLJUĈAK

Na osnovu rezultata istraţ ivanja o efektima BIOSENZAL®-a na citotoksiĉnost

(vijabilnost) i citostatiĉnost (proliferaciju) HeLa ćelija in vitro moţ e se zakljuĉiti sledeće:

1. Biosenzal ima direktno dozno-zavisno delovanje na vijabilnost i proliferaciju HeLa

ćelija in vitro

2. Vijabilnost HeLa ćelija direktno zavisi od koncentracije biosenzala, a doza od 10%

biosenzala smanjuje ćelijsku vijabilnost za više od 50%

3. Proliferacija HeLa ćelija direktno zavisi od koncentracije biosenzala, a doza od 5%

biosenzala smanjuje ćelijsku proliferaciju za više od 50%

4. Dobijeni rezultati mogli bi da daju doprinos daljim istraţ ivanjima i nalaţ enju novih

primena kantariona, a u cilju proširenja terapijskih indikacija i upotrebi u hemoterapiji ali i

leĉenju stanja gde će tek naći primenu.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 50

7. LITERATURA

1. Weiss FR, Fintelmann V. Herbal medicine, 2nd ed. Thieme, Stuttgart-New York,

2000; 274-276.

2. http://www.magicnobilje.com/kuvar/fitoterapija/nervi.html

3. http://artlife.info/Herbs%20pages/kantarion.html

4. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hypericin-3D-sticks.png

5. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hypericin.png

6. Newal C, Anderson L, and Philipson D. Herbal medicines, a guide for Health-care

Professionals. The Pharmaceutical Press, 1996: 250-252

7. Sokolović DT. Modulatorni efekti Biosenzal-a na ćelijsku proliferaciju i imunu

funkciju, magistarski rad. Medicinski fakultet Univerzitata u Nišu, 2003.

8. Lekovito bilje SR Srbije (1979)

9. http://www.zivetisabiljkama.net/index.php/pocetna/203

10. http://www.kakopedija.com/7017/kako-napraviti-kantarionovo-ulje/

11. http://www.najboljamamanasvetu.com/2011/09/5-koraka-do-savrsenog-caja/

12. http://www.mojaskola.me/os-salko-aljkovic/home/ljekovito-bilje

13. http://www.sinefarm.co.rs/sr/katalog/tinkture/kapi_od_prop_kant_cvit.htm

14. http://www.globalchemmade.com/company/10244/Products/58728.html

15. Rahbari R, Sheahan T, Modes V, Collier P, Macfarlane C, Badge RM. A novel L1

retrotransposon marker for HeLa cell line identification. BioTechniques, 2009; 46 (4): 277–

284.

16. Scherer WF, Syverton JT, Gey GO. Studies on the propagation in vitro of

poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial

cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. J. Exp. Med., 1953;

97 (5): 695–710.

17. Capes-Davis A, Theodosopoulos G, Atkin I, Drexler HG, Kohara A, MacLeod RA,

Masters JR, Nakamura Y, Reid YA, Reddel RR, Freshney RI. Check your cultures! A list of

cross-contaminated or misidentified cell lines. Int. J. Cancer, 2010; 127 (1): 1–8.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 51

18. Batts. Cancer cells killed Henrietta Lacks - then made her immortal. The Virginian-

Pilot, 2010. pp 1, 12–14. Retrieved 2012-03-17.; Note: Some sources report her birthday as

August 2, 1920 vice August 1, 1920.

19. http://www.exploratorium.edu/imaging_station/research/cancer/story_cancer4.php

20. http://www.olympusfluoview.com/gallery/cells/hela/helacells.html

21. http://www.medicaltourismco.com/oncology/cervical-cancer-treatment-abroad.php

22. http://en.citizendium.org/wiki/cervical_cancer

23. Washington, Harriet "Henrietta Lacks: An Unsung Hero", Emerge Magazine, October

1994

24. Skloot, Rebecca. The Immortal Life of Henrietta Lacks. New York: Crown/Random

House, 2010.

25. Sharrer T. HeLa Herself, The Scientist, 2010; 20 (7): 22.

26. http://itsbrowntown.blogspot.com/2012/08/an-open-letter-to-those-colleges-and.html

27. http://en.wikipedia.org/wiki/File:George_Gey.jpg

28. Smith, Van. The Life, Death, and Life After Death of Henrietta Lacks, Unwitting

Heroine of Modern Medical Science. Baltimore City Paper, 2002; Retrieved 2010-03-02.

29. Parker J, Murphy W, Wang D, O'Brien S, Parrish C. Canine and feline parvoviruses

can use human or feline transferrin receptors to bind, enter, and infect cell. Journal of

Virology. 2001; 75 (8): 3896–3902.

30. Acrani GO, Gomes R, Proença-Módena JL et al. Apoptosis induced by Oropouche

virus infection in HeLa cells is dependent on virus protein expression. Virus Res, 2010; 149

(1): 56–63.

31. Hou, S.Y. Wu, S. Chiang, C. Transcriptional Activity among High and Low Risk

human Papillomavirus proteinsE2 Proteins correlates of E2 DNA binding. Journal of

Biological Chemistry, 2002.

32. Del Puerto HL, Martins AS, Milsted A, et al. Canine distemper virus induces

apoptosis in cervical tumor derived cell lines. Virol. J., 2011; 8: 334.

33. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 on nobelprize.org

34. Ivanković M, Cukusić A, Gotić I, Skrobot N, Matijasić M, Polancec D, Rubelj I.

Telomerase activity in HeLa cervical carcinoma cell line proliferation. Biogerontology, 2007;

8 (2): 163–72.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 52

35. F. Pene, E. Courtine, A. Cariou, J.P. Mira. Toward theranostics. Crit Care Med, 2009;

37 pp. S50–S58

36. Masters JR. HeLa cells 50 years on: the good, the bad and the ugly. Nat. Rev. Cancer,

2002; 2 (4): 315–9.

37. Gold, Michael. A Conspiracy of Cells: One Woman's Immortal Legacy and the

Medical Scandal It Caused.

38. Van Valen LM, Maiorana VC. HeLa, a new microbial species. Evolutionary Theory

& Review, 1991; 10: 71–4.

39. Weiss R.F. Lenhbuch der Phytoterapie. Stutgart, 1985

40. Chen B, Xu Y, Roskams T, Delaey E, Agostinis P, Vandenheede J.R, and de Writte P.

Efficacy of atitumoral photodynamic therapy with hypericin; Relationship between

biodistribution and photodynamic effect in the RIF – 1 mouse tumor model. Int J Cancer,

2001; 93 (2): 275-282

41. Fox F.E, Niu Z, Tobia A. and Rook A.H. Photo activated hypericin is an

antiproliferative agent that induces a high rate of spoptotic death of normal, transformed and

malignant T lymphocytes; Implications for the treatment of cutaneous lymphoproliferative

and inflamantorz disorders. J Invest Dermatol, 1998; 111 (2): 327-332

42. Hamilton H.B, Hinton D.R, Law R.E, Gopalakrishna R, Su Y.Z, Chen Z.H. and

Couldwell W.T. Inhibition of cellular growth and induction of apoptosis in pituitary adenoma

cell lines by the protein kinase C inhibitor hypericin; Potential therapeutic application. J

Neurosurg, 1996; 85 (2): 329-334

43. Mellor H, Parker PJ. The extended protein kinase C superfamily. Biochem. J., 1998;

332 ( Pt 2): 281–92.

44. Weller M, Trepel M, Grimmel C, Schabet MBD, Krajewsky S. And Reed JC.

Hyperinin-induced apoptosis of human malignant giloma cells is light dependent,

independent of bcl-2 expresion, and does not require wild-type p53. Neurol Res, 1997; 19

(5): 459-470

45. http://muta-tion.blogspot.com/2011/08/apoptosis.html

46. Vandenbogaerde AL, Cuveele JF, Proot P, Himpens BE, Merlevede WJ. and de Witte

P.A. Differential cytotoxic effects induced after photosensitization by hypericin. J Photochem

Photobiol B, 1997; 38 (2-3): 136-142

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 53

47. Hunt E.J, Lester C.E, Lester EA, and Tackett RL. Effects of St. John’s Wort on free

radical production. Life sci., 2001; 69 (2): 181-190

48. Johnson SA. and Pardini RS. Antioxidant enzyme response to hypericin in EMT6

mouse mammary carcinoma cells. Free Radic Biol Med, 1998; 24 (5): 817-826

49. Wada A, Sakaeda T, Takara K, Hirai M, Kimura T, Ohmoto N. et al. Effects of St

John’s Wort and Hypericin on Cytotoxity of Anticancer Drugs. Drug Metab. Pharmacokin,

2002; 17 (5): 467-474

50. http://www.stanford.edu/class/humbio103/ParaSites2005/Ivermectin/resistance.htm

51. Freshney IR. Culture of animal cells, 5th ed . A john Wiley and sons, Inc., Publication.

2005.

52. http://en.wikipedia.org/wiki/Saponin

53. http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorouracil

54. http://en.wikipedia.org/wiki/Ethanol

55. http://en.wikipedia.org/wiki/Microscope

56. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Optical_microscope_nikon_alphaphot_%2B.jpg

57. http://en.wikipedia.org/wiki/Centrifuge

58. http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA

59. http://www.danlab.fi/Counting-chamber-Neubauer-dark-1pc

60. http://eurekabrewing.wordpress.com/

61. http://modernsteroid.blogspot.com/2012/03/potent-antiproliferative-activity-of.html

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 54

8. BIOGRAFIJA

Vanja Stojanović roĊen je u Nišu 31.07.1988 godine. Osnovno i srednje obrazovanje

stekao je u svom rodnom gradu, u kome je nastavio i visoko obrazovanje.

2007. godine upisao je Prirodno-matematiĉki fakultet na departmanu za Biologiju i

Ekologiju. Osnovne studije završio je u roku, 2010. godine sa prosekom 8,18 i ostvarenim

191ESP bodom. Iste godine nastavio je obrazovanje upisom na Master akademske studije

Biologije koje je završio 2012. godine sa prosekom 9,04 i ostvarenim 326 ESP bodom, 26

ESP bodova više od minimalnih 300. Ne raĉunajući odbranu Master teze, on je poloţ io 55

ispita i time postao student sa najvećim brojem poloţ enih ispita na Prirodno-matematiĉkom

fakultetu u Nišu na departmanu za Biologiju i ekologiju.

Veliku ţ elju za konstantnim napredovanjem koju je pokazao tokom studiranja kako u

nastavnim, tako i u vannastavnim aktivnostima i uĉešću na projektima, on će nastaviti i u

budućnosti.

Vanja stojanović ţ eli da završi doktorske studije iz oblasti genetike, a na osnovu

dosadašnjih rezultata, zalaganja i upornosti, nesumnjiv je njegov put ka daljem uspehu.

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 55

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Вања Стојановић Ментор, МН: Стево Најман Наслов рада, НР:

Ефекти екстракта кантариона (Hipericum perforatum L.) на вијабилност и пролиферацију HeLa ћелија in vitro Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: српски Земља публиковања, ЗП: Србија Уже географско подручје, УГП: Србија Година, ГО: 2012. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) стр. ; графички прикази Научна област, НО: биологија Научна дисциплина, НД: биологија ћелије Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Hipericum perforatum, HeLa ћелије, ћелијска

вијабилност, ћелијска пролиферација

УДК 582.684.1 : 576.32/36 Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ:

Циљ овог рада био је да се утврде ефекти екстракта кантариона (Hypericum

perforatum L.) на вијабилност и пролиферацију HeLa ћелија in vitro помоћу МТТ теста. Као алкохолни екстракт кантариона коришћен је комерцијални препарат Биосензал® у ефективним дозама од 0,625, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% и 15%. Одговарајуће концентрације етанола служиле су као контрола растварача, а медијум је био негативна контрола. Позитивна контрола за цитотоксичност на 24 сата је био сапонин, а за цитостатичност на 72 сата 5-флуороурацил. Установљена је дозна зависност деловања екстракта кантариона и на вијабилност и пролиферацију HeLa ћелија. Датум прихватања теме, ДП: Децембар, 2012.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

_______________________________________________________________Master rad

___________________________________________________________________________ 56

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Образац Q4.09.13 – Издање 1

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: master thesis Author, AU: Vanja Stojanović Mentor, MN: Stevo Najman Title, TI: Effects of St John’s wort (Hipericum perforatum L.) extract on

viability and proliferation of HeLa cells in vitro

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2012. Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) p. ; graphic representations Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: cell biology Subject/Key words, S/KW: Hipericum perforatum, HeLa cells, viability of cells,

proliferation of cells

UC 582.684.1 : 576.32/36 Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: The aim of this study was to determine the effects of St. John's wort

(Hipericum perforatum L.) extract on viability and proliferation of HeLa cells in vitro by using MTT. For this purpose was done the examination of commercial product Biosenzal® as alcoholic hipericum extract in different concentrations (0,625%, 1,25%, 2,5%, 5%, 10% and 15%). The appropriate concentrations of ethanol were used as a solvent control, and negative control was the pure medium. Positive control for cytotoxicity during 24h was saponin and for cytostatic effect during 72h was 5-Fluorouracil. Dose dependence of effects caused by hypericum extract on viability and proliferation of HeLa cells were determined. Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor: