EFEKTIVITAS EKSTRAK DAUN UNGU UNTUK

MENURUNKAN KADAR TNFα DAN NO Studi eksperimental pada mencit Swissyang diinfeksi Staphylococcus aureus

Effectiveness of Extract Gratophyllum pictum (L.) Leaves to Reduce

Level of TNFα and NO

Experimental studies in Swiss mice infected by Staphylococcus

aureus

Tesis

Untuk memenuhi sebagian persyaratan

Mencapai derajat Sarjana S-2

Magister Ilmu Biomedik

Nur Patria Tjahjani

22010113410004

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2015

TESIS

EFEKTIVITAS EKSTRAK DAUN UNGU UNTUK

MENURUNKAN KADAR TNFα DAN NO Studi eksperimental pada mencit Swiss yang diinfeksi Staphylococcus aureus

Disusun oleh :

Nur Patria Tjahjani

22010113410004

telah dipertahankan di depan Tim Penguji

pada tanggal 17 Juni 2015

dan dinyatakan telah memenuhi syarat untuk diterima

Menyetujui

Pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Prof.Dr.dr.Tri Nur Kristina,DMM.,M.Kes dr. Endang Sri Lestari, PhD

NIP. 195905271986032001 NIP.196610161997022001

Mengetahui :

Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro

.dr. A. Zulfa Juniarto, MSi Med, Sp.And,PhD

NIP. 197006081997021001

ii

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis ini adalah hasil pekerjaan saya sendiri

dan di dalamnya tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh

gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan lembaga pendidikan lainnya, serta

tidak terdapat unsur-unsur yang tergolong plagiarism sebagaimana dimaksud

dalam PerMendiknas No.17 Tahun 2010.Pengetahuan yang diperoleh dari hasil

penerbitan maupun yang belum atau tidak diterbitkan, sumbernya dijelaskan di

dalam tulisan dan daftar pustaka.

Semarang,Juni 2015

Nur Patria Tjahjani

iv

RIWAYAT HIDUP

A. Identitas

Nama : Nur Patria Tjahjani, S.Si.,Apt.

Tempat/tanggal lahir : Surakarta, 5 Januari 1971

Agama : Islam

Jenis Kelamin : Perempuan.

B. Riwayat Pendidikan

1. SDN Sompok II Semarang : Lulus Tahun 1983

2. SMPN 2 Semarang : Lulus Tahun 1986

3. SMAN 1 Semarang : Lulus Tahun 1989

4. Fak. Farmasi UGM Yogyakarta : Lulus Tahun 1996

5. Magister Ilmu Biomedik UNDIP Semarang : 2013 – Sekarang.

C. Riwayat Pekerjaan

1. Tahun 1996 – Sekarang : Staf Pengajar Tetap DIII Analis Farmasi

dan Makanan 17 Agustus 1945 Semarang

2. Tahun 1996 – Sekarang : Apoteker Penanggung Jawab Apotek

Fortuna Semarang.

3. Tahun 2009 – Sekarang : Staf Pengajar Tidak tetap di Poltekkes

Kemenkes Negeri Jurusan Analis Kesehatan Semarang.

D. Riwayat Keluarga

1. Nama Suami : Dwi Nugroho, SH

2. Nama Anak : Fatkhan Maulana Akbar

Fahmi Nur Rizki Madani

Fahma Nurrudina

Fadlan Noorikhsan

v

KATA PENGANTAR

Segala puji kehadirat Allah SWT atas rahmat, nikmat dan perkenan-Nya

sehingga dapat diselesaikannya tesis dengan judul “Efektivitas Ekstrak Daun

Ungu Untuk Menurunkan Kadar TNF-α dan NO (Studi eksperimental pada

mencit Swiss yang diinfeksi Staphylococcus aureus )". Tesis ini disusun sebagai

bagian dari tugas akhir dalam rangka menyelesaikan studi di Program Magister

Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro.Dalam penyelesaian

tesis ini, penulis banyak mendapatkan bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu

penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada :

1. Rektor Universitas Diponegoro yang telah memberikan ijin dan

kesempatan kepada penulis untuk meningkatkan ilmu pengetahuan pada

program studi ilmu biomedik.

2. Prof. Dr. dr. Tri Nur Kristina, DMM, M.Kes, Dekan Fakultas Kedokteran

Universitas Diponegoro Semarang dan selaku dosen pembimbing I atas

segala kesabaran dan ketulusannya yang telah banyak meluangkan waktu,

tenaga, pengarahan, serta memberikan dorongan, inspirasi kepada penulis

dalam menyelesaikan tesis ini.

vi

3. dr. Endang Sri Lestari, Ph.D, selaku dosen pembimbing II atas segala

kesabaran dan ketulusannya yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga,

pengarahan dan memberikan dorongan, motivasi kepada penulis dalam

menyelesaikan tesis ini.

4. dr. Achmad Zulfa Juniarto, MSi. Med.Sp.And.Ph.D, Ketua Program Studi

Ilmu Biomedik Program Pasca Sarjana Universitas Diponegoro yang telah

memberikan ijin dan kesempatan untuk menempuh pendidikan.

5. Dr.dr. RA Kisdjamiatun RMD, MSc, dan Dr.dr. Nyoman Suci Widyastiti,

M.Kes,Sp.PK selaku tim penguji yang telah memberi masukan dan saran.

6. Seluruh Guru Besar dan Dosen di lingkungan Magister Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Diponegoro yang telah memberikan pengetahuan

dan ilmunya selama penulis menempuh pendidikan.

7. Seluruh jajaran civitas akademika AKAFARMA-AAK 17 Agustus 1945

yang telah memberi dukungan moril dan materiil sehingga penulis dapat

melaksanakan studi lanjut.

8. Ririn Lispita Wulandari S.Farm.,Apt dan Annaas Setyawan Ns,

terimakasih atas kebersamaannya, bantuan dan motivasinya sehingga

penulis dapat menyelesaikan tesis ini.

9. dr. Fransisca PH, MSi.Med., terimakasih atas bantuan dan motivasinya.

10. Suami (Dwi Nugroho) dan anak-anakku tercinta (Fatkhan Maulana Akbar,

Fahmi Nur Rizki Madani, Fahma Nurrudina, dan Fadlan Noorikhsan)

vii

yang tiada henti memberikan doa, semangat, dukungan, yang sangat

berharga bagi penulis

11. Semua pihak yang telah membantu dan tidak dapat penulis sebutkan satu

persatu, atas budi baik mereka penulis sampaikan terima kasih.

Keterbatasan pengalaman, pengetahuan, dan pustaka dari penulis sehingga

tesis ini masih banyak kekurangan dan kelemahan.Untuk itu, saran dan kritik yang

konstruktif sangat membantu agar tesis ini dapat menjadi lebih baik dan sebagai

masukan bagi penulis untuk penelitian selanjutnya.

Akhir kata, semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan

dapat meningkatkan penggunaan tanaman obat asli Indonesia supaya menjadi tuan

rumah di negeri sendiri.

Semarang, Juni 2015

Nur Patria Tjahjani

viii

DAFTAR ISI

Halaman

Halaman Judul ....................................................................................................... i

Lembar Pengesahan .............................................................................................. ii

Lembar Monitoring ................................................................................................ iii

Pernyataan ............................................................................................................. iv

Riwayat Hidup ....................................................................................................... v

Kata Pengantar ....................................................................................................... vi

Daftar Isi ................................................................................................................ ix

Daftar Tabel ........................................................................................................... xiv

Daftar Gambar ....................................................................................................... xv

Daftar Grafik.......................................................................................................... xvi

Daftar Lampiran ..................................................................................................... xvii

Daftar Singkatan .................................................................................................... xviii

Abstrak .................................................................................................................. xx

BAB I PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1

1.2 Perumusan Masalah ........................................................................... 4

1.3 TujuanPenelitian ................................................................................ 4

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................. 4

1.5 Orisinalitas Penelitian ........................................................................ 5

ix

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 7

2.1 Tumor Necrosis Factor α (TNF-α) ..................................................... 7

2.2 Nitrit Oksida ...................................................................................... 8

2.2.1 Pembentukan NO teraktivasi .................................................... 8

2.3 Hubungan antara TNF-α dan NO ....................................................... 10

2.4Staphylococcus .................................................................................... 11

2.4.1 Morfologidan Identifikasi S. aureus ......................................... 11

2.4.2 Struktur BakteriS. aureus ......................................................... 12

2.4.3 Faktor Virulensi S. aureus ........................................................ 13

2.4.4KlasifikasiS. aureus ................................................................... 14

2.4.5 Patogenesis .............................................................................. 14

2.4.6Molekuler Patogenesis ............................................................... 15

2.5Respon Imunitas karena infeksi S. aureus ............................................ 17

2.5.1 Respon imunitas seluler ........................................................... 17

2.5.2 Mekanisme Respon Imunitas ................................................... 18

2.6 Daun Ungu ........................................................................................ 21

2.6.1 Taksonomi Daun Ungu ............................................................ 21

2.6.2Deskripsi ................................................................................... 22

2.6.3Khasiatdan Kandungan Kimia Daun Ungu ................................. 23

2.6.4 Kandungan Kimia Aktif ........................................................... 23

2.6.5Respon Imunitas Kandungan Kimia Aktif .................................. 24

x

2.7 Mencit ............................................................................................... 26

2.7.1 Taksonomi Mencit ................................................................... 26

2.8 Penentuan Dosis ................................................................................ 26

2.9Kerangka Teori .................................................................................... 28

2.10Kerangka Konsep .............................................................................. 29

2.11Hipotesis ........................................................................................... 29

BAB III METODE PENELITIAN ........................................................................ 30

3.1 Ruang Lingkup Penelitian .................................................................. 30

3.2 Rancangan Penelitian......................................................................... 30

3.3 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 32

3.4 Populasi dan Sampel .......................................................................... 33

3.4.1 Populasi ..................................................................................... 33

3.4.2 Sampel ..................................................................................... 33

3.5 Kriteria Inklusi, Eksklusi dan Drop Out ............................................. 33

3.5.1 Kriteria Inklusi ......................................................................... 33

3.5.2 Kriteria Eksklusi ...................................................................... 34

3.5.3Kriteria Drop Out ....................................................................... 34

3.6 Variabel Penelitian ............................................................................ 34

3.6.1 Variabel Bebas ......................................................................... 34

3.6.2 Variabel Tergantung ................................................................ 34

3.7 Definisi Operasional Variabel ............................................................ 35

3.8Analisis Data ....................................................................................... 35

xi

3.9 Alat, Bahan, dan Reagen Penelitian ................................................... 37

3.10 Prosedur Pembuatan Ekstrak ............................................................ 40

3.10.1 Determinasi Daun Ungu ......................................................... 40

3.10.2 Pengeringan dan Penyiapan Sampel ....................................... 40

3.10.3 Pembuatan Ekstrak Daun Ungu .............................................. 41

3.11Perhitungan Dosis .............................................................................. 41

3.12Mikrobiologi ..................................................................................... 43

3.12.1 Pembuatan Standar Kekeruhan Larutan ................................. 43

3.12.2 Prosedur kultur dan Pengenceran Suspensi Bakteri Uji ........... 43

3.12.3 Pemeriksaan Bakterimia ......................................................... 44

3.13Cara Euthanasi Hewan Coba .............................................................. 44

3.14Prosedur Pengumpulan Data .............................................................. 45

3.14.1 Persiapan Sebelum Penelitian .............................................. 45

3.14.2 Perlakuan Terhadap Mencit ................................................. 46

3.14.3 Prosedur Pembuatan Kultur Makrofag ................................. 47

3.14.4 Prosedur Pemeriksaan Kadar TNF-α .................................... 49

3.14.5 Prosedur Pemeriksaan Kadar NO ......................................... 52

3.15 Alur Kerja Penelitian ....................................................................... 54

3.16 Etika Penelitian ................................................................................ 55

BAB IV HASIL PENELITIAN .............................................................................. 56

4.1 Perbandingan Kadar TNF-α antar Kelompok Perlakuan ..................... 58

4.2 Perbandingan Kadar NO antar Kelompok Perlakuan .......................... 59

xii

4.3 Uji Korelasi Kadar TNF-α dan NO .................................................... 61

BAB V PEMBAHASAN ....................................................................................... 62

5.1 Kadar TNF-α ..................................................................................... 62

5.2 Kadar NO .......................................................................................... 65

5.3 Hubungan antara Kadar TNF-α dan Kadar NO .................................. 66

5.4 Keterbatasan Penelitian...................................................................... 68

SIMPULAN………………….. .............................................................................. 69

SARAN………………….. .................................................................................... 69

DAFTAR PUSTAKA………………….. ............................................................... 70

LAMPIRAN………………….. ............................................................................. 77

xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Orisinalitas Penelitian ............................................................................... 5

Tabel 2. Hasil Skrining Fitokimia Daun Ungu ........................................................ 23

Tabel 3. Rancangan Eksperimental ........................................................................ 32

Tabel 4.Definisi Operasional Variabel .................................................................... 35

Tabel 5. Pemeriksaan Bakteri S. aureus pada Kultur Darah .................................... 57

Tabel 6. Uji LSD Kadar TNF-α .............................................................................. 59

Tabel 7. Uji Mann-Whitney Kadar NO ................................................................... 61

Tabel 8. Uji Korelasi Spearman Kadar TNF-α dan NO .......................................... 61

xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Sintesis Nitrit Oksida ............................................................................ 9

Gambar 2.Staphylococcus aureus ........................................................................... 12

Gambar 3. Struktur Dinding Sel S. aureus .............................................................. 13

Gambar 4. Mekanisme Respon Imunitas Bakteri Intraseluler.................................. 19

Gambar 5. Respon imunitas nonspesifik dan spesifik ............................................. 20

Gambar 6. Daun Ungu ........................................................................................... 22

Gambar 7. Desain Rancangan Penelitian ................................................................ 30

xv

DAFTAR GRAFIK

Halaman

Grafik 1. Rerata Kadar TNF-α dari supernatan Kultur Makrofag Peritoneal.. ......... 58

Grafik 2. Rerata Kadar NO dari supernatan Kultur Makrofag Peritoneal ................ 60

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil Pengukuran Kadar TNF-α ......................................................... 77

Lampiran 2. Hasil Pengukuran Kadar NO .............................................................. 80

Lampiran 3. Hasil analisis statistik Kadar TNF-α ................................................... 83

Lampiran 4. Hasil analisis statistik Kadar NO ........................................................ 87

Lampiran 5. Hasil analisis Korelasi Spearman Kadar TNF-α dan NO .................... 95

Lampiran 6. Pembuatan Suspensi Ekstrak daun Ungu ............................................ 97

Lampiran 7. Perhitungan Sel pada Kultur Sel Makrofag Peritoneal ........................ 98

Lampiran 8. Pembuatan Larutan Standar untuk Penetapan Kadar NO .................... 99

Lampiran 9. Dokumentasi ...................................................................................... 100

Lampiran 10. Surat Keterangan .............................................................................. 103

1. Surat Keterangan Ethical Clearance

2. Surat Keterangan Pemeliharaan Hewan Coba

3. Surat Keterangan Determinasi Tanaman Daun Ungu.

4. Surat Keterangan Pembuatan Ekstrak Daun Ungu

5. Surat Keterangan Selesai Melaksanakan Pengujian Penelitian di

Unit Layanan Penelitian Pra-Klinik dan Pengembangan Hewan

Percobaan (LP3HP)LPPT UGM.

6. Surat Keterangan Selesai Melaksanakan Pengujian Penelitian

TNF-α dan NO di LPPT UGM.

xvii

DAFTAR SINGKATAN

APC : Antigen Presenting Cell

BA : Blood Agar

BAP : Blood Agar Plate

BH4 : Tetrahydrobiopterin

CD : Cluster of Differentiation

CHIP : Chemotaxis Inhibitory Protein

Eap : Extracellular adherence protein (Eap)

FAD : Flavin Adenin Dinukleotida

FBS : Foetal Bovine Serum

FMN : Flavin Mono Nukleotida

HIB : Heart Infusion Broth

ICAM : Intercelluler adhesion molecule

IFN-γ : Interferron Gamma

IL : Interleukin

iNOS : inducible Nitric Oxide Synthase

KHM : Konsentrasi Hambat Minimal

LPS : Lipopolisakarida

LTB : Leukotrien B

MHC : Major Histocompatibility Complex

MRSA : Methicillin Resistant Staphylococcus aureus

xviii

NK : Natural Killer

NADPH : Nicotinamide Adenin Dinucleotida

NO : Nitrit Oksida

NOS : Nitric Oxide Synthase

PAF : Platelet Activating Factor

PBS : Phosphat Buffer Saline

PRMB : Phenol Red Mannitol Broth

RNI : Reactive Nitrogen Intermediate

RPMI : Roswell Park Memorial Institute

ROI : Reactive Oxigen Intermediate

TCR : T Cell Receptor

Th : Sel T Helper

TLR : Toll Like Receptor

TNF-α : Tumor Necrosis Factor α

TNFR : Tumor Necrosis Factor Receptor

xix

Abstrak

Latar Belakang: Ekstrak daun Ungu (Gratophyllum pictum L.) mengandung

senyawa fitokimia aktif seperti alkaloid, tannin dan flavonoid yang mempunyai

aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.Penelitian ini bertujuan

untuk membuktikan efektivitas pemberian ekstrak daun Ungu dalam menurunkan

kadar TNF-α dan NO pada mencit Swiss yang diinfeksi dengan S. aureus.

Metode: Penelitian ini adalah Post Test Only Randomized Control Group

Designdengan menggunakan mencitSwiss sebanyak 30 ekor yang dibagi menjadi

5 kelompok perlakuan yaitu K(-) mencit sehat; K(+) mencit yang diinfeksi S.

aureus; P1, P2, P3 diinfeksi S.aureus dan diberi ekstrak daun ungu 75, 150, 300

mg/kgBB/ hari selama 7 hari. Pengukuran kadar TNF-α dan NO dari supernatan

kultur makrofag peritoneal dilakukandengan menggunakan ELISA dan microplate

reader.

Hasil: Rerata kadar TNF-α kelompok K(-), K(+), P1, P2, P3 secara berurutan

300,29;550,29; 390,34; 517,67; dan 327,55 pg/ml. Uji One Way ANOVA

menunjukkan ada perbedaan bermakna pada kelima kelompok perlakuan (p=

0,001), uji Post Hoc LSD kelompok P1 dan P3 berbeda bermakna dengan

kelompok K(+) dengan p = 0,013 dan p = 0,001. Rerata kadar NO kelompok K(-),

K(+), P1, P2, P3 secara berurutan adalah 1,32 ; 3,56 ; 2,50 ; 2,64 ; 1,56

µM/ml.Hasil uji Mann-Whitney menunjukkan bahwa kadar NO berbeda bermakna

antara kelompok K(+) dengan P3 dengan p=0.037. Hasil uji korelasi Spearman

terdapat korelasi positif antara TNF α dan NO dengan hasil bervariasi pada setiap

kelompok perlakuan (rs=0,143 – 0,657).

Simpulan: Pemberian ekstrak daun Ungu dosis 300mg/kgBB/hari selama 7 hari

secara bermakna dapat menurunkan kadar TNF-α dan NO pada mencit Swiss yang

diinfeksi S. aureus.

Kata kunci : Ekstrak daun Ungu, Staphylococcus aureus, TNF-α, NO.

xx

Abstract

Background: Extract of Gratophyllum pictum L. leaves containactive

phytochemical compounds such as alkaloids, tannins and flavonoids, which have

antibacterial activity against Staphylococcus aureus. This study aims to prove the

effectiveness of extract of G. pictum L.to reduce the level of TNF-α and NO in

Swiss mice infected with S. aureus.

Methods: The study was a Randomized Post Test OnlyControl Group design by

using 30 Swiss mice thatwere divided into 5 groups, consist of : K (-) normal

mice ; K(+) mice were infected with S. aureus ; P1 , P2 , P3 were infected with S.

aureus and given extract of G. pictum leaves 75, 150, and300 mg/kgBW/day for 7

days . The measurement of TNF-α and NOlevel were done from peritoneal

macrophages culture supernatant byusing ELISA and microplate reader .

Results: Mean levels of TNF-α group K ( - ) , K ( + ) , P1 , P2 , P3 were 300.29 ;

550.29 ; 390.34 ; 517.67 ; 327.55 pg / mlrespectively. One Way ANOVA test

showedthere was significant differences between all treatment groups (p= 0.001),

LSD Post Hoc test revealedP1 and P3 groups different significantly with K(+)

with p= 0.013 and p = 0.001. Mean levels of NO group K (-), K (+), P1, P2, P3

were 1.32; 3.56 ; 2.50 ; 2.64 ; 1.56 µM / mlrespectively.Mann-Whitney Test

showed that levels of NO significantly different between K(+) with P3 with

p=0,037.Spearman correlation test results are positive correlation between TNF-

α and NO with the variation results on each treatment groups (rs 0,143 – 0,657 ).

Conclusion: Extract G. pictum leaves 300 mg/kgBW/day for 7 days can

significantly reduce levels of TNF-α and NO in Swiss mice infected by S. aureus.

Keywords : Extract of Gratophylum pictum leaves,Staphylococcus aureus, TNF-α,

NO .

xxi