培養ヒト表皮角化細胞と真皮線維芽細胞の増殖とサイトカイン...
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日皮会誌:105 (5), 699―706, 1995 (平7)
培養ヒト表皮角化細胞と真皮線維芽細胞の増殖とサイトカイン
産生に対する乾癖治療薬の影響
丸山
岩月
幸治1)2)
啓氏1)
張
小野
要 旨
乾癖治療薬の皮膚細胞に対する作用を明らかにする
ために,われわれは正常ヒト表皮角化細胞(NHK),
真皮線維芽細胞(HDF)の増殖とそれらの細胞が産生
するサイトカインに対する影響を検討した.乾癖治療
薬として, corticosteroids〔hydrocortisone (HC),
dexamethasone (Dex)〕, VitaminDs誘導体〔!,25,
dihydroxyvitamin D,(1,25(OH)J)ムMC903〕,合
成retinoids fetretinate(Etret), Am-80〕, cyclosporin
A(CSA)を対象とした.細胞増殖の検討はMTT法,
サイトカインについてはinterleukin (IL) -6, Iし8を
ELISAにより測定した.
Dex,CSA,1,25(OH)2D3,MC903は10-8~10-6M濃
度範囲においてNHKの増殖を濃度依存性に抑制し
た.その10-6M濃度における増殖抑制率はDexと
CSAが約50%, 1,25(OH),D3とMC903が約30%で
あった.また,10-6M濃度の1,25 (OH几D,とMC903は
HDFの増殖を約30%抑制したが, DexとCSAは
HDFの増殖には影響しなかった.一方。EtretはNHK
の増殖に対して軽度の促進傾向を示した.サイトカイ
ンの産主に対する影響において, DexはIし1α刺激
NHKとIIDFによるIL-8産生を著明に抑制し,さら
にHDF産生のIし6を有意に抑制した. CsAはIL-1α
およびphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)刺激
によるNHKのIL-8産生を抑制した.1,25(OH)2D3と
MC903はPMA刺激によるNHK産生のIL-8, lL-la
刺激によるHDF産主のIL-8をそれぞれ抑制した.一
方, EtretはPMA刺激によるNHKのIし8産生を抑
制したが, IL-1α刺激に対する調節効果はほとんど認
1)福島県立医科大学皮膚科学教室(主任 金子史男教
授)
2)日東電工(株)メディカル事業部開発センター
3)北京医科大学第一医院皮膚科
平成6年9月12日受付,平成6年12月27日掲載決定
別刷請求先:(〒960-12)福島市光が丘1番地
福島県立医科大学皮膚科学教室 金子 史男
建中1)3)
一郎1)
小嶋
金子
幸夫I)
史男1)
められなかった.
以上の結果から,皮膚細胞の増殖とサイトカイン産
生に対して乾癖治療薬はそれぞれ特徴的な調節作用を
有することが示唆された.
緒 言
乾癖皮疹部において表皮細胞と浸潤炎症細胞とによ
るinterleukin (IL)-l, IL-6, IL-8, transforming
growth factor (TGF) aなどのサイトカイン・ネット
ワークの形成が本症における病因・病態と関連するこ
とが指摘されている1)~4).特に, y-mterferon(ffN-y),
Iし6, IL-8(よ皮疹部で増加していることが明らかにさ
れ5ト12),IL-6はmultifunctinalproinflammatory cyto-
kineとして知られ13)角化細胞の増殖も惹起する町
IL-8は好中球遊走因子14)として作用するのみならず角
化細胞の増殖因子15)としても作用する.すなわち,乾癖
の特徴である表皮肥厚と炎症性細胞の浸潤はこれらの
サイトカインの産生・増加と密接に関与する11)ことが
示唆される.一方,皮疹部に浸潤した細胞はT helper
type 1 (Thl) cellが優位であることが明らかにされ
た汽このことから, Thl cellから放出されたIFN-y,
IL-2, IL-12などの影響を受けて,皮膚細胞にIL-6, IL-
8などが誘導されるとともに接着分子の表現と応答す
るサイトカインを産生し,乾癖の病変形成にこれらの
サイトカインが関与することが推察される.このよう
に乾癖皮疹部においては表皮細胞のみならずT細胞
も関与した相互作用の結果,サイトカイン・ネットワー
クによるdysregulationが生ずる.われわれはこれま
でにIFN-7は正常ヒト表皮角化細胞(NHK.)の増殖
を抑制し,Iし1αの産土を増加させることを報告し
た17)18)
乾癖の治療は,従来ステロイド外用,レチノイド内
服, PUVA療法などが行われているが,最近,乾癖治
療薬としてvitamin DバVD3)誘導体やcyclosporin A
(CsA)が有効であることが総括され19)20)試みられて
いる.今回,われわれは乾癖治療薬の皮膚細胞に対す
700
丸山 幸治ほか
る直接の影響を明らかにする目的で, NHKと真皮線
維芽細胞(HDF)の増殖およびIL-1α刺激により炎症
を惹起した状態の細胞から産生されるIL-6とIL-8に
対する乾癖治療薬の影響を検討した.
材料と方法
1.乾癖治療薬
乾癖治療薬として, corticosteroids〔hydrocortisone
(HC), dexamethasone (Dex)〕, VDs誘導体〔1,25-
dihydroxyvitamin D3(],25(OH)2DムMC903((十)-
(5Z, 7E) -9,10-Secochola-5,7,10 (19), 22-tetraene-l
α,3β, 24, (R) -triol) (帝國製薬)〕,合成retinoids
〔etretinate (Etret) (日本ロッシュ),Λm-80 (4-〔(5,
6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-
naphthalenyl) -carbamoyl〕benzoic acid) (塩野義製
薬)〕, CsA(サンド薬品)を用いた. Dex, EtretとCsA
はdimethylsu!foxideに,1,25(OH)2D3,MC903およ
びAm-80はisopropanolに,HCはethanolにそれぞ
れ溶解し,10-3Mの濃度溶液として-2『C保存した.
各薬物はそれぞれのvehicleが最終濃度, 0.1%以下に
なるように調製して使用した.
2. NHKおよびHDFの培養と増殖評価
NHKは前報18)21)に従い皮膚移植術時に得られた皮
膚小片から分離した.まず,皮膚をpenicillin (lOOU/
ml), streptomycin (100μg/ml)加Dispase II (200U/
�)にて4°C, overnight処理し,表皮を剥離した.次
いで表皮を0.25%trypsin/0.02%EDTAにて5分処
理し, NHKを分離した. NHKの初代培養は
mitomycin-C処理3T3 feeder layerを用いてker-
atinocyte growth medium (KGM)(クラボウ社製)
にて行った.NHKはsubconfluency時にfeeder layer
非存在下で継代し,実験には2代目あるいは3代目の
細胞を用いた.
HDFは,皮膚摘出術により得られた正常部皮膚小
片を細切し, 20%fetal calf serum加Dulbecco's
MEM (FCS/DMEM)にて器官培養することにより遊
走増殖させた. HDFの継代は0.25%trypsin/0.02%
EDTAを用いて行い,綴代後は10%FCS/DMEMによ
り培養し3代目以降の細胞を実験に供した.
NHKおよびHDFの増殖に対する乾癖治療薬の影
響をみるために,細胞数をMosmannによるMTT
法22)により評価した.MTT法は, MTT (3- (4,5-
dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tertazolium bro-
mide)が生細胞ミトコンドリア酵素により代謝生成さ
れたformazanを比色する定量法で,以下に概略する.
まず,細胞を96 well plateに2,000cells/100μ1培地/
well密度にて播種し24~48時間培養した.各細胞の増
殖培地としてNHKにはKGM, HDFには10%FCS/
DMEMを使用した.各wellに各薬剤溶液50μ1を添加
し最終濃度を!0‥8~10‥6Mに調製した.コントロール
はvehicleのみを添加し,各薬剤濃度について6~8
連で行った.48時間刺激培養後,各wellにMTT溶液
を加え3~4時間代謝させた.次に,細胞内に生成さ
れたformazanを0.04NHC1/0.5%SDS/isopropanol
溶液23)で抽出し, 550nmの吸光度をmicroplate
reader (EAR400, SLT-Labinstruments, Austria)に
て測定した.この操作はdonorの異なる細胞について
繰り返し,結果は各薬剤刺激による吸光度をvehicle
添加コントロールの吸光度に対する%,すなわち,対
コントロール成長率で表示した.
3. NHKとHDFのサイトカイン産生に対する乾
癖治療薬の影響
NHKのIL-8産主に対する乾癖治療薬の影響につい
て以下の実験を行った.24 well plateに継代した
NHKをKGMにてsubconfluencyまで増殖させた
後,培地をHC-freeのKGMに交換して24時間培養し
た.その後, 5ng/ml recombinant lし1α(rIL-1α)(犬
塚製薬)あるいはphorbol 12-myristate 13-acetate
(PMA : 50ng/ml)/lipopolysaccharide (LPS : 10μg/
ml)と各薬剤(10-6M)を含有したHC-freeのKGM
にて置換し,48時間刺激培養して各3連で薬剤の影響
をみた.刺激後に培養上清を採取し,サイトカイン測
定まで-80°C保存した.刺激終了時における細胞は
0.25%trypsin/0.02%EDTAにより剥離し,その数を
計数した. HDFのIL-6, Iし8産生に対する乾癖治療薬
の影響についてNHKと同様に検討した.但し, HDFs
は10%FCS/DMEMにrIL-lad.Ong/ml)および各薬
剤(10-6M)を添加して48時間刺激培養した.
培養土清中のIL-6,1し8濃度は各々ELISAキット:
IL-6 (Biosource international, USA)およびIL-8(R
&D Systems, USA)により定量し,刺激培養終了時
の細胞数で補正しか.
結 果
1) NHKの増殖とIL・8産生に対する乾癖治療薬の
影響
乾癖治療薬のNHK増殖に対する影響をMTT
assayにより評価し,薬剤を加えていないNHKの増
殖数(コン1,ロール)に対する増殖%で示した(Fig.
1). Dex, 1,25(OH) ,D,, MC903, CsAは濃度依存性
40 20
1 1
100
80 60 §
一O1)UO3lO%
20 0
乾癖治療薬の皮膚細胞への影響
工
] バ占 T
]ソ宍 j]
・●・7 -8 -6 -7 -8・6 -7二t -6 -7 七一6-7-8 -6 -7 -8 (logM)
Dex l・25〈OH〉2D3 MC903 Etret Am-60 CSA
Fig. 1 Effects of antipsoriatic agents on NHK
proliferation
NHKs were cultured in KGM with or without
antipsoriatic agent. After 48 h incubation, NHK
proliferation was evaluated by MTT assay・
Results are expressed as mean土SD of 4 different
strains. *p<0.05, **p<0.01 (Dunnett's test vs.
control)
にNHKの増殖を抑制し,薬剤濃度の10-6Mにおける
増殖抑制率はDex, CsAが約50%, 1,25(OH)2D3,
MC903が約30%であった.一方, EtretはNHKの増殖
を軽度促進する傾向にあったが,統計的有意差は認め
られなかった. NHKのIL-8産生は,rlしlQ;(5ng/ml)
刺激により約2倍増加しか. NHK strainによってIL-
8産生レベルが異なったため,各strainごとにrIL-1α
刺激時のIL-8産生量に対する薬剤添加によるIL-8産
生増減量%を求め,各薬剤の効果を比較した(Fig. 2).
rIL-1α刺激NHKにおいて増加したIL-8は10-6Mの
DexおよびCSAにより約60%減少した.なお,rlし1α
と各薬剤の同時刺激培養における実験終了時の細胞数
は各strain別にそれぞれ0.7~1.1×10=, 1.7~3.0×
105,2.2~3.7×10=cells/wellの範囲であった.また,
PMA刺激により増加したIL-8はHC, CsA,!,25
(OH)2D3,MC903,Etretによって20~30%抑制された
(Table l).
2) HDFの増殖,IL-6およびIL-8産生に対する乾癖
治療薬の影響
HDFの増殖は1,25 (Oil)2D3とMC903によって約
30%抑制され(Fig. 3), Dex, CsAはHDFの増殖を
ほとんど抑制せずNHKに対する影響とは著しく異
なった. HDF産生のIし8は, rIL-1α(l.Ong/ml)刺
激により著明に増加した.その増加したIL-8は,10-6M
濃度のDexでは55.9±12.6%, 1,25(OH)2D3では
62.6±25.5%, MC903では47.4±24.1%まで低下を示
々|
iioo
-
350
0
noni・Deχ
701
゛CsA ゛1,2S(OH)2D3÷MC903 -t-Etret +Am-80
-
1レla stitnulatlon
Fig. 2 Effect of antipsoriatic agents on IL・8secre-
tion by NHKs stimulated with rIL-1α
After 48 h incubation, IL¬8 levels were measured
in the culture media of NHKs incubated with rlし
1α(5ng/ml) in the presence or absence of antip-
soriatic agent (10-6M).Each IL-8 level is eχpres-
sed as a percentage against the level of IL-8
produced by NHKs stimulated with rIL-1αalone
(mean十SD of 3 different strains). The statistical
analysis was performed by Dunnett's test.
し,これらの薬剤により有意に抑制された(Fig. 4).
なお, rIL-1αと各薬剤の同時刺激培養における実験終
了時の細胞数は各strain別にそれぞれ1.5~2.3×
10% 1.4~1.9×10=cells/weIlの範囲であった.また,
無刺激状態のHDFのIL-8産生に対してDexは抑制
的にAm-80は促進的に作用したが,他の薬剤はほとん
ど影響を及ぼさなかった(Table 2).なお,各薬剤刺
激培養終了時の細胞数は1.0~1.5×10=cells/wellの
範囲であった.一方,rlし1α刺激により増加したHDF
のIし6産主は, Dex(l(戸M)によって約70%抑制され
たが,他の薬剤はほとんど抑制効果を示さなかった
(Fig. 5).
考 察
乾癖は表皮の増殖と炎症性細胞の浸潤が特徴である
ことから,その治療薬はそれらを抑制調節する薬理作
用が必要である.この観点から,われわれはin vitro 培
養細胞系における表皮細胞の増殖および表皮細胞によ
るサイトカイン産生に対する乾癖治療薬の影響につい
て検討した。
NHKとHDFではそれらの細胞数とMTT代謝物
の吸光度は比例することから,細胞数の増減をMTT
assayにより評価可能であることを既に報告した24)
今回, MTT assayを用いてNHKとHDFの増殖に
゛CsA ゛1,25(0・2D3十MCgO3 +Etr≪t ÷Am-BO
IL・lastimulation
Fig. 4 Effects of antipsoriatic agents on IL一8
secretion by HDFs stimulated with rlし1α
HDFs were incubated for 48 h with rIL-1α(1ng/
ml) in the presence or absence of antipsoriatic
agent (10一6M).TheIL-8 level is eχpressed as a
percentage against the lレ8 produced by HDFs
stimulated with rIL-1αalone (mean士SD of 6
samples from two different strains).
角化細胞でみられるケラチン蛋白Kl, K6, KIO, K16
およびtype ltransglutaminase の合成を抑制するが,
基底細胞によるK5, K14に対してほとんど影響しな
い33)ことから,角化細胞の分化調節に関与したと考え
られる.
乾癖皮疹部におけるサイトカイン・ネットワークの
702 丸山 幸治ほか
Table l Inhibitory effectsof antipsoriaticagents
on IL-8 production by NHKs stimulated with
PMA/LPS
IL-8 inhibition (%)
HC
CsA
1,25(OH) A
MC903
Etret°
35.3土13.4
18.9土10.0
29.9土4.3
23.4土3.5
22.2土2.5
8 : PMA stimulation
inhibition(%) = [contro川L・8)-treatment(IL-8)]
/control(IL-8)χ100
対する乾癖治療薬の影響を検討した.その結果, 1,25
(OH)2D3およびMC903はNHKとHDF両細胞の増
殖を濃度依存性に抑制した.これまでに1,25 (OH几D3
は, NHKの分化を促進し,その増殖を抑制し25)~27)
HDFの増殖をreceptor依存性に抑制する28)ことが報
告されている. DexとCSAは特異的にNHK増殖を
抑制したが,これはこれらの薬剤に対するそれぞれの
細胞感受性の差あるいは培養液中の血清などが影響す
ることが推定された.これまでの報告ではCSAの
NHK増殖に対する効果は培養液中の血清の存在に
よって異なる29)~31)すなわち,血清存在下でのCsA
(0.1~30μg/mDは, NHKのthymidineの取り込みを
阻害しないが,無血清培地MCDB153 (Clonetics,
USA)では1~10μ■g/mlの範囲でNHKの増殖を抑制
し,その細胞に結合したCSAレベルは無血清の方が2
~3倍高値であり31),CSAがplasma中のlipo-
proteinsと結合する32)ことが明らかにされている.こ
れらのことから, CsAは血清存在下ではlipoproteins
などの成分に結合するため, HDF培養においては細
胞に結合する濃度の低下を来たし,その効果が軽減さ
れた可能性がある.一方, DexではMTT assay 時の
顕微鏡観察において各細胞のMTT代謝物の呈色反
応の低下が観察されており, Dexがミトコンドリア活
性を抑制したことも考えられ,結果としてMTT
assayによる細胞数の表示では低値を示したことが推
察された.一方, EtretはNHKの増殖を軽度ではある
が促進する傾向が認められ,他の薬剤とは異なる作用
を有しか.われわれはすでにf:tretはKGM培養にお
いてNHKの増殖を促進させること,また, PMA刺激
によりarrest状態にあるNHKの増殖を一部回復さ
せることを報告した42)これはレチノイドが分化した
140
120
100
0 0 0
8 6 4
一〇』lUOO
10%
20 0
T T T。T T ゃゃT Tj l 」 1
j
ソソ |
4 -7 -8 -6 -7 -8 -6 ・7 ・8 ・6 ・7 -8 ・6 ・7 -8-一一一一 Dei l・25《OH)2D3 MC9I)3 Etra Am-80
・6 ・7 -a (logM)
Fig. 3 Effects of antipsoriatic agents on HDF
proliferation
HDFs were cultured in 10%FCS/DMEM with or
without antipsoriatic agent. After 48 h incuba-
tion, HDFs were subjected to MTT assay・
Results are expressed as mean士SD of 4 different
strains
*p<0.05, **pく0.01 (Dunnett's test vs. control)
150
00 50
1(%)uo!iajoasB-ni
0
nOn イD頓X
乾癖治療薬の皮膚細胞への影響
Table 2 Effects of antipsoriatic agen七s on Iし8
production by unstimulated HDFs
IL-8(pg/W cells)
C!
C2
Deχ
CsA
1,25(OH)2D3
MC903
Etret
Am・80
n.1土0.9
12.7士3.0
4.6土1.0*
11.3土3.3
11.1士2.1
7.4土!.7
13.7土2.5
26.1土6.4"
Cl : vehicle control of isopropanol
C2: vehicle control of dimelhylsulfoxide
*pく0.05(Dunnett's test vs. C2)
¨pくO.OKDunnett's test vs. CD
異常については,特にIL-6, IL-8などが増加して乾癖
の病変形成に重要な役割を演じている1)‘-4)このこと
から,乾癖治療薬としてはその過剰産生を抑制調節す
る作用が望ましい.最近,各種乾癖治療薬のhuman
dermal microvascular endothelial cells (HDMEC)
のIL-6産生に対する影響34)が報告され,それによると
HCとDexはサイトカイン刺激によって完進した
HDMECによるIL-6産生を濃度依存性に抑制し, VD3
誘導体のcalcitriolはそのIし6産生を軽度抑制する
が, CsAはほとんど影響しないと述べられている.ま
た, DexはLPSやIL-1刺激によるmurine macro-
phage cellline,human monocytes. endotherial cells.
fibroblastsのIL-6産生を抑制することも明らかにさ
れている3≒われわれの結果からは, DexはrlL-la刺
激によるNHKとHDF両細胞のIL-8産生および
HDF産生のIL-6を著明に抑制した. Dexの作用はin
vivoにおいて細胞からのIL-1, IL-6, IL-10, IFN-yな
ど多くのサイトカイン産生を抑制し36),細胞に対する
刺激に拘わらずサイトカインの産生を全般的に抑制す
ると考えられる.したがって, Dexはサイトカイン産
生抑制の点から著効を有する薬剤と考えられるが,臨
床治療においてはステロイドとしての副作用が問題で
ある.
CSAは本実験においてはNHKの培養上清中のIL-
8レベルを低下させた.しかし, CsAはNHKのIし8
mRNA発現を抑制しないとの報告37)があることから,
CSAの作用にはIL-8蛋白合成あるいは分泌機構に対
する抑制が推察され,このことはin vivoにおいて表
皮細胞のIL-8産生を直接抑制することを期待させる.
150
芭loo
:S
50
n o n十Daχ
703
゛C9A ゛1・25(OH)2D3 +MC903 ÷Etret やAnトao
IL-1ostimulation
Fig. 5 Effects of antipsoriatic agents on IL-6
secretion by HDFs stimulated with rlL-la
The IL-6 level is expressed as a percentage
against the lし6 produced by HDFs stimぶated
with rIL-1αalone (mean上SD of 6 samples from
two differentstrains).
実際の臨床において,乾癖患者にCSAを3~14mg/
kg/dayにて投与した後の皮疹部中の濃度は約1~3
μg/�であり, in vitroにおける1μg/mlの実験では
CSAの細胞内濃度はin vivoの約10倍になるとの結果
もあり, in vitroの効果からin vivoにおける有効性
を証明する判断には議論の分かれるところであ
る31)38)このことからCSAの乾癖に対する有効|生はT
細胞のIL-2産生抑制を通してその活性化や増殖を抑
制し,他のサイトカイン産生を調節するといったT細
胞を中心とした免疫抑制が主な作用機構として総括さ
れている3≒一方, HDFのサイトカイン産生に対する
効果は培地中の血清により阻害された可能性があり,
今後の検討課題である.
1,25(OH)2D3とMC903は, PMA刺激によるNHK
のIL-8産生およびrlし1α刺激によるHDFのIL-8産
生を抑制し,その作用は細胞依存的であり刺激物質に
対する選択性があると考えられた.これまでに1,25
(OH)2D3はIL-1誘導のIL-8産生をhuman ker-
atinocytes, fibroblasts,monocytesについて抑制する
が, endotherial cellsについては抑制しないことが報
告されている申.われわれはすでに1,25(OH)2D3と
MC903がNHK産生のIL-laおよびIL-8の分泌を調
節することを明らかにした2い.今回,これらの薬剤は
HDFのIL-8産生も調節することが示され,好中球遊
走に対して軽減効果が推察され,これらの結果から,
VD3誘導体はサイトカイン産主調節作用と角化細胞の
704 丸山 幸治ほか
増殖調節作用を有し,その臨床における治療の有効性
と相対的な低副作用2o)などを考慮すると,その乾癖治
療における有肝比は高いことが期待される.
Zitnikら4叫よ, retinoic acid (RA)や他のretinoid
誘導体についてIし6産生に対する影響を詳細に検討
し,RAはIL-1誘導のhuman lung fibroblasts のIL-6
産生をタンパクおよびmRNAレベルで抑制するが,
Etretにはその効果がないこと,またTNFα誘導の
IL-6には効果がなく,さらにHeLa cell やmonocytes
産生のIし6にも効果がないことを述べている.われわ
れの結果もEtretはHDFのIL-6産生を抑制しなかっ
たが,Iし8に対しては刺激依存性にNHKのIL一8産生
文
1) Cooper KD, Hammerberg C,Baadsgaard 0, et
al: Interleukin-l in human skin : Dysregula-
don in psoriasis,J InvestVerniatol,95: 24S-26
S, 1990.
2) Baker BS, Fry L : The immunology of psor-
iasls, Br J Dermatol, 126 : 1-9, 1992.
3) Breathnach SM : The skin immune system
and psoriasis,Clin Exti Immunol,91: 343-345,
1993.
4) Sauder DN : The role of epidermal cytokines
in inflammatory skin diseases, / InvestDびー
matol, 95 : 27S-28S, 1990.
5) Grossman RM, Krueger J, Yourish D, et a1:
Interleukin 6 is expressed in h汝h levels in
psoriatic skin and stimulates proliferation of
cultured human keratinocytea, ProcNatIAcad
Sci. 85 : 6367-6371, 1989.
6) Prens EP, Benne K, van Damme J, et al:
Interleukin-1 and interleukin-6 in psoriasis, /
Inuest Dermatol. %: 121S一124S, 1990.
7) Kaneko F, Suzuki M, Takiguchi Y, Itoh N,
Minagawa T : Immunohistopathologic studies
in the development of psoriat沁lesion
influenced by gamma-interferon and the produc-
ing cells, / Dermatol Sci, 1: 425-434, 1990.
8) Neuner P, Urbanski A, Trautinger F, et al:
Increased IL-6 production by monocytes and
keratinocytes in patients with psoriasis, ブ
Invest Dermatol, 57: 27-33, 1991.
9) Ohta Y, Katayama l,Funato T, et al : In situ
expression of messenger RNA of interleukin-1
and interleukin-6 in psoriasis : Interleukin-6
involved in formation of psoriatic lesions, /1几ヽみ
Dermatol Res, 283 : 351-35G, 1991.
10) Gearing AJH, Finchman NJ, Bird CR, et al:
Cytokines in skin lesions of psoriasis, Cytokine,
を抑制した.既に報告した42)ようにEtretはVD3誘導
体と同様にPMA刺激によるNHKのIL-8産生に対
して抑制的に作用し,今回の結果からVD,誘導体と
Etretとでは皮膚細胞増殖に対する作用は対照的であ
るが, PMA刺激によるNHKのIL-8産生には共に抑
制的であることから,このIL-8産主の調節作用がこれ
らの薬剤の臨床効果を示す重要な役割を演じている可
能性がある.
各薬剤を提供戴いた各製薬会社(サンド薬品,塩野義製
薬,帝國製薬,日本ロツシユ)ならびにrIL-1αを供与戴い
た大塚製薬に深謝致します.
献
2 : 68-75, 1990.
11) Kaneko F,Itoh N, Yoshida H, Suzuki M, OnoI:
The cell components and cytokines in the sub-
corneal microabscess of psoriasis, FukushifnaJ
Med Sci, 37 : 103-112, 1991.
12) Gillitzer R,Berger R, Mielke v, Muler C, Wolff
K, Stingl G : Upper keratinocytes of psoriatic
skin lesions express high levels of NAP-l/IL-8
mRNA in situ,J Inveit Dermatol, 97: 73-79,
1991.
13)田賀哲也,岸本忠三:サイトカイシ.大沢利昭
編:現代科学増刊, 18,東京化学同人,東京,71-
85, 1990.
14)松島綱治:IL-IとTNFによって誘導される新し
いサイトカイン; IL8,Med Immunol,18:9-16,
1989.
15) Tuschil A, Lam C,Haslberger A,Lindley l:
Interleukin-8 stimulates calcium transients and
promotes epidermal cell proliferation, J Inuest
Dermatol. 55: 294-298, 1992.
16) Uyemura K,Yamamura M, Fivenson DF, Mod-
lin RL, Nickoloff BJ : The cytokine network
in lesional and lesion-free psoriatic skin is char-
acterized by a T-helper type l cell-mediated
response, / Invest Dermatol,101 : 701-705,
1993.
17)伊藤信夫,金子史男:培養表皮角化細胞に対する
y-interferonの影響一乾癖の組織像とy-
interferonとの関連についてー,目皮会誌, 103 :
1037-1042, 1993.
18) Maruyama K, Zhang JZ, Nihei Y, Ono l,Kane-
ko F : Regulatory effects of antipsoriatic
agents on interleukin-1αproduction by human
keratinocytes stimulated with gamma interfer一
〇n in vitro, Skin Pharmacol, linpress).
19) Bos JD, Meinardi MMHM, van Joost TH,
乾癖治療薬の皮膚細胞への影響
Heule F, Powles AV, Fry L : Use of cyclospor-
in in psoriasis, Lancet.Dec. 23/30 : 1500-1502,
1989.
20) Kragballe K: Vitamin D3 and skin diseases,
A司几 T^crmatol Res, 284(Suppl):S30-S36,
1992.
21) Zhang JZ, Maruyama K, Ono l, Iwatsuki K,
Kaneko F : Regulatory effects of 1,25-
dihydroxyvitamin D3 and a novel vitamin D3
analogue MC903 on secretion of interleukin-1
alpha(IL-1α)and IL-8 by normal human ker-
atinocytes and a human squamous cell car-
cinoma cell line (HSC-1), / Dermatol Sci, 1 124
-31, 1994.
22) Mosmann T: Rapid colorimetric assay for
cellular growth and survival : Application to
proliferation and cytotoxicity assays, / h
朋zび■tol Meth, 65 : 55-63, 1983.
23) Gree LM, Reade JL, Ware CF : Rapid color-
metric assay for cell viability : Application to
the quantitation of cytotoxic and growth inhibi-
tory lymphokines, J Immunol Methods, 70 : 257
-268, 1984.
24) Zhang JZ, Maruyama K, Iwatsuki K, Ono l,
Kaneko F: Effects of prostaglandin E, on
human keratinocytes and dermal fibroblasts : A
possible mechanism for the healing of skin
ulcers, Exp Dぼ■matol, 3:164-!70, 1994.
25) Hosomi J, Hosoi J, Abe E, Suda T, Kuroki T :
Regulation of terminal differentiation of cu1・
tured mouse epidermal cells by 1α,25-
dihydroxyvitamin D3,Tindocrinolosy,113: 1950
-1957, 1983.
26) Smith EL, Walworth NC, Holic MF: Effect of
lff,25-dihydroxyvitamin D3 0n the morphologic
and biochemical differentiation of cultured
human epidermal keratinocytes grown in
serum-free conditions, J Inuest Dermatol,86:
709-714, 1986.
27) Kobayashi T, Hashimoto K, Yoshikawa K :
Growth inhibition of human keratinocy七es by 1,
25-dihydroxyvitamin D3 is linked to dephos-
phorylation of retinoblastoma gene product,
Biockem Biotih'isResComTviMn, 195 : 487-493,
1993.
28) Clemens TL, Adams JS, Horiuchi N, et al:
Interaction of l,25-dihydroxyvitamin-D3 with
keratinocytes and fibroblasts from skin of nor-
mal subjects and a subject with vitamin-D-
dependent rickets, type II : A model for study of
the mode of action of 1,25-dihydroxyvitamin D3,
J Clin Endo出回I Metab, 5らご 824-830, 1983.
705
29) Kato N, Halprin KM, Taylor JR : Cyclosporin
A does not inhibit epidermal cell growth at
therapeutic levels,r InvestDermatol,88 : 52-
54, 1987.
30) Nickoloff BJ, Fisher GJ, Mitra RS, Voorhees
JJ : Additive and synergistic antiproliferative
effects of cyclosporin A and gamma interferon
on cultured human keradnocytes, Am J Pathol,
131 : 12-48, 1988.
31) Fisher G,I, Duell EA, Nickoloff BJ, et al :
Levels of cyclosporin in epidermis of treated
psoriasis patients differentially inhibit growth
of keratinocytes cultured in serum free contai]!¬
ing media, / InvestDermatol,91 : 142-146,
1988.
32) Lemaire M, Tillement JP : Role of lipo-
proteins and erythrocytes in the in vitro binding
and distribution of cyclosporin A in the blood, ./
Pharm PhccmOiCol,訊-.715-718, 1982.
33)岡田奈津子:皮膚のはたらきと皮膚病.野波英一一
郎,上野賢一,溝口昌子,大原國章編:皮膚臨床,
35(特33):1317-1323, 1993.
34) Hettmannsperger U, Detmar M, Owsianowski
M, Tenorio S, Kammeler HJ, Orfanos E:
Cytokine-stimulated human dermal microvas-
cular endothelial cells produce interleukin 6-
Inhibition by hydrocortisone, dexamethasone,
and calcitriol, / Inv�Dermatol. SS : 531-536,
1992.
35) Waage A, Slupphaug G, Shalaby R : Glucocor-
ticoids inhibit the production of lL-6 from
monocytes, endothelial cells and fibroblasts,
E町J Immunal, 10: 2439-2443, 1990.
36) Kunicka JE, Talle MA, Denhardt GH, Brown
M, Prince LA√Goldstein G : Immunosuppres-
sion by Glucoct rticoids : Inhib削on of produc-
tion of multiple lymphokines by in vivo admin-
istration of dexamethasoive. Cell Immunol,
149 : 39-49, 1993.
37) Elder JT, Hammerberg C, Cooper KD, et al:
Cyclosporin A rapidly inhibits epidermal cyto-
kine eχpression in psoriasis lesions, but not in
cytokine-stimulated cultured keratinocytes, /
Invest Dermatol, \01: 761-766, 1993.
38) Cooper KD, Baadsgaard 0, Duell E, Fisher G,
Ellis CN, Voorhees JJ: Langerhans cell sensi・
tivity to in vitro versus in vivo loading with
cyclosporine A, r InvestDermatol,98 : 259-260,
1992.
39) Wong RL, Winslow CM, Cooper KD: The
mechanisms of action of cyclosporin A in the
treatment of psoriasis, imTnunolTod砂, 14'- 69
706 丸山 幸治ほか
-74,!993.
40) Larsen CG, Kristensen M, Paludan K, et a1 : 1,
25(OH)2-D3 is a potent regulator of interleukin・1
induced interleukin-8 expression and produc-
tion, Bioc.旭市Biophys ResCornmun,176 : 1020
-1026, 1991.
41) Zitnik RJ, Robert MK, Latifpour J, et al:
Retinoic acid inhibition of IL-1-induced IL-6
production by human lung fibroblasts, / Im^
munol, 15: 1419-1427, 1994.
42) Zhang JZ, Maruyama K, Ono I, Nihei Y, Iwatsu-
kiK, Kaneko F : Effects of etretinate on ker-
atinocyte proliferation and secretion of
interleukin-1α(IL-1α) and IL-8, J Dermatol,
21: 633-638, 1994.
In Vitro Effects of Antipsoriatic Agents on Cytokine Secretion and
Cell Proliferation of Normal Human Keratinocytes
(NHK) and Dermal Fibroblasts (HDF)
Kohji Maruyama1)2),Jian・ZhongZhang1)3),YukioKojima", Keiji Iwatsuki''。
Ichiroon01)andFumio Kanek01)
"Department of Dermatology, Fukushima Medical College
(Director: Prof. F. Kaneko)
2)MediCalProducts Sector, Nitto Denko Corporation
3)Departmentof Dermatology, The First Teaching Hospital of Beijin Medical University
(Received September 12,1994; accepted for publication December 27,1994)
To clarify the effects of antipsoriatic agents on cytokine secretion and cell proliferation of normal
human keratinocytes (NHKs) and dermal fibroblasts (HDFs), an in vit几7study was ca�ed out using the
following agents: hydrocortisone (HC); dexamethasone (Dex); 1,25-dihydroxyvitamin Dパ1,25(OH),D3)
and its synthetic analogue MC903; cyclosporin A (CsA); and etretinate (Etret) and its analogue Am-80.
The cell proliferation was measured by MTT assay, and cytokine levels were determined by ELISA.
NHK proliferation revealed to be inhibited by Dex and CsA in a dose-dependent manner as well as
by 1,25(OH).D3 and MC903. At 10-6M concentrations of these agents, the inhibition of cell proliferation
was nearly 50% by Dex and CsA and about 30%by 1,25(OH)2D3 and MC903. Etret, however, was found
to be slightlystimulative on NHK proliferation. HDF proliferation was inhibited nearly 30%by 1,25(OH)2
D3 and MC903, but scarecely by Dex or CsA.
Regarding the regulatory effects on cytokine production by agents, Dex markedly inhibited IL-8
secretion in both NHKs and HDFs, which were stimulated with lし1α, and also significantly reduced IL-
6 secretion of HDFs induced by IL-la. CsA showed an inhibitory effect on lし8secretion in NHKs
stimulated with IL-1αor phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA),butdid not inhibit the secretion in
HDFs. Both 1,25(OH)2D3 and MC903 significantly suppressed IL-8 secretion of HDFs stimulated with IL-
1αand that of NHKs stimulated by PMA. Etret reduced IL-8 secretion of NHKs stimulated with only
PMA. These findings suggest that each antipsoriatic agent has a different regulatory effect on cytokine
secretion and cell proliferation in NHKs and HDFs. They may therefore make different therapeutic
contributions to the treatment of psoriasis.
(Jpn JDermatol 105: 699~706, 1995)
Key words: antipsoriatic agents, human keratinocytes, human dermal fibroblasts, cytokines