el diario de lab oratorio

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA - DEPARTAMENTO DE ING. BIOQUÍMICA

EL DIARIO DE LABORATORIO.

En la práctica de la química es muy importante usar el diario, bitácora, o cuadernos de laboratorio para escribir las observaciones y mediciones directamente. La documentación completa es indispensable en los laboratorio científicos, industriales, forenses, etc. por consideraciones legales. Aprender a mantener un diario de laboratorio es esencial para todos los profesionales que trabajen en la industria o haciendo investigación. En él se debe registrar todo lo que se hace en el momento en que se hace. NUNCA debe usarse hojas sueltas para anotar o confiar en la memoria.

Su función es registrar lo que hiciste y lo que observaste de tal modo que lo pueda entender otra persona. Una manera es usar siempre frases completas. Es útil escribir una descripción completa del experimento antes de entrar al laboratorio, con secciones que establezcan el propósito, métodos, resultados y conclusiones. Es muy recomendable preparar el diario para anotar en él los datos numéricos antes de llegar al laboratorio. También es buena práctica escribir la ecuación química balanceada para cada reacción que se usará, de modo que se comprenda lo que se está haciendo.

La medida de una verdad científica es la capacidad de que diferentes personas puedan reproducir un experimento. Un buen diario de laboratorio tendrá anotado TODO lo que se hizo y lo que se observó, para permitir que otros puedan reproducirlo. Si se hicieron trabajos en computadora, el diario debe tener los nombres de archivo y los discos en que están los datos de ese experimento, así como el nombre del programa que se usó y la versión de éste (ej. Word Perfect 5.1, Word 6, Works 4, etc.). Las impresiones de datos o resultados importantes deben pegarse en el diario, ya que la vida media del papel es por lo menos 10 veces mayor que la vida media de un disco magnético.

Procedimiento general:

1. Al llenar el diario importa principalmente el orden, no la belleza.2. Registrar todos los datos y observaciones con bolígrafo de tinta azul o negra, en el

instante y en el orden en que se obtienen. No dejar espacios en blanco para llenarlos después . NO USAR LÁPIZ.

3. Cuando se anoten datos hacerlo con las unidades apropiadas y el número correcto de cifras significativas.

4. Anota todos los datos y observaciones, aunque parezcan sin importancia, en el instante en que se obtienen.

5. Escribir siempre la fecha y la hora de trabajo.6. NUNCA arrancar hojas o pedazos de hoja del diario de laboratorio.7. Debe procurarse que los datos queden lo más limpios posible. En caso de error poner

una diagonal sobre el dato para marcarlo y si es necesario anotar una explicación de por que se tachó, no se debe tachar de manera que no vuelva a verse.

8. Inicia cada nuevo experimento en una página en blanco. Si al terminarlo no se llenó la página, traza una línea diagonal sobre todo el espacio en blanco sobrante.

9. Todas las páginas del diario de laboratorio deben estar numeradas.

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10. Al final de cada sesión experimental debe tener la firma de la persona que realizó el experimento y la de un testigo que puede ser el profesor de la asignatura o el auxiliar del laboratorio.

Este orden y limpieza es una ventaja; primero que nada está el ahorro de tiempo porque no hay que reorganizar y volver a escribir los datos. También hay un ahorro adicional de tiempo al hacer las operaciones para obtener los resultados si te acostumbras a poner los datos de manera ordenada y las posibilidades de error se reducen. Además en un registro inmediato se detectan los posibles errores en las mediciones y los cálculos. Los datos no se perderán o copiarán mal si se registran directamente en el cuaderno en vez de hojas sueltas.

En vez de llenar todo el espacio disponible se pueden dejar páginas alternas para hacer cálculos en sucio cuando se necesiten; por ejemplo, la página izquierda para los cálculos en sucio y la derecha para resultados.

Formato del diario de laboratorio.

Idealmente se debe usar una libreta encuadernada, con hojas numeradas y pasta gruesa. No se deben usar cuadernos de espiral, carpetas de argollas o de ningún tipo que permita quitar y poner hojas a voluntad.

El tamaño de la libreta debe ser cómodo de transportar y fácil de usar. De preferencia debe caber con facilidad en los espacios de la mesa de trabajo, para que no entorpezca el manejo de frascos de reactivo o el uso de equipo de laboratorio.

Se recomienda forrarla con plástico, para hacerla resistente a las salpicaduras de agua o reactivos.

Reservar las 2 primeras hojas para usarlas como tabla de contenido. Anotar de izquierda a derecha: Título descriptivo del experimento, fecha(s) en que se realizó y el número de página donde inicia.

Reservar las últimas 6 páginas del diario para anotar información útil que se use de manera repetitiva.

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PRÁCTICA No. 1

DETERMINACIÓN DE pKa

INTRODUCCIÓN

La fuerza relativa de un ácido débil depende de su tendencia a ionizarse. A una temperatura dada, el grado de ionización es un valor constante característico del mismo ácido. Como se trata de un sistema que puede alcanzar el equilibrio, es posible aplicar la ley de acción de masas para describirlo. Esta aplicación define una constante de equilibrio (K) en términos de las cantidades de reactivos y productos.

Cuando se hace referencia a un sistema en equilibrio que resulta de la ionización de un ácido débil, la constante de equilibrio se denomina constante de ionización ácida que se representa como Ka y se expresa por medio de la siguiente ecuación:

Esta expresión es válida para cualquier ácido (HA) monoprotónico débil, es decir, un ácido que sólo tenga un ácido ionizable.

A partir de la tabla que se presenta más adelante, se puede deducir que la fuerza ácida relativa puede predecirse mediante la simple inspección de los valores de pK a, ya que cuando menor es la fuerza del ácido, o cuanto mayor es el valor de Ka mayor es la fuerza del ácido.Para omitir el término exponencial, los valores de Ka se expresan comúnmente como valores de pKa, lo que se define como:

OBJETIVO

Determinar experimentalmente el valor del pKa aparente de algunos ácidos y a partir de este valor el pKa real de los mismos.

MATERIAL REACTIVOS2 Buretas graduadas de 50 ml Ácido acético 0.1 M1 Vaso de precipitado de 150 ml Hidróxido de sodio 0.17 M (valorado)Potenciómetro Muestras problemas 0.1 MPapel milimétrico

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METODOLOGÍA

ESTANDARIZACIÓN.

Utilizando una bureta, colocar en un vaso de precipitado (lo más exacto posible) 50 ml de ácido acético 0.1 M.

Introducir el electródo del potenciómetro, previamente limpio y libre de cualquier contaminante, dentro de la solución, cuidando de no golpear el electrodo y medir el pH.

Llenar una segunda bureta con la solución de hidróxido de sodio 0.17 M.

Titule la solución del ácido acético, agregando la base o titulante a intervalos de 1 ml y registre el pH.

Conforme se desarrolle la titulación, se debe ir elaborando una gráfica de pH contra el volumen de NaOH adicionado.

Cuando la pendiente de la curva empiece a incrementarse, adicione el NaOH a intervalos de 0.5 ml.

Continúe la adición de NaOH hasta que el pH se incremente bruscamente.

Prosiga la adición de NaOH gota a gota, hasta que la pendiente tienda a infinito. Este es el punto final.

A partir de la gráfica determine el pKa del ácido acético, el cual corresponde al pH obtenido con la mitad del volumen de base utilizada (V1/2).

1. DETERMINACIÓN DEL pKa.

1.1 Utilizando una muestra desconocida de 50 ml de un ácido (anote el código de la muestra en el diario de laboratorio), realizar el mismo procedimiento que con el ácido acético hasta el punto de inicio de la titulación (experiencia 1.1 a 1.3).

1.1 Adicione el volumen preciso de la solución de NaOH (V1/2) al ácido, en un solo intervalo.

1. Mida el pH, el cual debe ser el pKa aparente de su muestra.

3 CÁLCULO DEL pKa DE LAS MUESTRAS.

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El cálculo del pKa real de las muestras se realiza utilizando la ecuación final de la siguiente deducción:

dividiendo y multiplicando el primer miembro por

Pero como:

,

sustituyendo se tendría que:

y como la suma de las molaridades de todos los monocationes en solución es exactamente igual al de todos los monoaniones en solución (la baja concentración de OH - puede ser ignorada):

sustituyendo se obtendría que:

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multiplicando ambos miembros por Ka :

y como en el punto medio de la titulación se tiene que:

3.1 Sustituir en la ecuación anterior, el valor de H+ obtenido experimentalmente en el punto medio de la titulación.

3.2 Sustituir también el valor de Na+ utilizado hasta el momento de obtener el punto medio de la titulación.

3.3 Calcular también el valor de Ka y a partir de este, el valor del pKa real del ácido.

Fórmula Nombre pKa Ka Cl3CCO2H Ác. tricloroacético 0.51 0.31

F3CCO2H Ác. Trifluoracético 0.52 0.30(CO2H)2 Ác. oxálico 1.25 5.62 x 10-2

Cl2CHCO2H Ác. dicloroacético 1.29 5.13 x 10-2

F2CHCO2H Ác. difluoroacético 1.34 4.57 x 10-2

cis-HOO2CCH=CHCO2H Ác. meleico 1.83 1.48 x 10-2

H2NCH2COO2H glicina 2.33 4.68 x 10-3

CH3CO2H Ác. acético 4.76 1.74 x 10-5

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PRÁCTICA No. 2

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS.

INTRODUCCIÓN

La adición de una sal soluble de un ácido débil a una solución acuosa de este ácido, aumentará el pH (disminuye la concentración de H+) de la solución. La sal se ionizará totalmente y el aumento de la concentración de la base conjugada del ácido débil, por efecto de la ley de “acción de masas” desplazará el equilibrio hacia la izquierda y extraerá algunos iones hidrógeno, debido a lo anterior, el pH de una solución de un ácido débil está determinado no tanto por la concentración del ácido, sino por la razón de la concentración de la sal (base conjugada) a la concentración del ácido sin disociar. Tales soluciones se llaman soluciones amortiguadoras y pueden resistir el cambio de pH cuando se añade un ácido o base fuerte.

H2PO4- HPO4

= + H+

OBJETIVO

Aplicar la ecuación de Henderson - Hasselbalch para calcular los componentes de una solución amortiguadora a un determinado pH y aprecir la importancia de tales soluciones en los organismos vivos.

MATERIAL REACTIVOS4 Matraces volumétricos de 100 ml Fosfato de potasio monobásico1 Pipeta volumétrica de 1, 2, 5 y 10 ml Fosfato de sodio dibásico4 Vasos de precipitado de 250 ml Hidróxido de sodio1 Bureta graduada de 25 o 50 ml Ácido bórico2 vidrios de reloj de 5 cm de diámetro Hidróxido de sodio 1 N1 Pizeta Ácido clorhídrico 1 N

Agua destilada

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METODOLOGÍA

1. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

1.1 Haciendo uso de la ecuación de Henderson - Hasselbalch, calcular la cantidad de ácido y base conjugada para preparar 100 ml de cada una de las siguientes

soluciones amortiguadoras.

A Solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.2B Solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.6C Solución amortiguadora de fosfatos 0.1 M a un pH de 7.8D Solución amortiguadora de boratos 0.1 M a un pH de 8.0E Solución amortiguadora de boratos 0.1 M a un pH de 8.4F Solución amortiguadora de boratos 0.1 M a un pH de 8.8G Solución amortiguadora de boratos 0.1 M a un pH de 9.8

2 DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD AMORTIGUADORA (C. A.)

La capacidad amortiguadora, es la cantidad de base fuerte requerida para alterar el pH de la solución amortiguadora en una unidad de pH.

2.1 Colocar los 100 ml de solución amortiguadora en un vaso de precipitado de 250 ml e introducir el electrodo de medida del potenciómetro.

2.2 Preparar una bureta con solución de NaOH 1 N y adicionar 1 ml de esta base al vaso de precipitado que contiene la solución amortiguadora.

2.3 Registrar el pH resultante después de agitar perfectamente (¡Precaución! evite golpear el electrodo).

2.4. Repetir las experiencias 2.2 y 2.3, hasta que el pH de la solución cambie en una unidad.

2.5 Completa el cuadro de acuerdo a los resultados obtenidos en la experiencia 2.4.

VOLUMEN DE NaOH ADICIONADO (en ml) LECTURA DE pH

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CAPACIDAD AMORTIGUADORA = __________________________________

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PRÁCTICA No. 3

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN

Los laboratorios de investigación, requieren de métodos rápidos y sensibles para cuantificar proteínas. Las técnicas disponibles cumplen parcialmente los requerimientos de este tipo de cuantificaciones.El método de Lowry está sujeto a interferencias con iones como K+ y Mg++, EDTA, TRIS, tioles y carbohidratos. El método de Biuret es poco sensible y está sujeto a interferencias con amoniaco, TRIS y glicerol.Las técnicas anteriores se han modificado para eliminar tales interferencias, pero los procedimientos se han hecho más elaborados y tardados.El método de Bradford que se ensayará, elimina la mayoría de los problemas antes descritos y se basa en que el azul de Coomassie (blue G - 250) existe en dos formas coloridas (roja y azul), la forma roja es transformada a la forma azul cuando se forma un complejo con la proteína. Este complejo tiene un coeficiente de extinción alto, lo cual hace que el método sea muy sensible (detecta g). La formación del complejo es rápida (aproximadamente 2 minutos) y estable hasta por una hora.

OBJETIVO

Comparar la técnica tradicional para cuantificar proteínas (método de Biuret), con el método de Bradford que es muy sensible, rápido y exacto.

MATERIAL REACTIVOS13 Tubos de ensaye de 12 x 100 mm Reactivo de Bradford3 Pipetas de 5 ml Cloruro de sodio 0.15 M2 Pipetas de 1 ml Reactivo de Biuret1 Gradilla Solución amortiguadora TRISBaño María Estándar de proteína 10 mg/mlEspectrofotómetro Estándar de proteína 100 g/100 l1 Pizeta1 Vaso de precipitado de 250 ml

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METODOLOGÍA

1. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET

Esta técnica se fundamenta en la producción de un quelato soluble de color azul intenso a violeta, formado por péptidos y proteínas en un medio alcalino en presencia de ión Cu++.

1.1 Preparar seis tubos de ensaye de acuerdo a la siguiente tabla de distribución de reactivos.

Tubo No.

ESTÁNDAR DE PROTEÍNA

10mg/ml (ml)

NaCl 0.15 M(ml)

MUESTRA PROBLEMA

(ml)

REACTIVO DE BIURET

(ml)1 0 2.00 1.00 3.002 0.25 (2.5mg) 2.75 0 3.003 0.50 (5mg) 2.50 0 3.004 0.75 (7.5mg) 2.25 0 3.005 1.00 (10 mg) 2.00 0 3.006 0 3.00 0 3.00

1.2 Colocar los tubos de ensaye en incubación a 37°C durante 10 minutos.1.3 Enfriar los tubos de ensaye con agua de la llave.1.4 Hacer un barrido en el espectrofotómetro, para determinar la longitud de onda

( en nm) a la cual se obtiene la máxima absorbencia. Se puede utilizar cualquier tubo (por ejemplo el No. 3), calibrando con el tubo No. 6 (blanco).

1.5 Determinar la absorbencia de cada una de las soluciones (1 a la 5), utilizando el valor de la longitud de onda determinado en la experiencia anterior

1.6 Registrar los datos y elaborar una gráfica (en papel milimétrico) de absorbencia contra concentración (mg/ml), tomando solo los valores de los tubos del 2 al 5.

1.7 Utilizando la gráfica anterior, interpolar el valor de la absorbencia de la muestra problema y determine su concentración.

2 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

Esta técnica se basa en la formación de un ligando de color azul, que se obtiene por la unión del azul de Coomassie a las proteínas.

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1.1 Del estándar de proteínas empleado en el método de Biuret (10 mg/ml), hacer la dilución adecuada para obtener una concentración de 100 g/100 l. Esta solución resultante, se utilizará como estándar en el método de Bradford.En 1 ml de la solución de (10 mg/ml) hay 10 000 g. En 10 ml de la solución 100 000 g. Tengo que disolver estos en 100 000 l para que quede una solución de 100 000 g/100 000 l que es igual a 100 g/100 l y 100 000 l son 100 ml. por tanto debo disolver 10 ml de la solución patrón en 100 ml de agua.

2.2 Preparar 7 tubos de ensaye, de acuerdo a la siguiente tabla de distribución de reactivos.

TUBO No.

ESTÁNDAR DE PROTEINA

(ml)

SOLUCIÓN AMORTIGUADOR

A TRIS (ml)

MUESTRA PROBLEMA

(ml)

REACTIVO DE BRADFORD

(ml)1 0 1 0 52 0.2 (200 g)(0.2mg) 0.8 0 53 0.4(400 g)(0.4mg) 0.6 0 54 0.6(600 g)(0.6mg) 0.4 0 55 0.8 (800 g)(0.8mg) 0.2 0 56 1.0 (1000 g)(1mg) 0 0 57 0 0.5 0.5 5

Los datos de la columna 2 se multiplicam por 10 que es el factor de dilución que se hace. 10 ml de la solución patrón en 100 ml de agua1.1 Mezclar perfectamente cada uno de los tubos de ensaye y determinar la absorbencia

a una de 595 nm. Utilizar el tubo No. 1 (blanco) para calibrar el espectrofotómetro.

1.2 Registrar los datos y elaborar una gráfica (en papel milimétrico) de absorbencia contra concentración (g/ml), tomando solo los valores de los tubos del 2 al 6.

1.3 Utilizando la gráfica anterior, interpolar el valor de la absorbencia de la muestra problema y determine su concentración.

PRÁCTICA No. 4

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EXTRACCIÓN DE LA UREASA.

INTRODUCCIÓN

La ureasa (nombre común), número 3.5.1.5 de la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), nombre sistemático amido-hidrolasa de urea. Consta de seis subunidades estructurales iguales y es una enzima muy específica que se encuentra en varios tejidos vegetales (semillas de haba, soya, etc.). Cataliza la reacción:

NH2-CO-NH2 + 3 H2O CO2 + 2 NH4OH

Se emplea como catalizador en los laboratorios de análisis clínico para cuantificar la urea. El hidróxido de amonio formado puede titularse y representa una medida de la cantidad de urea presente en una muestra de sangre o de orina.En esta enzima los grupos sulfhidrilo (-SH) son de gran importancia. La enzima es activa cuando los grupos –SH están intactos. Las formas oxidadas (-S-S-) inactivas, probablemente pueden ser reactivadas por la acción de compuestos ricos en –SH tales como la cisteína y el glutatión. Una alteración más estable es la reacción de los grupos –SH con iones metálicos como Hg++, Ag+ o Cu++, con los cuales forma un “mercáptido”. Estos derivados mercaptídicos inactivos de las moléculas enzimáticas, pueden en ocasiones reactivarse por efecto de cisteína o glutatión.

OBJETIVO

Extraer la ureasa a partir de semillas de haba o soya y demostrar su actividad catalítica sobre una solución de urea.

MATERIAL REACTIVOS2 Matraces Erlenmeyer de 200 ml Harina de soya o de habaEmbudo simple Acetona/agua 3:1 (v/v)Papel filtro HieloFrasco color ámbar de 50 ml AcetonaAgitador de vidrioMortero con pistiloEstufa

METODOLOGÍA

PREPARACIÓN DE LA HARINA DE SOYA O DE HABA

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Tritrurar perfectamente 10 g de semillas secas de soya o de haba en un mortero.

Colocar el triturado obtenido, en una estufa a 60°C y dejarlo secar durante la noche.

Pulverizar perfectamente el triturado.

1. EXTRACCIÓN DE LA UREASA

1.1 Pesar 5 g del pulverizado en un matraz Erlenmeyer y cubrirlo con una mezcla de acetona/agua.

1.2 Depositar el matraz en un baño de hielo y agitar la mezcla constantemente durante 15 min.

1.3 Filtrar la mezcla y lavar el pulverizado que queda retenido en el papel, utilizando 5 ml de acetona fría.

1.4 Conservar el filtrado en un frasco color ámbar a temperatura de 3 a 5°C.

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PRÁCTICA No. 5

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO EN UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA.

INTRODUCCIÓN

Las enzimas modifican la velocidad de una reacción química sin alterar el equilibrio final, ya que reducen la energía libre de activación para la transformación del sustrato a producto.La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, se incrementa al aumentar la concentración del sustrato, hasta un punto en el cual ya no hay incremento aún con la adición de más sustrato.En esta fase, el sustrato ha saturado los sitios activos de la enzima y se logra la velocidad máxima de la reacción, la cual depende de la afinidad de la enzima y el sustrato correspondiente.

OBJETIVO

Determinar la actividad enzimática de la enzima ureasa y demostrar la influencia que tiene la concentración de la urea (sustrato) sobre dicha actividad.

MATERIAL REACTIVOSBaño María Rojo de metilo al 0.04%Pipeta de 1 ml HCl 0.1 MPipeta de 5 ml Urea 0.20 M6 Vasos de precipitados de 250 ml HgCl2 al 1%10 Tubos de ensaye Solución de ureasaBureta graduada de 25 ml Acetato fenil mercúrico 0.001 MPinzas para bureta Cisteína 0.01 MEmbudo simple Amortiguador de fosfatos 0.1 M a pH 7.01Papel milimétrico

METODOLOGÍA

1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1. Preparar una serie de tubos de ensaye con las soluciones que se indican en el siguiente cuadro, respetando el orden de adición de las mismas.

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TUBO No. UREA 0.20M(ml)

AMORT.DE FOSFATOS (ml)

HgCl2

(gotas)1 0.0 5.0 32 0.10 4.90 03 0.15 4.85 04 0.25 4.75 05 0.50 4.50 06 1.00 4.00 07 2.50 2.50 08 3.75 1.25 09 5.00 0 0

1. Calentar en baño María los tubos de ensaye a 50°C durante 5 minutos.2. Agregar a cada uno de los tubos 5 gotas de ureasa y mezclar perfectamente.3. Calentar nuevamente los tubos en baño María a 50°C durante 30 minutos.4. Adicionar 3 gotas de HgCl2 a cada tubo, excepto al blanco (tubo No. 1).5. Transferir el contenido de cada uno de los tubos en diferentes vasos de precipitados.6. Agregar a cada vaso, 4 gotas del indicador rojo de metilo.7. Titular el contenido de cada uno de los vasos, adicionando HCl 0.1 M hasta la

parición de un color canela estable.8. Para los tubos del 2 al 6, realizar los siguientes cálculos:

A: Volumen de ácido usado (L)XA : Molaridad del ácido usado (mol/L)NA : Número de moles de HCL adicionadoNN : Número de moles de amoniaco que reaccionan con el HCL adicionado (mol)

NU : Número de moles de urea hidrolizados (mol)V : Velocidad de reacción inicial (mol/min)

AA AXN

NA NN

2N

U

NN

t

NV U

16

230

10001.01tubodelHCldemlproblemadelHCldeml

min

oshidrolizadureademoles


t

AXV A

2

REACTIVACIÓN DE LA UREASA CON CISTEÍNA

1. Preparar 2 tubos de ensaye con los siguientes reactivos y en el orden que se indica.

TUBO No.

UREA 0.25 M(ml)

AMORT. DE FOSFATOS (ml)

ACETATO FENIL MERCÚRICO (ml)

CISTEÍNA(ml)

1 3.75 1 1 02 3.75 1 1 1

1. Continuar como en las experiencias 1.3. a 1.102. Comparar la actividad de la enzima en ambos tubos.

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PRÁCTICA No. 6

EFECTO DE LA TEMPERATURA EN UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Las reacciones catalizadas por enzimas son afectadas por la concentración del sustrato, la concentración de la enzima, el pH del medio de reacción y la temperatura.La temperatura influye sobre la velocidad de una reacción enzimática de dos formas: (1) durante períodos cortos y a un rango estrecho de temperatura, la velocidad aumenta aproximadamente dos veces por cada incremento de 10°C y (2) por arriba de 40 o 50°C, la velocidad disminuye rápidamente debido a la desnaturalización de la enzima por el calor.

OBJETIVO

Observar el efecto que tiene la temperatura en una reacción enzimática.

MATERIALREACTIVOS

6 Tubos de ensaye de 20 ml UreasaPipetas de 2 y 5 ml HgCl2 al 1 %Goteros Urea 0.25 M6 Vasos de precipitado de 250 ml Rojo de metilo al 0.04 %Embudo simple HCl 0.1 MBaño de agua a 4, 25, 35, 50 y 65°C Amortiguador de fosfatos 0.1 M a pH 7.01Bureta graduada de 25 mlPapel milimétrico

METODOLOGÍA

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A DIFERENTES TEMPERATURAS


TUBO No. UREA 0.25 M (ml)

AMORT. DE FOSFATOS (ml)

HgCl2

(gotas) UREASA

(gotas)1 (blanco) 2.5 2.5 3 5

2 2.5 2.5 0 53 2.5 2.5 0 54 2.5 2.5 0 55 2.5 2.5 0 5

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6 2.5 2.5 0 5

1. Mezclar perfectamente cada uno de los tubos de ensaye e incubarlos 30 minutos en un baño de agua a las siguientes temperaturas:

TUBO No. 1 2 3 4 5 6TEMPERATURA °C 35 4 25 35 50 65

1. Adicionar 3 gotas de HgCl2 a los tubos del 2 al 62. Transferir el contenido de cada uno de los tubos en diferentes vasos de precipitados.1.5 Agregar a cada vaso, 4 gotas del indicador rojo de metilo.1.1 Titular el contenido de cada uno de los vasos adicionando HCl 0.1 M hasta la aparición de un color

canela estable

1.2 Para los tubos del 2 al 6, realizar los siguientes cálculos:

Con los resultados obtenidos, construir una gráfica que relacione los M de urea hidrolizados a diferentes temperaturas.

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PRÁCTICA No. 7

EFECTO DEL pH EN UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO

Observar el efecto que tiene el pH en una reacción enzimática.

MATERIALREACTIVOS

6 Tubos de ensaye de 20 ml Ureasa5 Pipetas de 5 ml HgCl2 al 1 %Goteros Urea 0.25 M6 Vasos de precipitado de 250 ml Rojo de metilo al 0.04 %Embudo simple HCl 0.1 MBaño de agua a 50°C Amortiguador de acetatos 0.1 M a pH 4.0Bureta graduada de 25 ml Amortiguador de fosfatos 0.1 M a pH 6.0Papel milimétrico Amortiguador de fosfatos 0.1 M a pH 7.0

Amortiguador de boratos 0.1 M a pH 8.0

METODOLOGÍA

1. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA A DIFERENTES pH.


TUBO No. UREA 0.25 M (ml)

AMORTIGUADOR (ml) HgCl2

(gotas) UREASA

(gotas)1 (blanco) 2.5 pH = 7.0 , 2.5 3 5

2 2.5 pH = 4.0 , 2.5 0 53 2.5 pH = 6.0 , 2.5 0 54 2.5 pH = 7.0 , 2.5 0 55 2.5 pH = 8.0 , 2.5 0 5

1. Mezclar perfectamente cada uno de los tubos de ensaye e incubarlos 30 minutos en un baño de agua a 50°C.Adicionar 3 gotas de HgCl2 a los tubos del 2 al 6.

2. Transferir el contenido de cada uno de los tubos en diferentes vasos de precipitados.3. Agregar a cada vaso, 4 gotas del indicador rojo de metilo.3.1 Titular el contenido de cada uno de los vasos adicionando HCl 0.1 M hasta la aparición de un color

canela estable

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3.2 Para los tubos del 2 al 6, realizar los siguientes cálculos:

1. Con los resultados obtenidos, construir una gráfica que relacione los M de urea hidrolizados (actividad enzimática) con el pH.

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230

10001.01tubodelHCldemlproblemadelHCldeml

min

oshidrolizadureademoles


PRÁCTICA No. 8

CINÉTICA ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Cinética enzimática.

Las enzimas son proteínas que realizan la catálisis de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. Aunque las reacciones enzimáticas obedecen a los mismos principios de la cinética química, se diferencian de éstas por el hecho de que las enzimas son susceptibles de saturación.Durante una reacción enzimática, el sustrato S se une químicamente a la enzima E para formar un complejo ES. Luego de sufrir varias reacciones químicas el complejo ES se rompe para dar origen a los productos y enzima libre, que puede iniciar otro ciclo catalítico.

E + S ES E + P

En 1913, Michaelis y Menten desarrollaron la teoría cinética general que explica el comportamiento de las reacciones química catalizadas enzimáticamente, mostrando una cinética clásica como la que se muestra:

Transaminasas.

En el catabolismo de mas de una docena de aminoácidos, el grupo alfa – amino es removido de un determinado amino – ácido al carbono alfa de un cetoácido mediante

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catálisis enzimática. A las enzimas que catalizan dichas reacciones se les conoce como transaminasas. En esta reacción el grupo alfa – amino se transfiere al ceto – ácido alfa – cetoglutárico.La actividad de la transaminasa pirúvica se determina por colorimetría midiendo la cantidad de alfa – cetoácido producido. Mediante la reacción estequiométrica con 2,4-DNPH que forma un compuesto colorido que tiene una absorción a una de 505 nm.

OBJETIVO

Obtención de un extracto crudo de transaminasa pirúvica a partir de un producto vegetal para:

Observar el comportamiento de una reacción enzimática en un extracto crudo vegetal. Medir la actividad de transaminación de la enzima por colorimetría. Estudiar la cinética enzimática, y determinar sus parámetros cinéticos.

MATERIALREACTIVOS

Bisturí o navaja Chícharos frescosBotella para lavar de 500 ml Solución ácida de 2,4 dinitrofenilhidracina 1.5 mMPipeta PasteurCristalizador

Solución amortiguadora TRIS-HCl 40 mM, EDTA 0.25 Mm pH 7.5

Embudo de vidrio de tallo largo Solución de Hidróxido de sodio 1 NGasa Solución patrón de ácido pirúvico .002 MHieloParrilla magnética

Sustrato L-alanina 0.002 M -cetoglutarato 0.002M, TRIS-HCl 0.1 M pH 7.5

4 Pipetas serológicas de 1, 5, 10 mlProbeta graduada de 50 mlTermómetro2 Tubos para centrífuga15 Tubos de ensayeMortero con pistilo2 Vasos de precipitado de 250 ml

METODOLOGÍA

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO DE ENZIMAColoque el mortero en una cama de hielo, con el bisturí pique finamente los chícharos y coloque el picado en el mortero, agregue 20 ml de solución TRIS – HCl 40 mM pH 7.5, homogenice manteniendo siempre en el hielo. Enfríe un tubo de ensaye y en él filtre el

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homogeneizado a través de cuatro capas de gasa, centrifugue el homogeneizado a 3 500 rpm durante 5 minutos y vierta el sobrenadante en un tubo de ensaye frío y manténgalo en el hielo hasta su uso.

CINÉTICA DE LA TRANSAMINACIÓN

Prepare un baño María o una estufa a 37°C, y al mismo tiempo ponga a hervir agua en un vaso de precipitado de 250 ml que se usará como baño María. A un tubo de ensaye agregue 1 ml de sustrato y 0.2 ml del extracto de la enzima y colóquelo en el baño María en ebullición, durante 5 minutos.Prepare 7 tubos de ensaye para cada una de las concentraciones de acuerdo a la tabla siguiente:

De cada una de las concentraciones se tienen 5 tubos, el primer tubo de cada concentración no se incuba, de inmediato se le adiciona 1 ml. De 2,4 dinitrofenilhidracina se homogeniza y reposa durante 20 minutos, posteriormente se adicionan 5 ml de solución NaOH 1 N se agita y espera 5 minutos y se lee en el espectrofotómetro a una denm. El segundo tubo se incuba durante 5 minutos y posteriormente se adiciona 2,4 dinitro fenilhidracina, se homogeniza y reposa durante 20 minutos posteriormente se adicionan 5

Tubo número

Sustrato L-alanina (ml.)

TRIS – HCl (ml)

Extracto crudo(ml)

1 0.0 3.00 0.22 0.5 2.5 0.23 1.0 2.0 0.24 1.5 1.5 0.25 2.0 1.0 0.26 2.5 0.5 0.27 3.0 0.0 0.2

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ml de solución NaOH 1 N se agita y espera 5 minutos y se lee en el espectrofotómetro a una nm.El tercer tubo se incuba por 10 minutos se procede como en el paso anterior y así sucesivamente cada tubo hasta el No 5 que se incuba por 20 minutos y se procede de igual manera.Construya una gráfica de Concentración de producto en mM de ácido pirúvico, (interpolando los datos de absorbancia en la curva de calibración) contra tiempo para cada concentración, y así obtener una familia de curvas.

A cada curva (concentración), determine su pendiente en la parte inicial del tiempo donde la curva es de primer orden y construya una gráfica de velocidad de reacción (pendiente de la curva) contra concentración de sustrato; para determinar la Velocidad máxima de la reacción enzimática.

CURVA DE CALIBRACIÓN Y MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICAEtiquete 6 tubos de ensaye y coloque los reactivos según la siguiente tabla.

Volumen en mililitrosTubo número Agua Patrón de ác. pirúvico

1 3.0 0.02 2.5 0.53 2.0 1.04 1.5 1.55 1.0 2.06 0.5 2.5

En cada tubo adicione 1 ml de 2,4 DNPH agite vigorosamente, incube a temperatura ambiente durante 20 minutos, agregue 5 ml de solución de NaOH 1 N agite vigorosamente e incube a temperatura ambiente por cinco minutos.Calibre el colorímetro a 505 nm con el tubo No. 1, lea la absorbencia de cada tubo y construya una gráfica de absorbencia contra concentración de ácido pirúvico.

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Primera concentración

Segunda concentración

Tercera concentración

Tiempo Incubación

con.

piruvat

Reacción de primer

orden


ESTUDIO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA MEDIANTE EL USO DE CATALASA PRESENTE EN GLÓBULOS ROJOS.

Objetivo

Estudiar un proceso enzimático, obteniendo los parámetros cinéticos característicos.

Fundamento

La catalasa es una enzima presente en organismos aeróbicos cuya función biológica es catalizar la descomposición del agua oxigenada según la siguiente reacción:

2 H2O2 O2 + 2 H2O

En el experimento a realizar, la catalasa se obtiene a partir de sangre. A continuación se impregna un papel de filtro en la disolución de sangre en solución amortiguadora. el cual se introduce en una disolución de agua oxigenada (sustrato). La formación de oxígeno provoca la subida del papel de filtro desde el fondo del reactor discontinuo hasta llegar a la superficie del mismo (probeta graduada). La actividad enzimática de la catalasa se mide como una función del tiempo empleado por el papel en llegar a la superficie del reactor de distinta concentración de agua oxigenada.

Procedimiento experimental

Se preparan las siguientes disoluciones:

500 ml de buffer fosfato 0.1 M a pH = 7. Para su preparación se toman 0.031 mol de K2HPO4 compltándose con agua destilada hasta los 500 ml. Una vez preparada se coloca en un baño de agua-hielo hasta su uso posterior.

Disoluciones de agua oxigenada: 500 ml de H2O2 al 2 %, 1 % 0.5 %. 0.25%, 0.125 %, 0.062 %, 0.031 %, 0.015 % y 0.007 % (p/v). Todas ellas se prepara a partir del reactivo comercial al 30 % (p/v).

3 ml de sangre y completar 40 ml con buffer.

Se prepara una solución de sangre tomando 3 ml de sangre y completar 40 ml con buffer.Posteriormente, se extraen 3 ml de la disolución y se trasvasa a una placa de Petri. Seguidamente, se toman unos trozos de papel de filtro, de unos 4 cm de diámetro asegurándose que quepan en una probeta de 250 ml y se impregnan de la solución de sangre que contiene a la enzima. Una vez que el papel está impregnado con la disolución enzimática, se deposita en el reactor (probeta de

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250 ml) discontinuo, que contiene 500 ml de disolución de agua oxigenada de la concentración correspondiente.

Se coloca el papel hasta el fondo del reactor con una varilla de vidrio y se toma como tiempo inicial del experimento (tiempo cero) cuando se deja el papel en libertad. A continuación , se cronometra el tiempo que tarda en subir el papel de filtro hasta situarse en la superficie.

Se repite el proceso para cada concentración de agua oxigenada a estudiar y se toman al menos 6 o 7 medidas de tiempo en cada una de ellas con objeto de obtener un valor promedio.

Cálculos

A partir de los datos cinéticos obtenidos y las concentraciones de agua oxigenada, realizar una representación de Lineweaver-Burk ( t vs. 1/[H2O2] ) y obtener los parámetros cinéticos que caracterizan a este sistema enzimático.

Existen otras fuentes naturales de catalasa. 0.4 g de hígado de ternera equivalen, en actividad enzimática, a 25 g de zanahoria, 40 g de remolacha, xx g de puerro, xx g de cebolla, xx g de chirivía, xx g de brotes de patata, xx g de calabacín, xx g de nabo, xx g de espinaca, xx g de rábano, xx g de albaricoque, xx g de pepino, xx g de cereza, xx g de brécol, xx g de plátano, xx f de leche sin pasteurizar, xx g de sangre, …

Preparación del extracto enzimático:Sangre ----------------------------------------------- 3 mlBuffer de fosfatos 0.1 M pH 7.0 --------------- 40 ml

PRÁCTICA No. 8

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CINÉTICA ENZIMÁTICA

INTRODUCCIÓN

Cinética enzimática.

Las enzimas son proteínas que realizan la catálisis de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. Aunque las reacciones enzimáticas obedecen a los mismos principios de la cinética química, se diferencian de éstas por el hecho de que las enzimas son susceptibles de saturación.Durante una reacción enzimática, el sustrato S se une químicamente a la enzima E para formar un complejo ES. Luego de sufrir varias reacciones químicas el complejo ES se rompe para dar origen a los productos y enzima libre, que puede iniciar otro ciclo catalítico.

E + S ES E + P

En 1913, Michaelis y Menten desarrollaron la teoría cinética general que explica el comportamiento de las reacciones química catalizadas enzimáticamente, mostrando una cinética clásica como la que se muestra:

OBJETIVO

Observar el comportamiento de la reacción enzimática de la ureasa. Medir la actividad de la enzima. Estudiar la cinética enzimática, y determinar sus parámetros cinéticos.

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MATERIALREACTIVOS

2 Pipeta de 1 mLRojo de metilo al 0.04%

2 Pipeta de 5 mLHCl 0.01 M

4 Matraces Erlenmeyer de 125 mLUrea 0.25 M

17 Tubos de ensaye 20x120 mmHgCl2 al 1%

1 Bureta graduada de 25 o 50 mLSolución de ureasa

1 Pinzas para buretaAmortiguador de fosfatos 0.1 M a pH 7.01

1 Soporte universalAgua destilada

5 Vaso de precipitados de 250 mL

1 Pizeta

METODOLOGÍA

1. Prepare 4 tubos de ensaye para cada una de las concentraciones de acuerdo a la tabla siguiente:

2.Concentración UREA 0.25 M

(mL)AMORT. DE

FOSFATOS (mL)HgCl2

(gotas)1 0.25 4.75 02 0.50 4.5 03 0.75 4.25 04 1.00 4.00 0

Blanco 1.25 3.75 3

1. Calentar los tubos de ensaye a 50°C durante 5 minutos.2. Agregar a cada uno de los tubos 5 gotas de ureasa y mezclar perfectamente.3. Vierta el contenido del tubo de ensaye preparado como blanco en un matraz

Erlenmeyer lavándolo con agua destilada, adicionando el agua de lavado al matraz y titule con ácido clorhídrico.

4. Incubar los tubos a 50°C.5. Tomar un tubo de cada concentración a los siguientes tiempos de incubación: 0, 10,

20, y 30 minutos.

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6. Adicionar 3 gotas de HgCl2 a cada tubo, inmediatamente que se cumpla el tiempo de incubación y agitando perfectamente.

7. Transferir el contenido de cada uno de los tubos a matraces Erlenmeyer, lavando y adicionando el agua de lavado al matraz

8. Agregar a cada matraz Erlenmeyer, 4 gotas del indicador rojo de metilo.9. Titular el contenido de cada uno de los vasos, adicionando HCl 0.01 M hasta la

parición de un color canela estable.10. Calcule los micromoles de urea hidrolizados mediante la fórmula empleada en las

prácticas anteriores.11. Construya una gráfica de M de urea hidrolizados , contra tiempo para cada una de

las concentración con que se trabajó.12. A cada curva (concentración), determine su pendiente en la parte inicial del tiempo

donde la curva es de primer orden y construya una gráfica de velocidad de reacción (pendiente de la curva) contra concentración de sustrato; para determinar la Velocidad máxima de la reacción enzimática y la Km.

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el diario de lab oratorio

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