ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

Electroforeza este o metoda fizico-chimica de analiza ce permite separarea proteinelor pe baza diferentelor intre vitezele de deplasare intr-un camp electric aplicat mediului respectiv. Ca urmare

a caracaterului lor amfoter, proteinele poseda o sarcina electrica ce depinde de natura moleculei, pH si de compozitia mediului. Moleculele incarcate electric, aflate in solutie si supuse actiunii unui

camp electric, vor migra catre electrodul de polaritate opusa.

Viteza cu care se deplaseaza o particula intr-un camp electric depinde de mai multi factori:

densitatea de sarcina electrica la suprafata particulei (functie de marimea sarcinii si de volumul particulei), densitatea particulei, gradientul de potential (reprezentat de raportul dintre diferenta

de potential dintre electrozi si distanta dintre acestea), forta ionica a mediului, vascozitatea lui, temperatura. De aceeasi factori depinde si gradul de rezolutie al unei metode electroforetice,

natura suportului folosit si pH-ul mediului fiind decisive.

De-a lungul timpului s-au folosit mai multe suporturi electroforetice, gelul de agaroza fiind

cel care asigura cea mai buna rezolutie.

Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza in gel de agaroza: tehnica standard,

electroforeza in gel de SDS-agaroza (la care adaugarea SDS - sodium dodecil sulfat in compozitia suportului electroforetic permite separarea fractiunilor pe baza masei moleculare) si focalizarea

izoelectrica.

Electroforeza in gel de agaroza prezinta cateva avantaje, cele mai importante fiind:

gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate

rapiditatea, conferita de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca

urmare a independentei totale a celor doua module (de migrare si colorare)

gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minima a factorului uman la metodele

manuale)

diversificarea parametrilor investigati (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine

normale si patologice) aplicabilitatea in cazul mai multor lichide biologice (ser dar si urina, LCR si altele), precum

si faptul ca pentru aceste lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel

inlaturat un neajuns important care facea, de multe ori, impracticabila metoda pentru electroforeza proteinelor urinare, din LCR si din alte fluide hipoproteice

Electroforeza proteinelor serice separare beta1-beta2

Profil electroforetic normal

Hiper gama globulinemie

Banda dubla in zona de mobilitate alfa 2

- ser hemolizat -

Profil monoclonal in zona de mobilitate beta 2

Profil monoclonal in zona de mobilitate gama

Profil biclonal in zona de mobilitate gama

Electroforeza proteinelor serice separare beta total

Profil electroforetic normal

Hiper gama globulinemie

Benzi monoclonale in zona de mobilitate beta

Banda monoclonala in zona de mobilitate gama

Profil biclonal in zona de mobilitate beta

Profil biclonal in zona de mobilitate gama

Aspecte particulare

Pozitia 8 (gel stanga) – fibrinogen in zona de mobilitate beta-gama.

Pozitia10 (gel dreapta – "benzi in mustata" corespunzatoare alfa si beta lipoproteinelor (in zonele de mobilitate alfa2 si beta).

(A.Chiva- Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator-ghid de interpretare-Ed. Universitara « Carol Davila », Bucuresti, 2008)

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

Permite separarea proteinelor serice in 5 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH 9.2 sau in 6 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la

pH 8.5. Utilizarea amidoschwarz-ului drept colorant confera rezolutie, specificitate si sensibilitate metodei, putand fi detectate, chiar si benzi monoclonale slab reprezentate.

Interpretarea principalelor modificari pe electroforeza proteinelor serice Modificari la nivelul albuminelor

bisalbuminemii tranzitorii sau permanente

analbuminemie congenitala

hipoalbuminemia apare in:

o insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica severa)

o diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii o pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva

(gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri) o hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse

(tireotoxicoza, sindrom Cushing) hiperalbuminemia fara semnificatie patologica importanta apare frecvent la pacientii

cu hemoconcentratie locala sau sistemica sau in urma perfuziilor cu albumina

Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele

Cresc in:

sindrom nefrotic

diabet zaharat

miocardoscleroza

endocardite bacteriene

arsuri

boli infectioase

reumatism

reactii inflamatorii

In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2.

Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1 poate fi observata in:

hepatita cronica

reactii de faza acuta insotite de hemoliza

terapie cu estrogeni

sarcina

Cresterea predominanta a componentelor alfa-2 se intalneste in:

poliartrita reumatoida

boli cu complexe imune circulante

Scaderea alfa-1 globulinelor apare:

in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii de proteine

in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsina

Beta globulinele cresc in:

anemia feripriva

dislipidemii

boala Cushing

gamapatii monoclonale(Ig A, Ig G, lanturi usoare Kappa sau Lambda)

hepatite toxice

ciroze, inclusiv alcoolice

sindrom nefrotic

Scaderi ale beta globulinelor pot apare in:

insuficienta hepatica, malnutritie, pierderi proteice corelate cu diminuarea valorii

transferinei in mobilitatea electroforetica in zona beta-1 scaderea fractiunii C3 a complementului, asociata cu o scadere a fractiunii beta-2

Gama globulinele cresc in:

infectii bacteriene

parazitoze

colagenoze

poliartrita reumatoida

obstructie biliara

hepatita acuta sau cronica

ciroza hepatica

leucemii

mielom multiplu

boli inflamatorii

Estomparea sau absenta benzii gama sugereaza un deficit imun (agamaglobulinemie).

Modul de conservare si pastrare a probelor pentru electroforeza

Parametru Proba de analizat Conservare

Electroforeza proteinelor serice ser 1 saptamana la 2-8°C

1 luna la congelator

Factori de interferenta pentru determinarile electroforetice

Parametru Factori de interferenta Efect

Electroforeza proteinelor

serice (standard si HR)

plasma ca proba de

analizat

tratament cu

anticoagulante hemoliza serului

decongelarea probelor

prezenta fibrinogenului cu

mobilitate beta-gama

dublarea peak-ului in zona alfa-

2 sau beta-globulinica banda suplimentara in punctul

de aplicare a probei

Despre electroforeză Deşi cunoscut încă de la sfârţitul secolului XIX, electroforeza se afirma că o metoda analitică de separare în urma lucrărilor referitoare la stadiul unor

proteine (1937) elaborate de Arne Tiselius, laureat al premiului Nobel, numit şi “părintele electroforezei”. Denumirea de electroforeză provine din asocierea cuvântului grec electron (electric) cu cel latin phore (purtator), evidenţiându -se astfel rolul esenţial al câmpului electric în procedeul descris. Electroforeza este o metodă de analiză şi separare bazată, în principal pe criterii de sarcină electrică şi masă moleculară. Migrarea diferenţială a particulelor încărcate electric se face sub acţiun ea unui câmp electric continuu. Electroforeza proteinelor pe gel de agaroză este tehnica cea mai uşoară şi mai puţin costisitoare, implicând o cantitate limitată de materiale, un timp de lucru scurt şi o reproductibilitate foarte bună. Separarea electroforetică a proteinelor serice prezintă un interes major în testele clinice, datorită importantelor informaţii pe care le oferă acestea în diverse afecţiuni, precum şi asupra modalităţilor de tratare a acestora Electroforeza proteinelor serice ajută la diagnosticarea diferitelor cazuri clinice, cum ar fi cazuri de mielom multiplu, macroglobulinemie, amiloidoză, sindrom nefrotic, afectiuni hepatice, infecţii acute şi cronice sau cazuri în care nu se pot explica anumite simptome (oboseală, creşterea vitezei de sedimentare a eritrocitelor, dureri de spate, osteoporoză, leziuni osoase, deficienţe de imunoglobuline, creş terea calciului, proteinuria Bence Jones, insuficienţe renale) PH – ul solutiei de migrare joacă un rol important în preluarea sarcinilor electrice. În cazul proteinelor, pH -ul la care sarcina globală este nula se numeşte pH izoelectric. PRINCIPIUL ELECTROFOREZEI

O proteină în soluţie care are un pH inferior punctului sau izoelectric se va comporta ca o bază şi va accepta protonii H+. Ea va deveni astfel încărcată pozitiv : în mediu acid

O proteină în soluţie care are un pH superior punctului său izoelectric se va comporta ca un acid şi va ceda protonii H+. Ea va deveni astfel încărcată negativ : în mediu bazic

Prin urmare stabilirea pH-ului electrolitului purtător constituie condiţia esenţiala pentru obţinerea separărilor. Prin electroforeza serului, în condiţiile amintite mai sus, se obţin saşe fracţiuni: albumina,

α1-, α2-, β- si γ- globuline. Se poate realiza astfel şi o electroforegramă a fiecărei migrări. O electroforegramă normală este reprezentată în modul urmator :

A. Fracţiile proteice din ser separate prin electroforeza pe gel de agaroză. Pot fi observate fracţiile albumină, a1 (orosmucoid, a1-antitripsină, a1-antichimotripsină), α2 (α-lipoproteină, haptoglobulină, ceruloplasmină, Gc globulină, α2-macroglobulin[), β1 (transferin, hemopexin, β -lipoprotein), β2 (IgA, complement C3) şi γ ( fibrinogen, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).

B. Reprezentarea grafică (electroforegramă) obţinută în urma separării proteinelor unui ser normal. Valori normale, exprimate procentual şi în g/dl, ale fracţiilor proteice.