elektroforesis zona 2014
TRANSCRIPT
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
1/13
2014/4/16
1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 1
ELEKTROFORESIS
ZONA
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 2
LO Bahan Kajian
Mahasiswa mampu menjelaskan dan
menerapkan pemisahan dengan elektroforesiszona beserta instrumentasi utamanya.
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 3
Elektroforesis Zona
Definisi dan Sejarah1
Perkembangan Teknik
Elektroforesis2
Instrumentasi Utama3
Faktor yang memengaruhi
pemisahan4
Elektroforesis Kertas5
Elektroforesis Selulosa
Asetat6
Elektroforesis gel alami7
Elektroforesis gel buatan8
Aplikasi9
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 4
Buku Acuan
Meloan CE. 1999. Chemical Separations:
Principles, Techniques and Experiments.
Canada, John Wiley & Sons
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
2/13
2014/4/16
2
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 5
Definisi dan Sejarah
Arne Tiselius
Swedia 1902-1971
Father of Electrophoresis
The Nobel Prize in Chemistry 1948
For his research on electrophoresis and adsorption analysis,
especially for his discoveries concerning the complex nature of the
serum proteins.
Serum kuda pada Pipa U dipisahkan dengan elektroforesis
menghasilkan 4 pita yang terpisah dengan baik yang terdiri
atas albumin dan 3 globulin yang diberi nama , , dan
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 6
Definisi dan Sejarah
Pemisahan ion dalam larutan berdasarkan perbedaan
ukuran dan muatan ketika tegangan tinggi diberikan pada
larutan
Muatan positif akan bergerak ke kutub negatif dan
sebaliknya
+
+
+
+
+
++
+
+
+
3
+
3
+
3
+
2
+
2
+
2
+
+
+
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 7
Definisi dan Sejarah
Keadaan struktur ionik dipengaruhi oleh
Jumlah dan keadaan gugus yang dapat diionkan
pH lingkungan
Keberadaan ion lainnya
Perbedaan dengan metode lain
Asosiasi dengan ion lawanKromatografi penukar ion
prinsip?
Pergerakan pada medan elektrik elektroforesis prinsip
Pengendapan pada elektroda elektrodeposisi / elektrolisis
prinsip
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 8
Definisi dan sejarah
Sistem fase tunggal mobilitas relatif ion
kondisi elektrik
GAYA DORONG:F (dlm elektroforesis)
Teknik dua fase
- Adsorpsi
- Solubilitas
- Pengikatan ligan
- Interaksi ion
Teknik satu fase
- Friksi molekular
- Elektrostatis
GAYA TAHANf(koefisien
friksi).v(kecepatan
partikel)
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
3/13
2014/4/16
3
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 9
Definisi dan Sejarah
F>=f.
F=Q.E
Q.E = f.saat Ekonstan = Q/f =
Berdasarkan Hk Stoke:
f = 6r molekul bulat
F =Q.E= 6r
U = /E =Q/6r
Q : muatan partikel;
E: kekuatan medan
: mobilitas per unitmedan listrik
r : jari-jari partikel (cm)
: viskositas medium(poises)
: kecepatanelektroforetik (cm/dt)
U: mobilitas partikel (cm2
volt-1dt-1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 10
Contoh Soal
Tentukan mobilitas ion Ba2+dalam larutan BaCl20.0625M,jejari Ba2+dalam larutan sebesar 2.78A dan viskositas
larutan 10.31 mili poises.Jawab
Q = 2x4.8x10-10esu (electrostatic unit of charge) bagaimana cara menentukan hal ini?
r= 2.78 x 10-8cm
= 1.03 x-2poises300 volt = 1.000692145 esu
U= .
3...33= 5.9x10-4cm-2.vol-1dt-1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 11
Definisi dan sejarah
Untuk memperhitungkan
efek ion Cl-yang ada
dalam larutan diperlukan
koreksi denganpersamaan Debye-
Huckel
u =
u : kekuatan ionik
A: konstanta: 0.2333x108
untuk air pada 25oC
r : jari-jari partikel (cm)c: konsentrasi (mol/L)
Z: valensi ion
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 12
Contoh Soal
Berdasarkan soal sebelumnya, tentukan mobilitas Ba2+ketika
dipertimbangkan keberadaan ion lainnya.
Jawab
=
=
0.06252
+ 20.06251 = 0.187489
U=
=
5.9x10;
..33 .=
4.6210;cm2volt-1dt-1
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
4/13
2014/4/16
4
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 13
Definisi dan Sejarah
Secara praktis digunakan
persamaan
=
=
.
k=C/R
:jarak pergerakan ion (cm)
: jarak antar elektroda (cm)
V : tegangan (volt)
t : waktu (detik)
E : kekuatan medan (volt/cm)
i : arus (amper)
q : luas penampang lintas sel (cm2)
k : konduktivitas spesifik (ohm-1cm-1)
R : tahanan larutan dalam sel (ohm)
C : konstanta sel (cm-1)
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 14
Contoh Soal
Larutan albumin telur 3% dalam bufer pH 7.2 ditempatkan pada sel
elektroforesis yang memiliki diameter 1.2cm. Digunakan arus sebesar
20mA dan albumin telur memerlukan waktu 208 menit untuk bergerak
5.87cm menuju elektroda (+). Jika konstanta sel sebesar 18.3cm -1dan
tahanan sistem sebesar 7690 ohm pada 0oC, tentukan mobilitas
albumin telur tsb.
Jawab
Tentukan konduktivitas spesifik:
k = C/R = 18.3/7690 = 0.00238 ohm-1cm-1
Tentukan nilai E: =
.=
.
(3..)(.3)= 7.43 volt/cm
Tentukan nilai U: =
=
;.
()(.3)= -6.3x10-3cm2volt-1det-1
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 15
Perkembangan teknik
elektroforesis1930 : Pipa U Tiselus
1937 : Elektroforesis Kertas disarankan oleh P Konig diaktualkan 1948 oleh EFisher
1939 : elektroforesis zona dikembangkan
1955 : gel pati (Smithies)
1957 : Selulosa Asetat (J Kohn)
1959: PAGE (polyacrylamide gels) (Raymond & Weintraub)
1961 : IEF (Svensson)
1964 : Disc gel electrophoresis (Ornstein & Davis)
1969 : SDS electrophoresis (Beber & Osborn)
1971 : Gel selulosa asetat (Meera)
1975 : Elektroforesis 2 dimensi
1977: sekuensing gel digunakan
1979 : gel agarosa
1983 : pulsed field electrophoresis
1983 : capillary electrophoresis
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 16
Perkembangan teknik
elektroforesis
Horizontal vertikal
+ -
+
+
Zona sempit
- Spot
- pita
Zona
sempit
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
5/13
2014/4/16
5
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 17
Instrumentasi utama
Elektroda (positif dan negatif)
Sumber tegangan
Medium
Bufer
Pewarna/deteksi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 18
Medium
Perkembangan elektroforesis didasari oleh
perkembangan medium Kertas kertas selulosa asetat gel
Fungsi:
Reseptor spot/pita dari zat-zat terlarut
Menyediakan jalur migrasi
Medium berbeda: efektivitas pemisahan
berbeda bergantung sifat zat yang dipisahkan
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 19
Bufer
Fungsi:
Membawa arus yang diberikanjembatan konduksi
Menyediakan pH
Menentukan muatan dari zat terlarut
Kekuatan ionik bufer
Kekuatan yang tinggi menghasilkan pita yang tajam
Kekuatan yang tinggi menghasilkan panas lebih tinggi
Bufer yang biasa digunakan
Bufer barbital & Tris-EDTA untuk protein
Tris-asetat-EDTA & tris borat-EDTA
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 20
Deteksi
Dengan pewarnaan: Prinsip: diberi pereaksi spesifik
Cara: disemprot, diuapi, direndam, dll
Kadang perlu menghilangkan warna
background pada medium dengan
destaining.
Tanpa pewarnaan: Deteksi dengan UV
Densitometer/scanner
Identifikasi Mengukur jarak tempuh komponenRf
Spot dengan Rf/jarak tempuh yang sama dengan standardianggap sebagai senyawa yang sama
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
6/13
2014/4/16
6
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 21
Beberapa pereaksi pewarna
Pereaksi Senyawa yang dideteksi
Amido black 10 B ProteinCoomassie blue Protein
Silver nitrat Protein
Etidium bromida DNA dan RNA
Sudan black Lipid dan lipoprotein
Schiff-periodic acid Karbohidrat dan glukoprotein
Ninhydrin Asam amino
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 22
Peralatan Elektroforesis
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 23
Faktor yang memengaruhi
pemisahan
Voltase yang digunakan
Konsentrasi bufer
pH bufer Efek elektroosmotik
Efek difusi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 24
Voltase yang digunakan
Tegangan yang tinggi akan menyebabkan
Efek termal Penguapan bufer
perubahan mobilitas karena perubahan tegangan dan arus
Menyebabkan efek kapiler pada kertas dan gel karena akanmengambil bufer dari tempat bufer
Waktu pemisahan pendek
Panas maksimum yang dapat ditoleransi 0.15watt/cm3
Perhitungan panas:
H=
: panas yang terbentuk W/cm3
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
7/13
2014/4/16
7
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 25
Contoh Soal
Tentukan panas yang terbentuk pada albumin
telur di soal sebelumnya
Jawab
H=
=
.
.3.3= 0.132 W/cm3
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 26
Voltase yang digunakan
Pada saat panas sangat tinggi dapat
ditemukan bentuk pita yang tersenyum
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 27
Konsentrasi bufer
Mempengaruhi mobilitas partikel (ingat
kembali rumus perhitungan U)
Konsentrasi bufer
viskositas bufer ?
mobilitas ion ? memerlukan konduktivitas ?
pemanasan ? efek yang muncul?
=
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 28
pH bufer
Muatan zat ampiprotik ditentukan pH lingkungannya
pH asam = kation pH basa = anion
tidak bermuatan
pH = pI
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
8/13
2014/4/16
8
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 29
Efek elektroosmotik
Zat berbeda hantaran berbeda
Contoh: kertas (medium) dan air (pelarut/bufer) akan
berinteraksi menimbulkan perbedaan muatan
Kertas lebih bermuatan (-) dari selulosa
Air lebih bermuatan (+)
Air ditempatkan pada tabung kapiler yang diberi
elektroda positif dan negatif, air akan bermigrasi
pada elektroda negatif
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 30
Efek difusi
Cairan cenderung mengalir
Kecepatan difusi dipengaruhi oleh Ukuran partikel: makin kecil ukuran partikel,
makin cepat berdifusi
Perbedaan konsentrasi
Suhu: makin tinggi makin mudah berdifusi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 31
Elektroforesis kertas
Teknik pekerjaan mirip dengan kromatografi kertas
Aplikasi contoh: Cara kering:
seperti kromatografi kertas
Resolusi spot lebih baik karena lebih kecil Belum ada jembatan konduksi
Cara basah: kertas dibasahi dengan bufer lalu contoh ditetesi
Spot lebih lebar
Sudah ada jembatan konduksi
Hanya untuk molekul kecil yang mobilitasnya kecil perlupotensial tinggi (200volt/cm)panas
Efek elektroosmotik tinggi
Efek difusi besar membran selulosa asetat
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 32
Selulosa Asetat
transparan
Lebih seragam dan memberikanpemisahan yang lebih tajam dan
mengurangi efek backgroundpada pewarnaan.
Waktu pemisahan lebih pendek
Jangan dicelupkan dalam bufertapi biarkan bufer masuk daribagian dasar selulosa asetat
Faktor difusi masih besar
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
9/13
2014/4/16
9
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 33
Gel alami
Memperbaiki efek difusilebih kaku
Gel alami pati kentang polimer alami, ukuran pori sesuai
dengan sifat kimia bahan pati kentang/beragam
tidakdapat digunakan untuk penyaringan
Resolusi lebih baik dari kertas
Cara mempersiapkan
Pati kentang + bufer dipanaskan sekitar 90oC hingga larut.
Udara dalam campuran dikeluarkan dengan vakum
Letakkan pada cetakan, disiapkan tempat meletakkan contoh dengan
sisir dan didinginkan
Gel yang telah dirunningdapat dipotong dan diwarnai dengan
pewarna yang berbeda
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 34
Gel Buatan
Ukuran pori seragam bergantung konsentrasi
Konsentrasi kecil konsentrasi besar
Hati-hati memilih konsentrasi perhatikandata dari produsen bahan kimia
Contoh PAGE
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 35
PAGE
Lebih fleksibel, kuat, dan mudah ditanganidibandingkan dengan gel lain
Transparan thd radiasi UV dan Vis
Menghilangkan efek elektroosmosis dan difusi Pembuatan gel akrilamida memerlukan
Monomer akrilamida
N,N-metilena-bis-akrilamida sebagai cross linker
Ammonium persulfat (APS) sebagai inisiator
Tetrametilenadiamina (TEMED) sebagai katalisator
Polimerisasi fotokimiawi diaktifkan oleh riboflavindengan adanya radikal UV
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 36
Reaksi pembentukan PAGE
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
10/13
2014/4/16
10
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 37
PAGE
Gel standar: 7.5% ukuran molekul 10.0001.000.000
3.5% ukuran molekul 1.000.0005.000.000 Ukuran >5.000.000 agarosa atau campuran gel
Elektroforesis Gel diskontinu 2 konsentrasi gel:
stacking gel /gel atas ukuran pori besar &
separation gel / gel bawah ukuran pori kecil
2 nilai bufer (biasanya berbeda 2 satuan pH) Bufer gel bawah pH sekitar 8.9
Bufer gel atas pH sekitar 6.7
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 38
SDS PAGE
Sodium dodesil sulfat (SDS): detergen
Bagian hidrofobik bereaksi dengan
protein dengan perbandingan teratur Protein membawa muatan SDS dg Mr
berbeda sampel memiliki muatansama tapi berbeda Mr-nya
U=
3.
;/3
=kzMr-1/3
persamaan logaritmik antara U danMr
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 39
SDS
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 40
Pemisahan protein terikat SDS
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
11/13
2014/4/16
11
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 41
PAGE & SDS PAGE
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 42
Aplikasi
Forensik
Membandingkan
DNA sampel daritersangka,
korban, dan data
di lapangan
+
T1
DNA
T2 T3 korban
Tersangka Sampeldilapangan
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 43
Aplikasi
Penentuan hubungan evolusi DNA organisme
+
DNA
1 32 4 5 1 2 3 4 5
Kura-kura ular tikus tupai lalat
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 44
Aplikasi
Menentukan bobot molekul protein dengan
SDS PAGE
Carilah literatur mengenai penggunaan
elektroforesis zona
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
12/13
2014/4/16
12
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 45
Aplikasi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 46
Aplikasi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 47
Aplikasi
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 48
Aplikasi
/ /
-
5/20/2018 Elektroforesis Zona 2014
13/13
2014/4/16
13
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 49
LATIHAN
Apa yang dimaksud dengan elektroforesis
Jelaskan sejarah perkembangan elektroforesis
Jelaskan instrumentasi utama pada elektroforesis Jelaskan faktor-faktor yang memengaruhi pemisahan
pada elektroforesis
Apakah persamaan dan perbedaan antaraelektroforesis kertas, selulosa asetat, gel alami dan gelbuatan.
Apakah persamaan dan perbedaan native PAGE danSDS-PAGE
Sebutkan contoh penerapan pemisahan denganelektroforesis zona
FMIPA IPB Teknik Pemisahan KIM 234 Bagian Kimia Analitik 50
PENUTUP
PELAJARI ELEKTROFORESIS KAPILER untuk
PERTEMUAN YANG AKAN DATANG