elektroforetske metode

7/22/2019 Elektroforetske metode

1/59

Elektroforetskemetode

Doc. dr. sc. Olga Gornik


2/59

Elektroforeza

kretanje iona u elektrinom polju

razdvajanje komponenata smjese

v = Eq/f

v = brzina E = elektrino polje

q = naboj molekule

f = koeficijent trenja


3/59

imbenici u elektroforezi

elektrino polje napon, U (V) jakost struje, I (A) otpor, R (W)

uzorak naboj, veliina, oblik

ufer sastav, koncentracija, pH

elektroforetski medij adsorpcija elektroendoosmoza

fiksni anioni kationi u otopini

molekularno prosijavanje


4/59

Vrste medija (nosaa) za elektroforezu

papir

celuloza acetat acetilirane hidroksilne skupine

krobni gel

vodikovim vezama umreeni polimeri galaktoze

poliakrilamidni gel

polimerizacija akrilamida promjenjiva umreenost


5/59


6/59

Elektroforeza serumskih proteina nacelogel trakama


7/59

Elektroforeza serumskih proteina


8/59

Gel elektroforeza


9/59

Polimerizacija akrilamidnog gela

CHCH2 C NH CH2 NH C CH CH2

OOO

C NH2

CHCH2

akrilamid N,N-metilenbisakrilamid

+

SO4-

O C NH

CH2

NHO C

CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

CO NH

CH2

NHCO

CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2

NH2C

O

NH2C

O

NH2C

O

CO NH

NHC NH2C NH2CNH2C

umreeni poliakrilamidni gel


10/59

Elektroforeza proteinaElektroforeza u agarnom gelu

vodoravna elektroforeza

razdvajanje na osnovi omjera mase i naboja

razmjerno rijetka primjenaElektroforeza u poliakrilamidnom gelu

gotovo uvijek uspravna elektroforeza

nativna elektroforeza razdvajanje na osnovi omjera mase i naboja

uva kvarterne strukture

osjetljiva na bioloke interakcije

denaturirajua elektroforeza SDS elektroforeza (SDS-PAGE)

razdvajanje na osnovi veliine

SDS daje naboj razmjeran masi


11/59

Agarozna gel elektroforeza


12/59

Agarozna gel elektroforeza


13/59

Poliakrilamidna gel elektroforeza


14/59

SDS denaturirajua elektroforeza u

poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) SDS natrijev dodecilsulfat

1.4 g SDS / g proteina

SO3-

Na+

redukcija SS-mostova merkaptoetanolom iliditiotreitolom (DTT)

razdvaja proteine prema njihovoj veliini pokretljivost obrnuto razmjerna logaritmu

molekulske mase


15/59

Pokretljivost proteina obrnuto jerazmjerna logaritmu molekulske mase

1,6

1,8

2

2,2

garitamM

r

1

1,2

1,4

0 1 2 3 4 5 6

l

Relativna pokretljivostusporedba sastandardnim proteinimadaje mase podjedinica a ne nativnog proteina male greke, npr. glikoproteini


16/59

imbenici koji utjeu na SDS-PAGE gustoa gela

za proteine uglavnom 7-15%

umreenje (% bisakrilamida) za proteine 30% A, 0.8% BIS

za DNA 38% A, 2% BIS

stalni napon / stalna jakost struje

zagrijavanje stakla

koliina uzorka preoptereenje

istoa kemikalija i vode


17/59

Coomassie plavo

najea boja za proteine

u kiselim alkoholnimotopinama

os etl ivost do 0.1 /mm2

CH2

NH5C2

NC2H5

CH2

SO3--

O3S

R R

NH

OC2H5

R250: R=H

G250: R=CH3


18/59

Diskontinuirana elektroforeza znaajnopoboljava razluivanje SDS-PAGE


19/59

Sabijajui gel sabija proteine u tankuvrpcu i tako pridonosi razluivanju

Kontinuirana Diskontinuiranaelektroforeza elektroforeza


20/59

Princip diskontinuirane elektroforeze


21/59

SDS-PAGE

ena ur ra u adiskontinuirana


22/59

Elektroforeza nukleinskih kiselinaelektroforeza u agaroznom gelu

vodoravna elektroforeza

vrlo ista agaroza (bez nukleaza) razmjerno slaba rezolucija

identifikacija rekombinantnih plazmida,.

u poliakrilamidnom gelu vrlo dobra rezolucija

razlika od jednog nukleotida

kod sekvenciranja DNA

gelovi dugaki i do metar


23/59

Ekstrakcija proteina iz gela mehaniki

smrzavanje gela tekuim duikom, usitnjavanje u

tarioniku, centrifugiranje razmjerno slabo iskoritenje

elektroelucija

e stra c a prote na u e e tr nom po u razmjerno sloena oprema

dobro iskoritenje

centrifugiranjem specijalne kivetice za centrifugiranje

uglavnom za agarozne ili niskopostotnepoliakrilamidne gelove


24/59

Izoelektrino fokusiranje

razdvajanje proteina na osnovu njihoveizoelektrine toke (pI)

otopina amfolita smjesa oko 500 tvariamfolitnog karaktera (sintetiki polimerioli oamino i oli okarboksilnih kiselina

amfolitiu gelu

jepH

visok puferski kapacitet pH okolnogmedija = pI amfolita

proteini se rasporeuju kroz pHgradijent s obzirom na svoju pI

mogue razdvojiti proteine s razlikom

pI od 0.02 (pa i 0.001)

danas najee imobilizirani(komercijalno dostupni) gradijenti

smanje

stabilan pHgradijent

nakon primjeneelektrinog polja

doda se optopinaproteina i primjeni

elektrino polje

proteini surasporeeni

kroz pH gradijentovisno o njihovojpI


25/59

Stabilan pH gradijent

pri visokom pHprotein jenegativno nabijen

pri niskom pHprotein jepozitivno nabijen

prikazani protein ima pI 6.5


26/59

Izoelektrine toke nekih proteina

Protein pI

Pepsin


27/59

Primjena IEF u dijagnostici

IEF cerebrospinalne tekuine

detekcija oligoklonalnih imunoglobulina usporedba seruma i crebrospinalne tekuine na

prisutnost dodatnog proteina u uzorku likvora -

skleroza) mali volumen uzorka, uzorak nije potrebno ukoncentrirati

imunofiksacija nakon IEF

anti IgA, IgM, kappa, lambda


28/59

Primjena IEF u dijagnostici

IEF transferina

s obzirom na razinu sijalinizacije proteina

sijalinska kiselina negativni naboj 0-5 po proteinu

alkoholizam

uroeni poremeaji glikozilacije

apolipoprotein E ( VLDL) u hiperlipoproteinemiji

Arg-61 apoE

apoE


29/59

Dvodimenzionalna (2 D) elektroforezaIzoelektrino fokusiranje

Prva dimenzija

Izoelektrinofokusiranje

smanjenjepI

gel elektroforeza

gel za izoelektrino

fokusiranje stavljase na SDSpoliakrilamidni gel

Druga dimenzija

SDS-PAGE

smanjenjepI

smanjenje

Mr


30/59

Procjena molekulske mase proteina(SDS gel elektroforeza)

Nepoznatiprotein

Relativna pokretljivost

Mrstandard

nepoznatiprotein


31/59

Dvodimenzionalna (2 D) elektroforezaIzoelektrino fokusiranje

gel elektroforeza

prva dimenzija

Izoelektrinofokusiranje

smanjenjepI

druga dimenzija

SDS-PAGE

gel za izoelektrino

fokusiranje stavljase na SDSpoliakrilamidni gel

smanjenjepI

smanjenje

Mr

Vrlo veliko razluivanje!


32/59

2 D elektroforeza proteina E.colivizualizirano vie od 2000 proteina

(moe i do 5000)


33/59

2 D elektroforeza seruma


34/59

Analiza rezultata 2D elektroforeze

"Nedostaje ti jedan protein... A ne, ti ima jedan vika! "


35/59

za ozbiljan rad neophodna visokastandardizacija i raunalna obrada

Analiza rezultata 2D elektroforeze

usporedba rezultata s velikimbrojem gelova u bazi podataka


36/59

Teorijske Mr i pI proteina iz stanine

membrane plijesni


37/59

Vizualizacija proteina nakon elektroforeze

Nefluorescentne boje

Coomassie Brilliant Bluelimit detekcije ~ 1g proteinavarijabilnost zbog odbojavanja, pozadina

Koloidni Coomassie Brilliant Blue-Gpoveana osjetljivost ( ~20 ng proteina)

Bojanje srebromosjetljivost: 1-5 ng proteina


38/59

Fluorescentne boje (vea osjetljivost, ali skupe)

SYPRO Orange, Red (Molecular Probes) 4-8ng

SYPRO Ruby (Molecular Probes) ~1ngDeepPurple (GE Healthcare)


39/59

2-D diferencijalna elektroforeza (2D DIGE) unaprijed obiljeenih uzoraka

Unutranji standardobiljeen s Cy2

Ekstrakt roteina

2 D-PAGE

valna duljinaekscitacije

Cy2

valna duljina

analiza slike,kvantitacija

GE Healthcare

obiljeen s Cy3

Ekstrakt proteinaobiljeen s Cy5

ekscitacijeCy3

valna duljinaekscitacije

Cy5

boje bez utjecaja na pI,podjednake molekulske mase


40/59

Osobine 2D elektroforeze

mapa intaktnih proteina koja odraava promjene uekspresiji proteina, izoformama ili posttraslacijskim

modifikacijama proteini se razdvajaju na velikoj povrini to im

omoguava dobru rezoluciju

razdvajanje vie od 5000 proteina istovremeno (~2000rutinski)

moe razdvojiti proteine ije se pI razlikuju za 0.001

detekcija i kvantifikacija


41/59

Identifikacija proteinaWestern blot

razgradnja

izrezivanje/elucija iz gela

Edmanova odgradnja

specifinoprotutijelo

imunodetekcija

MALDI-MS analiza AK Edmanova razgradnja

N-terminalna

izrezivanje/elucija iz gela

2D gel membrana

N-terminalnosekvenciranje

proteina

sekvenca

PSD-MALDI

MS/MSHPLC/CE MALDI ESI-MS

Identifikacija pomou baze podataka

AK slijed frakcionirani peptidi masa peptida

AK slijed


42/59

Identifikacija proteina (MALDI-TOF)

izrezivanje proteina razgradnja proteina

nanoenje na MALDI chipproiavanje proteina

proteaza

MALDI-TOF analiza


43/59

Pretraivanje baze podataka za dobivene

mase peptida rezultati svih teorijskih digestija proteina

specifinim enzimom u bazi podataka

usporedba teorijskih masa s eksperimentalnoo ven m masama

podudaranje peptida/proteina

l k f k


44/59

1. Izoelektrino fokusiranje

(trake)

Trake od 11 cm:

pH 4-7

pH 3-10

Trake od 7 cm, 13 cm i18 cm:

pH 4-7

pH 3-10 pH 6-11

2 I l k i f k i j


45/59


nanoenje uzorka

imobilizirani pH gradijent

4 I l k i f k i j


46/59


elektroforeza

2D l k f b


47/59

2D elektroforeza potrebna oprema

Analiza 2D gelova

K il l k f


48/59

Kapilarna elektroforeza

klasina elektroforeza: 100-500 V (IEF 1000-3500V)

vei napon bolje razdvajanje, ali i veaJouleova toplina (topljenje gela, denaturacija i kaotinokretanje proteina, zaobljena fronta kretanja)

U kapilari je mogue!

K il l k f


49/59

Kapilarna elektroforeza

elektroforetsko putovanje kroz usku kapilaru punjenupuferom ili gelom uz visoki napon (20-30kV)

kapilara promjera 25-100 m duina najee 25-60 cm

mali promjer i debeli silika zid pomau smanjenju Joulovog zagrijavanja uslijedvisokog napona

silika sloj

poliimid

El kt t ki t k


50/59

Elektroosmotski tok

electroosmotic flow= EOF

vEF = EF E vEOF = EOF E -elektroforetska mobilnost

E -jaina elektrinog polja

stvarna brzina = elektroforetska brzina +brzina elektroosmotskog toka

vstvarna = vEF + vEOF = (EF + EOF) E

Ui k l kt t k t k


51/59

+

-

anoda (+) katoda (-)

EOF

Uinak elektroosmotskog toka

A)

ukupni +

ukupni -

anoda (+) katoda (-)

Kada je elektroosmotski tok

jaiod elektroforetskog toka aniona

Kapilarna elektroforeza detekcija


52/59

Kapilarna elektroforeza - detekcija

Detektor

UV/VIS

najei

proirenje veaosjetljivost, manja rezolucija

fluorescentni

obiljeene molekule radiometrijski

(radioaktivnost)

masena spektroskopija

identifikacija komponenti

kompjutorska analiza igrafika prezentacija

vrijeme

Osobine kapilarne elektroforeze


53/59

relativno jednostavna aparatura

traje svega nekoliko minuta

izrazito visoko razluivanje

automatizacija metode

Osobine kapilarne elektroforeze

- -

elektroferogram vrlo mali kapacitet (1 10 nl)

relativno jeftina (


54/59

Primjene kapilarne elektroforeze analiza ugljikohidrata

monosaharidni sastav

analiza proteina

glikoforme transferina eritropoetin u doping kontroli (razlikovanje rekombinantnog i humanog

proteina s obzirom na glikozilaciju sijalinizaciju)

identifikaci a roteina serumski proteini monoklonski imunoglobulini

Bence-Jones protein

hemoglobinhemoglobinopatije

analiza DNA odreivanje slijeda nukleotida i genotipizacija

inorganski anioni/metalnih iona neuobiajeni metaboliti u urinu metabolike bolesti

Elektroforeza u pulsirajuem polju


55/59

Elektroforeza u pulsirajuem polju

pulsed field electrophoresis

za razdvajanje velikih DNA molekula(itavih kromosoma)

molekule vee od 20 kb inae putujuzajedno (jedna difuzna vrpca)

Vrijeme elektroforeze:


56/59

18-20 satielektrode

elektrino polje mijenja smjer male molekule se brzo preorjentiraju, velike puno sporije

Prednosti elektroforeze u pulsirajuem


57/59

podigla granicu analize DNA s veliine 30-50 kb na

preko 10 000 kb

bakterijski fingerprint bakterije iz uzorka pacijenta

Prednosti elektroforeze u pulsirajuem

polju

. , , -

postojeim bazama podataka) genotipizacija

...,ali dugotrajan postupak

Izotahoforeza


58/59

Izotahoforeza selektivna separacija i koncentracija ionskih analita

diskontinuirajui puferski sustav

uzorak se nanosi izmeu brzog vodeeg elektrolitai sporog terminirajueg elektrolita

analit posjeduje ionsku mobilnost veu odterminirajue, a manju od vodee

molekule analita u sporom elektrolitu e putovatibre od njegovih iona, a u vodeem sporije odnjegovih pa e se formirati otra vrpca izmeu dva

elektrolita (analit se nae u sendviu)

analiti se razdvajaju ovisno o mobilnosti

Izotahoforeza


59/59

Izotahoforeza

elektroforetske metode

Documents