elektroforeza ii

1/14/2015

1

Elektroforeza

II

dr Mara Aleksić, vanr. prof.

• IEF - koristi se za razdvajanje proteina na osnovu njihovih različitih

izoelektričnih tački pI

Izoelektrično fokusiranje

pI je pH vrednost na kojoj je količina + i – naelektrisanja na čestici jednaka,

čestica je neutralna i ne kreće se u elektročnom polju

GEL SA STABILNIM pH GRADIJENTOM

Gelu se dodaje smeša od 50-100 amfolita nosača

Amfolit nosač je sintetički polimer oligoamino – i oligokarboksilnih kiselina.

Određen broj amino i karboksilnih grupa određuje pI svakog amfolita nosača.

U električnom polju amfolit se kreće ka odgovarajućoj elektrodi i zaustavlja na pH=pI

1/14/2015

2

Izoelektrično fokusiranje

RAZDVAJANJE PROTEINA

1. U gel sa stabilnim pH gradijentom unosi se smeša proteina. U zavisnosti od

znaka i količine naelektrisanja koje nose, proteini se kreću ka odgovarajućoj

elektrodi.

2. Kretanjem kroz gel prolaze kroz sredine različitih pH i tada dolazi do

promene u naelektrisanju grupa. Kada se protein nađe u sredini gde je pH=pI,

neto naelektrisanje je 0, µ=0, protein se zaustavlja.

1.

2.

Dvodimenzionalna elektroforeza

Koristi se za analizu smeše velikog broja komponenata.

Kombinacija dve jednodimenzionalne tehnike.

Vektori spoljašnjeg električnog polja su međusobno normalni.

Najčešće korišćena kombnacija je IEF i SDS-page:

Prvo se komponente smeše razdvoje u gradijentu pH prema svojim

izoelektričnim tačkama, tj. naelektrisanju.

Zatim se u pravcu normalnom na pravac prvobitnog električnog polja

vrši SDS-PAGE razdvajanje prema relativnim molekulskim masama.

1 2

1

2

1/14/2015

3


Važno je obezbediti dobro prijanjanje gelova

kada se prelazi u drugu dimenziju


Koristi se za detaljno razdvajanje složenih proteinskih smeša

i za procenu čistoće proteina

1/14/2015

4

IZOTAHOFOREZA

Iso - jednako

Tachos - brzina

Phoresis - migracija

Razdvajanje pri jednakim brzinama

Elektroforeza sa diskontinuiranim sistemom elektrolita:

Dva pufera

Tris-HCl pufer

Cl- jon

velika pokretljivost

vodeći jon

(“leading” jon L)

Tris-glicin pufer

glicinatni jon

mala pokretljivost

zaostajući - krajnji jon

(“trailing” jon T)

Konvencionalne

elektroforetske tehnike Izotahoforeza

- jedan pufer

- jedna vrsta jona provodi struju

- jačina električnog polja je ista

u svim delovima

- zone se kreću različitim brzinama

koje su proporcionalne pokretljivosti

- dva pufera

- više vrsta jona provodi struju

- jačina električnog polja

nije konstantna u svim delovima

- zone se kreću istim brzinama

iako su im pokretljivosti različite

EvE

v

Kada se primeni spoljašnji potencijal:

Slabo električno polje nastaje u oblasti vodećeg L jona

jer je njegova pokretljivost velika.

Jako električno polje nastaje u oblasti zaostajućeg T jona

jer je njegova pokretljivost mala.

IZOTAHOFOREZA

1/14/2015

5

IZOTAHOFOREZA

Pre

unošenja

uzorka

t=0

U sistem se unosi

smeša dve

negativno

naelektrisane

komponente S1 i S2

1S2S

T1S2SL

U električnom polju svi anjoni kreću ka anodi i obrazuju zone

srazmerno svojim pokretljivostima

Sve zone putuju istom brzinom koja je jednaka brzini najbržeg vodećeg jona L.

Struju provode i joni uzorka.

Zone su u direktnom kontaktu.

1/14/2015

6

Ev Brzine kretanja jona su iste

Pokretljivosti jona su različite

U svakoj zoni je različita jačina električnog polja

GRADIJENT ELEKTRIČNOG POLJA

Disk-gel elektroforeza

DISKONTINUALNA podloga

DISKONTINUALNI puferski sistem

Zone u obliku DISKA

Podloga: 3 različita poliakrilamidna gela

sa porama različite veličine

Puferski sistem: 2 pufera različitih pH i I

1/14/2015

7


Podloga

poliakrilamidni gel sastavljen od tri gela 1. Gel sa uzorkom (sample gel)

2. Gel za koncentrovanje (stacking gel)

- velika poroznost (mala konc.

akrilamida 3-5%)

- Tris-HCl pufer, pH 6,9 mala jonska

jačina

3. Gel za razdvajanje (resolving,

separating gel)

- mala poroznost (velika konc.

akrilamida 8-20%)

- Tris-HCl pufer, pH 8 - 9 velika jonska

jačina Puferski sistemi:

•Tris-HCl, pH 6,9 (u gelu za koncentrovanje) i

pH 8-9 (u gelu za razdvajanje)

•Tris-glicin, pH 8,3 (u rezervoarima pufera)


Na početku, Cl¯ joni

(zeleni) su u gelu, a

glicinski anjoni

(narandžasti) u

rezervoarima (pH 8,3)

Proteini koji se razdvajaju

imaju pokretljivost između

vodećeg Cl¯ i zaostajućeg

glicinskog jona – nalaze

se u “sendviču” (plavo).

Proteini se koncentrišu u

gelu za koncentrovanje u

uskim zonama na osnovu

razlike u naelektrisanju.

Kada proteini dođu u

gel za razdvajanje,

pokretljivost glicina

raste (pH 8-9)

Zbog male poroznosti

proteini zaostaju, a Cl¯

i glicinski anjoni

nastavljaju ka anodi.

Proteini se razdvajaju

na osnovu razlike u

veličini.

pH 8-9

pH 6,9

pH 8,3

pH 8,3

1/14/2015

8

Prenos makromolekula na membranu

BLOTING

• Za dalju analizu makromolekula razdvojenih

elektroforezom potrebno ih je odvojiti od podloge – gela

• BLOTTING tehnika (engl. blot – mrlja)

• Makromolekuli se sa gela prebacuju na membranu od

nitroceluloze ili polivinilfluorida

BLOTING

KAPILARNI BLOTING

• Pufer iz rezervoara

kapilarno prolazi kroz gel,

pa kroz membranu noseći

makromolekule.

• Spor proces (24 h)

• Brzina se može povećati

vakuum blotingom

ELEKTROBLOTING

• Ponovljena elektroforeza:

posle klasičnog razdvajanja

gel se prekrije membranom i

ponovi se proces

elektroforeze.

• Efikasniji proces

1/14/2015

9

KAPILARNI BLOTING

ELEKTROBLOTING

Kada se uključi struja počinje elektroforeza

makromolekuli sa gela prelaze na nitroceluloznu membranu

1/14/2015

10

DNK – Southern blotting

(1975 prof. Southern, engl. south - jug)

RNK – Northern blotting (engl. north - sever)

Proteini – Western blotting (engl. west - zapad)

BLOTING

Proteini – Western blotting

Proteini koji su razdvojeni

SDS gel eleltroforezom

elektroblotingom se

prebacuju sa

poliakrilamidnog gela na

nitroceluloznu membranu.

Sa gornje i donje strane se

nalazi bloting papir čija je

uloga da pokupi višak

tečnosti.

1/14/2015

11


A) Blokiranje nespecifičnih veznih mesta za

ligand na membrani (albumin seruma

gobečeta, mleko u prahu)

B) Membrana se izlaže primarnom antitelu

koje prepoznaje određeni protein i vezuje

se za njega.

Membrana se ispira puferom i oslobađa

nevezanog antitela.

C) Membrana se izlaže sekundarnom

antitelu (za koje je vezan enzim) koje

prepoznaje primarnon antitelo i vezuje se

za njega.

D) Detekcija: dodaje se supstrat koji reaguje

sa enzimom i daje obojene ili

luminiscentne proizvode.

Intenzitet boje srazmeran je količini proteina

Uvećano na

sledećem

slajdu


1/14/2015

12

KAPILARNA

ELEKTROFOREZA CE

Izvor visokog napona

5-50kV (kod klasične elektroforeze 0,1-0,5 kV)

Razdvajanje se izvodi u

kapilari malog prečnika

(prečnik 10–100 m

dužina 10-100cm)

(kod klasične elektroforeze u kadici)

Kapilara

- punjena puferom (“free solution CE”)

- punjena gelom (“capillary gelelectrophoresis”)

VEĆI NAPON BOLJE RAZDVAJANJE, ali i velika Joulova toplota.

U uskoj kapilari toplota se efikasno rasipa i ne predstavlja problem kao

kod klasične elektroforeze.

Shema aparata za CE

1/14/2015

13

Unutrašnja površina kapilare sadrži

slabo kisele silanolne grupe SiOH

koje disosuju na pH>3 (SiO)

Za negativnu površinu kapilare

vezuju se hidratisani pozitivni joni.

Stvara se dvostruki električni sloj

ELEKTROOSMOTSKI TOK

EOF “electroosmotic flow”

Elektroosmotski tok prema katodi

Ev efef

Ev eofeof eofoeftot vvv

Posledice EOF kod kapilarne elektroforeze:

- Nenaelektrisani molekuli se kreću u električnom polju!

- Anjoni se kreću ka katodi!

ELEKTROOSMOTSKI TOK

EOF “electroosmotic flow”

1/14/2015

14

KAPILARNA ELEKTROFOREZA –

DETEKCIJA NA KAPILARI “on line”

Deo kapilare je ogoljen (“prozor”)

kroz njega prolazi svetlosni zrak sa lampe.

Komponenta koja prolazi kroz taj deo kapilare apsorbuje

svetlost, što registrije detektor.

UV VIS spektrofotometar

Fluorimetar

Maseni spektrometar! CE-MS

• Bolje razdvajanje

• Kraće vreme razdvajanja (nekoliko minuta, čak

u nekim slučajevima nekoliko sekundi)

• Veoma male količine uzorka (nL = 10-9L)

• Može se povezati sa masenim

spektrometrom

PREDNOST CE NAD DRUGIM ELEKTROFORETSKIM TEHNIKAMA

1/14/2015

15

CE sa masenim spektrometrom

UREĐAJ ZA KAPILARNU ELEKTROFOREZU

1/14/2015

16

Razdvajanje komponenata smeše

Kvalitativna i kvantitativna analiza lekova u svim vrstama

farmaceutskih formulacija

Određivanje čistoće lekova (primese, nečistoće)

Određivanje droga, peptidnih lekova, enantiomera

Analiza lekova i njihovih metabolita u biološkom

tečnostima

Određivanje supstanci iz metabolizma (vitamini, proteini,

bilirubin...)

PRIMENA CE

Primena elektroforeze u

kliničkoj hemiji

• Kvantitativna analiza proteina seruma

• Identifikacija i kvantifikacija hemoglobina

• Razdvajanje i određivanje klasa lipoproteina

• Razdvajanje i kvantifikacija enzima

• Određivanje specifičnih klasa imunoglobulina

• ....

elektroforeza ii

Documents