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Protocolos – Sandro R. Valentini
ELETROFORESE DE PROTEÍNAS EM GEL DE
POLIACRILAMIDA - SDS (SDS-PAGE)
- Misturar as amostras protéicas com tampão de amostra q.s.p. 1X (loading buffer-
2X). Ferver as amostras 96oC por 5 minutos.
- Montar as placas – Mini protean III- Bio Rad.
- Preparar o gel de resolução (tabela 18.3 – Maniatis).
- Aplicar o gel de resolução no aparato até o nível desejado (no mínimo 0,5 cm
abaixo do pente). Aplicar água Milli-Q para nivelar o gel.
- Após polimerização, retirar a água e secar com papel de filtro.
- Aplicar o gel de empacotamento (tabela 18.4 – Maniatis) e inserir o pente.
- Montar o aparato de eletroforese contendo o tampão de corrida.
- Realizar eletroforese (100 V a 200 V).
- A seguir, o gel pode ser submetido ao ensaio de western blot ou corado com
coomassie blue por 30 minutos a temperatura ambiente seguido de tratamento
com o descorante.
- Após coloração por coomassie blue, acondicionar o gel no "bastidor" entre duas
folhas de papel celofane umidecidas em água. Manter a temperatura ambiente
até secagem do gel.
SOLUÇÕES:
• Tampão de Amostra 2X (Loading buffer-2X)
Tris/HCl pH 6,8 100mM
SDS 4,0%
Azul de bromofenol 0,2%
Glicerol 20,0%
Antes do uso, adicionar dithiotreitol q.s.p. 200mM (estoque: 1 M armazenado a –20 oC)
• Tampão de corrida 10X
Tris 250mM
glicina pH 8,3 2,5M
SDS 1%
• Corante coomassie blue (1L) • Descorante (1L)
Coomassie blue 2,5g Metanol 450mL
Metanol 450mL Ácido acético glacial 100mL
Ácido acético glacial 100mL Água Milli-Q 450mL
Água Milli-Q 450mL
Protocolos – Sandro R. Valentini