Determinación Experimental de Estructuras de Proteínas

Universitat de València - Grado en Bioqímica y Ciencias Biomédicas Estructura de Macromoléculas y Enzimología

P1 - Representación y Análisis de Estructuras de Proteínas

Actualizado: 10/03/2017 17:40:41

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Introducción

Bases de Datos de Información EstructuralEn la actualidad se conocen con detalle atómico más de130,000 estructuras tridimensionales (3D) demacomoléculas biológicas, la mayoría de ellasproteínas. Estas estructuras han sido determinadasexperimentalmente, utilizando métodos como Difracciónde Rayos-X (~90% de los casos), Resonancia magnética Nuclear(RMN) (~9% de los casos), y en menor medida (~1%),Microscopía Electrónica y otras técnicas de difracción.

Toda esta enorme información estructural estádisponible de forma libre para la enseñanza, lainvestigación, la sanidad o la industria. Para sudifusión y su uso se utiliza un formato especial(formato pdb), en el cual se escribe la estructurade cada proteína en un fichero de texto y se leasigna un código propio de identificación (pdb-ID). Todos losficheros de estructuras se depositan y organizan enun archivo accesible sin restricciones a través deInternet.

El archivo de estructuras 3D de bio-macromoléculas esúnico. Por razones históricas recibe el nombre deProtein Data Bank (PDB). A nivel mundial esgestionado a través del Consorcio wwPDB, formadopor cuatro miembros: dos en USA (RCSB PDB y BMRB),uno en Europa (PDBe) y uno en Japón (PDBj). Cada unode ellos organiza el deposito de nuevas estructuras,a la vez que mantiene una copia completa yactualizada del archivo, a través de las bases de datos RCSB PDB, PDBe y PDBj.

Las bases de datos facilitan el acceso a la información estructural a través de herramientas debúsqueda. Además, proporcionan información estadística sobre el contenido del archivo e información bibliográficasobre cada registro, y complementan la información estructural depositada por los autores con unaamplia gama de datos obtenidos a partir del análisis de las estructuras, tales como:

Modelos gráficos de estructuras terciaria y cuaternaria.Evaluación de la calidad de las estructuras.Esquemas de estructura primaria y secundaria.Localización de dominios.Estudio de ligandos y sitios de unión.Vínculos a entradas de la misma molécula en otras bases de datos (de secuencias, declasificación estructural, de función, etc.).

Representación y Análisis de EstructurasLas estructuras de moleculares corresponden a la escala nanométrica, por lo que no pueden ser observadasdirectamente con resolución atómica. Por ello, para su estudio se llevan a cabo representaciones gráficas apartir de los ficheros de coordenadas atómicas experimentales y con ayuda de programas informáticos.Dichas representaciones computacionales son modelos moleculares tridimensionales que pueden ser rotados,anotados y re-escalados y que en muchos casos permiten el cálculo de propiedades moleculares.

Existe una gran variedad de programas informáticos adecualdos para llevar a cabo representacionesgráficas de macromoléculas biológicas. En general, pueden clasificarse en:

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1. Programas de visualización molecular. Permiten una exploración rápida de la molécula a través dedistintos modos de ilustración. Se integran fácilmente en sitios web, aunque su capacidadgráfica y de análisis molecular es muy limitada. Dos ejemplos de uso muy extendido sonJmol y RasMol.

2. Programas de análisis y modelización molecular. Permiten una visualización acoplada a herramientas demodelización y análisis de la estructura. DeepView - SwissPdbViewer es de los más sencillosdentro de este grupo, aunque incorpora herramientas de alineamiento estructural de variasmoléculas, sustitución de residuos, búsqueda de cavidades y detección de contactos. Otroscasos, como PyMol, MolMol y VMD presentan una alta calidad gráfica y multiplesposibilidades de análisis que además pueden expandirse mediante el uso de scripts yplugins.

Resumen del Desarrollo de la PrácticaEn la Parte 1, "visitaremos" una de las bases de datos del consorcio wwPDB y revisaremos brevementeel tipo de información general que proporciona. Tomaremos después algunos ejemplos de proteínasconcretas y analizaremos la información que se encuentra sobre ellas directamente en la base dedatos. Estudiaremos además las características de sus ficheros estructurales en formatos PDB y FASTA.

En la Parte 2, llevaremos a cabo representaciones de una estructura elegida de la base de datos,utilizando su fichero DPB y con la ayuda de un programa avanzado de análisis molecular. Visualizaremosla molécula con detalle atómico a través de diversos modelos. Paralelamente, llevaremos a cabo unestudio de algunos detalles de la estructura de la molécula, como la determinación de distanciasentre átomos, la búsqueda de interacciones específicas, la caracterización de sitios de unión deligandos y la comparación entre dos formas estructurales de la misma molécula.

Objetivos

1. Conocer las principales bases de datos de estructuras tridimensionales de macromoléculasbiológicas.

2. Llevar a cabo búsquedas y acceder a información estructural concreta.

3. Conocer en qué consiste la información estructural depositada en las bases de datos, así comolas características de los formatos de fichero estructural más comunes.

4. Llevar a cabo representaciones de modelos moleculares a partir de datos estructuralesobtenidos de la base de datos.

5. Visualizar y analizar con detalle la estructura de una proteína.

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J. Salgado - 2016, Universitat de València

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Protein Data Bank, en www.rcsb.org

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Actualizado: 10/03/2017 17:41:26

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INSTRUCCIONES

El texto que sigue es un guión de la práctica. Anota las respuestas a las preguntas, ya que deberásincluir algunas de ellas en el formulario de resultados. Es obligatorio entregar ese formulario completo através de Aula Virtual.

Parte 1

Bases de Datos del wwPDBComo ya se ha descrito en la introducción, el wwPDBmantiene un repositorio único de estructuras deproteínas determinadas experimentalmente que puedeconsultarse a través de distintos puntos de acceso.Vamos a utilizar el gestionado por RCSB (ResearchCollaboratory for Structural Bioinformatics), cuya base de datosse denomina RCSB PDB.

Ejercicio 1:

Vista general del archivo

Accede a RCSB PDB y revisa su contenido.

En la página inicial encontrarás un campo pararealizar búsquedas y el cuadro principal condistintos tabuladores (con opciones que también puedesencontrar en el menú superior).

Los apartados Welcome y Learn contienen informacióngeneral, divulgativa y educativa. Los apartadosDeposit y Analyze son utilizados por usuariosavanzados. Permiten insertar estructuras de nuevasmoléculas, analizar su calidad o comparar estructuras de distintas moléculas. En el apartado Searchpodemos navegar a través del archivo y localizar estructuras individuales o por tipos. Por último,en el apartado Visualize encontraremos herramientas sencillas para crear y observar modelos gráficosde estructuras.

¿Qué tengo que hacer?

Para iniciarte, revisa brevemente la información disponible en la base de datos. Por ejemplo, através de Search averigua:

1. ¿Cuáles son los organismos cuyas moléculas se encuentran más representadas en la base de datos?2. ¿Qué métodos experimentales se han utilizado para determinar las estructuras de la base de datos?3. A pesar del nombre de la base de datos, no todas las estructuras depositadas en ella son proteínas.

¿Qué tipos de moléculas (polímeros) hay en la base de datos?

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Ejercicio 2:

Búsqueda de estructuras de una proteína concreta: Mioglobina

A cada estructura depositada en la base de datos se le asigna un código de 4 dígitos (PDB-ID). Si quieresacceder al registro correspondiente a una estructura determinada puedes usar su PDB-ID e introducirlo enla herramienta de búsqueda de la parte superior.

Si desconoces ese código para la estructura que te interesa, puedes buscarla utilizando el nombre dela molécula, su función, el nombre del autor de la estructura, etc.

Por ejemplo, la primera estructura de proteína en ser "descubierta" fue la de la mioglobina de cachalote,determinada experimentalmente por H.C. Watson y J.C. Kendrew a finales de la década de los 60 (del siglopasado). Esta estructura inauguró en 1976, junto a otras 12 de distintas proteínas, la primera versión del Protein Data Bank.

¿Qué tengo que hacer?

Localiza todas las estructuras de mioglobina que existen en la base de datos

Como verás, a día de hoy en la base de datos existen muchas estructuras de mioglobinas.Corresponden a diversos organismos, variantes con distintos ligandos, versiones mutantes, estudiosllevados a cabo con distintos métodos, etc. Averigua:

1. ¿Cuántas estructuras de mioglobinas existen en la base de datos? ¿Cuál es la más reciente? ¿Cuál es suPDB-ID?

2. Encuentra la primera estructura de mioglobina en ser descubierta (la original de Watson y Kendrew). ¿Cuál essu PDB-ID? ¿En qué año fue resuelta esa estructura? ¿En qué revista, en qué año y por qué autor o autoresfue publicada esa estructura?

3. ¿Qué aporta la última estructura resuelta de mioglobina con respecto a las anteriores?4. Compara la calidad de la última estructura de mioglobina resuelta con respecto a la primera (mioglobina

de Kendrew)

Ejercicio 3:

Ficheros de datos estructurales y su representación

La estructura de cualquiera de las moléculas incluidas en la base de datos se escribe en ficheros detexto con formatos especiales. Cuando accedemos a cualquier registro concreto, sus ficherosestructurales se encuentran en el apartado "Display Files".

El primero de los ficheros disponibles corresponde tan solo a la estructura primaria (secuencia de residuos deaminoácido), que aparece escrita en formato FASTA. Después se encuentran varios tipos de fichero deestructura tridimensional, que entre otra información contienen las coordenadas espaciales o Cartesianas{x,y,z} de los átomos de la molécula. Por lo general se incluyen solo las coordenadas de los átomospesados (C, O, N, S, P u otros, si los hay, pero no H). El formato de estructura 3D más intuitivo y másutilizado recibe el nombre de formato "PDB".

En los ficheros PDB suele haber una primera parte, denominada HEADER con información complementaria acercadel origen de la proteína, el método usado para la determinación estructural, la calidad de laestructura, la secuencia de residuos, la estructura secundaria, etc. La estructura 3D como tal seencuentra a continuación y corresponde a todas las líneas que comienzan por ATOM. Si existen gruposquímicos no proteicos en la molécula, su estructura se escribe en las lineas que comienzan por HETATM. Enambos casos, cada linea se organiza en columnas que contienen el número de orden del átomo, su nombre,elnombre y orden de secuencia del residuo correspondiente a dicho átomo y las tres coordenadas cartesianas que dictan laposición espacial puntual de ese átomo. Después de estos valores se encuentran normalmente dos más, con elnúmero de ocupación (frecuencia de esa posición espacial entre varias conformaciones posibles) y elfactor "B" de temperatura (desplazamiento de la posición del átomo con respecto a un valor medio). Estosdos últimos números son una medida de la flexibilidad de la molécula en el punto correspondiente alátomo considerado.

¿Qué tengo que hacer?

Busca de nuevo la primera estructura resuelta de mioglobina y revisa sus ficheros FASTA y PDB. Averigua:

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1. ¿Qué tipo de código se utiliza para definir la secuencia de residuos en el formato FASTA?2. ¿De qué manera se indican los comentarios en este formato?3. De acuerdo con la información presente en el fichero PDB, ¿cuál es el origen biológico de la mioglobina

correspondiente a esa estructura?4. ¿A qué moléculas o grupos químicos corresponden los átomos no proteicos presentes en la estructura?

A continuación representaremos y analizaremos esta última estructura. Descarga su fichero pdb.Trabajaremos con él en la Parte 2.

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INSTRUCCIONES

El texto que sigue es un guión de la práctica. Anota las respuestas a las preguntas, ya que deberásincluir algunas de ellas en el formulario de resultados. Es obligatorio entregar ese formulario completo através de Aula Virtual.

Parte 2

Representación y Análisis de la Estructura de la MioglobinaComo se ha explicado en la Introducción, paravisualizar y analizar estructuras se utilizanprogramas informáticos de modelado molecular. Aunque esposible obtener representaciones de laestructura a través de herramientas presentesen el sitio web de la propia base de datos, suscapacidades son muy limitadas. Por ello, enesta práctica utilizaremos el programa VMD(Visual Molecular Dynamics), desarrollado en laUniversidad de Illinois y disponible en código abiertoy de forma libre. Puedes encontrar un manual deVMD en este enlace.

A continuación vamos a representar y analizar laestructura de la Mioglobina con ligando OHunido (ver Parte 1, Ejercicio 3).

Ejercicio 1

Análisis de Estructura Secundaria

Abre el fichero PDB correspondiente a laestructura elegida utilizando VMD. Obtendrásinicialmente una representación por defecto.

Prueba distintas formas de visualización através de las opciones que aparecen en Graphics-->Representations. Debemos crear representaciones claras, teniendo en cuenta aquello que queremosobservar o analizar. Para ello, se pueden combinar múltiples tipos de representación, de toda lamolécula o de partes de ella, utilizando adecuadamente las reglas de selección para cadenas, residuos, etc.

Por ejemplo, podemos crear una representación esquemática en la que se muestre la cadena principal peptídica ylos elementos de estructura secundaria.

En la ventana de Representaciones (Graphics -->Representations)...

Para representar esquemáticamente la cadena proteica...

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En el campo Selected Atoms introduce proteinEn el campo Coloring Method selecciona Secondary StructureEn el campo Drawing Method selecciona Cartoon

Por otro lado, la estructura secundaria puede analizarse a través de un diagrama de Ramachandran.

Los comandos especiales de análisis se encuentran en el menú de "Extensions"

Extensions -->Analysis -->Ramachandran Plot En la nueva ventana, selecciona el número de Molecule. Cada punto en el diagrama corresponde aun residuo.

¿Qué tengo que hacer?

Crea una representación esquemática en la que se muestre la cadena principal peptídica y loselementos de estructura secundaria.

A continuación, obtenemos el diagrama de Ramachandran para esta molécula

1. De acuerdo con la representación esquemática "cartoon", ¿qué tipos de estructura secundaria se observanen la mioglobina?

2. ¿Cuáles son los tipos de estructura secundaria presentes según el diagrama de Ramachandran?3. ¿Existen en el diagrama de Ramachandran residuos en regiones prohibidas? ¿Qué tipo de residuos son?

Ejercicio 2

Representación del complejo mioglobina-OH

Ahora representaremos con detalle el grupo hemo y el ligando CO, así como las histidinas proximal y distal.Utiliza como ayuda los consejos que aparecen en el cuadro siguiente:

Combina distintas representaciones cada vez que necesites un estilo diferente.

Inicialmente partimos de la representación esquemática (cartoon) que ya hemos creado en elEjercicio 1. Sobre ella superponemos tantas otras como sea necesario.

En la ventana de Representaciones (Graphics -->Representations)...crea representaciones nuevas (Create Rep)

Ahora, para representar el grupo hemo o el OH...

Averigua su denominación como "residuo": Selections ->Keyword ->ResnameEn el campo Selected Atoms introduce resname, seguido de la denominación que correspondaEn el campo Coloring Method selecciona TypeEn el campo Drawing Method selecciona Licorice

Para resaltar determinados residuos

Localiza tu residuo de interés: Extensions ->Analysis ->Sequence ViewerAl abrirlo se crea una nueva "representación". Si seleccionamos cualquier residuo en elsequence viewer, el número de identificación del residuo (resid, seguido del número quecorresponda) pasa directamente al campo "Selected Atoms" de la representación. Paralelamente,el residuo seleccionado aparece resaltado en la pantalla principal. Ajusta en esarepresentación las propiedades de Coloring Method y Drawing Method según tu preferencia

Para representar átomos próximos a otro átomo

Por ejemplo, vamos a resaltar todos los átomos de la proteína que se encuentren al menos a 4Angstroms de distancia del catión hierroEn el campo Selected Atoms introduce protein, seguido and within 4 of name FE¿Sabrias usar esta estrategia para encontrar las histidinas proximal y distal?¿Y para averiguar si en el sitio de unión del grupo hemo predominan residuos polares o hidrofóbicos?

Para exportar una imagen de la estructura

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Orienta adecuadamente la molécula y ajusta su tamaño dependiendeo de lo que quieras resaltar.Crea un fichero de imagen con: File ->Render ->Start Rendering

¿Qué tengo que hacer?

Crea representaciones que te sirvan para conocer de qué tipo son los residuos que conforman elsitio de unión del grupo hemo

Solapa nuevas representaciones y ajústalas hasta mostrar con claridad una imagen sencilla de lamioglobina con detalles del grupo hemo, el Fe2+, el ligando OH unido y las histidinas distal yproximal

1. ¿Cuál es la numeración de residuo de las histidinas distal y proximal?

Resultado para entregar: Busca una orientación adecuada de la molécula y crea una imagen. Inserta ydescribe la imagen en el formulario de resultados. El texto que acompañe a la imagen debe contenerinformación breve sobre el origen de la estructura (pdb-ID, método de determinación estructural,autores y referencia de la publicación). También debe describir el tipo de información estructuralhas destacado en la imagen.

Ejercicio 3

Medida de Distancias, Ángulos y Superficies

Puedes determinar las dimensiones de la molécula de forma aproximada introduciendo una rejilla(Extensions-->Visualization-->Ruler). Puedes medir fácilmente distancias entre cualquier par de átomosy ángulos entre cualquier par de vectores (o enlaces). También puedes marcar átomos concretos. Paraello utiliza el ratón y las opciones que aparecen en el menú principal bajo Mouse-->Label).

Para un análisis más detallado utilizamos comandos introducidos a través de una consola (Extensions -->Tk Console). La distancia entre dos átomos se determina mediante el comando measure bond, el ánguloentre dos vectores mediante measure angle y el area accesible al solvente (sasa) mediante measure sasa, peroantes debemos crear las selecciones de átomos adecuadas, sobre las cuales aplicamos los comandos.

Por ejemplo:

Cálculo de la distancia entre el Fe2+ y el átomo NE2 del residuo 93:

Averiguamos la numeración de los dos átomos ("atomid"):

set sel [atomselect 0 "element Fe or (resid 93 and type NE2)"]$sel get index, tomamos nota de los atomid

Calculamos la distamcia entre los dos átomos:

measure bond {atomid1 atomid2}

Cálculo de la superficie accesible de la apo-mioglobina

measure sasa 1.4 [atomselect 0 "protein"]

Cálculo de la superficie accesible de la holo-mioglobina

measure sasa 1.4 [atomselect 0 "protein or (resname HEM)"]

Cálculo de la superficie accesible del complejo mioglobina-OH

measure sasa 1.4 [atomselect 0 "protein or (resname HEM OH)"]

¿Qué tengo que hacer?

1. Compara las distancias entre el Fe2+ y el átomo NE2 de las histidinas distal y proximal.2. ¿Cómo es el sitio de unión del grupo hemo en la Mioglobina? ¿Es superficial o se encuentra en una hendidura

profunda de la proteína? Averígualo comparando las superficies accesibles de la apomioglobina(mioglobina sin grupo hemo) y la holomioglobina (mioglobina con hemo unido). NOTA: Si el sito de

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unión se encuentra en una hendidura, el área de la apomioglobina será menor que el área de laholomioglobina.

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