emoglobina (hb) costituisce il 90% delle proteine del globulo rosso (ca. 300 milioni di molecole per...
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Emoglobina (Hb)Costituisce il 90% delle proteine del globulo
rosso (ca. 300 milioni di molecole per cellula)
E’ un trasportare di O2: si lega a questo elemento quando si trova nei polmoni (o nelle lacune di Wolff del sacco vitellino o
nella placenta) o lo rilascia nei tessuti
Grazie all’Hb il sangue è in grado di trasportare una quantità di O2 100 volte più
elevata di quella che potrebbe essere trasportata da un ugual volume di soluzione salina acquosa come il plasma l’Hb rende il sangue capace di trasportare MOLTO O2
proteina tetramerica composta da una parte proteica ed una
non proteica
Gruppo eme: l’atomo di Fe è in grado di legare l’O2 solo quando si trova allo stato ridotto (Fe2+)
La parte proteica crea il microambiente idrofobico necessario a mantenere l’atomo di Fe nel suo stato
ridotto
Curva di dissociazione dell’Hb e sua dipendenza dal pH
La curva di dissociazione e la sua dipendenza dal pH e dalla concentrazioni di alcuni composti chimici dipendono dalla parte
proteica
Nei diversi periodi dello sviluppo l’approvvigionamento di O2 avviene in strutture
diverse necessità di differenti Hb ciascuna espressa in uno specifico periodo ontogenetico e
adatta ad associarsi all’O2 nella specifica struttura di approvvigionamento
La parte proteica è sempre costituita da 4 catene polipeptidiche uguali due a due (2 catene di tipo e
2 catene di tipo non-)
Emoglobine embrionali Hb Gower I (22) Hb Portland (22) Hb Gower II (22)
emoglobina fetale Hb F (22)
Emoglobine adulte Hb A2 (22)Hb A (22)
Produzione dei vari tipi di catene globiniche nelle diverse fasi della vita
di un individuo
I due switch (embrionale fetale e fetale post-natale) sono controllati a livello trascrizionale
Produzione di eritrociti
Negli adulti è presente una certa quota di HbF a distribuzione non uniforme: si trova in poche
cellule cellule FLa quantità di HbF aumenta in condizioni di
stress emopoietico (es. in carenza di O2)
Qual è l’origine delle cellule F ?
Due ipotesi: 1) due popolazioni diverse di cellule staminali 2) un’unica popolazione in grado di attuare due diversi programmi trascrizionali
Risposta: un’unica popolazione di cellule staminali Cloni originatesi da una singola cellula progenitrice contengono sia cellule con HbF che cellule con HbA
Produzione di tutti gli elementi figurati del sangue
Lo switch feto adulto è dovuto a uno switch del programma trascrizionale delle cellule
progenitrici e non ad uno switch nell’attivazione di popolazioni staminali diverse
L’eritropoiesi ricapitola l’ontogenesi
Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259
le catene di tipo sono lunghe 141 aminoacidi, i loro geni si trovano sul
cromosoma 16 (cluster , circa 30 kb)
le catene di tipo sono lunghe 146 aminoacidi, i loro geni si trovano sul cromosoma 11
(cluster , ca. 60 kb)
catene di tipo e di tipo mostrano una
forte omologia di sequenza ad
indicare una loro origine evolutiva
comuneUna notevole omologia si
riscontra anche con la sequenza della
mioglobina proteina che lega l’O2 nel muscolo
Mioglobina Emoglobina
In entrambi i cluster i geni sono organizzati secondo l’ordine
temporale in cui sono espressi e sono presenti delle regioni
regolative (LCR = Locus Control Region), poste diverse kb a monte
dei geni stessi, che sono necessarie per l’espressione di
tutti i geni del cluster
I geni globinici sono di piccole dimensione (< 1.6 kb) hanno 3 esoni e 2 introni, il 38% della loro sequenza è codificante
I due cluster dei geni globinici
Strachan e Read – Genetica Molecolare Umana, Zanichelli, 2012
Organizzazione dei due cluster globinici: cluster (cromosoma 16) e cluster (cromosoma 11
Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia
La proteina si trova in forma praticamente pura all’interno dei gl.rossi cellule di un tessuto facilmente accessibile
Molti individui hanno patologie, anche di tipo quantitativo, dovute a mutazioni dei geni globinici o delle regioni di controllo talassemie, HPFH
alfa talassemie /non- < 1 (c’è un difetto di catene )
beta talassemie /non- > 1 (c’è un difetto di catene non , che nell’adulto sono sostanzialmente le )
In ogni momento della vita di un individuo (periodo embrionale, fetale e post-natale) il
rapporto
n° catene /n° catene non- = 1
Si definisce talassemia la condizione in cui tale rapporto 1
Le talassemie sono quindi un difetto QUANTITATIVO generalmente dovuto a perdita di funzione
Nomenclatura
Microcitemia o Talassemia minor o Trait talassemico sono sinonimi e indicano la condizione CLINICAMENTE ASINTOMATICA degli eterozigoti facilmente individuabili attraverso un semplice esame ematologicoAnemia mediterranea o Morbo di Cooley o Talassemia major sono sinonimi e indicano il quadro clinico, molto grave (mortale in assenza di cure) degli individui omozigoti (o eterozigoti composti per alleli non funzionanti)
Si definiscono alleli thal0 (thal0) gli alleli che causano assenza completa di catene ()
alleli thal+ (thal+) causano una riduzione più o meno marcata di catene ()
I principali parametri del sangue che risultano alterati nei microcitemici
nei microcitemici la quantità totale di Hb è ridotta mentre il numero di globuli rossi è aumentato
gli eritrociti sono però più piccoli
il ridotto contenuto di Hb determina un appiattimento delle emazie e una loro maggiore resistenza all’emolisi
in soluzione salina ipotonica.
g/dl
per l
3
g/dl
per l
3
in soluzione ipotonica l’emolisi delle emazie normali è totale e il liquido color
rosa è limpido;
le emazie microcitemiche vengono distrutte solo in parte e la soluzione resta torbida.
NORMALE MICROCITEMICO
i globuli rossi dei malati
sono quasi completamente
privi di Hb, sono molto
pochi e presentano marcate
alterazioni morfologiche,
alcuni sono solo dei
frammenti, tutti vanno
incontro ad una precoce
distruzione
NEI MALATI NON
CURATI SI
OSSERVANO
GRAVISSIME
DEFORMAZIONI
DEL CRANIO E
DELLA FACCIA,
OLTRE A
EPATO- E
SPLENOMEGALIA
FREQUENZA DELLA MICROCITEMIA NEL MONDO
La microcitemia è frequente in tutti i paesi che si affacciano sul Mediterraneo (da cui il nome di anemia mediterranea) e in tutto il
sud-est asiatico
si calcola che i portatori sani nel mondo siano circa 180.000.000 e, in assenza di prevenzione, le nascite di nuovi malati
70.000 ogni anno
in Italia vivono circa 2.500.000
microcitemici sani
grazie alla prevenzione le
nascite di individui malati sono molto
limitate
la frequenza dei portatori sani è molto alta nelle
regioni meridionali, in Sardegna, in
Sicilia e nella regione del delta del Po
FREQUENZA DELLE MICROCITEMIE IN ITALIA
dal GENE al PRODOTTO POLIPEPTIDICO
FUNZIONANTE
1. Il gene deve essere presente;
2. Il gene deve essere trascritto;
3. Il trascritto deve essere maturato:
rimozione degli introni, aggiunta del CAP,
aggiunta del poli-A
4. L’mRNA maturo deve essere portato nel
citoplasma e caricato sui ribosomi;
5. La traduzione deve avere inizio;
6. L’mRNA deve essere tradotto per tutta la
sua lunghezza;
7. La catena polipeptidica deve essere stabile
e in grado di svolgere la sua funzione
Maturazione del trascritto primario (produzione di mRNA)
Produzione del trascritto primario e rimozione degli introni
EVENTOCOMPROMESSO
REGIONE GENICA MUTATA
TIPO DI ALLELE
N° DI ALLEL
I NOTI
CONSEGUENZA FUNZIONALE
Trascrizione Promotore Thal (+) 19 L’attività trascrizionale
residua varia tra il 20 e il 50%
Splicing Introne, sito
donatore o accettore
Introne, sequenze consesus
Introne, attivazione di un sito criptico
Esone, attivazione di un sito criptico
Thal (0)
Thal (+)
Thal (+)
Thal (+)
16
16
6
5(3 MS
e 2 SS)
Exon skipping o ritenzione
dell’introne (o di parte di esso)
mRNA normale presente in quantità
ridotta + mRNA anormale
Come sopra
Come sopra, inoltre in caso di mutazione
MS la globina prodotta presenta
una SSA
Mutazioni che causano ‘perdita di funzione’
EVENTOCOMPROMESS
O
REGIONE GENICA MUTATA
TIPO DI
ALLELE
N° DI ALLEL
I NOTI
CONSEGUENZA FUNZIONALE
Taglio dell’RNA e poliadenilazione
Sito di adenilaz.AATAAA
Thal (+) 6 RNA normali +
RNA instabili
Capping Sito del capping
Thal (+) 1 RNA normali+
RNA instabili
Attacco al ribosoma
5’ UTR RBS=Ribos. Binding
Site
Thal (+) 7 Assenza di traduzione
Inizio traduzione 1° codone (AUG)
Thal (0) 7 (max poss 9)
Assenza di traduzione
Traduzione codificante codone
sensoSTOP
Thal (0) 16 mRNA instabile per presenza di un codone di stop
prematuro
Traduzione codificanteindel
Thal (0) > 60 Come sopra
Traduzione codificanteMS
Il polipeptide presenta una singola sostit. aa, le conseguenze funzionali dipendono da sede e proprietà di aa.
sostituito e aa. sostituente
HPFH Hereditary Persistence of Fetal Haemoglobin
In base all’evento mutazionale che ne è la causa può essere suddivisa in due categorie:
•forme dovute a delezione (di tratti più o meno estesi del cluster globinico)
•forme NON dovute a delezione (ndHPFH), quelle dovute a mutazioni del cluster in genere presentano mutazioni in regioni regolative dei geni
Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia
Studi biochimici di correlazione struttura-funzione
Scoperta del primo crossing-over dislocato (intragenico) la Hb Lepore
Scoperta della prima regione HSR (Hot Spot of Recombination)
Scoperta della prima regione HSR (Hot Spot of Recombination)
Come si è arrivati alla scoperta della LCR delezioni diverse e loro conseguenze e studio dello stato cromatinico della regione
Assenza dei geni assenza delle catene globiniche
I geni sono intatti ma le globine non vengono sintetizzate, perché?
Struttura della LCR 5 siti sensibili al trattamento con DNAsi I, ciascun sito è di 250 bp e contiene sequenze di legame per vari fattori di trascrizione
La LCR è necessaria per l’espressione di TUTTI i geni del cluster e isola la regione dalla vicina cromatina inattiva
Come agisce la LCR ? E’ stato dimostrato la LCR lega dei fattori di
trascrizione e interagisce fisicamente con i promotori dei geni globinici (con un promotore alla volta)
Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259
Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?
Due meccanismi: Competizione tra geni
Studi su topi transgenici
Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259
Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?
Silenziamento di geniIn topi transgenici con il solo gene legato alla LCR
il transgene viene espresso solo nel periodo
embrionale sequenze necessarie per il
silenziamento sono state identificate sia nella parte
distale che in quella prossimale del promotore
Stamatoyannopoulos G (2005) – Exp Hematol 33: 259
Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?
In sintesi di fondamentale importanza sono:
1) La distanza dalla LCR2) La presenza di fattori di silenziamento3) La presenza di fattori di accensione gene-
specifici (sicuramente per il forse per il )
Periodo embrionale il gene viene espresso in quanto fisicamente più vicino alla LCR
Periodo fetale il gene viene silenziato, la LCR agisce sul gene che (forse) è attivato anche da fattori di trascrizione specifici
Periodo adulto il gene viene silenziato, il gene si lega a fattori di trascrizione specifici e su di esso agisce la LCR
Attualmente sono state indentificate varie proteine coinvolte nel silenziamento dei geni o
nell’accensione del gene . Il fenotipo di soggetti portatori di vari tipi di talassemie dovute a delezione
contribuisce a chiarire l’importanza di specifiche regioni del cluster per il legame di queste proteine
Ghedira et al. (2013) – Hematologica 98: 305-308)
mRNA con codoni di STOP che cadono prima
dell’ultimo esone sono instabili e vengono
degradati meccanismo attraverso il quale
viene impedita la produzione di ‘monconi
polipeptidici’ che potrebbero essere dannosi per
la cellula
NMD Nonsense-Mediated Decay =
degradazione mediata da codoni non-senso
Quando gli mRNA arrivano nel citoplasma sono
ancora legati, in corrispondenza dei punti di
splicing, a complessi proteici (EJC = Exon
Junction Complex) che vengono rimossi solo
durante il primo round di traduzione. mRNA da
cui non vengano rimossi gli EJC sono instabili e
vengono degradati.
Frecce verdi formazione di codoni di STOP prematuri prima dell’ultimo esone, mRNA instabili > non produzione di ‘tronconi polipeptidici’
Frecce rosse formazione di codoni di STOP prematuri nell’ultimo esone, mRNA stabili > produzione di ‘tronconi polipeptidici’