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Emprego de marcadores moleculares (RAPD) no estudo genético de Ilex paraguariensis St. Hil.
Wendt, S. N.; Mazza, M. C.; Quoirin, M. G.; Sousa, V. A.; Sturion, J. A.
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Introdução
Pertence a família Aquifoliaceae
Brasil, Paraguai, Argentina e Uruguai
Arbórea, 12-30 m, perene (100 anos)
Diplóide (2n=40) e dióica (dioicia críptica)
Produção de bebidas, corante natural, conservante alimentar, medicamentos diversos, produtos de higiene e cosméticos.
Estudos genéticos e programas de melhoramento são escassos conhecimento da diversidade genética:
• planejamento dos programas de melhoramento
• conservação de recursos genéticos
Ilex paraguariensis
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Detectam variabilidade genética ao nível de DNA.
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Amplificação de segmentos de DNA ao acaso, utilizando um único primer, com 10 pb, cuja sequência nucleotídica é arbitrária
O primer dirige a síntese de vários segmentos de DNA em diversos pontos do genoma várias bandas no gel
O polimorfismo tem natureza binária
Marcadores genéticos dominantes
Marcadores moleculares
AA Aa aa
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Objetivo
Determinar a variabilidade genética de diferentes procedências de erva-mate, utilizando marcadores RAPD.
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Materiais e métodos
Material vegetal
Folhas jovens de três procedências: Ivaí, Pinhão e Cascavel, do teste de procedências e progênies, localizado na Fazenda Vila Nova, Município de Ivaí.
28 indivíduos/procedência.
Extração do DNA
150 mg folhas
Protocolo modificado de Doyle & Doyle (1987)DOYLE, J.J., DOYLE, J.L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leal tissue. Phytochem. Bull., v. 9, p. 11-15, 1987.
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Etapas da extração do DNA
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Quantificação e diluição do DNA
Amplificação do DNA
Volume final de 13 l.
Componentes: DNA, H2O, tampão, MgCl2, dNTPs, primer, Taq polimerase
Etapas:
- 15 s a 94 ºC- 30 s a 35 - 60 s a 72 ºC- 5 min a 72 ºC
40 ciclos
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15 primers
Primer Sequência (5’ 3’)OPA-01 CAGGCCCTTCOPA-02 TGCCGAGCTGOPF-01 ACGCATCCTGOPF-03 CCTGATCACCOPF-05 CCGAATTCCCOPF-14 TGCTGCAGGTOPH-03 AGACGTCCACOPH-04 GGAAGTCGCC
Primer Sequência (5’ 3’)OPH-05 AGTCGTCCCCOPH-08 GAAACACCCCOPH-12 ACGCGCATGTOPH-13 GACGCCACACOPH-15 AATGGCGCAGOPH-18 GAATCGGCCAOPH-19 CTGACCAGCC
Eletroforese em gel de agarose 1,6%, corado com brometo de etídeo.
Os géis foram visualizados em
transiluminador de luz UV e fotografados.
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Etapas da técnica RAPD
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Análise dos dados
Os fragmentos foram tabulados como 1 para presença e 0 para ausência de banda no gel de eletroforese.
Resultados
Os 15 primers produziram 159 fragmentos, com o número de bandas produzidas por primer variando de 6 (OPH-19) até 13 (OPH-05), em média 10,6 bandas/primer.
71,40% fragmentos polimórficos.
O tamanho dos fragmentos variaram de 110 a 1830 pb.
Perfil RAPD
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M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 M
Produtos da amplificação por RAPD de amostras da procedência Pinhão, usando o primer OPH-12. M = DNA Ladder 100 pb, 1-28 = Indivíduos da procedência Pinhão, Colombo-PR, 2001.