empreinte génétique des souches de mycobacterium tuberculosis
DESCRIPTION
Empreinte génétique des souches de Mycobacterium tuberculosis. Professeur Férièle MESSADI-AKROUT Laboratoire Régional d’Hygiène E.P.S. Hédi CHAKER de Sfax. RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Technique basée sur la détection des éléments d’insertion IS 6110 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Empreinte génétique des souches Empreinte génétique des souches de de Mycobacterium Mycobacterium
tuberculosistuberculosis
Professeur Férièle MESSADI-AKROUTProfesseur Férièle MESSADI-AKROUTLaboratoire Régional d’HygièneLaboratoire Régional d’Hygiène
E.P.S. Hédi CHAKER de SfaxE.P.S. Hédi CHAKER de Sfax
RFLPRestriction Fragment Length Polymorphism
Technique basée sur la détection des éléments d’insertion
IS 6110
Met en évidence les polymorphismes des mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis
Permet d’obtenir les profils (empreintes) génétiques ou
« fingerprints » des souches, les distinguant ainsi entre elles
Outil fiable pour des études épidémiologiques :
sur les sources d’infection
Les chaînes de transmission
Identification de miniépidémies multirésistantes
Le nombre de copies et le site d’insertion dans le chromosome : variables d’une souche à l’autre
relative instabilité de cet élément génétique
Polymorphisme des profils d’IS 6110 est expliqué par:
Le nombre et les différentes positions des IS dans le chromosome
La taille des fragments de restriction dépendant des sites de restriction adjacents aux IS
Transposition : événement extrêmement rare
MATERIEL
237 souches de M. tuberculosis provenant 226 patients
Fin 1992 et 1993 dans 12 hôpitaux tunisiens
74 % de sexe masculin
10371
1298
66665
32
0 20 40 60 80 100 120
SFAX
SOUSSE
KSAR HELAL
MONASTIR
M BOURGUIBA
LA RABTA
LA MARSA
ARIANA
NABEUL
SIDI BOUZID
GABES
HOPITAL MILITAIRE
Nombre de souches
PROVENANCE DES SOUCHES
TYPES DE LOCALISATION
93 % d’origine pulmonaire
7 % d’origine extra-pulmonaire :
urine 0,4 %
ponction lombaire 0,4 %
biopsie 0,8 %
pus 3,3 %
autres ponctions 2,1 %
Étude de la sensibilité des souches aux anti-tuberculeux
technique des proportions Canetti et al.
Fiche de renseignement complétée à partir des dossiers
médicaux et enquêtes épidémiologiques effectuées par
DSSB.
Résistance primaire
Résistance secondaire
METHODES
Technique RFLP: méthode décrite par Van Embden et al
Institut National de Santé Publique et de Protection de
l’Environnement Bilthoven Neederland
1. Extraction ADN génomique des mycobactéries
culture bactérienne Tampon Tris EDTA (pH 8)
mycobactéries tuées par la chaleur (20 mn à 80°C). Digestion par lysozyme (1mg/ml) lyse des parois mycobactériennes
Ajout protéinase K, SDS (dénaturation des protéines) 10 mn à 65° C
Ajout NaCl (0,6M) CTAB (cétylNNN Triméthylammonium Bromide).
Séparation des protéines et des ac. Nucléiques
Ajout chloroforme – Isoamylalcool permet extraction ADN (phase aqueuse) :
Précipitation ADN avec isopropanol
2. Digestion ADN avec une enzyme de restriction
Pvu II (endonucléase) (Boehringer Mannheim
Allemagne)
Reconnaît la séquence palindromique CAG |CTG
Coupe une seule fois dans IS 6110 et en dehors à
distances variables
3. Électrophorèse sur gel d’agarose (0,8 %)
Fragments d’ADN digérés sont séparés selon leur taille
4. Southern blotting
transfert fragments ADN sur membrane de nitrocellulose
5. Préparation de la sonde par PCR
6. Hybridation avec sonde marquée à la peroxydase
(245 pb)
7. Détection par technique chimique non radio active
( ECL: Enhanced ChemiLuminescence)
8. Analyse des profils par ordinateur avec le logiciel Gel compar . ( RIVM Bilthoven, Hollande)
Coefficient de similitude entre les différents profils Poids moléculaires et intensité des bandes
Dendrogramme
RESULTATS
Nombre de copies IS 6110 varie de 3 à 22
Majorité des souches ont entre 7 et 15 copies (91,1 %)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Nombre de copies IS 6110
%
Analyse de profils génétiques montre par ordinateur une faible
hétérogénéité.
72 % des souches sont regroupées dans 3 « clusters » qui
contiennent plus de 10 copies IS 6110
souches proviennent de 3 clones
Souches africaines moins polymorphiques que souches
néerlandaises
Souches Tunisiennes
Souches Néerlandaises
Degré de polymorphisme plus faible
Pays à haute prévalence Pays à basse prévalence
Taux de transmission plus Important Réactivation endogène
Infection récente
Il n’existe pas de relation entre le profil RFLP et l’acquisition de résistance par les souches de M. tuberculosis
Analyse du profil RFLP permet :
d’identifier des miniépidémies (souches résistantes ou sensibles)
d’analyser les circonstances de la transmission (infections nosocomiales)
d’aider à la définition des mesures à prendre pour éviter ce type d’accident
Il n’existe pas de souches ne possédant pas IS 6110 comme celles décrites par Yuen sur des souches vietnamiennes
Au niveau des 3 groupes RFLP principaux:
pas possibilité d’associer un profil à une origine géographique particulière
Mobilité importante de la population
Comparaison aux souches éthiopiennes:
Aucun profil comparable, ceci confirme l’hypothèse d’une possible différenciation par l’origine géographique
Comparaison aux souches néerlandaises:
Profil similaire chez un chauffeur transportant des animaux en Tunisie et au Maroc
Infection probablement contractée en Tunisie
Intérêt de la mise en place d’une collection de
souches provenant du monde entier et présentant
des caractéristiques différentes de manière à pouvoir
associer à des profils particuliers une origine
géographique et peut être des caractères de
pathogénicité et de résistance aux antituberculeux
Différents prélèvements provenant du même patient
même profil RFLP
Malgré polymorphisme des souches de M. tuberculosis.
Phénomène de transposition : rare
Deux prélèvements pulmonaires et une ponction
ganglionnaire provenant d’un même patient
Profils identiques sites pulmonaires
Profil différent pour le site ganglionnaire mais similaire avec une bande en plus
rare phénomène de transposition
Plutôt que d’une infection par 2 souches différentes
La transmission intra familiale de la tuberculose a été
démontrée dans 2 cas :
- 2 frères de Ksar Helal même profil génétique
- 1 frère et une sœur de Sousse même profil génétique
3 souches multirésistantes isolées chez 3 patients de régions (Ariana, Sousse, Sfax)
même profil RFLP
PCR Innolipa Rif-TB
Test même type de mutation (R2) sur le gène rpo B
(responsable de la résistance à la Rifampicine)
Source commune d’infection, transmission de souche M D R
3 souches présentant une résistance à l’isoniazide (Rce primaire)
même profil RFLP.
3 patients résidant dans 3 villes proche de Menzel Bourguiba (Nefza, Mateur, Bizerte)
pas de contact démontré
Source commune d’infection
- même lieu
- même bar (narguilé)
Détection de contaminations intra laboratoires : 8 sujets ne présentant aucun signe radiologique ni clinique de tuberculose ont un profil identique à d’autres souches isolées le même jour dans le même laboratoire.
Souche isolée chez une technicienne de laboratoire
identique à celle d’un autre patient.
investigations épidémiologiques plus approfondies
infection au laboratoire possible
CONCLUSIONCONCLUSION
Technique RFLP : Existence de 3 grands Technique RFLP : Existence de 3 grands groupes mettant en évidence un taux de groupes mettant en évidence un taux de transmission importanttransmission important
Malgré le faible degré de polymorphisme, Malgré le faible degré de polymorphisme, aucune relation retrouvée entre:aucune relation retrouvée entre:les 3 différents clustersles 3 différents clustersl’âgel’âgele tropisme des tissusle tropisme des tissusorigine géographiqueorigine géographique
• A mis en évidence : Des contaminations de laboratoire Recherche de source d’infection Association RFLP et résistance primaire
• RFLP méthode de référence : Différenciation réinfection et rechute Établir la transmission de souches sensibles ou résistantes Déterminer la nature nosocomiale d’une épidémie
• Surveillance de la résistance primaire et secondaire couplée à l’analyse RFLP devrait être poursuivie à long terme afin d’évaluer la performance du traitement antituberculeux
Merci pour votre attention