05.06.2016

1

En rask innføring i immunhistokjemi

Elin Borgen

Avd for patologi

Oslo Universitetssykehus

Bioingeniørkongressen 2016 ‐ Oslo Kongressenter

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

05.06.2016

2

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

Antigener, antistoffer og immunhistokjemi

• Antigener (Ag) er antistoffgenererende molekyler som kan fremkalle immunologisk respons, især dannelse av antistoffer

• Antistoffer (As) er proteiner av typen immunglobuliner som produseres av kroppens plasmaceller som ledd i immunrespons.

• Immunhistokjemi (IHK) er en metode for å lokalisere spesifikke Ag i vev/celler ved hjelp av As/Ag binding

05.06.2016

3

Antistoff  ‐molekylær struktur:

05.06.2016

4

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

05.06.2016

5

Immunhistokjemi (IHK)  ‐ viktig del av patologidiagnostikken

• Identifikasjon/klassifikasjon av sykdommer/kreftsvulster

• Bestemmelse av prognose (prognostiske markører)

• Bestemmelse av følsomhet for en bestemt behandling ( prediktive markører som HER2, østrogenreseptor, progesteronreseptor…)

• Påvisning av bakterier/virus/sopp

• Forskning

• På OUS: 46% økning i IHK i løpet av siste 3 år

Companion diagn kit Antigen  Pasientgruppe Medikament(er)

DAKO EGFR PharmDx Kit

EGFR  Colorectal cancer Erbitux (cetuximab);Vectibix(panitumumab)

DAKO C‐KIT PharmDx c‐kit protein=CD 117 

GIST Gleevec/Glivec(imatinib mesylate)

PATHWAY ANTI‐HER‐2/NEU (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical systems

HER2Mammacancer

Herceptin(trastuzumab)

INSITE HER‐2/NEU KITBiogenex Laboratories, Inc.

HER2 Mammacancer Herceptin(trastuzumab)

Bond Oracle Her2 IHC System

HER2 Mammacancer Herceptin(trastuzumab)

HERCEPTEST(DAKO) HER2

Mammacancer;Metastatic gastric cancerMetastatic gastroesophageal junction adenocarcinoma,

Herceptin(trastuzumab);Perjeta (pertuzumab);Kadcyla(ado‐trastuzumab emtansine)

PD‐L1 IHC 22C3 pharmDx(DAKO)

PD‐L1 Non‐small cell lung cancer (NSCLC)

KEYTRUDA® (pembrolizumab)

VENTANA ALK (D5F3) CDx Assay

ALK Non‐small cell lung carcinoma (NSCLC) tissue stained with a BenchMark XT

Xalkori (crizotinib)

Companion diagnostic kits for immunhistokjemi godkjent av FDA per mai 2016

05.06.2016

6

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

IHK ‐ Den historiske utviklingen • 1940 : Immunfluorescens på frysesnitt (ufiksert frosset vev; Coons, 

Proc Soc Exp Biol Med. 1941;47:200)

• 1960‐1970: IHK med vanlig lysmikroskopi (muliggjort ved innmerking med pepperrot peroxidase)

• 1974: IHK på vanlig rutinediagnostisk formalinfiksert paraffininnstøpt materiale (CR Taylor. J Clin Pathol 1974; 27:14)

• 1991: Antigen retrieval (demaskering) ved hjelp av varmebehandling : en revolusjon som førte til bred innføring av IHK rutinediagnostikken (S‐R Shi, J Histochem Cytochem. 1991; 39: 741

• Tidlig 1990‐tall: IHK innført rutinediagnostikk (dvs på paraffinblokker)

• Og deretter: utvikling av stadig bedre antistoffer og IHK protokoller (økt sensitivitet, reproduserbarhet, standardisering )

05.06.2016

7

IHK protokoll: Forbehandling: antigen demaskering (« antigen retrieval»)

• Retrieval : The act or process of getting and bringing back something.

• Shi S‐R et al, J Histochem Cytochem. 1991 Jun;39(6):741‐8:

→  An gen retrieval in formalin‐fixed, paraffin‐embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections

• Formalinfiksering fører til kryssbindinger mellom formalinen og proteiner ivevet. Kryssbindingene hemmer antistoff/antigen‐binding.

• Kryssbindingene kan løses opp igjen vha bl a varmebehandling (hydrolyse).

• pH i løsningen påvirker også resultatet.

Antigen demaskering (retrieval)• Heat induced epitope retrieval (HIER)

– Oppvarming/koking i vannholdig buffer

( ulike måter:  koking i PT link (Dako), i mikrobølgeovn, i trykk‐koker,  eller varmebehandling i selve fargemaskinen (Ventana, Bond, …)

• Forbehandlingsbufferen er vanligvis Tris/EDTA (pH ca 9) eller citrat‐basert (pH6),

• …og de ulike fargemaskin/deteksjonssystem‐leverandørene har hver sine forbehandlingsbuffere:

Leverandør Tris/EDTApH9

CitratpH6

Dako High pH Low pH

Ventana/Roche CC1(pH 8.5)

CC2

Bond/Leica Solution 2 Solution1

For noen få antistoffer: enzymbehandling eller ingen forbehandling.

05.06.2016

8

: HQ label: Hydroxy quinoxaline= et hapten

: Polymer med HRP på

Celle/antigen

Primærantistoff(mus el kanin)

HRP/polymer‐mrk geit anti musog HRP‐mrk geit anti kanin

Kanin anti musel. mus anti kanin

HQ‐mrk geit anti musog HQ‐mrk geitanti kanin

HRP/multimer‐musmonoklonaltanti‐HQ

HRP/multimer‐musmonoklonaltanti‐HQ

OptiViewamplifier

: OptiView amplifier «containingtyramide with a linker containing HQ»

‐ Flex‐ UltraView

‐ Flex+‐ UltraView medamplifikasjon 

OptiView(fra Ventana)

OptiView medamplifikasjon

Moderne IHK deteksjonssystemer(hjemmelaget forenklet fremstillingav noen hovedprinsipper)

Eksempel: Immunfarging med antistoffet Melan‐Amot melanocyttene basalt i plateepitelet i huden:

05.06.2016

9

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

Standardisering, standardisering, standardisering‐ preanalytiske variable – fallgruber for IHK

• For lang  tid fra kirurgisk inngrep til formalinfiksering

– Viktig å skjære opp store preparater

• For kort fikseringstid er generellt verre enn for lang fikseringtid

– formalinen bruker 1 time/mm på å trenge inn, først deretter starter fikseringsprosessen

– ASCO/CAP, for HER2 på mammabiopsier: Fikseringtid 6‐72 timer

– NordiQC anbefaler minimum 16‐24 t fiksering for biopsi på 1 mm

– →  Praksis på OUS: 6 timer fiksering skal være absolutt minimum for nålebiopsier.

– 24 timer eller mer for større preparater

• For høy temperatur 

– Aldri over maks 60 grader før deparaffinisering/demaskering 

• Hurtigfremføring, mikrobølgeovn basert: Den rådende anbefaling er:

– bør testes for de enkelte antistoff inntil man vet mer om konsekvensene

– og positiv kontrollmaterialet bør være tilsvarende behandlet 

– …altså i praksis nokså uhåndterbart…)

• Dekalsinering kan ødelegge; går som oftest bra, men bør overvåkes

• Avdelingene bør opprette fagansvarlig bioingeniør og fagansvarlig  patolog spesielt for histologilaboratoriene 

05.06.2016

10

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

Fagansvar  ‐ IHK‐ karrieremuligheter for bioingengiør!

• Overvåke kvaliteten av immunfargeprotokollene, inklsammen med patolog riktig valg av primærantistoffer

• Positiv‐kontroller (Pos ktr på hvert snitt, med mindre det er tilstrekkelig med intern kontroll i selve pasientsnittet)

• Innkjøring av nye antistoffer; lage multiblokker

• Eksterne kvalitetssikringsprogrammer: NordiQC og Neqas

• Kommunikasjon med de som sender inn prøvemateriale og med histologilab for best mulig standardisering av preanalytiske variable.

05.06.2016

11

Støping av positivkontroll‐blokker

(Kopiert fra presentasjon av Søren Nielsen, Aalborg sykehus/NordiQC,Kurs i Immunhistokjemi Oslo januar 2012)

…men hvordan gripe det an…?

05.06.2016

12

At the very beginning...

1. dag  0.1 ‐ 0.15 mm

2.‐3. dag 2‐3 0.1 ‐ 0.2 mm

4.‐5. Dag 0.1 ‐ 0.2 mm

De to første ukene går fosteret fra å være en liten celleball….

05.06.2016

13

6. Dag 0.1 ‐ 0.2 mmHer fester det seg til livmorslimhinnen

7.‐8‐dag 0.1 ‐ 0.2 mmHer synker det ned i uterinslimhinnen

…..til å bli en flat avrundet plate,bestående av to cellelag oppå hverandre:

EpiblastHypoblast

Hypoblast

Epiblast

3. uke: Epiblast‐cellene prolifererer og hoper seg opp til en fortykkelse («the primitive streak»)

langs midtlinjen.I denne fortykkelsen danner det seg en langsgående fordypning. 

Epiblastceller vandrer ned i fordypningen hvor de så bryter seg løs fra epiblastcelleneog migrerer videre i alle retninger og legger seg innimellom epiblastlaget

og hypoblastlaget, og danner her et tredje cellelag: mesoderm.

Dermed består fosteret av 3 cellelag – som nå heter:Ectoderm (som tidligere het epiblast) – endoderm (tidl. hypoblast)  ‐ mesoderm.

05.06.2016

14

Primitive streak hos humant foster

Prosessen hvor det tolagede fosteret blir til tre lag (i ca 3. uke) kallesgastrulering og organiseres av «the primitive node» (Hensens node) 

Etisk betydning/overgang ?

“The development of the primitive streak is taken,by some bioethicists,  to signify the creation

of a unique, potential human being”

Victor Hensen(1835‐1924):

Humant 10 mm embryo ved 7 ukers graviditet

05.06.2016

15

• Ectoderm blir til hudoverflaten (plateepitelceller).

•Fra ectoderm utvikles også nervesystemet.

• Endoderm blir til cellelaget som kler innsiden av (mesteparten av) tarmkanalen, og div kjertler som åpner seg i tarmkanalen som lever og bukspyttkjertel; samt luftrør, lungealveoler, urinblære, skjoldbruskkjertel (for det meste sylinderepitelceller)

• Mesoderm blir til benvev/benmarg/blod, brusk, muskel og bindevev

Embryologi  – kortversjonen:

• Carcinomer er kreft utsprunget i epitelceller, dvsvev derivert fra ectoderm eller endoderm.

• Sarcomer er kreft utsprunget i vev derivert fra mesoderm– Osteosarcomer (benkreft), levkemier, lymfomer, (utgått fra benmarg/lymfesystem), leiomyosarcomer (utgått i glatt muskulatur), fibrosarcomer (utgått i bindevev),...

• Nevrogene svulster utgår fra neurectoderm– Hjernesvulster, schwannom, neuroblastom,...  

05.06.2016

16

Plate‐ og sylinderepitel:

• Flerlaget plateepitel: har man der hvor det trengs beskyttelse mot ytre slitasje (hud, munnhule, spiserør,... – her får man plateepitelcarcinomer.

• Sylinderepitel (ett eller noen få lag) : har man i innvendige slimhinner, kjertler mm – her får man adenocarcinomer (for eks mamma‐, colon‐, ovarie‐, prostata‐ endometriecancer)

Immunhistokjemi  – kortversjonen...:

• Carcinomer er typisk positive for antistoff mot cytokeratiner (CK), som utgjør epitelcellenes celleskjelett

• Hematopoietiske tumores (lymfomer, levkemier) er typisk positive for antistoff mot CD45 (=LCA, «leukocyte common antigen»)

• Sarcomer er typisk positive for vimentin (fibrosarcomer) eller desmin (muskelderiverte svulster) eller CD31 (karsvulster),.. 

• Nevrogene svulster og melanomer er typisk positive for S‐100

• Men under visse omstendigheter, som ved  kreftutvikling, kan celler gjenoppta produksjonen av proteiner som normalt bare er tilstede i fosterlivet. Kreftceller kan også uttrykke markører som ikke var tilstede i cellene de kom fra opprinnelig… og ofte er det kombinasjoner av antistoffer som gir fasitsvaret…

05.06.2016

17

Ectoderm

Endoderm

Mesoderm

overflate ectoderm

neurectoderm

Hud (plateepitel)Plateepitelcarcinomer(CK5/6, CK14,...)

nervesystemet

Melanocytter i huden

Nevrogene svulster(S‐100, CD56,...)

Melanomer(S‐100, HMB45, melanA,..

tarm, luftveier, mamma,lever, pancreas,...

Adenocarcinomer (hovedsaklig)CK7, CK8, CK18, CK20,..

BindevevFibrosarkomer (vimentin,..)

Hematopoietiske system/benmargLymfomer, levkemier(CD45: alleCD3: T‐lymfocytter/T‐cellelymfomCD20: B‐lymfocytter/B‐cellelymfomCD15/CD30: Hodgkins lymfomMyeloperoxidase: granulocytter(myeloid levkemi) 

Blodkar/lymfekar

Karsvulster (angiosarcomer,..)(faktor VIII, CD31,C D34,D2‐40)

Benvev/bruskOsteosarcom/chrondrosarcom

MusklerDesmin (både tverrstripet skjelettmusk. og glatt muskulatur)Glatt muskulatur (leiomyom/leiomyosarkom; SMA, h‐caldesmonTverrstripet skjelettmuskulatur (myogenin, myoD1,...)

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

05.06.2016

18

Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS:‐ en nålebiopsi fra tumor i lever hos 22 år gammel kvinne:

hematoxylin‐eosin‐farget snitt

Normale leverceller

Normale leverceller

Tumor

05.06.2016

19

Hematoksylin‐eosinfarging:

Mikroskopisk utseende som en ondartet tumor – cellerik og med kjerner med store nukleoler.Vekstmønsteret er dels litt spolcellet, dels litt «epiteloid», dels udifferensiert/ubestemmelig…

Bredspektert antistoff mot cytokeratin (epitelceller) (AE1AE3) :Normalt levervev sterkt positivt,men tumor er nega v.  →   Altså er det ikke et carcinom.

Tumorcellene er negative

De normale levercellene er positive

05.06.2016

20

CD45 er negativ (bortsett fra i enkelte normale hvite blodlegemer→ altså er det ikke et lymfom

Kan det være en kar‐derivert tumor?→ men CD34 er negativ i tumorcellene(det er bare blodkar/lymfekar som er positive.

05.06.2016

21

CD99 pos. kontroll

Kan det være Ewing sarkom ?

→  Men CD99, som er en typisk markørfor Ewing, er negativ:

Et lungecarcinom?Men lungemarkøren TTF1 er negativ…:

Pos ktr TTF1(normalt lungevev)

…og Myf4 og CD117 (for hhv rhabdomyosarkom og gastrointestinal stromal tumor (GIST))var også negative….

05.06.2016

22

S‐100 er negativ i normal lever  

‐men positiv i tumorcellene! 

Ectoderm

Endoderm

Mesoderm

overflate ectoderm

neurectoderm

Hud (plateepitel)Plateepitelcarcinomer(CK5/6, CK14,...)

nervesystemet

Melanocytter i huden

Nevrogene svulster(S‐100, CD56,...)

Melanomer(S‐100, HMB45, melanA,..

tarm, luftveier, mamma,lever, pancreas,...

Adenocarcinomer (hovedsaklig)CK7, CK8, CK18, CK20,..

BindevevFibrosarkomer (vimentin,..)

Hematopoietiske system/benmargLymfomer, levkemier(CD45: alleCD3: T‐lymfocytter/T‐cellelymfomCD20: B‐lymfocytter/B‐cellelymfomCD15/CD30: Hodgkins lymfomMyeloperoxidase: granulocytter(myeloid levkemi) 

Blodkar/lymfekar

Karsvulster (angiosarcomer,..)(faktor VIII, CD31,C D34,D2‐40)

Benvev/bruskOsteosarcom/chrondrosarcom

MusklerDesmin (både tverrstripet skjelettmusk. og glatt muskulatur)Glatt muskulatur (leiomyom/leiomyosarkom; SMA, h‐caldesmonTverrstripet skjelettmuskulatur (myogenin, myoD1,...)

05.06.2016

23

Eksempel: Immunfarging med antistoffet Melan‐Amot melanocyttene basalt i plateepitelet i huden:

…og også Melan‐A, mot melanocytter er positiv:

05.06.2016

24

Ectoderm

Endoderm

Mesoderm

overflate ectoderm

neurectoderm

Hud (plateepitel)Plateepitelcarcinomer(CK5/6, CK14,...)

nervesystemet

Melanocytter i huden

Nevrogene svulster(S‐100, CD56,...)

Melanomer(S‐100, HMB45, melanA,..

tarm, luftveier, mamma,lever, pancreas,...

Adenocarcinomer (hovedsaklig)CK7, CK8, CK18, CK20,..

BindevevFibrosarkomer (vimentin,..)

Hematopoietiske system/benmargLymfomer, levkemier(CD45: alleCD3: T‐lymfocytter/T‐cellelymfomCD20: B‐lymfocytter/B‐cellelymfomCD15/CD30: Hodgkins lymfomMyeloperoxidase: granulocytter(myeloid levkemi) 

Blodkar/lymfekar

Karsvulster (angiosarcomer,..)(faktor VIII, CD31,C D34,D2‐40)

Benvev/bruskOsteosarcom/chrondrosarcom

MusklerDesmin (både tverrstripet skjelettmusk. og glatt muskulatur)Glatt muskulatur (leiomyom/leiomyosarkom; SMA, h‐caldesmonTverrstripet skjelettmuskulatur (myogenin, myoD1,...)

…og positiv er også HMB45:som er et antistoff mot melanosomer. Er tilstede i normale melanocytter i fosterlivet, men ikke i normale, hvilendemelanocytter senere.Antigenet dukker opp igjen i aktiverte melanocytter, som ved betennelsestilstander,og ved godartede og ondartede føflekker. 

Diagnose:Malignt melanom(ondartet føflekk)

05.06.2016

25

Disposisjon

• Definisjoner

• Viktigheten av immunhistokjemi

• Metode

• Fallgruber

• Fagansvar for immunhistokjemisk lab – hvordan gripe det an…

• Embryologi – kortversjonen

• Et eksempel fra rutinediagnostikken på OUS

• Noen råd og tips…

… hvordan gripe det an…:

05.06.2016

26

Nyttig:  NordiQC nettside: http://www.nordiqc.org/

På nettsiden liggerogså

NordiQC listeover top 20

IHK websites→→ 

Nyttig bok:Mogens Vyberg:Anvendt immunhistokemi( selv om den nåikke er helt ny lenger)

Valg å gjøre ved innkjøring av IHK protokoller

• Optimal klon/antistoff til den aktuelle problemstilling– sjekk NordiQC , artikler på PubMed, spør evt samarbeidspartnere,…

• Forbehandlingsbuffer• Konsentrasjon av primærantistoffet• Deteksjonssystem• Vev å teste på (normalvev/tumorvev…)• Sammensetning av positivkontrollen (bør oftest bestå av flere 

stanser, må inneholde noe som uttrykker antigenet svakt også – og normalvev er en fordel).

• Sjekk om det foreligger særskilte krav (ved prediktive markører som østrogen‐og progesteronreseptor, HER2, ALK, CD117,…)

• Det som står i antistoff dataarket kan være upålitelig !

05.06.2016

27

Dette har vist seg nyttig hos oss på IHK lab på OUS: 

• Arkivér alle testsnitt ved uttesting av nye antistoffer– skriv   på glasset fargedato, produktnr for primærantistoffet, forbehandlingsbuffer og deteksjonssystem .

• Fyll ut et testskjema for hvert nytt antistoff, som alle på laben har tilgang til• Opprett en excelfil alle på laben har tilgang til, for å holde orden på uttestinger og godkjente protokoller• Lag en digital mappe (evt som alle har tilgang til), for hvert enkelt antistoff:

– Log (som en wordfil; lavterskel! – notater, mailer, råd/tips/ utdrag fra artikler, konklusjoner…)– Dataark– Artikler

• Lag digital huskelapp for hvert antistoff til bruk ved hurtig sjekk av positiv‐kontroller (kan hente bilder/info bl a fra NordiQC nettsider, dataark fra ulike leverandører, artikler, etc…)

• Positivkontroller:– Nummerer pos ktr blokkene – og skriv pos ktr blokknr på hvert glass– Lag digital mappe med oversikt over kontrollblokkene (blokknr og innhold i blokkene, dato for 

støping, dato for når tatt inn/ut av bruk.)– Positivkontroll‐snittenemå  ikke stå i romtemperatur mer enn 1‐2 uker! Vår praksis på OUS er:

• i romtemperatur : maks 1‐2 uker (holder litt lengre i kjøleskap)• ‐20 °C: 4‐6‐uker• ‐80 °C: >6‐uker(Spesielt sårbart: østrogen‐ og progesteronreceptor, HER2, virus, …)

– Unngå sollys på snitt (gjelder både på fargede og ufargede snitt).• Lag multiblokker til uttesting av antistoffer – og lag digital mappe med oversikt over inn holdet i 

multiblokkene• Husk personvernhensyn ved lagring av notater/div info ! (remissenummer koblet med diagnose er 

sensitive opplysninger, hvis lagres på steder hvor leseren samtidig har tilgang til pasient navn/fødselsdata (?).

Fyll ut ett slikt digitalt  testark for hvertnytt antistoff  og logfør uttestingeneunderveis her.                              

Opprett to digitale mapper på et fellesområde hvor skjemaeneplasseres:‐ Protokoller under arbeid‐ Protokoller godkjent

forts….dette har vist seg nyttig hos oss på IHK lab på OUS: 

Tips: Ingen bestilling av nyttantistoff før skjemaet er fyllt ut!

Skjemaet er laget etter en mal fra Søren Nielsen v/Aaborg Sykehus

05.06.2016

28

forts….Dette har vist seg nyttig hos oss på IHK lab på OUS: 

Excelfil som opprettes på et fellesområde for å holde orden på uttesting av nye antistoffer

Skjema for kontrollblokk

05.06.2016

29

05.06.2016

30

Takk for oppmerksomheten!