ENZIMTECHNOLGIA

Krnyezettechnolgiai laboratriumi gyakorlat

ELTE Kmiai Intzet, Szerves Kmia Tanszk

2

Bevezets

Az enzimek

Az enzimek az l szervezetekben vgbemen kmiai reakcik fehrje tpus kataliztorai (biokataliztorok). Katalitikus tulajdonsguk a szervetlen kataliztorokhoz hasonlan a reakcisebessg nvelsben nyilvnul meg, j reakcit megnyitsval (1. bra). A kmiai reakcik egyenslyi llapott az enzimek nem befolysoljk, csupn az egyensly kialakulst gyorstjk meg ms kataliztorokhoz hasonlan.

Reaktnsok

Termk(ek)

Eakt(katalitikus)

Eakt(nem katalitikus)

Eakt

Energia

1. bra

Ms fehrjkhez hasonlan, az enzimek is egyszerek (proteinek) vagy sszetettek (proteidek) lehetnek. A proteineket csak polipeptidlnc alkotja. A proteidek kz tartoz enzimek fehrjerszbl (apoenzim) s nem fehrjetermszet rszbl (koenzim) plnek fel. Az apoenzim s a koenzim egyttest holoenzimnek nevezzk. Az apoenzim nem kpes funkcijt elltni a koenzim nlkl.

Az enzimmolekulk azon rszt, amely kzvetlenl rszt vesz a katalzisben aktv centrumnak nevezzk. Az aktv centrumot a kthely s a katalitikus hely egyttese alkotja. A kthelyen trtnik a szubsztrtmolekula (azon molekula, amelynek talakulst az enzim katalizlja) megktse msodrend ktsek kialaktsval, a kthelyet kpez aminosav-oldallncok segtsgvel. A kthely kzelben lv katalitikus helyen olyan aminosav-oldallncok tallhatk, amelyek kzvetlenl kzremkdnek a szubsztrt katalitikus talaktsban. Az sszetett enzimeknl a koenzim is rszt vesz a katalitikus hely felptsben.

S

E E

S P

E (ES)x E + P

E

Akt

v c

entr

um

kthely

katalitikushely

2. bra

S: Szubsztrt E: Enzim P: Termk ES: Enzim szubsztrt komplex

3

pH

enzimaktivits

3. bra

Az enzimek esetben tbbfle specifitsrl beszlhetnk: 1.) szubsztrtspecifits: pl. a glkzizomerz csak a glkz-fruktz talakulst katalizlja,

ms aldz-ketz talakulst nem; 2.) reakcispecifits: klnbz enzimek ms-ms ton alaktjk t ugyanazt az anyagot,

pl. az -amilz a kemnytlnc belsejben segti el a hidrolzist, gy termkknt dextrinek kpzdnek, ezzel szemben a -amilz hatsra a kemnytmolekulk vgeirl maltz egysgek hasadnak le;

3.) sztereospecifits: kirlis vegyletek esetben csak meghatrozott konfigurcij molekulk talaktsa trtnik meg, vagy meghatrozott konfigurcij termk kpzdhet csak.

Az enzimek katalitikus hatsnak szmszer jellemzsre szolgl az enzimaktivits. Ez megadja, hogy adott id alatt, adott mennyisg enzim mennyi anyagot kpes talaktani szigoran definilt krlmnyek (T, pH stb.) kztt.

Az enzimes katalzist szmos tnyez befolysolja. A szubsztrt mennyisge, a hmrsklet, pH stb. mind hatssal vannak a reakci-sebessgre (enzimaktivitsra). Egy-egy tnyez hatsa a tbbi lland rtken tartsa mellett vizsglhat.

Az enzimaktivits pH-fggst a 3. brn lthatjuk. A gyakorlat sorn az amiloglkozidz enzimaktivitsnak pH-fggsre is hasonl grbt kell kapnunk. A reakcisebessg pH-fggst tbb tnyez eredmnyezheti. Brmely disszocicira kpes enzim- vagy szubsztrt-molekularsz szerkeze-tt ugyanis befolysolja a pH.

Az enzimek ipari alkalmazsa

Biotechnolgiai eljrsokrl beszlhetnk, ha biolgiai rendszereket alkalmaznak ipari folyamatok sorn. Ez jelentheti mikroorganizmusok felhasznlst (mikrobiolgiai technolgia) vagy enzimksztmnyek alkalmazst (enzimtechnolgia).

A biolgiai rendszerek felhasznlsnak elnyei: 1.) bonyolult kmiai reakcikat tudnak vgrehajtani a szintetikus megoldsnl

egyszerbben; 2.) enyhbb reakcikrlmnyek kztt mehet vgbe a reakci. Az elzek az enzimek nagymrtk specifitsnak s aktivitsnak ksznhetek. Sok esetben hasznljk fel immobilizlt alakban a biolgiai rendszereket, ilyenkor a

sejteket vagy enzimeket szilrd hordozhoz rgztik, gy tltenek meg velk egy oszlopot, amelyen tengedik a szubsztrt oldatt. Az immobilizci rvn megoldhat a biolgiai rendszerek jrahasznostsa, tovbb a folyamatos zemmd is biztostott. Ezek a tnyezk a termels gazdasgossgt nvelik.

Ismert enzimtechnolgiai eljrs az izocukor ellltsa. Az izocukor glkz-fruktz elegy

tmny vizes oldata, amelyet az lelmiszeriparban destszerknt hasznlnak. Elnys tulajdonsga, hogy nehezen kristlyosodik, illetve ers nedvszv kpessge miatt megakadlyozza a ksztmny vzvesztst. Magyarorszgon nagy mennyisgben gyrtanak izocukrot Szabadegyhzn. Az izocukrot kemnytbl lltjk el -amilz, amiloglkozidz s glkz-izomerz enzimek segtsgvel.

4

A kemnyt nem egyetlen, jl definilt sszettel molekulbl ll vegyletet jelent, hanem -D-glkzmolekulk kondenzcja tjn keletkezett poliszaharidok keverkt, amelyekben a glkzegysgek 1,4 ill. 1,6 ktssel kapcsoldnak egymshoz. (4. bra)

4. bra

A kemnyt a nvnyi sejtekben klnbz alak s felpts, fehr, szilrd szemcsk formjban rakdik le. A termszetes kemnytszemcsk kt klnbz tpus kemnytbl plnek fel. Az egyik az amilz, a msik az amilopektin. Az amilz a szemcsk belsejben, az amilopektin pedig fleg a szemcsk kls rtegben rakdik le. Mindkett -D-glkzbl pl fel. Az amilz kizrlag 1,4--glkozidktsekkel, molekuli szablyos spirlis alakak (1 spirlmenet 6 glkzegysget foglal magban). Ezzel szemben az amilopektinmolekulk elgaz oldallncokat is hordoznak, melyek gy jnnek ltre, hogy az rismolekult felpt glkzegysgek nmelyikn a 6-os sznatomhoz is kapcsoldik egy glkzmolekula acetlktssel. Az amilopektin kevs foszfort is tartalmaz foszforsavszter-csoportok formjban. Az amilz kmiai sszettelre j kzeltssel felrhat a (C6H10O5)n sszegkplet. Az n polimerizcifok rtke amilz esetben 1000 krl van. Ha eltekintnk a foszforsavszter-csoportoktl, a fenti kplet az amilopektinre is rvnyes, s itt n rtke kb. 5000. A termszetes (mg nem hidrolizlt) kemnyt hideg vzben nem olddik, ha azonban a kemnytt savval kezelik (hidrolizljk) az rismolekulk kisebb egysgekre (dextrinekre) bomlanak, ezltal n a kemnyt vzben val oldhatsga. Mivel a sav nem specifikusan hastja a glikozidos ktseket, a hidrolzis sorn nem csak klnbz mret dextrinek, hanem glkzmolekulk is keletkeznek.

A poliszacharid molekulk tl nagyok a felszvdshoz, ezrt a kemnyt l,4-glikozidos ktseit az emszts sorn, de a nvnyi s mikrobilis sejtekben a tartalktpanyagknt val felhasznlskor is az amilz enzimek hastjk. Ez a folyamat jelents a csrz gabona magvakban, ahol ezrt a csrzs sorn amilz enzimek is termeldnek. Az -amilz endo-hidrolz, a lnc bels rszben a glikozidos ktseket vletlenszeren hastja, a -amilz exo-hidrolz, a nem redukl lncvgrl maltz egysgeket hast le.

Az amiloglkozidz enzim egy exoenzim, a kemnyt nem redukl lncvgeirl glkz egysgeket hast le. A glkz izomerz enzim a glkz fruktzz val talakulst katalizlja.

Az izocukor ellltsa sorn felhasznlt nyersanyag a kukorica. A szemekbl eltvoltjk a

fehrjetartalm csrt, amelyet llati takarmnyknt hasznostanak. A csrtlantott szemeket megrlik, s a kemnytt elklntik, majd gondosan tiszttjk.

Ezutn -amilz enzimet adnak hozz, s 85-94 C-on, 5-6 pH-n elhidrolizljk a kemnytt. Ezt az enzimet hevtssel inaktivljk, s a lehttt oldathoz amiloglkozidz-ksztmnyt adnak, amely glkzig viszi tovbb a hidrolzist. Az gy kapott glkz-oldatot immobilizlt glkz-izomerz enzimmel feltlttt oszlopokon engedik t, aminek hatsra egyenslyi reakci sorn a glkz egy rsze fruktzz izomerizldik. A kapott oldatot tiszttjk s tmnyre (kb. 64 m/m %-osra) beproljk.

5

Gyakorlati munka

A gyakorlat clja:

Az ipari izocukor-elllts folyamatainak vizsglata az -amilz s amiloglkozidz enzimek katalizl hatsnak tanulmnyozsval (enzimaktivits pH-, s hmrsklet-fggsnek mrse).

Egy adott enzim aktivitsnak meghatrozst kt mdon vgezhetjk el, megmrhetjk: a) adott id alatt, adott hmrskleten s pH-n az enzim menyi szubsztrtot kpes

talaktani b) adott id alatt, adott hmrskleten s pH-n az enzim mennyi termket kpes

ellltani. A gyakorlat kt feladatcsoportbl ll:

A) Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak fggvnyben 40 s 60 oC-on.

Az -amilz enzim aktivitst a vzoldhat kemnyt (szubsztrt) koncentrcijnak cskkensvel jellemezzk. A kemnyt jddal sttkk sznreakcit ad. A glkz egysgekbl felpl kemnyt hidrognhidakkal stabilizlt heliklis, azaz spirlalak amilzlnca ugyanis csszer szerkezetet alkot, ami a jdmolekulkat zrvny formjban, adszorpcis komplexknt kpes megktni, ez okozza, hogy a kemnyt kk elsznezdst ad, ha jd-oldatot cseppentnk hozz. A kk szn intenzitsa 600 nm hullmhosszon, spektrofotometrisan meghatrozhat. A kemnytnek az -amilz enzimmel val hidrolzisnek elrehaladst a kialakult komplex sznnek vltozsa jelzi. Az oldat jddal mindaddig kk sznezdst ad, amg kemnyt van jelen. A hidrolzis elrehaladtval, a kk szn ibolyra, majd barnra vltozik, mert ezeket a szneket mr a nagyobb, illetve kzepes molekulasly dextrinek adjk. Ha a barna szn is eltnik, az azt jelenti, hogy legfeljebb kisebb molekulasly dextrinek vannak jelen az oldatban.

A hidrolzis elrehaladsval cskken mennyisg kemnyt-jd komplex 600 nm mrt abszorbancija egyenes arnyos a kemnyt koncentrcijval (Lambert-Beer trvny):

A= -lg(I/Io)= cl

ahol A az abszorbancia, Io a bees fny intenzitsa, I az anyagon thaladt fny intenzitsa, a molris abszorpcis egytthat, l az anyagon thalad fnyt hossza, c a koncentrci. Az -amilz enzim aktivitsnak meghatrozshoz a hidrolzis id elteltvel megmrjk a klnbz enzimkoncentrcij oldatok abszorbancijt, majd a kapott rtkekeket brzoljuk az enzimkoncentrci fggvnyben. A kapott grbvel a hidroliztum kemnyttartalmnak vltozst tudjuk jellemezni az enzimkoncentrci fggvnyben.

B) Az amiloglkozidz enzimaktivitsnak vizsglata a pH-fggvnyben. A kemnytnek amiloglkozidz enzimmel trtn hidrolzise sorn D-glkz keletkezik, melynek mennyisgt kt klnbz mdszerrel mrjk meg: jodometris titrlssal s spektrofotometrisan.

6

A jodometris meghatrozs sorn lgos oldatban a jdbl hipojodit keletkezik, ami az enzimes hidrolzis sorn keletkez D-glkz formilcsoportjt karboxilcsoportt oxidlja. Az oxidcit jdfelesleggel vgezzk, amit az oldat savanytsa utn tioszulft-oldattal mrnk vissza; majd a feleslegben adott s a fogyott jd klnbsgt vve megkapjuk az oxidcihoz szksges jd mennyisgt. Ebbl kiszmthatjuk a hidrolzis sorn keletkezett D-glkz mennyisgt. (A jodometris titrls vgpontjnak jelzsre az amiloglkozidz ltal rintetlenl hagyott kemnyttartalom szolgl.)

Reakciegyenletek

I2 + 2OH- = OI- + I- + H2O ~ CHO + OI- + OH- = ~ COO- + I- + H2O

___________________________________________________________________________

~ CHO + I2 + 3OH- = ~ COO- + 2I- + 2H2O OI- + I- + 2H+ = I2 + H2O

2S2O32- + I2 = S4O62- + 2I-

A spektrofotometris meghatrozs sorn az enzimes hidrolzissel keletkezett D-glkzt 3,5-dinitroszalicilsavval oxidljuk, ami a redoxireakciban 3-amino-5-nitroszalicilsavv redukldik, ekzben az oldat szne srgrl barnra vltozik. A kapott oldat 600 nm-en mrt abszorbancija egyenesen arnyos a keletkez 3-amino-5-nitroszalicilsav koncentrcijval.

O

OH

OH

OH

CH2OH

COOH

OH

OH

OH

OH

CH2OH

+

OH

COOH

NO2O2N

OH

COOH

NH2O2N

+OH

A reakci sorn egyb mellkreakcik is bekvetkeznek, de a mrt abszorbancibl -kalibrcis grbe felvtele utn- visszakvetkeztethetnk a D-glkz koncentrcijra.

A gyakorlatot 5 fbl ll csoport vgzi el 6 ra alatt. A gyakorlat a kvetkez rszfeladatokbl ll:

1. A vzoldhat (elhidrolizlt) kemnyt nedvessgnek meghatrozsa

2. A vzoldhat (elhidrolizlt) kemnyt szabad glkz-tartalmnak meghatrozsa

3. Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata adott pH-n: a keletkezett D-glkz meghatrozsa jodometrisan.

4. Kalibrcis grbe felvtele: ismert koncentrcij D-glkz-oldatokkal vgzett 3,5-dinitroszalicilsavas oxidcit kvet abszorbancia meghatrozsa 600 nm-en.

5. Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata klnbz pH-rtkeken

7

(pH=3,5 pH=4,5; pH=5,5; pH=6,5): a keletkezett D-glkz meghatrozsa spektrofotometrisan.

6. pH=5,5 foszft puffer-oldat elksztse

7. Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak fggvnyben 40 oC-on

8. Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak fggvnyben 60 oC-on

1. A vzoldhat (elhidrolizlt) kemnyt nedvessgtartalmnak meghatrozsa

Mivel az elhidrolizlt kemnyt vizet s kis mennyisg glkzt is tartalmaz, az oldat

tnyleges kemnyttartalma nem egyezik meg az 1 vegyes %-os bemrsi koncentrcival. Ezrt szksges az elhidrolizlt kemnyt vz-s szabadglkz-tartalmnak a meghatrozsa. A nedvessgtartalom meghatrozshoz hrom, elre lemrt csiszolatos bemr ednybe mrjnk be analitikai pontossggal egyenknt 0,5 g vzoldhat kemnytt, majd helyezzk az ednykket 105 C-ra belltott szrtszekrnybe. Hrom ra elteltvel helyezzk t az ednykket exszikktorba, majd kb. 15 perc elteltvel mrjk le jbl az ednyek tmegt.

2. A vzoldhat (elhidrolizlt) kemnyt szabad glkz-tartalmnak meghatrozsa

A szabad glkz-tartalom meghatrozshoz a felhasznlsra kerl elhidrolizlt (vzoldhat) kemnytbl 1g/100 cm3 (1 vegyes %-os oldatot) koncentrcij oldatot ksztnk a kvetkez mdon. Egy 100 cm3-es fzpohrba mrjnk be analitikai mrlegen 0,5 g elhidrolizlt (vzoldhat) kemnytt, majd oldjuk fel 50,0 cm3 (pipetta) desztilllt vzben. Ezutn mrjnk ki hromszor 5 cm3 (pipetta) a vzoldhat kemnyt oldatbl hrom 100 cm3-es csiszoltdugs Erlenmeyer-lombikba.

A vzoldhat kemnyt oldat szabad glkz-tartalmnak meghatrozsa jodometrisan trtnik az albbiak szerint:

A jodometris mrs menete: A 100 cm3-es csiszoltdugs Erlenmeyer-lombikba bemrt 5 cm3-es oldatokat desztilllt

vzzel 25 cm3-re hgtjuk (mrhenger), majd hozzadunk 4 cm3 1 M NaOH-oldatot (mrhenger) s brettbl 5 cm3 0,05 M I2-oldatot. Ezutn 20 percig llni hagyjuk sttben, majd 10 cm3 0,5 M knsavval savanytjuk (mrhenger) s 0,1 M tioszulft-oldattal titrlunk.

A szabad glkz-tartalom szmtsa: A tioszulft mroldat fogysai alapjn, a jd- s tioszulftoldat faktornak

figyelembevtelvel szmtsuk ki a vzoldhat kemnytoldat glkztartalmt mmol/dm3-ben.

8

3. Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata adott pH-n

A felhasznlsra kerl elhidrolizlt (vzoldhat) kemnytbl 1g/100 cm3 (1 vegyes %-

os oldatot) koncentrcij oldatot ksztnk gy, hogy analitikai mrlegen mrjnk ki 0,5 g vzoldhat kemnytt, s ezt szrjuk bele az elzleg alaposan kimosott s kitrlt reaktorednybe (a bemrednyt ill. bemrpaprt mrjk vissza!). Ezutn a bemrt vzoldhat kemnytt oldjuk fel 50,0 cm3 (pipetta) adott pH-j ntrium-acett/ecetsav puffer oldatban.

A kvnt pH rtkre belltott kemnyt oldatot temperljuk a reaktorban (50 oC, 5 perc kevertets). Majd kevertets kzben adjunk hozz 0,5 cm3 (pipetta) amiloglkozidz-oldatot. Az enzimoldat hozzadstl szmtva pontosan 5 perc mlva (stopper!) pipettzzunk a reaktor tartalmhoz 5 M ntrium-hidroxid-oldatot, hogy a pH eltolsval lelltsuk az enzim mkdst. A pH=3,5 s pH=4,5 rtkre pufferelt oldatokhoz az 5 M NaOH-bl 2 cm3-t, a pH=5,5 s pH=6,5 rtkre pufferelt oldatokhoz 1 cm3-t adjunk (pipetta). Tovbbi fl percig kevertessk az oldatot, majd pipettval mrjnk ki hromszor 5 cm3 mintt hrom 100 cm3-es csiszoltdugs Erlenmeyer-lombikba az enzimaktivits meghatrozshoz. (Ezutn mossuk el alaposan a reaktort s a kevert s trljk szrazra.)

A kapott oldat glkz-tartalmnak meghatrozsa jodometrisan trtnik az albbiak szerint: A jodometris mrs menete: A reaktorbl kimrt 5 cm3-es mintkat desztilllt vzzel 25 cm3-re hgtjuk (mrhenger), majd hozzadunk 4 cm3 1 M NaOH-oldatot (mrhenger) s brettbl 5 cm3 0,05 M I2-oldatot. Ezutn 20 percig llni hagyjuk sttben, majd 10 cm3 0,5 M knsavval savanytjuk (mrhenger) s 0,1 M tioszulft-oldattal titrljuk.

Az enzimaktivits szmtsa: A tioszulft mroldat fogysai alapjn, a jd- s tioszulftoldat faktornak

figyelembevtelvel szmtsuk ki a reaktorbl vett mintk s az eredeti kemnytoldat glkztartalmt mmol/dm3-ben.

Szmtsuk ki, hogy milyen glkzkoncentrci alakult volna ki az egyes pH-rtkeken, ha nem hgtottuk volna fel az eredetileg 50 cm3 trfogat mintaoldatot. Ehhez az albbi kplet hasznlhat fel:

V

50 cm

ssz

3. c( higtott oldat ) = c , ,

ahol Vssz = 50 cm3 + az enzimmkds lelltsra a reaktor tartalmhoz adott 5 M

NaOH trfogata + 0,5 cm3 enzimoldat. A hguls figyelembevtelvel kapott glkzkoncentrcik s a kemnytoldat szabad

glkz-tartalmnak klnbsgei adjk az enzimaktivits rtkeket. brzoljuk ezeket a pH fggvnyben!

4. Kalibrcis grbe felvtele: ismert koncentrcij D-glkz-oldatokkal vgzett 3,5-dinitroszalicilsavas oxidcit kvet abszorbancia meghatrozsa 600 nm-en.

Elksztjk az 2,0 g/dm3, 1,5 g/dm3, 1,0 g/dm3 s 0,5 g/dm3 koncentrcij D-glkz-oldatokat a kvetkez mdon: bemrnk 0,2 g D-glkzt (analitikai mrleg) s feloldjuk 30 cm3(mrhenger) desztilllt vzben (100 cm3-es fzpohrban), majd az oldatot 100 cm3-es

9

mrlombikba mossuk t. Ezutn az 2,0 g/dm3 trzsoldatbl megfelel hgtssal 1,5 g/dm3, 1,0 g/dm3 s 0,5 g/dm3 koncentrcij oldatokat ksztnk (10 cm3-es mrlombikokban, pipetta).

A kalibrcis grbe felvtelhez a D-glkz-oldatokbl bemrnk 3-3 cm3-t (pipetta), hozzadunk 3-3cm3 1 % -os 3,5-dinitroszalicilsavas oldatot (pipetta), a kmcsveket jl sszerzzuk, parafilmmel lezrjuk s 90 oC-os vzfrdbe helyezzk 15 percre. Ezutn a kmcsveket lehtjk, majd 1-1 cm3 40 %-os klum-ntrium-tartart-oldatot (pipetta) adunk az oldatokhoz. Megmrjk az oldatok abszorbancijt 600 nm-en, majd brzoljuk a mrt abszorbancia rtkeket a koncentrci fggvnyben.

5. Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata klnbz pH-rtkeken (pH=3,5 pH=4,5; pH=5,5; pH=6,5); a keletkezett D-glkz koncentrcijnak

meghatrozsa spektrofotometrisan

Egy kmcsbe bemrnk 1 cm3-t az 1%-os vzoldhat kemnyt oldatbl, valamint ngy msik kmcsbe bemrnk 1-1 cm3-t (pipetta) a klnbz pH rtkeken vgzett enzimatikus hidrolizis sorn kapott oldatokbl. Ezutn 2-2 cm3 vizet s 3-3 cm3 1%-os 3,5-dinitroszalicilsavas oldatot pipettzunk az oldatokhoz, a kmcsvek jl sszerzzuk, majd parafilmmel lezrjuk s 90 oC-os vzfrdbe helyezzk 15 percre. Ezutn a kmcsveket lehtjk, majd 1-1 cm3 40 %-os klum-ntrium-tartart-oldatot (pipetta) adunk az oldatokhoz. Megmrjk az oldatok abszorbancijt 600 nm-en. A kalibrcis grbe segtsgvel meghatrozzuk az oldatok D-glkz koncentrcijt, majd a kapott koncentrcikat a pH fggvnyben brzoljuk.

6. pH=5,5 foszft puffer-oldat elksztse

Bemrnk 1,28 g (3,5 mmol) kristlyos Na2HPO4.12 H2O-t, s feloldjuk 200 cm

3 desztilllt vzben (400-500 cm3-es fzpohrban). Az oldathoz ezutn kis rszletekben annyi 1%-os H3PO4-at adunk, hogy a pH 5,5 legyen (az oldat pH-jt mszerrel ellenrizzk), majd egy 500 cm3-es mrlombikba ntjk s jelre tltjk. Az elkszlt oldatot nvvel s a szksges adatokkal megjelljk.

7. Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak

fggvnyben 40 oC-on

Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglathoz a felhasznlsra kerl elhidrolizlt (vzoldhat) kemnytbl 1 g/100 cm3 (1 vegyes %-os oldatot) koncentrcij oldatot ksztnk a kvetkez mdon. Mrjnk be 0,5 g vzoldhat kemnytt egy 250 cm3-es Erlenmeyer-lombikba, szuszpendljuk el 30 cm3 desztillt vzben, majd ntsnk hozz 70 cm3 forr desztillt vizet. Ha szksges forraljuk mg az oldatot, hogy teljesen homognn vljon. Miutn az oldat lehlt mrhenger segtsgvel egsztsk ki a trfogatt 100 cm3-re.

Ezutn 9 db kmcsvet sorszmmal ltunk el s az -amilz oldatbl hgtsi sorozatot ksztnk az albbi tblzatban ismertett mdon:

10

kmcs 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

0,5%-os vzoldhat kemnyt oldat (cm3) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

pH=5,5 puffer-oldat (cm3) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

csapvz (cm3) 6,0 5,9 5,8 5,7 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2

-amilz-oldat (cm3) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

A kmcsvek tartalmt sszerzzuk, majd fl ra hosszat 40 oC-os vzfrdbe helyezzk. A reakciid elteltvel a kmcsveket Bunsen-g lngjba tartjuk, tartalmukat vatosan felforraljuk. (Magas hmrskleten az enzim elveszti aktivitst.) Ezutn a kmcsvek tartalmt lehtjk, s 1-1 csepp Lugol-oldatot (5g I2 + 10g KI/100 cm

3 vz) adunk az oldatokhoz. Feljegyezzk az oldatok sznt, majd 600 nm hullmhosszon meghatrozzuk az abszorbancia rtkeket. (Ha szksges, az oldatokat mrs eltt higtjuk.) Az szlelseket tblzatba jegyezzk fel, grafikusan brzoljuk az abszorbanci-enzimkoncentrci rtkeket, s rtkeljk a vltozsokat!

8. Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak fggvnyben 60 oC-on

Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglathoz a felhasznlsra kerl elhidrolizlt (vzoldhat) kemnytbl 0,5 g/100 cm3 (1 vegyes %-os oldatot) koncentrcij oldatot ksztnk a kvetkez mdon. Mrjnk be 0,5 g vzoldhat kemnytt egy 250 cm3-es Erlenmeyer-lombikba, szuszpendljuk el 30 cm3 desztillt vzben, majd ntsnk hozz 70 cm3 forr desztillt vizet. Ha szksges forraljuk mg az oldatot, hogy teljesen homognn vljon. Miutn az oldat lehlt mrhenger segtsgvel egsztsk ki a trfogatt 100 cm3-re.

Ezutn 9 db kmcsvet sorszmmal ltunk el s az -amilz oldatbl hgtsi sorozatot ksztnk az albbi tblzatban ismertett mdon:

kmcs 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

1%-os vzoldhat kemnyt oldat (cm3) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

pH=5,5 puffer-oldat (cm3) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

csapvz (cm3) 6,0 5,9 5,8 5,7 5,6 5,5 5,4 5,3 5,2

-amilz-oldat (cm3) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

A kmcsvek tartalmt sszerzzuk, majd fl ra hosszat 60 oC-os vzfrdbe helyezzk. A reakciid elteltvel a kmcsveket Bunsen-g lngjba tartjuk, tartalmukat vatosan felforraljuk. (Magas hmrskleten az enzim elveszti aktivitst.) Ezutn a kmcsvek tartalmt lehtjk, s 1-1 csepp Lugol-oldatot (5g I2 + 10g KI/100 cm

3 vz) adunk az oldatokhoz. Feljegyezzk az oldatok sznt, majd 600 nm hullmhosszon meghatrozzuk az abszorbancia rtkeket. (Ha szksges, az oldatokat mrs eltt higtjuk.) Az szlelseket tblzatba jegyezzk fel, grafikusan brzoljuk az abszorbanci-enzimkoncentrci rtkeket, s rtkeljk a vltozsokat!

11

Jegyzknyv ksztse A gyakorlatrl egy jegyzknyvet kell kszteni, az t hallgatnak kln-kln az ltala vgzett feladatokbl, kitltve a megfelel jegyzknyvi lapokat. Az elksztett jegyzknyvnek tartalmaznia kell: az elvgzett munka tmr lerst; a mrsi adatokat s szmtsokat; eredmnyek szveges rtkelst.

Feladatcsoport Szksges jegyzknyv adatlapok

A hallgat 1.- 5. lapok

B hallgat 6.-10. lapok

C hallgat 11.-13. lapok

D hallgat 14.-15. lapok

E hallgat 16.-17. lapok

FELADATOK BEOSZTSA

A hallgat Elvgzend feladatok - A vzoldhat (elhidrolizlt) kemnyt nedvessgnek meghatrozsa (1.feladat)

- Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata pH=3,5 s 4,5 puffer-oldatban (3.feladat)

B hallgat Elvgzend feladatok -A vzoldhat (elhidrolizlt) kemnyt szabad glkz-tartalmnak meghatrozsa (2.feladat)

- Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata pH=5,5 s 6,5 puffer-oldatban (3.feladat)

C hallgat Elvgzend feladatok -Az abszorbancia-D-glkz koncentrci kalibrcis grbe felvtele (4. feladat)

- Az amiloglkozidz enzim katalizl hatsnak vizsglata klnbz pH-rtkeken: a keletkezett D-glkz koncentrcijnak meghatrozsa spektrofotometrisan (5.feladat)

12

D hallgat Elvgzend feladatok - pH=5,5 foszft puffer-oldat elksztse (6.feladat)

-Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak fggvnyben 40 oC-on (7.feladat)

E hallgat Elvgzend feladatok -pH=5,5 foszft puffer-oldat elksztse (6.feladat)

-Az -amilz enzim katalizl hatsnak vizsglata az enzim koncentrcijnak fggvnyben 60 oC-on (7.feladat)

Zrthelyi

A gyakorlatok elejn a hallgatk zrthelyit rnak. A feladatrszek beosztsa fggetlen a zrthelyi krdsektl, teht minden feladatrszbl fel kell kszlni!!!

Ellenrz krdsek

-Mit neveznk biotechnolgiai eljrsnak? -Mi a biotechnolgiai eljrs elnye? -Mit neveznk enzimnek? -Mit neveznk enzimaktivitsnak? -Milyen mdokon lehet egy enzim aktivitst meghatrozni? -Milyen mdon befolysoljk a kmiai reakcikat az enzimek? -Milyen talakulst katalizl az -amilz enzim? -Milyen talakulst katalizl az amiloglkozidz enzim? -Milyen talakulst katalizl a glkzizomerz enzim? -Mit neveznk izocukornak? -Mi a Lambert-Beer trvny? -Mi a kemnyt? Milyen szerkezeti rszekbl ll? -Milyen monoszacharid nyerhet a kemnyt hidrolzise sorn? Mi a kplete? Rajzolja le! -Mi a pH? -Mi a puffer-oldat? Mi a szerepe? Mibl kszthetnk puffer-oldatot? -Mi a Lugol-oldat? -Egy mintn jdprbt vgznk Lugol-oldattal. A minta szne kk lett. Milyen kvetkeztetst tudunk levonni a sznvltozsbl? -Egy mintn jdprbt vgznk Lugol-oldattal. A minta szne lila lett. Milyen kvetkeztetst tudunk levonni a sznvltozsbl? -Egy mintn jdprbt vgznk Lugol-oldattal. A minta szne barna lett. Milyen kvetkeztetst tudunk levonni a sznvltozsbl? -Egy mintn jdprbt vgznk Lugol-oldattal. A minta szne srga lett. Milyen kvetkeztetst tudunk levonni a sznvltozsbl? -Ismertesse, hogy milyen mdszereket alkalmazunk a gyakorlaton a hidrolzis sorn kapott D-glkz-koncentrcijnak meghatrozsra?

13

-Ismertesse az amiloglkozidz enzimaktivitsnak nyomonkvetsre alkalmazott jodometris titrls menett! Milyen vgpontjelzst alkalmazunk? -Hogyan hatrozza meg az albbi adatok alapjn a vizsglt kemnyt nedvessgtartalmt!

Kemnyt tmege szrts eltt

Kemnyt tmege szrts utn

1 1,0987g 0.8043g

2 1,1352g 0.8453g

3 1,0793g 0.8362g