1. 1. ENDOCRINOLOGA GINECOLGICA CLNICA Y ESTERILIDAD 8th Edition Editors Marc A. Fritz M.D. The University of North Carolina at Chapel Hill Leon Speroff M.D. Oregon Health & Science University 2012 Lippincott Williams & Wilkins 530 Walnut Street, Philadelphia, PA 19106 USA 978-84-96921-97-9 978-0-7817-7968-5 Av. Carrilet n. 3, Edifici D Ciutat de la Justcia 08902 L'Hospitalet de Llobregat Barcelona (Espaa) Tel.: 93 344 47 18 Fax: 93 344 47 16 e-mail: lwwespanol@wolterskluwer.com Traduccin y revisinCeler Soluciones, s.l. M. Jess del Sol Jaquotot Licenciada en Medicina y Ciruga Se han adoptado las medidas oportunas para confirmar la exactitud de la informacin presentada y describir la prctica ms aceptada. No obstante, los autores, los redactores y el editor no son responsables de los errores u omisiones del texto ni de las consecuencias que se deriven de la aplicacin de la informacin que incluye, y no dan ninguna garanta, explcita o implcita, sobre la actualidad, integridad o exactitud del contenido de la publicacin. Esta publicacin contiene informacin general relacionada con tratamientos y asistencia mdica que no debera utilizarse en pacientes individuales sin antes contar con el consejo de un profesional mdico, ya que los tratamientos clnicos que se describen no pueden considerarse recomendaciones absolutas y universales. El editor ha hecho todo lo posible para confirmar y respetar la procedencia del material que se reproduce en este libro y su copyright. En caso de error u omisin, se enmendar en cuanto sea posible. Algunos frmacos y productos sanitarios que se presentan en esta publicacin slo tienen la aprobacin de la Food and Drug Administration (FDA) para un uso limitado al mbito experimental. Compete al profesional sanitario averiguar la situacin de cada frmaco o producto sanitario que pretenda utilizar en su prctica clnica, por lo que aconsejamos la consulta con las autoridades sanitarias competentes. Derecho a la propiedad intelectual (C. P. Art. 270) Se considera delito reproducir, plagiar, distribuir o comunicar pblicamente, en todo o en parte, con nimo de lucro y en perjuicio de terceros, una obra literaria, artstica o cientfica, o su transformacin, interpretacin o ejecucin artstica fijada en cualquier tipo de soporte o comunicada a travs de cualquier medio, sin la autorizacin de los titulares de los correspondientes derechos de propiedad intelectual o de sus cesionarios. Reservados todos los derechos. Copyright de la edicin en espaol 2012 Wolters Kluwer Health Espaa, S.A., Lippincott Williams & Wilkins ISBN edicin espaola: 978-84-96921-97-9 Edicin espaola de la obra original en lengua inglesa Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility, 8th edition, de Marc A.
2. 2. Fritz y Leon Speroff, publicada por Lippincott Williams & Wilkins. 2011 by LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, a WOLTERS KLUWER business 2005 by Lippincott Williams & Wilkins 530 Walnut Street Philadelphia, PA 19106 (USA) 351 West Camden Street Baltimore, MD 21201 ISBN edicin original: 978-0-7817-7968-5 Composicin: Servei Grfic NJR, S.L., Barcelona Impresin: R.R. Donnelley-Shenzhen Impreso en China Prefacio Hace 38 aos, iba andando por uno de los pasillos de Yale cuando me encontr a Bob Glass que se diriga hacia m. Se detuvo y dijo, Nate (Nathan Kase) y yo estamos escribiendo un libro. Te interesa colaborar con nosotros? Por supuesto! dije, y un ao despus apareci la primera edicin de nuestro libro, mecanografiado por m en una mquina de escribir porttil Royal, con 273 pginas y un precio de 17 dlares. No hace mucho tiempo, hablando con uno de mis compaeros, mencion que acababa de ver la primera edicin de nuestro libro y que me pareci como una cartilla de las que se usan en primaria. l me mir a los ojos y dijo, Por eso me gustaba! Muchos aos y varias ediciones despus, estaba yo en una esquina de Nueva York esperando para cruzar la calle. De repente, una idea me sacudi como una descarga. Me dej inmvil en la esquina y, cuando el semforo cambi, todo el mundo cruz menos yo. La idea era: Qu obligacin tan enorme es que en nuestro libro no haya nada que pueda llevar a la asistencia inadecuada de una paciente. Haba que hacerlo bien! Cmo llegu aqu? Mis abuelos, mi padre y mi to eran campesinos de las montaas de Macedonia, en la frontera norte de Grecia. Un da de 1911 mi abuelo se fue y desapareci. Durante los siguientes 10 aos, el pueblo ayud a mi abuela a sacar adelante a sus dos hijos. Un da de 1921, mi abuela recibi un telegrama escrito a mano por mi abuelo, que deca: Estoy en Sofa, Bulgaria. Ven y renete conmigo. Durante esos 10 aos haba estado en Estados Unidos, trabajando en la construccin del ferrocarril. No envi dinero alguno. Mi abuela y sus dos hijos anduvieron 320 kilmetros hasta llegar a Bulgaria. No fue tan difcil como suena, porque aunque caminaron durante 2 meses de pueblo en pueblo, sus habitantes les proporcionaron alimentos y un lugar donde dormir. Encontraron a mi abuelo en un hotel, con miles de dlares ahorrados de su trabajo en Amrica. La idea era comprar una granja, pero de algn modo les estafaron la mitad del dinero y no consiguieron nada a cambio. Mi padre, que tena entonces 18 aos, dijo, Si puedes ganar tal cantidad de dinero en Amrica, vamos. Llegaron a travs de Ellis Island a Ohio, donde un buen amigo de la familia haba encontrado un trabajo para mi abuelo en la fbrica de acero de Lorain. Con el dinero que les quedaba, compraron una granja de 10 hectreas. En esa granja pas mis primeros aos, hablando macedonio y poco ingls. En este momento, se est usted preguntando, Qu objeto tiene contar esta historia? El objeto es que si me hubiera dicho cuando yo era un nio cmo cambiara mi vida, nunca le hubiera credo. Si me hubieran dicho que algn da estara escribiendo un prefacio para la 8.a edicin de un voluminoso libro mdico, no lo hubiera credo. Por los primeros aos de mi vida, nunca di nada por sentado. Valoro profundamente todo lo que ha sucedido a lo largo de mi carrera, especialmente este libro. Durante muchos aos y a travs de mltiples ediciones en once idiomas, este libro ha abierto puertas y nos ha permitido a m y mi familia hacer amigos en numerosos pases. Estoy muy agradecido por una experiencia que siempre ha sido emocionante y edificante. Ya es momento de pasar el relevo. Marc Fritz lleg a Oregn en 1981 para formarse en endocrinologa de la reproduccin. Pronto le ped a Marc que escribiera una revisin sobre la regulacin del ciclo menstrual. Cuando termin, dej el manuscrito en el buzn de mi consulta un viernes por la tarde, cuando yo no estaba, previendo una destruccin crtica de su trabajo. No tuvo que esperar mucho. Le
3. 3. llam ese domingo por la tarde, pero con un mensaje que l no esperaba. Le felicit por el trabajo y de lo impresionado que estaba por su capacidad para articular el conocimiento cientfico de un modo tan claro y conceptual. Algunas de las frases que escribi permanecen en el captulo 6. Este libro quizs sea la nica obra mdica que queda de este tamao escrita por un solo autor, razn por la que el estilo de la redaccin es uniforme de principio a fin. Y el estilo ha sido siempre un factor importante de su xito, que ha evitado la jerga mdica y que nunca temi establecer conclusiones mdicas importantes y recomendaciones basndose en los conocimientos mdicos actualizados. Marc Fritz y yo hemos sido buenos amigos desde 1981, y sus escritos me demostraron que me iguala en su compulsin por hacerlo bien y sus esfuerzos por ser clnicamente fiable. Por estos motivos, Marc era una eleccin natural y obvia para convertirse en el autor senior de este libro. Actualmente soy profesor emrito, conduzco un tractor, practico tranquilamente el bisbol, pesco con mosca y sigo escribiendo. Os deseo a todos una buena salud, y una vida feliz y gratificante. Leon Speroff Portland Oregn Hace 29 aos, se inici mi perodo de formacin en endocrinologa de la reproduccin con Leon Speroff. Era el primer alumno de Leon, y llegu a Portland, Oregn, en 1981, impaciente, excitado y con determinacin. Los siguientes dos aos moldearon y dieron forma, en muchos aspectos, a todo lo que ha venido despus. El relato de Leon sobre el primer manuscrito que escrib como residente es bastante real. Cuando recib el encargo, me sent de nuevo ansioso, excitado y con determinacin, pero tambin con dudas. Pas innumerables horas buscando entre las estanteras y copiando artculos en la biblioteca mdica, organizando y resumiendo la bibliografa en fichas de 4 6, y mecanografiando el artculo en una mquina de escribir porttil Underwood en la mesa de la cocina. Ech el resto con el encargo asignado, pero no estaba totalmente seguro de que fuera lo suficientemente bueno. Cuando sali aquella revisin sobre el ciclo menstrual, publicada como artculo de Modern Trends en Fertility and Sterility en 1982, se convirti en la base de una amistad para toda la vida. Durante mi perodo de residencia, este libro (entonces en su 2.a edicin, con un total de 433 pginas) fue una compaa constante. Lo le y rele desde la cubierta a la contracubierta, y en sus pginas encontr mi pasin, el trayecto de mi carrera y a mi profesor. Si me hubieran dicho entonces que algn da estara escribiendo un prefacio para la 8.a edicin de esta obra, no lo hubiera credo. En los aos que siguieron a mi formacin en Oregn me convert en un compaero de cada edicin de las posteriores. Para m, leer el libro era lo ms parecido a tener una conversacin con Leon, o igual que escucharle en una conferencia; siempre claro, lgico y prctico, con un toque personal. Cuando Leon me invit a ser coautor de la 7.a edicin del libro, sent muchas de las mismas emociones que tuve cuando estaba preparando aquel primer manuscrito como residente; era natural. Fue un placer trabajar juntos de nuevo preparando la edicin anterior y sta que nos ocupa. Me siento verdaderamente honrado por llegar a ser el autor senior de este libro y por encargarme de su futuro. Soy consciente de la responsabilidad y agradezco enormemente la oportunidad. Comprensiblemente, Leon lo considera la entrega de un relevo y, para m, naturalmente, es como cerrar un crculo perfecto. Marc A. Fritz Chapel Hill, North Carolina P.S.: los colores de la cubierta de la 8.a edicin en ingls son los de la Universidad de Tulane. El smbolo de la cubierta es la Estrella de Macedonia de la poca de Filipo de Macedonia y Alejandro Magno.
4. 4. 1 Biologa Molecular Para Mdicos NA Herramientas de imgenes Evidentemente, la secuencia de ADN anterior es un mutante. Sin embargo, el hecho de que podamos identificar que este criptograma es una secuencia nucleotdica y diagnosticar un cambio mutante pone de manifiesto el increble avance experimentado en el conocimiento de la biologa humana. La biologa molecular es la subespecialidad de la ciencia que estudia la estructura y la funcin del genoma, es decir, el conjunto total del ADN (cido desoxirribonucleico), la macromolcula que contiene toda la informacin hereditaria. El monje austriaco Gregor Mendel pas mucho tiempo de su vida monacal estudiando su huerto de guisantes y fue el primero que expres los principios de la herencia en la dcada de 1860. Describi los rasgos dominante y recesivo, y las leyes de la transmisin que rigen la herencia homocigtica y heterocigtica de estos rasgos. Las teoras de Mendel permanecieron ocultas hasta 1900, ao en que se descubrieron. Por desgracia, Mendel falleci 16 aos antes de que se reconociera su trabajo. Sin embargo, cunto hemos avanzado en slo 150 aos, principalmente en los ltimos 50! En 1903 se propuso el emparejamiento y la separacin de los cromosomas durante la divisin celular, pero hubo que esperar hasta 1946 para que Edward Tatum y Joshua Lederberg, de la Universidad de Yale, demostraran con bacterias que el ADN portaba informacin hereditaria. James Watson y Francis Crick, que trabajaban en los Cavendish Laboratories de Cambridge, propusieron en 1953 la estructura del ADN creando un modelo basado en los parmetros que Maurice Wilkins y Rosalind Franklin haban obtenido mediante cristalografa de rayos X. Crick, Watson y Wilkins recibieron el premio Nobel en 1962; Franklin falleci en 1958, y este galardn no se otorga a ttulo pstumo. En la replicacin del ADN participan numerosos sistemas enzimticos. La ADN polimerasa se aisl en 1958, y la polimerasa del cido ribonucleico (ARN), en 1960. En 1978 Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans recibieron el premio Nobel por su descubrimiento, en la dcada de 1960, de la accin enzimtica en el empalme o el corte del ADN. El uso de las enzimas ligasa y endonucleasa de restriccin permiti producir molculas de ADN recombinante, hito logrado por Paul Berg en la Universidad de Stanford en 1972. E. M. Southern, de la Universidad de Edimburgo, desarroll en 1975 la tcnica para transferir ADN de geles de agarosa a filtros de nitrocelulosa, lo que permite unir fragmentos de ADN a sondas de ARN radiomarcadas y, por lo tanto, aislarlos. La clonacin de genes o de fragmentos de ADN fue el resultado de un descubrimiento decisivo: la posibilidad de introducir en bacterias plsmidos que portan molculas de ADN exgeno, lo que culmin en la replicacin del ADN exgeno. El genoma es el conjunto completo de ADN de un organismo. Un gen es una regin contigua de ADN que puede codificar un producto proteico y contiene secuencias reguladoras que regulan su expresin. Se necesitaba un neologismo para designar el estudio de las funciones e interacciones de todos los genes del genoma, y en 1987 se acu el trmino genmica, a partir de una publicacin con el mismo nombre. Hemos entrado en la era de la biologa molecular. En poco tiempo los problemas endocrinos se explicarn, se diagnosticarn y se tratarn a nivel molecular. En breve, los anlisis hormonales tradicionales no sern ms que una prctica mdica del pasado. El poder de la biologa molecular nos alcanzar a todos, y a lo largo de este libro se percibirn las numerosas contribuciones de la biologa molecular. Pero, por desgracia, la biologa molecular habla su propio idioma, un idioma que es casi incomprensible para los no iniciados. En este captulo queremos ofrecer una introduccin a la medicina molecular.
5. 5. Comenzar un libro clnico con un captulo sobre biologa molecular y otro sobre bioqumica no hace ms que recalcar que el juicio clnico competente se funda en un trabajo preliminar de conocimientos bsicos. Por otra parte, la prctica clnica no exige un dominio tcnico y complejo de una ciencia bsica. Por tanto, la finalidad de estos dos primeros captulos no es presentar un curso intensivo de una ciencia bsica, sino repasar los principios ms importantes y la informacin necesaria para desarrollar los conceptos clnicos y fisiolgicos que deben seguirse. Tambin pretendemos que en estos captulos se puedan consultar ciertos detalles que a todos nos cuesta trabajo recordar. Los cromosomas Los seres humanos somos eucariotas, organismos que tienen clulas con un ncleo verdadero delimitado por una membrana nuclear y que se reproducen por mitosis. Las bacterias son procariotas, organismos que carecen de un ncleo verdadero y que se multiplican mediante divisin celular. Con la excepcin del ADN del interior de las mitocondrias, todo nuestro ADN est empaquetado en un ncleo rodeado de una membrana nuclear. Se cree que las mitocondrias descienden de bacterias primitivas absorbidas por nuestros ancestros, y que todava contienen genes importantes. Dado que los vulos son ricos en mitocondrias, las enfermedades debidas a los genes mitocondriales (p. ej., la neuropata ptica de Leber) son transmitidas por la madre. Las mitocondrias del espermatozoide se eliminan durante la fecundacin. Los cromosomas son paquetes de material gentico formados por una molcula de ADN (que contiene muchos genes) a la que se une un gran nmero de protenas que mantienen la estructura del cromosoma y participan en la expresin gnica. Las clulas somticas humanas contienen 46 cromosomas: 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales. Todas las clulas somticas son diploides, es decir, tienen 23 pares de cromosomas. Slo los gametos son haploides, ya que tienen 22 cromosomas autosmicos y uno sexual. El tamao de los cromosomas vara entre los 50 millones y los 250 millones de pares de bases. El cromosoma 1 contiene casi todos los genes (2 968) y el cromosoma Y tiene el nmero menor (231). Todos constan de una porcin ms estrecha denominada centrmero, que divide el cromosoma en dos brazos, el brazo corto p y el brazo largo q. Los dos miembros de cada par de autosomas son homlogos, de forma que cada uno de ellos deriva de un progenitor. El nmero de cromosomas no indica el grado de sofisticacin y complejidad evolutivas; el perro tiene 78 cromosomas y la carpa, 104! Un gen es una unidad de ADN dentro de un cromosoma que puede activarse para transcribir un ARN especfico. La localizacin de un gen en un cromosoma concreto se denomina locus. Al existir 22 pares de autosomas, casi todos los genes tambin son pares. Estos pares son homocigticos cuando se parecen y heterocigticos cuando son distintos. Slo el 2 % del genoma humano est formado por genes que codifican la sntesis de protenas. En 1952, Alfred Hershey y Martha Chase confirmaron que el ADN es la fuente de la transmisin gentica. Su informe se hizo famoso como el experimento de la batidora, en el que el ADN marcado de bacterifagos infect bacterias y la agitacin de la batidora separ las partculas de los fagos, demostrando que el marcador radioactivo se encontraba nicamente en las clulas bacterianas. El cariotipo humano habitual es una imagen que presenta los cromosomas distribuidos en pares, obtenida normalmente despus aplicar tratamiento proteoltico y tincin de Giemsa para producir patrones caractersticos de formacin de bandas, lo que permite elaborar un plano til para su localizacin. Con la tincin, cada brazo se divide en regiones y cada regin en bandas que se numeran desde el centrmero hacia el exterior. Para designar un punto determinado en un cromosoma se sigue este orden: nmero del cromosoma, smbolo del brazo (p indica el brazo corto y q el brazo largo), nmero de la regin y nmero de la banda. Por ejemplo, 7q31.1 es la localizacin del gen de la fibrosis qustica. Mitosis Todos los eucariotas, desde las levaduras hasta los seres humanos, experimentan un tipo similar de divisin y multiplicacin celulares. La divisin nuclear de todas las clulas somticas se denomina mitosis, y durante este proceso cada cromosoma se divide en dos. Para que el crecimiento y el desarrollo sean normales, es necesario que toda la informacin del genoma se reproduzca fielmente en todas las clulas. La mitosis consta de las siguientes fases: Interfase Durante esta fase, tiene lugar toda la actividad normal de la clula, salvo la divisin activa. En ella es posible ver el cromosoma X inactivo (corpsculo de Barr o cromatina sexual) en las clulas femeninas. Profase Cuando comienza la divisin, los cromosomas se condensan y las dos cromtides se hacen visibles. La membrana nuclear desaparece. El
6. 6. centrolo es un orgnulo fuera del ncleo que forma los husos para la divisin celular; el centrolo se duplica, y cada centrolo resultante migra a un polo opuesto de la clula. Metafase Los cromosomas migran al centro de la clula, formando una lnea denominada plano ecuatorial. La condensacin de los cromosomas es mxima en esos momentos. Se forma el huso mittico, que consiste en microtbulos de protenas que parten de los centrolos de manera radial y se unen a los centrmeros. Anafase Se produce la divisin en el plano longitudinal de los centrmeros. Las dos nuevas cromtides se trasladan a lados opuestos de la clula atradas por la contraccin de los husos. Telofase Comienza la divisin del citoplasma en el plano ecuatorial y finaliza con la formacin de dos membranas celulares completas. Los dos grupos de cromosomas estn rodeados por membranas nucleares que forman nuevos ncleos. Cada cadena de ADN constituye una plantilla que sirve para duplicar el contenido de ADN de la clula. Meiosis La meiosis es la divisin celular en la que se forman los gametos, cada uno con un nmero haploide de cromosomas. La meiosis tiene dos fines: la reduccin del nmero de cromosomas y la recombinacin para transmitir informacin gentica. En la meiosis I, los cromosomas homlogos se emparejan y se separan. La meiosis II es similar a la mitosis, pues los cromosomas ya divididos se escinden y segregan formando nuevas clulas. Primera divisin meitica (meiosis I) Profase Leptoteno: Condensacin de los cromosomas. Cigoteno: Emparejamiento de cromosomas homlogos (sinapsis). Paquiteno: Cada pareja de cromosomas aumenta de espesor y forma cuatro cadenas. En esta etapa puede producirse el entrecruzamiento o recombinacin (intercambio de ADN de segmentos homlogos entre dos de las cuatro cadenas). Los quiasmas son los lugares de contacto donde se producen (y se visualizan) los entrecruzamientos. Este movimiento de bloques de ADN es un mtodo para crear diversidad gentica. Por otra parte, la insercin de secuencias durante la gametognesis puede provocar enfermedades genticas. La recombinacin transposicional, que utiliza enzimas que reconocen secuencias especficas de nucletidos, permite la insercin de un elemento gentico en cualquier regin de un cromosoma. Se trata de un mtodo empleado por los virus (como el virus de la inmunodeficiencia humana) para transformar las clulas hospedadoras. Diploteno: Separacin longitudinal de cada cromosoma. Metafase, anafase y telofase de la meiosis I La membrana nuclear desaparece y los cromosomas se mueven hacia el centro de la clula. Un miembro de cada pareja se dirige a cada polo y las clulas se dividen. La meiosis I se denomina a menudo divisin reductora porque cada producto nuevo tiene ahora el nmero haploide de cromosomas. Durante la primera divisin de la meiosis tiene lugar la herencia mendeliana. Los entrecruzamientos que se producen antes de la metafase dan como resultado nuevas combinaciones de material gentico, tanto favorables como desfavorables. Segunda divisin meitica (meiosis II) La segunda divisin se produce despus de la primera y en ella no se replica el ADN. En el ovocito, la meiosis II comienza despus de la fecundacin. El resultado final es la produccin de cuatro clulas haploides.
7. 7. Herramientas de imgenes Volver al principio Estructura y funcin del ADN El ADN es el material de los genes encargado de codificar el mensaje gentico que se transmite a travs de protenas concretas. Por tanto, es la molcula ms importante de la vida y el mecanismo fundamental para la evolucin. Los genes son fragmentos de ADN que codifican protenas especficas, junto con las secuencias flanqueadoras e intercaladas que actan controlando y regulando las funciones. Cada molcula de ADN consta de un esqueleto de desoxirribosa, es decir, grupos repetidos idnticos del azcar desoxirribosa unidos
8. 8. mediante enlaces fosfodister. Cada desoxirribosa se une por orden (lo que le confiere individualidad y especificidad) a una de las cuatro bases nitrogenadas: Una purina: adenina o guanina. Una pirimidina: timina o citosina. Los nucletidos son los elementos bsicos con los que se construye el ADN. Constan de tres elementos principales: desoxirribosa (un azcar), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Los enlaces fosfato-azcar son asimtricos; el fsforo se une al carbono 5 de un azcar y al carbono 3 del azcar siguiente. Por lo tanto, un extremo es el 5 (5 prima) y el otro es el 3 (3 prima). Por convencin, el ADN y sus secuencias nucleotdicas se escriben de izquierda a derecha, del extremo 5 al extremo 3, la direccin que sigue el proceso de transcripcin. El extremo 5 da lugar a la formacin del extremo amino de la protena, mientras que el extremo 3 forma el extremo carboxilo.
9. 9. Herramientas de imgenes
10. 10. Herramientas de imgenes El ADN consta de dos cadenas de desoxirribosa enrolladas una alrededor de la otra en el sentido de las agujas del reloj formando una doble hlice; las bases nitrogenadas ocupan la parte interior y se emparejan mediante enlaces de hidrgeno: la adenina con la timina y la citosina con la guanina. El ARN se diferencia del ADN en que slo tiene una cadena, su molcula de azcar es la ribosa y tiene uracilo en lugar de timina. Phoebus Levene, un inmigrante ruso en Estados Unidos que trabaj en el Rockefeller Institute of Medical Research desde 1905 hasta su muerte en 1940, identific los componentes del ADN (al descubrir y asignar un nombre a los azcares ribosa y desoxirribosa) y fue el primero en sugerir la estructura nucleotdica, investigacin que proporcion las bases para la posterior descripcin de la importancia del ADN. Cmo es posible que el ADN de una clula, que cuando se estira totalmente mide casi dos metros de longitud, quepa en la clula?
11. 11. Watson y Crick resolvieron este problema cuando propusieron que formaba una hlice bicatenaria muy enrollada: la doble hlice. Al igual que el centmetro es una de las unidades para medir la longitud, el par de bases (pb) es la unidad que se usa para medir el ADN. El par de bases puede ser adenina-guanina o citosina-timina, de forma que el nucletido de una cadena se empareja con el de la otra cadena que tiene enfrente. As pues, un fragmento de ADN se mide por el nmero de pares de bases, por ejemplo, un fragmento de 4 800 pb (un fragmento de 4,8 kb). Se calcula que tenemos 3 200 millones de pb de ADN, y slo una pequea parte de ellas codifican las protenas. El ADN del interior de las clulas no es una molcula desnuda. Las cadenas nucleotdicas se enrollan alrededor de un ncleo de protenas (histonas) formando un nucleosoma. Los nucleosomas se condensan en muchas bandas, que son las que se identifican en los cariotipos. Esta condensacin es otro mecanismo importante para poder empaquetar la larga estructura del ADN en una clula. Otras muchas protenas se asocian al ADN, algo importante tanto para su estructura como para su funcin. El proceso de replicacin del ADN comienza con la separacin de la doble cadena helicoidal del ADN, iniciada en varios pasos por accin enzimtica. Conforme el ADN original se desenrolla formando las cadenas plantilla, la ADN polimerasa cataliza la sntesis de las nuevas cadenas duplicadas, que vuelven a formar una doble hlice con cada una de las cadenas originales (lo que se denomina replicacin). Por consiguiente, cada molcula hija contiene una de las cadenas originales. Se calcula que la molcula de ADN original presente en el cigoto fecundado debe copiarse aproximadamente 1015 veces durante la vida de un ser humano. La rapidez y la exactitud son dos requisitos esenciales. Esta precisin unida a los sistemas de correccin de errores hace que los errores que afectan a la funcin de la protena del gen sean muy raros. Aminocido Abreviatura de tres letras Letra Glicina Gli G Alanina Ala A Valina Val V Isoleucina Ile I Leucina Leu L Serina Ser S Treonina Tre T Prolina Pro P cido asprtico Asp D cido glutmico Glu E Lisina Lis K Arginina Arg R
12. 12. Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Cistena Cis C Metionina Met M Triptfano Trp W Fenilalanina Fen F Tirosina Tir Y Histidina His H La homeosecuencia es una secuencia de ADN, muy bien conservada a lo largo de la evolucin, que codifica una serie de 60 aminocidos denominada homeodominio. Las protenas del homeodominio actan como factores de transcripcin unindose al ADN. La homeosecuencia influye en funciones especficas de los tejidos que son esenciales para el crecimiento y el desarrollo del embrin. Genoma humano El genoma de cada especie consta del conjunto completo de secuencias de ADN de todos los cromosomas. En cada genoma humano haploide hay casi 3 000 millones de pares de bases; el ADN bicatenario helicoidal se compone de 6 000 millones de nucletidos y, segn los clculos, de entre 20 000 y 25 000 genes, que es la unidad funcional de informacin hereditaria ms pequea. Los genes representan slo alrededor del 2 % del ADN humano. Aunque a primera vista parece sumamente complejo, todo el lenguaje gentico se escribe con slo cuatro letras: A, C, G y T (U en el caso del ARN). Adems, este lenguaje se limita a palabras de 3 letras: los codones. Por ltimo, todo el mensaje gentico est fragmentado en los 23 pares de cromosomas. A partir de los cuatro nucletidos, tomados de tres en tres, en total hay 64 combinaciones posibles. Bsicamente todos los organismos vivos utilizan este cdigo. El genoma slo cambia cuando se producen nuevas combinaciones heredadas de los padres o por mutacin. Segunda posicin Primera posicin (extremo 5) U C A G Tercera posicin (extremo 3) U Fen Ser Tir Cis U Fen Ser Tir Cis C Leu Ser Fin Fin A Leu Ser Fin Trp G
13. 13. C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Tre Asn Ser U Ile Tre Asn Ser C Ile Tre Lis Arg A Met Tre Lis Arg G G Val Ala Asp Gli U Val Ala Asp Gli C Val Ala Glu Gli A Val Ala Glu Gli G Si leemos la primera fila de la tabla, el codn UUU especifica la fenilalanina, el codn UCU especifica la serina, el codn UAU especifica la tirosina y el codn UGU especifica la cistena. UAA, UAG y UGA son codones de terminacin. Estructura y funcin de los genes La disposicin lineal de muchos genes forma un cromosoma. Un gen se compone de un fragmento de ADN que contiene exones separados por intrones, los codones codificador y no codificador de los nucletidos, respectivamente. Los patrones intrn-exn tienden a conservarse durante la evolucin. Se cree que los genes de la -globina y la -globina aparecieron hace 500 millones de aos y que los intrones ocupaban la misma posicin que en la actualidad. Exn El segmento de un gen que produce el ARN mensajero que codifica una protena especfica. Intrn El segmento de un gen que no est representado en el ARN maduro y que, por tanto, no codifica protenas, pero puede realizar funciones reguladoras. Codn Una secuencia de tres bases presente en el ARN o el ADN que codifica un aminocido especfico; triplete.
14. 14. Con algunas excepciones, se crea que un gen daba lugar slo a una protena. El concepto de un gen-una protena fue propuesto inicialmente en 1909 por Archibald Garrod, y respaldado experimentalmente en la dcada de 1940 por George Beadle y Edward Tatum, genetistas estadounidenses, relacionando mutaciones de un solo gen a dficits de una sola enzima. No obstante, mediante un mecanismo denominado corte y empalme alternativo, los 20 000 a 25 000 genes humanos pueden producir ms de 100 000 protenas. Como ya se ha sealado, los intrones no se traducen en protenas. nicamente las secuencias de ADN de los exones (la parte que sale del ncleo) se transcriben en ARN mensajero y, a continuacin, se traducen en protenas. Sin embargo, las variaciones (corte y empalme alternativo) pueden producir protenas relacionadas. Los genes tambin incorporan secuencias flanqueadoras que son importantes para la transcripcin gnica. El rea que iniciar la accin del ADN (p. ej., la unin del ADN al complejo hormona-receptor) se denomina regin potenciadora. El rea real en la que empieza la transcripcin es la regin promotora. Slo algunas secuencias nucleotdicas relativamente cortas son promotoras, como la secuencia T- A-T-A-A, o TATA, y la secuencia C-C-A-A-T, o CAT. Las regiones promotoras (los lugares de unin para la ARN polimerasa y numerosos cofactores) suelen estar prximas al comienzo de la regin codificadora del gen. Las regiones potenciadoras son ms grandes que las promotoras y pueden localizarse en cualquier lugar, incluso alejadas del gen, pero normalmente estn en el extremo flanqueador 5. En el extremo 3 suele haber una secuencia codificadora para la cola de poliadenina (poli-A), comn en la mayora de las molculas de ARN mensajero. Las regiones potenciadoras unen protenas (protenas reguladoras) que actan como seales para regular la expresin gnica aumentando o conteniendo la unin de la ARN polimerasa en la regin promotora. Es un mtodo para crear funciones celulares distintivas. Por ejemplo, un tejido sensible a la accin de una hormona puede responder a sta porque contiene una protena receptora especfica que, al unirse a la hormona, se unir a una regin promotora del ADN. Protenas especficas (denominadas factores de transcripcin) se unen a regiones potenciadoras y activan la transcripcin. En la regulacin de la transcripcin gnica suelen intervenir secuencias de ADN en la regin flanqueadora en direccin 5 de un gen.
15. 15. Herramientas de imgenes Tres de los codones (UAG, UAA, UGA) reciben el nombre de codones de terminacin porque especifican una parada en la traduccin del ARN en una protena (como un punto al final de una frase). En cambio, un marco de lectura abierto es una larga serie de pares de bases entre dos codones de terminacin; por consiguiente, un marco de lectura abierto codifica la secuencia de aminocidos de la protena. La deteccin e identificacin de un marco de lectura abierto es un paso importante en el anlisis de las secuencias de ADN, ya que una secuencia larga de este tipo suele encontrarse nicamente en un gen activo. La expresin gnica consta de los siguientes pasos: transcripcin del ADN en ARN; procesamiento del ARN para producir ARN
16. 16. mensajero funcional mediante la eliminacin de intrones (por corte y empalme); traduccin del ARN mensajero de un ribosoma en una cadena peptdica y procesamiento estructural de las protenas a la forma funcional. Transcripcin La transcripcin es la sntesis de ARN mensajero monocatenario a partir de un gen (ADN bicatenario). La secuencia de aminocidos de la protena es codificada en el ADN por los codones; cada codn, un triplete de tres bases nitrogenadas, codifica un solo aminocido. La ARN polimerasa construye el ARN mensajero leyendo la cadena de ADN (la cadena no codificadora) que es complementaria del ARN; as pues, el ARN es una copia exacta de la otra cadena de ADN (la cadena codificadora), que tambin se denomina cadena complementaria de la molcula de ADN (recuerde dos diferencias importantes: la timina y la desoxirribosa del ADN se sustituyen por uracilo y por ribosa, respectivamente, en el ARN). La complementariedad molecular es un concepto que resulta a la vez fcil y difcil de entender. El aspecto fcil es que una cosa es igual que otra. La parte complicada es la necesidad de comprender y visualizar que la molcula complementaria no es idntica a su plantilla, sino que ms bien es el lugar en el que la plantilla entra y la molcula complementaria sale. Por tanto, las cadenas de la doble hlice no son idnticas. Cada cadena de ADN tiene una estructura complementaria; en un sentido, una plantilla positiva y una plantilla negativa, y cada una especifica a la otra. Por consiguiente, cada cadena es una plantilla para su ADN complementario (en la replicacin) o su ARN complementario (en la transcripcin). As, el ARN mensajero se sintetiza a partir de la plantilla negativa, la cadena no codificadora, de forma que tendr la misma estructura que la plantilla positiva, la cadena codificadora. Los especialistas en biologa molecular tienen que pensar en tres dimensiones. La transcripcin comienza en el lugar de inicio en direccin 5, la regin flanqueadora no traducida de 5 en la que las dos cadenas de la doble hlice se separan. El proceso contina hacia 3, copiando una de las cadenas hasta que se alcanza un codn especfico, que proporciona un mensaje de terminacin. La sntesis del ARN prosigue con la adicin de una cadena larga de adeninas, la cola poli-A; sta es la regin 3 no traducida que supuestamente estabiliza el ARN impidiendo su degradacin. Despus de la transcripcin a partir de un gen, el ARN entra en el citoplasma, donde se cortan las regiones del intrn y se empalman los exones (corte y empalme del ARN), de forma que se produce una molcula completa de ARN maduro. El comienzo y el final de cada exn y cada intrn tienen secuencias que, cuando se copian en el ARN, envan seales a una enzima para que elimine las partes intercaladas. Casi todos los intrones comienzan con GU y finalizan con AG (GT y AG en el intrn del ADN). Los intrones tienen una longitud variable; un solo intrn puede ser ms largo que el ARN final. La molcula de ARN maduro posee un elemento adicional en uno de sus extremos (casquete formado por la adicin de un nucletido modificado, la 7-metilguanina) que lo protege frente a las ribonucleasas (RNasas); en el otro extremo, se aade una cola poliadenina (la cola de poli-A) (adems de un factor de estabilizacin, quiz una seal para dirigir la salida del ncleo). Ninguno de los extremos est traducido en los ribosomas. Herramientas de imgenes
17. 17. Herramientas de imgenes Factores de transcripcin Los factores de transcripcin son protenas que se unen a elementos reguladores del ADN (potenciadores y promotores) y que, por tanto, influyen en la expresin gnica. Los receptores de las hormonas esteroideas son factores de transcripcin. La transcripcin gnica y la formacin del ARN mensajero se estimulan o se inhiben por la interaccin directa con el ADN. Los factores de transcripcin tambin pueden interactuar con otros factores (coactivadores y correpresores, tambin llamados protenas adaptadoras) para producir efectos conjuntos. La actividad de estas protenas puede verse afectada adems por la fosforilacin desencadenada por las seales emitidas por los receptores de la superficie celular (a menudo, factores de crecimiento). Los microARN son pequeos ARN de 18 a 25 nucletidos, no codificadores de protenas, resultantes de la transcripcin de genes y que regulan la expresin gnica objetivo tanto a nivel de traduccin como de transcripcin; se han identificado ms de 1 500 mARN. Es importante considerar el resultado final de la actividad hormonal y la expresin gnica como un reflejo del contexto celular, es decir, la naturaleza y la actividad de los factores de transcripcin bajo la influencia de protenas intracelulares adaptadoras especficas. Se explica as cmo agentes similares (y factores de transcripcin similares, p. ej., el receptor estrognico) pueden ejercer acciones diferentes en tejidos distintos. Traduccin El ARN mensajero se desplaza desde el cromosoma en el que fue sintetizado hasta un ribosoma del citoplasma, donde dirige el ensamblaje de los aminocidos y su constitucin en protenas (traduccin). Cada clula presenta un proteoma caracterstico, pero dinmico y en cambio constante, que es el conjunto de protenas exclusivo de esa clula. Los aminocidos se incorporan al proceso por la accin de molculas especficas de ARN de transferencia. La secuencia concreta de tres bases en un extremo del ARN de transferencia es complementaria del codn que codifica el aminocido especfico. La unin de esta rea al codn del ARN mensajero coloca al aminocido especfico del otro extremo en la secuencia correcta para la protena. Cada vez que las molculas de ARN de transferencia leen la plantilla de ARN, se coloca un aminocido, comenzando en el extremo amino (el extremo 5) y terminando en el extremo carboxilo (el extremo 3). El proceso empieza en el primer codn, AUG, y contina hasta que se llega a un codn de terminacin (UAA, UAG o UGA), momento en el que el ARN mensajero se desprende del ribosoma y degenera. La secuencia lineal concreta de aminocidos est especificada por la codificacin gentica; a su vez, esta secuencia determina la forma tridimensional de la protena, la estructura plegada necesaria para su funcin. Slo existen 20 000 a 25 000 genes humanos codificadores de protenas, pero hay ms de
18. 18. 100 000 protenas. Evidentemente, un solo gen puede producir ms de una protena. Herramientas de imgenes La expresin final de un gen no siempre termina con el proceso de traduccin. Las protenas sufren un proceso adicional (posterior a la traduccin), como la glucosilacin (las gonadotropinas) o la escisin proteoltica (conversin de la proopiomelanocortina en ACTH). Reciben el nombre de modificaciones epigenticas. Los mecanismos que producen protenas a partir de genes son parecidos en todo el mundo biolgico. Esto significa que es posible aprender conceptos fundamentales de la funcin humana estudiando organismos simples, y que pueden fabricarse microbios para producir protenas humanas. Mutaciones Muchos genes existen en formas diversas, denominadas alelos. El cambio en una secuencia de ADN que causa un cambio perjudicial en la estructura o la funcin de una protena constituye una mutacin. La sustitucin se define como un cambio en una sola base nitrogenada. Una sustitucin en un codn puede ocasionar la incorporacin del aminocido incorrecto a una protena, lo que provoca un cambio o la prdida de la funcin. La insercin o la delecin de aminocidos en la protena final pueden deberse a un proceso errneo de corte y empalme del ARN. Dada la gran redundancia existente en el cdigo gentico (muchos codones codifican el mismo aminocido y slo hay 20 aminocidos), no todas las sustituciones producen un efecto. Un ejemplo clnico de sustitucin de una sola base (mutacin
19. 19. puntual) es la mutacin que causa la drepanocitosis, que consiste en la sustitucin de la timina por adenina en el gen de la -globina. Si las regiones homlogas del ADN estn mal alineadas, el entrecruzamiento puede ser desigual, lo que causa deleciones e inserciones (adiciones). Una mutacin finalizadora hace referencia a la sustitucin de una sola base que produce un codn de terminacin, lo que trunca la protena. Las deleciones y las inserciones pueden afectar a bases nicas, a exones enteros, o incluso a uno o varios genes. En la meiosis es habitual la recombinacin o el intercambio de material gentico. Incluso un cambio en la unin de una regin codificadora y otra no codificadora puede dar lugar a un ARN mensajero anmalo. Anomalas cromosmicas Anomalas numricas Las anomalas numricas suelen estar provocadas por la falta de disyuncin, es decir, la ausencia de separacin en la anafase, ya sea durante la divisin mittica o durante la meiosis. La aneuploida se define como un nmero de cromosomas que no es un mltiplo exacto del nmero haploide, por ejemplo, la monosoma (45,X o sndrome de Turner) o la trisoma (trisoma 13 o sndrome de Patau, trisoma 18 o sndrome de Edwards, trisoma 21 o sndrome de Down, 47,XXY o sndrome de Klinefelter). El mosaicismo indica una o varias estirpes celulares con un cariotipo diferente, derivado normalmente de la falta de disyuncin al principio de la mitosis (cuando dos cromosomas emparejados no se separan). La poliploida, mltiplos del nmero haploide de cromosomas, es una causa importante de aborto espontneo. Anomalas estructurales Las anomalas estructurales suelen obedecer a roturas cromosmicas inducidas por la radiacin, por frmacos o drogas, o por virus. La anomala resultante depende de la reordenacin de las piezas rotas. As pues, en una translocacin existe un intercambio de material entre dos o ms cromosomas no homlogos. Una translocacin equilibrada no se asocia a la ganancia ni a la prdida de material gentico, y la persona afectada se denomina portador de una translocacin. Defectos monognicos Los defectos monognicos estn causados por mutaciones de genes especficos que se transmiten conforme a las leyes de herencia mendeliana: autosmicas dominantes, autosmicas recesivas, recesivas ligadas al cromosoma X y, raras veces, dominantes ligadas al cromosoma X. Adems, los trastornos monognicos pueden transmitirse mediante la herencia de genes mitocondriales, impronta materna o paterna, disoma (herencia de ambos pares de un cromosoma de uno de los progenitores) y repeticiones excesivas (fenmeno en el que existen ms de las repeticiones habituales de tres pares de bases). Herencia autosmica dominante La transmisin no est relacionada con el sexo de la persona y resultan afectados tanto los hijos homocigotos como los heterocigotos (basta con que exista un alelo anmalo). Si ambos progenitores son heterocigotos, cada hijo tendr un riesgo de resultar afectado del 75 %. Si uno de los progenitores es heterocigoto, el riesgo de cada hijo ser del 50 %. El efecto depende de la expresin variable. Son trastornos autosmicos dominantes la enfermedad de Huntington, la neurofibromatosis y el sndrome de Marfan. El efecto de un gen dominante anmalo est influido por la penetrancia, el grado en que se expresa el gen dominante. La penetrancia completa, en contraposicin con la incompleta, significa que el gen siempre se expresa y siempre produce un fenotipo identificable. Herencia autosmica recesiva Estas afecciones nicamente se expresan en el fenotipo de los homocigotos (los dos alelos tienen que ser anmalos). Si ambos progenitores son heterocigotos, cada hijo tiene un riesgo de resultar afectado del 25 % y un riesgo de ser portador del 50%. Son ejemplos de trastornos autosmicos recesivos la fibrosis qustica, la drepanocitosis y la hiperplasia suprarrenal por carencia de 21-hidroxilasa. Herencia recesiva ligada al cromosoma X Un padre afectado slo puede transmitir la afeccin a las hijas. Cuando una enfermedad es recesiva, slo se afectan las mujeres homocigotas. Cada hijo de una portadora tiene el 50 % de probabilidades de resultar afectado, y cada hija, un 50 % de probabilidades de ser portadora. Son ejemplos el daltonismo y la hemofilia A. Impronta genmica La impronta genmica indica una influencia persistente en la funcin del genoma por las contribuciones del padre y de la madre. Por ejemplo, el desarrollo de la placenta est controlado fundamentalmente por genes derivados del padre. Por lo tanto, una mola hidatiforme tiene un cariotipo normal, pero todos sus cromosomas proceden del padre. Las estructuras placentarias estn ausentes en los teratomas
20. 20. ovricos, tumores que contienen nicamente cromosomas de origen materno. Los experimentos realizados en la naturaleza y con animales indican que la contribucin materna al genoma es ms importante para el desarrollo del embrin. En determinadas enfermedades autosmicas recesivas, la expresin, la gravedad y la edad de aparicin dependen de si el gen o el cromosoma mutante provienen del padre o de la madre. Los sndromes de Angelman, de Prader-Willi y de Beckwith-Wiedemann son ejemplos de trastornos humanos asociados a la impronta genmica. La epigentica es el estudio de los cambios en la expresin gnica no provocados directamente por cambios en las secuencias del ADN. Los mecanismos incluyen modificaciones del ADN sin variar la secuencia del mismo, como la metilacin del ADN para desactivar la expresin gnica, la alteracin de las protenas histonas que son responsables de la estructura global de la cromatina (afectando a la transmisin durante la replicacin celular), la produccin de nuevas formas de ARN y las alteraciones en las protenas celulares que influyen en la expresin gnica. Cada uno de estos mecanismos puede transmitirse a la descendencia y ser responsable de la impronta. Es otro mtodo por el que las especies pueden adaptarse, otra va para la evolucin. Volver al principio Tcnicas de biologa molecular La enzima que rompe los enlaces fosfodister y corta en fragmentos la molcula de ADN se denomina endonucleasa; la enzima de restriccin (endonucleasa de restriccin) corta slo en los sitios con secuencias nucleotdicas especficas. Las enzimas de restriccin se descubrieron en bacterias, en las que forman un mecanismo defensivo que corta (y, por tanto, desactiva) todo ADN exgeno (de virus invasores) introducido en la clula bacteriana. Como parte de este mecanismo protector, las bacterias tambin contienen metilasas que metilan los sitios de reconocimiento en el ADN nativo, dirigiendo la accin de la enzima de restriccin hacia el ADN exgeno no metilado. Cada bacteria tiene enzimas de restriccin distintas con sitios de accin especficos. Hay enzimas de restriccin que cortan el ADN en trozos (fragmentos de restriccin), oscilando desde muchos fragmentos pequeos hasta algunos trozos grandes, dependiendo del nmero de nucletidos de la secuencia de reconocimiento. Estas enzimas se denominan segn el organismo y la cepa de los que proceden. La combinacin de fragmentos de restriccin, es decir, la unin de dos trozos cortados de ADN, produce ADN recombinante. La ADN polimerasa es una enzima que incorpora nucletidos aislados a una molcula de ADN. Una ADN polimerasa slo puede formar ADN si cuenta con una plantilla de ADN; el ADN sintetizado ser complementario de la plantilla. La ARN polimerasa tambin necesita una plantilla de ADN para fabricar ARN. Una desoxirribonucleasa (ADNasa) puede eliminar nucletidos. Combinando el tratamiento de la ADNasa con la accin de la ADN polimerasa, es posible introducir nucletidos radiomarcados en una molcula de ADN, produciendo una sonda de ADN. La sonda de ADN es comparable al anticuerpo que se utiliza en los inmunoanlisis. El anticuerpo es especfico y reconoce la hormona frente a la que est dirigido, mientras que la sonda de ADN detecta especficamente una secuencia de ADN. La transcriptasa inversa es una ADN polimerasa que depende del ARN. Se denomina transcriptasa inversa porque el flujo de informacin va del ARN al ADN, en direccin contraria a la habitual. Esta enzima permite copiar prcticamente cualquier molcula de ARN en ADN monocatenario; este tipo de ADN se denomina ADN complementario porque es la imagen especular del ARN mensajero. La funcin de las sondas de ADN complementario es limitada, porque leen nicamente los exones (recuerde que los intrones son eliminados del ARN) y, por tanto, estas sondas leen slo grandes reas. El ADN y el ARN son molculas cargadas, por lo que migrarn en un campo elctrico. Los fragmentos pueden analizarse mediante electroforesis sobre gel (agarosa o poliacrilamida), donde se observa que los de mayor tamao son los que migran ms despacio. Por convencin, los geles se leen de arriba abajo y los fragmentos ms pequeos ocupan la parte inferior. Anlisis de Southern En primer lugar, se desnaturaliza el ADN para separar las dos cadenas, que son digeridas por enzimas de restriccin para producir fragmentos ms pequeos que se cargan en un gel de electroforesis. La tcnica de Southern, llamada as en honor de su descubridor, E. M. Southern, determina el tamao de los fragmentos, que se separan mediante electroforesis; cuanto ms pequeo sea el fragmento, ms rpida ser la migracin. El gel de electroforesis se vierte en un trozo grueso de papel de filtro cuyos extremos estn sumergidos en una solucin rica en sal. Se coloca una membrana especial (nitrocelulosa) sobre el gel y sta se cubre a su vez con un montn de toallas de papel comprimidas con un peso. La solucin salina asciende hasta el papel de filtro por un efecto de mecha; se mueve a travs del gel por accin capilar, llevando el ADN consigo. El ADN es transportado a la membrana de nitrocelulosa, a la que se une. La solucin salina contina movindose y es absorbida por las toallas de papel. As, la membrana de nitrocelulosa o nailon crea una rplica del patrn de electroforesis original. El ADN se fija a la membrana mediante coccin a temperatura elevada o por la aplicacin de luz ultravioleta. A
21. 21. continuacin, pueden introducirse sondas marcadas especficas de ADN o ARN para su hibridacin. En la tcnica de hibridacin una sonda especfica se fija a su secuencia complementaria. Los fragmentos con esta secuencia se identifican a continuacin mediante autorradiografa. Pueden utilizarse sondas fluorescentes que se detectan tras su activacin por un haz de lser, lo que permite efectuar una evaluacin cualitativa y cuantitativa mediante un ordenador. La tcnica de Southern sigue siendo un procedimiento necesario, pero a menudo se sustituye por la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa, ms rpida y sensible. La tcnica de Northern detecta secuencias de ARN. Se denomina Northern porque el ARN es la imagen opuesta al ADN. El ARN extrado se separa mediante electroforesis y se transfiere a una membrana, igual que en la tcnica de Southern, para la hibridacin con sondas (ADN complementario). La tcnica de Northern se utiliza, por ejemplo, para determinar si la estimulacin hormonal de una protena concreta en un tejido est mediada por el ARN mensajero, es decir, por expresin gnica. Este mtodo tambin puede sustituirse por la reaccin en cadena de la polimerasa utilizando una enzima transcriptasa inversa. La electroforesis para separar y cuantificar protenas recibe el nombre de tcnica de Western, y se utilizan anticuerpos para el proceso de identificacin de la hibridacin. Al igual que la tcnica de Northern, la tcnica de Western no slo analiza la presencia de un gen, sino tambin la expresin gnica. Los trminos Northern y Western son ocurrencias intencionadas (algo raro en la ciencia) creadas a partir de la tcnica de Southern. La hibridacin sin electroforesis, en la que se coloca una gota del extracto celular directamente sobre el papel de filtro, se denomina transferencia de puntos(dot blotting). Hibridacin Cuando dos cadenas complementarias de ADN vuelven a asociarse, el proceso se denomina hibridacin. Se trata de una tcnica que permite estudiar una zona concreta del ADN empleando una sonda de ADN radiomarcada que es especfica (una secuencia complementaria). Primero, se trata la membrana producida tras la tcnica de Southern para que bloquee sitios de unin inespecficos. A continuacin, la membrana se trata (se hibrida) con la sonda marcada. Despus se identifica la localizacin de la sonda unida mediante autorradiografa (si se usan sondas radiomarcadas) o por mtodos colorimtricos. Por lo tanto, la secuencia de la sonda determina la secuencia en el sitio de unin. Siempre que dos productos son complementarios, se produce hibridacin. As, el ADN complementario puede hibridarse a su plantilla, el ARN mensajero. La hibridacin in situ es la tcnica en la que se toman sondas marcadas de ADN o ARN y se colocan directamente en una extensin de tejido o de clulas. Puede utilizarse un fragmento de ADN clonado y marcado con fluorescencia; este mtodo se denomina FISH (hibridacin in situ con fluorescencia). La regin correspondiente al ADN clonado se ilumina cuando se aplica luz fluorescente, salvo que se haya producido la delecin de esa regin en uno de los cromosomas. La tcnica FISH ha permitido descubrir varios sndromes por microdelecin, como el sndrome de Prader-Willi. Tecnologa de micromatrices Este mtodo detecta la expresin gnica evaluando miles de genes al mismo tiempo. El ADN complementario clonado se hibrida con ADN complementario marcado, preparado a partir del tejido que se va a estudiar. Si ese tejido expresa un gen, la seal marcada se observa fcilmente. La produccin de genochips especficos permite buscar mutaciones y polimorfismos con esta tcnica. La micromatriz o genochip es una disposicin fsica de ADN que puede identificar simultneamente miles de productos nicos de ARNm en muestras heterogneas. Se han creado chips que incluyen el genoma humano completo y pueden evaluar ms de 500 000 polimorfismos de un solo nucletido en una muestra. As pues, un chip de ADN puede contener los 20 000 a 25 000 genes humanos codificadores de protenas en su totalidad. Este proceso sumamente automatizado puede indicar, aunque no cuantificar, las diferentes expresiones gnicas en respuesta a diversos estmulos o afecciones. Por ejemplo, la expresin gnica puede compararse antes y despus del tratamiento hormonal. El mtodo tambin puede detectar deleciones, duplicaciones y alteraciones gnicas mediante una tcnica conocida como hibridacin genmica comparativa, que utiliza una muestra de ADN de referencia para la hibridacin, en lugar de ADN complementario. Reaccin en cadena de la polimerasa La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es una tcnica que amplifica (con relativa rapidez) pequeos fragmentos o reas de ADN hasta obtener cantidades lo bastante grandes para que puedan analizarse mediante electroforesis y mtodos de transferencia. Esta tcnica produce numerosas copias de secuencias de ADN especficas sin necesidad de recurrir a la clonacin. Es necesario conocer la secuencia que se desea ampliar. Se seleccionan marcadores especficos (secuencias cortas de ADN sintetizadas correspondientes a cada extremo de la secuencia estudiada) que definirn la regin de ADN que se va a ampliar. Estas secuencias flanqueadoras se denominan cebadores. La muestra de ADN, los cebadores y el exceso de nucletidos aislados libres se incuban con una ADN polimerasa. El primer paso consiste en separar el ADN en sus dos cadenas mediante desnaturalizacin trmica (92C); a continuacin, se baja la temperatura (40C), con lo que los cebadores se pegan (templan) a sus regiones complementarias del ADN. Se vuelve a elevar despus
22. 22. la temperatura a 62 C y la ADN polimerasa sintetiza entonces una nueva cadena empezando y terminando en los cebadores, formando as un nuevo ADN bicatenario. Al repetir el ciclo muchas veces (alternando la temperatura de la reaccin) se multiplica la cantidad de ADN que puede estudiarse (ms de un milln de veces); este incremento es exponencial. As, es posible analizar el ADN a partir de una sola clula y visualizar los genes mediante tcnicas de transferencia sin usar sondas marcadas, todo ello en un termociclador, la mquina que efecta el procedimiento completo. Dado que en el proceso se alternan el calentamiento y el enfriamiento, la ADN polimerasa termorresistente es una ventaja, ya que no es necesario reponerla de forma peridica. El problema se solucion con el descubrimiento de ADN polimerasa (Taq polimerasa) en un microorganismo (Thermophilus aquaticus) termfilo (microbio de agua caliente) que se encontr en Mushroom Pool, una fuente termal poco conocida del Yellowstone National Park. Esta polimerasa de alta temperatura permite automatizar el proceso. La PCR con transcriptasa inversa se utiliza para ampliar pequeas cantidades de un ARN especfico. La plantilla inicial es una molcula de ARN, que se convierte en su complementaria por la accin de la transcriptasa inversa, una enzima descubierta inicialmente en los retrovirus. El nuevo ADN es procesado a continuacin por el procedimiento de PCR habitual. La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa ha permitido estudiar cantidades increblemente pequeas de ADN a partir de casi todos los tejidos o lquidos corporales. Es posible diagnosticar el sndrome de Down en las pocas clulas fetales obtenidas de la sangre materna. Algo que llama especialmente la atencin es la multiplicacin de pequeas cantidades de ADN degradado obtenido de especies raras y extinguidas que se conservan en museos. Tambin se ha multiplicado y secuenciado el ADN de fsiles (p. ej., de un magnolio de 18 millones de aos). Con este mtodo, tambin es posible identificar un gen por su expresin de ARN mensajero. El ARN es la plantilla usada en la multiplicacin tras su conversin en ADN complementario. La reaccin en cadena de la polimerasa se usa para detectar microbios, y proporciona los resultados en cuestin de horas, incluso en presencia de antimicrobianos. Este mtodo puede detectar bacterias que no pueden aislarse con tcnicas de cultivo. La PCR en tiempo real es una tcnica que se utiliza actualmente de forma sistemtica en los laboratorios clnicos. El mtodo es ms rpido que la PCR convencional, 1 h o menos, utilizando sondas fluorescentes. La luz emitida por las sondas se representa inmediatamente en un grfico, lo que permite una cuantificacin casi instantnea del ADN medido. Inmunoprecipitacin de la cromatina La inmunoprecipitacin de la cromatina (ChIP) localiza una protena en su lugar de unin en el ADN. La tcnica usa un anticuerpo especfico para la protena de inters. El ADN aislado por el complejo anticuerpo-protena-ADN puede estudiarse a continuacin mediante PCR. La regin especfica del genoma puede determinarse utilizando una micromatriz de ADN, un mtodo que se conoce como ChIP-chip (o ChIP-on-chip). Clonacin del ADN Clonar significa aislar un gen y copiarlo. La recopilacin de molculas de ADN obtenidas con mtodos de clonacin recibe el nombre de coleccin de ADN o genoteca. El equivalente en el ADN de todos los ARN mensajeros aislados de una clula o un tejido concretos se denomina coleccin de ADN complementario. Se han producido ADN complementarios para ms del 70 % de los genes humanos y mridos. Empezando por el ARN mensajero, es posible centrar la bsqueda en el gen de inters (en lugar de buscar en todo el genoma). Estas genotecas se crean usando la transcriptasa inversa. Las molculas de ADN pueden insertarse entonces en un vector apropiado (que se describe a continuacin), con lo que se producen molculas duplicadas. Con ayuda de sondas, se selecciona el ADN complementario que se corresponde con el gen de inters (teniendo en cuenta que el ADN complementario slo incluye los exones de un gen). La clonacin del ADN consiste simplemente en producir muchas copias idnticas de un fragmento de ADN especfico. Para la clonacin tambin puede usarse la reaccin en cadena de la polimerasa. Como ya se ha explicado, la clonacin de ADN complementario se centra en el equivalente del ARN mensajero para el ADN; en la clonacin del ADN genmico se copia el ADN de los genes usando una endonucleasa de restriccin. La clonacin tambin puede emplearse para fabricar varias copias de sondas o de fragmentos de ADN desconocidos. Cuando se desconoce la secuencia de aminocidos, es posible trabajar en el sentido contrario. Si se conoce la protena especfica, pueden fabricarse anticuerpos frente a ella. Cuando se inserta ADN complementario en determinados vectores, se identifica la produccin de la protena con los anticuerpos; por lo tanto, se aislar el fragmento de ADN. Un vector es una entidad en la que puede insertarse ADN exgeno. Se introduce el vector con el ADN exgeno en una clula hospedadora, que produce entonces tanto el vector como el ADN exgeno. Los primeros vectores que se usaron fueron plsmidos bacterianos, molculas de ADN circular (minicromosomas) que coexisten en el citoplasma con el ADN cromosmico bacteriano. Lo ms destacable es que portan los genes que codifican la resistencia a los antibiticos. Esto permite seleccionar las clulas bacterianas que contienen el plsmido usando el antibitico apropiado. Tambin se han creado vectores plasmdicos que permiten efectuar la
23. 23. seleccin en funcin del color. Se han desarrollado diversas cepas bacterianas, cada una para un uso especfico. La rotura del ADN del plsmido por enzimas de restriccin, seguida de la incorporacin del ADN exgeno con la ADN ligasa, produce molculas de ADN del plsmido (ADN recombinante que contiene el ADN exgeno) que pueden replicarse. Los vectores plasmdicos pueden incorporar fragmentos de ADN exgeno de hasta 10 kb. La digestin de los plsmidos recuperados por enzimas de restriccin libera el fragmento de ADN deseado, que puede recuperarse entonces mediante electroforesis. Existen otros vectores. Los bacterifagos (o fagos) son virus que infectan y se multiplican dentro de bacterias. Los vectores fgicos pueden incorporar insertos de ADN ms grandes, de hasta 20 kb. La clonacin del ADN con vectores fgicos sigue la misma secuencia bsica explicada con los plsmidos. Con vectores csmidos, combinaciones artificiales de fagos y plsmidos, se clonan fragmentos de mayor tamao de ADN exgeno. Los fragmentos muy grandes, de hasta 1 000 kb, pueden clonarse con cromosomas artificiales de levaduras. Este mtodo tambin puede funcionar con genes enteros. Fases bsicas de la clonacin: 1. Elegir una fuente de ADN: ADN genmico o ADN complementario. 2. Fragmentar el ADN usando endonucleasas de restriccin. 3. Introducir los fragmentos en vectores. 4. Introducir los vectores en bacterias. 5. Recopilar el ADN clonado que se ha propagado en la bacteria para formar una genoteca. 6. Buscar la secuencia deseada en la genoteca. Entre los posibles mtodos se encuentran el uso de sondas de nucletidos complementarios para fragmentos que se hibridan o la deteccin de una protena especfica producida usando anticuerpos frente a esa protena o analizando la funcin de la misma. Animales transgnicos Los animales transgnicos se producen mediante la insercin de genes clonados o ADN complementario en bacterias, levaduras, lombrices, peces, ranas y ratones. En los mamferos, el gen clonado o el ADNc pueden inyectarse en un proncleo de un vulo fecundado, donde se integrar en los cromosomas. Los vulos se transfieren luego al tero de la madre receptora, cuya descendencia tendr el ADN exgeno. Las funciones y los comportamientos biolgicos alterados se atribuyen al ADN exgeno. Los animales transgnicos son tiles para el estudio de enfermedades hereditarias y tumores malignos, y permiten llevar a cabo experimentos en genoterapia. La transferencia de genes nuevos o alterados es un mtodo importante para estudiar la funcin gnica. Pueden incluso desarrollarse plantas transgnicas para producir nuevos frmacos, y la introduccin de genes que confieren resistencia a los insectos puede resolver el problema de la contaminacin por insecticidas. Modelos animales con inactivacin gnica En los modelos animales usados para determinar la funcin de un gen se emplea el mtodo consistente en desactivar un gen concreto. En una demostracin sencilla, pero importante, puede determinarse si un gen especfico y su protena son esenciales para la vida o para una funcin (como la gestacin). Esto suele lograrse introducindose ADN exgeno en un animal mediante un vector para sustituir ADN endgeno. Puede conseguirse un resultado similar interfiriendo con ARN mensajeros especficos, aunque no se logra la prdida completa de una expresin gnica especfica porque la nueva divisin celular reactiva la expresin gnica. Volver al principio Identificacin de los genes Para clonar un gen entero cuya protena se conoce, se produce una coleccin de ADN complementario. El fragmento especfico de ADN se identifica ligndolo a la protena. Una vez identificado, puede rastrearse todo el gen usando el ADN complementario, que sealar los intrones y los exones. Otra estrategia consiste en sintetizar una sonda de oligonucletidos, cuya secuencia se basar en la secuencia de aminocidos conocida en la protena (a partir de la secuencia peptdica, puede predecirse la secuencia de ADN que codifica esa protena). Ese mtodo puede usarse con un fragmento relativamente pequeo del pptido. Conforme se van clonando ms genes, se establece la frecuencia de los codones en los aminocidos concretos. El ADN complementario puede clonarse sin producir una genoteca usando la reaccin en cadena de la polimerasa para multiplicar el ADN complementario fabricado a partir del ARN mensajero
24. 24. por la transcriptasa inversa. Es posible clonar secuencias solapadas del genoma empleando un fragmento de ADN de cada producto subsiguiente, a fin de trabajar en todo un cromosoma de forma sistemtica para buscar un gen; es lo que se denomina paseo cromosmico. Todo el proceso de secuenciacin puede efectuarse por ordenador, incluso la bsqueda de marcos de lectura abiertos. Tras identificar la secuencia de un fragmento de ADN, el ordenador utiliza las bases de datos de ADN y protenas para predecir la secuencia, el sitio de reconocimiento, la traduccin de la protena y la homologa con secuencias conocidas. El cientfico selecciona entonces los tamaos de los fragmentos de restriccin para la clonacin. Cuando se ha analizado el gen, hay que compararlo con el gen de la enfermedad. Si la mutacin es grande, puede detectarse mediante la tcnica de Southern. En las alteraciones pequeas, es necesario efectuar comparaciones en las secuencias de ADN, lo que es posible usando la reaccin en cadena de la polimerasa para multiplicar las secuencias gnicas especficas hasta obtener cantidades fciles de estudiar. Es posible localizar un gen en un cromosoma especfico, aunque se ignore su protena, con estudios basados en reordenaciones cromosmicas y anlisis de ligamiento. Cada enfermedad se asocia a una alteracin cariotpica, por lo que se puede actuar sobre el cromosoma concreto para localizar el gen. Los anlisis de ligamiento utilizan polimorfismos de la longitud de fragmentos de restriccin. Polimorfismo del ADN La tcnica de Southern revela patrones de bandas especficos que reflejan la longitud variable de los fragmentos de ADN producidos por la accin de las enzimas de restriccin. Un sitio concreto puede mostrar una mutacin debido a que tiene un patrn distinto (la diferencia en la longitud del fragmento de ADN detectada con la tcnica de Southern obedece a la diferencia en las secuencias). Estas diferencias en las secuencias de ADN se denominan polimorfismos de la longitud de fragmentos de restriccin. Los polimorfismos de nucletidos aislados, o simplemente polimorfismos, suelen ser variaciones benignas y comunes. El genoma humano contiene alrededor de 4,5 millones de polimorfismos, de los que se han identificado ms de 3 millones. Aunque el 99,9 % de las secuencias de ADN en los seres humanos son iguales, los polimorfismos de nucletidos aislados pueden actuar como marcadores genticos de un gen importante desde el punto de vista mdico. Los polimorfismos estn gobernados por las leyes mendelianas de la herencia y si se identifica casualmente un polimorfismo en un paciente con una enfermedad concreta, es posible estudiar su transmisin. El polimorfismo, que est ligado a la enfermedad por casualidad, puede usarse para estudiar la herencia de una enfermedad cuando se desconocen los genes. El polimorfismo es una especie de bandera que marca zonas concretas de los cromosomas. Este mtodo de estudio precisa ADN de, por lo menos, una persona afectada y un nmero suficiente de miembros de la familia para rastrear el polimorfismo, ya sea con la tcnica de Southern (si las secuencias son largas) o con la reaccin en cadena de la polimerasa (mtodo ptimo para las secuencias cortas). Para determinar la correlacin entre los marcadores genticos (polimorfismos) y el fenotipo tambin se emplean haplotipos (similares a los polimorfismos, pero con una secuencia nucleotdica ms larga, incluso un conjunto de varios polimorfismos). Los esfuerzos que utilizan las tecnologas genticas para vincular los polimorfismos de nucletidos aislados y los haplotipos a problemas clnicos y rasgos hereditarios se conocen como estudios de asociacin del genoma completo. Los minisatlites son una forma de polimorfismos. Los genes se concentran en zonas aleatorias a lo largo de los cromosomas, separados por secuencias largas de ADN no codificador. Los minisatlites son zonas no codificadoras de ADN que se repiten en nmeros variables, lo que se denomina nmero variable de secuencias repetidas en tndem, distribuidas a lo largo de cada cromosoma humano. Dichas zonas pueden seguirse con sondas de ADN, con lo que se obtiene una huella nica para cada persona. Esta singularidad se aplica en medicina forense. Los microsatlites, como su propio nombre indica, son ms pequeos que los minisatlites. Por lo general, constan de repeticiones de slo dos nucletidos. Los polimorfismos de ADN son ya millares y permiten cartografiar los genes con gran precisin. La cartografa de las variaciones de polimorfismos de nucletidos aislados en los seres humanos (el mapa de haplotipos humanos) ya est en camino. Proyecto Genoma Humano El conjunto de todos los genes humanos recibe el nombre de genoma. El objetivo del Proyecto Genoma Humano internacional, que comenz en 1990, era secuenciar el genoma humano; se logr un primer borrador en el ao 2001 y se obtuvo el 99 % de la secuencia real en 2003, ms de 2 aos antes de lo previsto y 50 aos despus de la publicacin de Watson y Crick. El nmero de genes codificadores de protenas (20 000 a 25 000) es menor de lo que se haba calculado. Menos del 2 % de los genes del genoma humano con casi 3 000 millones de nucletidos codifica protenas; por tanto, el resto es una rica fuente para los historiadores de la evolucin y un objetivo para la induccin de cambios genticos. El nmero de genes vara en cada cromosoma concreto; los que resultan afectados por la trisoma, los nmeros 13, 18 y 21, son los que tienen menos genes. La informacin sobre el proyecto del genoma humano est disponible en: http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml
25. 25. Afortunadamente, Internet surgi a tiempo para alojar la enorme cantidad de datos generados por los estudios realizados sobre el genoma humano. El National Center for Biotechnology Information (NCBI) mantiene un sitio web que ofrece bases de datos y tambin el sitio Online Mendelian Inheritance in Man de la Universidad Johns Hopkins, que es una gua de los genes humanos y los trastornos hereditarios: http://www.ncbi.nlm.nig.gov/projects/genome/guide/human El sitio web GeneTests es tambin una fuente de informacin gentica recomendada, financiada por los NIH. Incluye revisiones de enfermedades especficas, un directorio internacional de laboratorios de pruebas genticas y clnicas de diagnstico prenatal, adems de materiales didcticos: http://www.genetests.org La siguiente ola de informacin proceder de proyectos como ENCODE y 1000 Genomes. ENCODE es un grupo de investigacin organizado por el National Human Genome Research Institute de los NIH para crear una enciclopedia de los elementos funcionales del genoma humano (http://www.genome.gov/ENCODE). El proyecto 1000 Genomes secuenciar los genomas de 1 000 personas de todo el mundo para cartografiar las variaciones del ADN con alta resolucin (http://www.1000genomes.org/page.php). El mapa del genoma humano puede servir de base para localizar los factores hereditarios que predisponen a ciertas enfermedades y las mutaciones que causan la enfermedad, y para integrar la secuenciacin gentica en las funciones biolgicas. Pronto se podr disponer de un registro personal que contenga nuestro plano gentico completo. Se han cartografiado las localizaciones cromosmicas de los genes responsables de la produccin de hormonas. A partir de las secuencias de ADN clonadas, es posible predecir las secuencias de aminocidos. Cada una de las protenas de un gen representa un posible objetivo diagnstico o teraputico. Por supuesto, los trastornos hereditarios tambin sern objeto de caracterizacin y, finalmente, de su curacin con genoterapia. No obstante, incluso despus de haber identificado y cartografiado un gen, su caracterizacin completa sigue siendo una tarea complicada que requiere mucho tiempo. Ser todava ms complicado comprender del todo los trastornos provocados por las interacciones de varios genes. Genmica y protemica La genmica hace referencia a todo el proceso implicado en el Proyecto Genoma Humano, la descripcin completa de la secuencia gentica y el estudio de la expresin gnica, especialmente usando la tcnica de micromatrices con genochips. Con todo, la genmica no revelar todo el misterio. Las protenas fabricadas mediante expresin gnica se alteran en el proceso de traduccin y tambin con modificaciones posteriores a la traduccin, como la glucosilacin, la mutilacin y la fosforilacin. Por lo tanto, para conocer la historia completa hace falta la protemica, el estudio de los productos terminales con funcin biolgica, las protenas de una clula o de un tejido. Tanto la genmica como la protemica son necesarias para comprender la fisiologa, diagnosticar las enfermedades y disear nuevos frmacos. El proceso de identificacin de las protenas consiste en separar las protenas mediante electroforesis, digerir las ms grandes formando otras ms pequeas, medir el contenido de aminocidos mediante espectrofotometra de masas e identificar especficamente las protenas mediante su comparacin con bases de datos informatizadas. A continuacin, pueden compararse los perfiles de masa de las clulas normales y anmalos. Las alteraciones posteriores a la traduccin pueden detectarse comparando protenas especficas frente a protenas conocidas. Se dispone actualmente de chips de protenas, comparables a los chips de ADN, que pueden utilizarse para estudiar los cambios protenicos. La metabolmica es el estudio de pequeas molculas en el interior de las clulas, los productos metablicos que las caracterizan. Los extractos celulares sin clasificar se someten a mediciones mediante cromatografa, espectrometra o resonancia magntica para crear patrones caractersticos, huellas qumicas, asociadas a clulas normales o anmalas. La cantidad de datos generados por la genmica, la protemica y la metabolmica es enorme, y sera imposible manejarla sin bases de datos informatizadas. La bioinformtica es la ciencia dedicada al desarrollo de tcnicas informticas para organizar y analizar mejor el creciente caudal de informacin mediante la creacin de sistemas eficientes de bsquedas y recuperacin de datos. Esto permitir poner los datos a disposicin de laboratorios distribuidos por todo el mundo, y permitir estudiar la informacin con anlisis matemticos sofisticados y compartirla a escala mundial. Volver al principio Aplicaciones clnicas
26. 26. El reto para la medicina moderna consiste en interpretar clnicamente la ingente cantidad de datos generados por la genmica y la protemica. No cabe duda de que el conocimiento de la funcin de los genes y las protenas ser un rasgo que acelerar el progreso humano. Conocer las predisposiciones genticas de una persona permitira personalizar el diagnstico y tratamiento mdicos hasta su mxima expresin. No obstante, nos encontramos en una nueva y compleja era, que no siempre es directa. Por ejemplo, una predisposicin gentica pude conllevar slo un pequeo porcentaje de aumento del riesgo de sufrir una enfermedad; en qu punto est justificada una intervencin en trminos de rentabilidad, no slo para la persona, sino tambin para la sociedad? Adems, la actividad gnica puede activarse y desactivarse en respuesta a factores ambientales. Desde el punto de vista del cuidador del paciente, es posible que ocurra ms lentamente de lo previsto, pero no hay duda de que estamos a punto de convertir la teora genmica en prctica clnica. El diagnstico molecular de los trastornos genticos precisa nicamente una pequea muestra de ADN, que puede obtenerse de cualquier clula con ncleo, como los leucocitos o las clulas epiteliales. La reaccin en cadena de la polimerasa realizada con mecanismos automticos permite efectuar un diagnstico rpido del ADN con material multiplicado a partir de una sola clula. Supone una ventaja importante en los anlisis genticos prenatales y en el diagnstico y la determinacin del sexo antes de la implantacin. La PCR permite efectuar diagnsticos de ADN a partir de una sola clula extrada de embriones fecundados in vitro. El diagnstico molecular est limitado por la prevalencia de cambios genticos heterogneos. En otras palabras, muchos trastornos estn causados por mutaciones diferentes en personas distintas. En cambio, otros (como la drepanocitosis) siempre obedecen al mismo cambio. En el caso de la fibrosis qustica, el 70 % de los pacientes (de ascendencia de Europa septentrional) presenta la misma delecin de 3 bases, mientras que el 30 % restante muestra un conjunto sumamente heterogneo de mutaciones. Otro problema del diagnstico molecular reside en la necesidad no slo de encontrar un cambio sutil en un gen, sino tambin de diferenciar los cambios importantes de variaciones benignas (polimorfismos). Se han desarrollado mtodos ingeniosos basados en la PCR para cribar y detectar mutaciones con rapidez. Para que una mutacin detectada tenga trascendencia, hay que segregarla y vincularla a una enfermedad identificada en una familia. Al menos un tipo de carencia de hormona del crecimiento se hereda con un patrn autosmico recesivo. La clonacin del ADN de la hormona del crecimiento complementario de su ARN mensajero permiti localizar el gen de esta hormona. Se encuentra en un grupo que tambin incluye el gen del lactgeno placentario humano. Este grupo de genes contiene varias unidades de ADN que son homlogas y propensas a la recombinacin, lo que origina una delecin en un cromosoma y una duplicacin en otro. Otras protenas gobernadas por genes agrupados, como las globinas, tambin responden a mecanismos similares. El primer informe de un diagnstico clnico basado en la hibridacin del ADN fue el diagnstico prenatal de -talasemia, realizado en el Department of Obstetrics and Gynecology de la Universidad de California en San Francisco. La produccin con fines comerciales de protenas a partir de genes clonados insertados en bacterias crece a pasos agigantados, como demuestra la produccin de insulina (la primera) y de hormona del crecimiento. La glucosilacin no tiene lugar en sistemas bacterianos y, por tanto, para la produccin comercial de glucoprotenas recombinantes hacen falta estirpes celulares de mamferos. Se ha logrado este reto y actualmente se dispone de gonadotropinas recombinantes. Se ha aislado y clonado el gen de la gonadoliberina, localizado en el brazo corto del cromosoma 8. La tecnologa molecular fue esencial para caracterizar la inhibina, la hormona folicular del ovario que inhibe la secrecin de hormona foliculoestimulante (FSH). Se ha secuenciado el gen de la inhibina y se ha constatado que es homlogo al gen de la hormona antimlleriana. La subunidad comn a las gonadotropinas, la tirotropina y la gonadotropina corinica humana (GCh) se ha ubicado en un gen que se ha aislado, secuenciado y localizado en el cromosoma 6. El genoma humano contiene muchos genes que pueden causar cncer. Otros genes, en cambio, tienen la capacidad de bloquear el crecimiento maligno. El cncer es una enfermedad gentica, pues puede decirse que los tumores son clnicos; todas las clulas estn relacionadas genticamente (aunque alteraciones genticas subsiguientes pueden generar clulas citogenticamente diferentes en tumores). Los oncogenes, descubiertos en virus tumorales, son genes que transforman las clulas que crecen normalmente en crecimientos anmalos mediante la codificacin de protenas que participan en la transduccin de las seales, en concreto, la transmisin de mensajes de regulacin del crecimiento. Existen numerosos oncogenes y muchas vas de accin diferentes, todas las cuales desembocan en un estado proliferativo. Las mutaciones que activan estos genes dan lugar a una actividad de las protenas independiente de las seales aferentes o bien a una actividad en el lugar y el momento equivocados. El resultado final es la activacin (por un oncogn alterado) del crecimiento persistente. Pero probablemente este cambio solo no es suficiente para producir un tumor. Los tumores suelen conllevar alteraciones en muchos oncogenes, y tambin en antioncogenes. En las clulas normales tambin hay antioncogenes, es decir, genes supresores del crecimiento que deben estar inactivas para que puedan crecer los tumores. La predisposicin hereditaria al cncer tambin puede obedecer a una mutacin en los genes supresores de tumores. Aunque la activacin de un oncogn es un efecto dominante, las mutaciones supresoras de tumores son recesivas y pueden portarse y transmitirse, pero se mantienen inactivas hasta que el emparejamiento se realice con un antioncogn normal. Por consiguiente, el cncer es una enfermedad gentica, pero la regulacin del crecimiento normal requiere un complejo sistema que tardaremos mucho tiempo en dominar. Esto conlleva alteraciones en muchos genes que, finalmente, dan lugar a un tumor con una
27. 27. heterogeneidad que determina la sensibilidad a varias modalidades teraputicas. Durante este perodo, es posible que la tecnologa del ADN recombinante sea capaz de alcanzar un diagnstico con tiempo suficiente para conseguir un remedio. El conocimiento del oncogn especfico implicado en un tumor determinado tambin ofrece posibilidades teraputicas. Por ejemplo, puede unirse un antimetabolito al anticuerpo frente a un oncogn para actuar sobre las clulas del cncer. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales que afectan a los productos proteicos de oncogenes especficos. La biologa molecular est transformando tanto el diagnstico como el tratamiento. Es posible identificar el ADN de virus y bacterias. El proceso automtico de la PCR produce patrones electroforticos que pueden leerse de modo automtico. Con esta tcnica, es posible detectar una sola molcula de ADN del virus del papiloma humano entre 10 000 clulas humanas o ms. Hoy en da se utilizan en clnica varios cientos de pruebas genticas. La farmacogenmica es el estudio de variaciones genticas en la farmacodinmica que pueden explicar distintas respuestas a la misma dosis de un medicamento. Por ejemplo, distintos polimorfismos que intervienen en la sntesis enzimtica pueden afectar al metabolismo y la eliminacin. Las pruebas genticas ofrecen la posibilidad de predecir la farmacocintica de un frmaco en una persona, lo que permitira la seleccin de una dosis adecuada para reducir al mnimo los efectos secundarios y maximizar la eficacia. La produccin defectuosa de protenas endgenas puede corregirse sustituyendo el mecanismo problemtico. Se dispone de dos estrategias: la introduccin de clulas exgenas que producen la protena que falta o la sustitucin del gen defectuoso (ms concretamente, la adicin de un ADN complementario corregido). As pues, los trastornos monognicos recesivos son candidatos potenciales a la genoterapia, al igual que las enfermedades contradas, como el cncer y las infecciones. En lneas generales, la genoterapia se define como la obtencin de los mecanismos celulares del propio paciente para producir un agente teraputico. Un gen introducido en una clula puede sustituir a otro defectuoso o ausente, o bien producir una protena que surta el efecto deseado. Sin embargo, este campo todava est en sus comienzos. Se han desarrollado directrices especficas para la genoterapia que deben revisarse a varios niveles. Un tipo de tratamiento humano consiste en el uso de vectores retrovirales para transferir genes marcadores a clulas humanas en cultivo que despus se devuelven al paciente de origen. Esta tcnica permite, por ejemplo, localizar linfocitos que se infiltran en los tumores, hepatocitos del donante o linfocitos T citolticos que son especficos para el virus de la inmunodeficiencia humana. Estos genes transferidos tambin pueden manipularse para proporcionar una funcin concreta a pacientes con trastornos monognicos hereditarios. Otro tipo de tratamiento consiste en la transferencia de genes que codifican factores que destruyen clulas tumorales, como el factor de necrosis tumoral o la interleucina. Los vectores retrovirales son virus que se han alterado de forma que las clulas infectadas por los vectores no pueden fabricar protenas virales. De este modo se evitan la replicacin y la diseminacin del virus, pero s puede tener lugar la transferencia gnica en clulas en fase de replicacin. Otros mtodos de transferencia en fase de desarrollo son el uso de vectores de adenovirus y el ADN plasmdico como objetivo especfico. Volver al principio Conclusin El avance molecular es inexorable. En el futuro se utilizar la medicina preventiva basada en la prediccin. Al conocer la dotacin gentica de una persona concreta, ser posible dirigir la deteccin apropiada e intensiva de las afecciones a las que sea propensa. Este tipo de conocimiento tambin deber tener en cuenta aspectos sociales y polticos. No exageramos al predecir que en el futuro se evitarn matrimonios y embarazos debido a incompatibilidades genticas. La sociedad est creando directrices acerca del uso de esta informacin: por las personas, los empleadores, las organizaciones sanitarias y los gobiernos. El progreso cientfico debe ir unido a la educacin pblica y profesional para poder controlar debidamente estos conocimientos. Volver al principio Bibligrafa Collins FS, Green ED, Guttmacher AE, Guyer MS, on behalf of the U.S. National Human Genome Research Institute, A vision for the future of genomics research. A blueprint for the genomic era, Nature 422:835, 2003. Croce CM, Oncogenes and cancer, New Engl J Med 358:502, 2008. 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29. 29. 2 Biosntesis, Metabolismo y Mecanismo de Accin de las Hormonas NA Herramientas de imgenes La definicin clsica de hormona consiste en una sustancia que se produce en un tejido especial, desde donde se libera hacia el torrente circulatorio y viaja a clulas sensibles distantes en las que ejerce sus efectos caractersticos. Lo que durante un tiempo se pens que era un viaje sencillo, ahora se considera una odisea que se torna ms compleja conforme se descubren nuevas facetas del recorrido en los laboratorios de investigacin de todo el mundo. De hecho, se ha puesto en duda la idea de que las hormonas slo sean productos de tejidos especiales. Se han descubierto hormonas complejas y receptores hormonales en organismos unicelulares primitivos, lo que indica que las glndulas endocrinas representan un avance tardo de la evolucin. La capacidad generalizada de las clulas de sintetizar hormonas explica los descubrimientos curiosos de hormonas en lugares extraos, como hormonas gastrointestinales en el cerebro, hormonas reproductoras en secreciones intestinales y la capacidad de los tumores malignos de sintetizar hormonas inesperadas. Las hormonas y los neurotransmisores eran y siguen siendo un medio de comunicacin. nicamente cuando los animales evolucionaron a organismos complejos se desarrollaron glndulas especiales para producir hormonas que podan utilizarse de una manera ms sofisticada. Asimismo, las hormonas debieron aparecer incluso antes de que se separase la evolucin de las plantas y los animales porque existen muchas sustancias vegetales semejantes a hormonas y receptores hormonales. Por consiguiente, no resulta sorprendente que, dado que todas las clulas contien