engenharia genÉtica biologia molecular andré fioravante guerra
TRANSCRIPT
![Page 1: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/1.jpg)
ENGENHARIA GENÉTICABIOLOGIA MOLECULAR
André Fioravante Guerra
![Page 2: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/2.jpg)
CONCEITOS
O QUE É DNA?
O QUE ELE FAZ?
PORQUE ELE É VITAL EM SERES VIVOS?
COMO PROMOVER MODIFICAÇÕES NELE?REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR)TÉCNICA DE CLONAGEM (DNA RECOMBINANTE)SELEÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES
![Page 3: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/3.jpg)
3
![Page 4: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/4.jpg)
4
Cada nucleosídeo é ligado a um grupo fosfato formando um nucleotídeo
Cada base nitrogenada é ligada à molécula de açúcar formando um nucleosídeo
EXISTE UM ATOMO CENTRAL DE FOSFORO LIGADO A 4 ATOMOS DE OXYGENIO
![Page 5: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/5.jpg)
5
Pirimidinas• Estruturas de anel único contendo 6 átomos C & N
Purinas• Estruturas da cadeias
cíclicas: Anel duplo• 5 e 6 C & N
Bases NitrogenadasQuatro bases de DNA
A= AdeninaT= TiminaG= GuaninaC= Citosina
U = uracil (RNA)
![Page 6: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/6.jpg)
6
Açúcar Deoxiribose
DNA RNA
![Page 7: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/7.jpg)
7
![Page 8: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/8.jpg)
O QUE ELE FAZ???
![Page 9: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/10.jpg)
![Page 11: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/11.jpg)
11
O “dogma central” da biologia molecular
Proposto por Francis Crick em 1958. Em 1970 publicado na revista Nature DNA codifica para produção de RNA RNA codifica para produção de proteina. Proteina não codifica para produção de proteina,
RNA ou DNA. O final nas palavras de Francis Crick
“Once information has passed into protein, it cannot get out again”.
![Page 12: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/12.jpg)
Conceitos Básicos
• GENOMA: todo DNA existente num organismo
• GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional – proteínas – ou RNAs
![Page 13: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/13.jpg)
COMO?
![Page 14: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/14.jpg)
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO Dependente de fator protéico
ENVOLVE A PROTEINA rho
![Page 15: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/15.jpg)
LOCALIZAÇÃO DO PROMOTOR
ATG
![Page 16: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/16.jpg)
PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS
![Page 17: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/17.jpg)
tRNA• tRNAs tem cerca de 80 bases, • Existem ao menos 31 no
citoplasma, 22 na mitocôndria. • Todos os tRNAs tem um braço
aceptor com uma sequência 3′ CCA, que é covalentemente ligada ao aminoácido. (A)
• Posuem um triplet anticodon que transientemente se liga ao mRNA. (B)
• A estrutura geral é denominada trevo (cloverleaf )
A
B17
![Page 18: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/18.jpg)
AA
braço doanti-codon
tRNAAtivação dos aminoácidos
Amino acil tRNA sintetases: ligação dos aminoácidos à extremidade 3’ do tRNA de acordo com o anti-códon
AAs
Uma única amino acil tRNA sintetase liga umAminoácido a todos os seus tRNAs
![Page 19: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/19.jpg)
Três passos na Tradução: Iniciação
1. A subunidade menor do rRNA se liga ao mRNA via sequência líder próxima ao start codon (AUG).
19
![Page 20: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/20.jpg)
Código Genético
20
![Page 21: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/21.jpg)
Tradução:
Molécula de mRNA
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
CysMetAla
5’ 3’
AspGlu
Phe His
Direção do avanço do ribossomo
Ribossomo
Proteína
tRNA
aa livre
codon
Gly
![Page 22: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/22.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
CysMetAla
5’ 3’
AspGlu
Phe HisGly
![Page 23: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/23.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Asp
MetAlaCys
5’ 3’
GluPhe HisGly
![Page 24: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/24.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Glu
MetAlaCysAsp
5’ 3’
PheGly
His
![Page 25: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/25.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Phe
MetAlaCysAspGlu
5’ 3’
GlyHis
Ile
![Page 26: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/26.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Gly
MetAlaCysAspGluPhe
5’ 3’
HisIle
Lys
![Page 27: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/27.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
His
MetAlaCysAspGluPheGly
5’ 3’
Ile
Lys
![Page 28: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/28.jpg)
A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Ile
MetAlaCysAspGluPheGlyHis
5’ 3’
Lys
![Page 29: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/29.jpg)
G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A
Lys
MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle
5’ 3’
Leu
![Page 30: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/30.jpg)
U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A
Leu
MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle
Lys
5’ 3’
Met
![Page 31: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/31.jpg)
G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G
Met
MetAlaCysAspGluPheGlyHisIle
LysLeu
5’ 3’
Asn
![Page 32: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/32.jpg)
G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C
Asn
Met AlaCysAspGluPheGlyHisIle
LysLeuMet
5’ 3’
Pro
![Page 33: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/33.jpg)
U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A
Pro
Met Ala CysAspGluPheGlyHisIle
LysLeuMetAsn
5’ 3’
Gln
![Page 34: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/34.jpg)
G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A
Gln
Met Ala Cys AspGluPheGlyHisIle
LysLeuMetAsnPro
5’ 3’
![Page 35: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/35.jpg)
C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A
Met Ala Cys Asp GluPheGlyHisIle
LysLeuMetAsnProGln
5’ 3’STOP
![Page 36: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/36.jpg)
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A A A A
Ala Cys Asp Glu PheMet Gly
HisIle
Lys Leu
Met Asn
Pro Gln
5’ 3’STOP
![Page 37: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/37.jpg)
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet Gly
HisIle
Lys Leu
Met Asn
ProGln
5’ 3’STOP
![Page 38: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/38.jpg)
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet Gly
His Ile Gln Lys
Pro LeuAsn Met
5’ 3’
![Page 39: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/39.jpg)
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet
Gly His
Ile Gln Lys
Pro LeuAsn Met
5’ 3’
A U A A A A U U A A U G A A C AA A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu PheMet
Gly His
Ile Gln Lys
Pro LeuAsn CYS
5’ 3’
Muda aforma e função
VARIAÇÃO GENÉTICA=POLIMORFISMO
![Page 40: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/40.jpg)
A replicação in vivo
• Replicação é semi-conservativa e a polimerização deve ser sempre no sentido 5´→3´
• Mas o DNA é antiparalelo ou seja, uma fita ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sentido 3’ → 5’
• Como ocorre então a replicação nos dois sentidos?
![Page 41: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/41.jpg)
Forquilha de replicação do DNA
Proteínas de iniciação identificam a origem da replicação (rica em A-T) participam da ligação da DNA helicase ao DNA
A proteína de iniciação acoplada à DNA helicase abre o DNA na junção “Y”.
As pontes de H se rompem e a molécula se abre como um zíper
As fitas se mantêm separadas durante a replicação graças à ação de umas proteínas as Single-strand binding proteins – SSBP’s
![Page 42: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/42.jpg)
História do PCR
Em 1993, Kary Mullis, um químico ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método em 1985 que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-491
![Page 43: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/43.jpg)
PCR
• Qual é o objetivo?Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima
• Quais os componentes?Mg2+
DNA Polimerase
dNTP
Primers
![Page 44: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/44.jpg)
Termociclador
• Como na técnica de PCR se encontram vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento
![Page 45: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/45.jpg)
Uma reação típica de PCR
Sterile Water 38.0 ul10X PCR Buffer 5.0 ulMgCl2 (50mM) 2.5 uldNTP’s (10mM each) 1.0 ul PrimerFWD (25 pmol/ul) 1.0 ul PrimerREV 1.0 ulDNA Polymerase 0.5 ulDNA Template 1.0 ul
Total Volume 50.0 ul
![Page 46: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/46.jpg)
• Molécula de DNA obtida através da junção de dois ou mais fragmentos de DNA
O que é uma molécula de DNA recombinante?
5’- -3’ 5’- -3’
5’- -3’
![Page 47: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/47.jpg)
• O que é clonagem?• Utilização da reprodução assexuada para obter organismos que
são geneticamente iguais entre si e ao organismo parental
Clonando um gene
Seleção Reprodução assexuadaIsolamento
![Page 48: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/48.jpg)
• O vetor• O DNA inserido não é replicado na célula a menos
que esteja recombinado com DNA cromossômico ou inserido em replicon (elemento genético capaz de replicação autônoma) extracromossômico.
• Replicons são reconhecidos como substratos por enzimas da célula responsáveis pela repli-cação (ou vetores)
• Podem ser usados para carregar DNA recom-binante, permitindo sua replicação• O tipo mais comum de vetor sãoos plasmídeos
Clonando um gene
20min
20min
Após 30 gerações (10h) haverá 1x 109 cels
![Page 49: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/49.jpg)
• Endonucleases altamente específicas, conhecidas como enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios precisamente definidos.
• Fragmentos são gerados por cortes nos sítios de restrição no fragmento de DNA e no vetor
• DNA ligases podem unir os fragmentos acima para obter a molécula de DNA recombinante
Clonando um gene
• Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?
Genes estão presentes em regiões contínuas de DNA cromossômico e não aparecem perfeitamente delimitados por sítios de restrição. Como conseguir o fragmento específico contendo o gene de interesse?
![Page 50: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/50.jpg)
• Há basicamente 3 possibilidades:– DNA sintético– PCR (RT-PCR)– Triagem de Bibliotecas genômicas ou de cDNA
Clonando um gene
• Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?
Fragmentação mecânicaOu enzimática
![Page 51: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/51.jpg)
Vetores
•Plasmídeos• Sítio de clonagem múltipla (MCS)• Marcadores de seleção• Alfa-Complementação (hospedeiro Lac-)
![Page 52: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/52.jpg)
Tecnologia do DNA recombinante
![Page 53: ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR André Fioravante Guerra](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062819/570638581a28abb8238fc85a/html5/thumbnails/53.jpg)
Gene produtor de toxina