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Ensayos biotecnológicos

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Ensayos biotecnológicos

Salvador Camacho Garrido

© Salvador Camacho Garrido

© EDITORIAL SÍNTESIS, S. A.Vallehermoso, 34. 28015 Madrid

Teléfono 91 593 20 98http://www.sintesis.com

ISBN: 978-84-907712-3-5Depósito Legal: M-12.867-2015

Impreso en España - Printed in Spain

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de Editorial Síntesis, S. A.

ÍNDICE

1. Biotecnología ............................................................................................................. 19

Objetivos ........................................................................................................................ 19Mapa conceptual ........................................................................................................... 20Glosario .......................................................................................................................... 201.1. Biología molecular ........................................................................................... 211.2. Tecnología ......................................................................................................... 221.3. Biotecnología .................................................................................................... 231.4. Biotecnología. Toda una historia .................................................................... 24

1.4.1. Biotecnología ayer ................................................................................... 241.4.2. Biotecnología hoy ................................................................................... 251.4.3. Biotecnología mañana ............................................................................. 26

1.5. La biotecnología en España ........................................................................... 261.6. Ventajas de la biotecnología .......................................................................... 281.7. Riesgos de la biotecnología ............................................................................ 30

1.7.1. Riesgos para el medio ambiente ............................................................... 301.7.2. Riesgos para la salud ............................................................................... 31

1.8. Preocupaciones éticas y sociales ................................................................... 331.9. Bioética ............................................................................................................. 341.10. Principios fundamentales de la bioética ....................................................... 35Resumen ......................................................................................................................... 36Actividades de autoevaluación .................................................................................. 36

2. El laboratorio biotecnológico ................................................................................. 39

Objetivos ........................................................................................................................ 39Mapa conceptual ........................................................................................................... 40Glosario .......................................................................................................................... 41

SÍndice

2.1. El laboratorio biotecnológico ........................................................................ 412.2. Niveles de seguridad de los laboratorios ..................................................... 432.3. Material y aparatos .......................................................................................... 442.4. Reactivos ........................................................................................................... 452.5. Técnicas de esterilización ............................................................................... 462.6. Cultivo de microorganismos ........................................................................... 47

2.6.1. Cultivos puros ......................................................................................... 482.6.2. Preparación de medios ........................................................................... 482.6.3. Mantenimiento de cultivos microbianos .................................................... 492.6.4. Microorganismos implicados ................................................................... 50

2.7. Cultivos celulares ............................................................................................. 512.7.1. Tipos de cultivos celulares ....................................................................... 512.7.2. Medios de cultivos celulares .................................................................... 522.7.3. Mantenimiento de cultivos celulares ......................................................... 52

2.8. Buenas prácticas de laboratorio .................................................................... 532.9. Toma de muestras ............................................................................................ 54

2.9.1. Exudado nasal ........................................................................................ 542.9.2. ADN ...................................................................................................... 55

2.10. Prevención de riesgos ..................................................................................... 562.11. Riesgos biológicos ........................................................................................... 56

2.11.1. Vías de infección .................................................................................... 562.11.2. Contención ............................................................................................. 572.11.3. Plan de protección .................................................................................. 572.11.4. Formación .............................................................................................. 57

2.12. Agentes biológicos. Clasificación ................................................................... 572.13. Normas de asepsia y seguridad ...................................................................... 582.14. Higiene en el trabajo del laboratorio biotecnológico ................................ 60

2.14.1. Limpieza y eliminación del material .......................................................... 602.14.2. Residuos infecciosos ............................................................................... 612.14.3. Tratamiento de residuos infecciosos ......................................................... 61

2.15. Equipos de protección ................................................................................... 622.15.1. Equipos de protección en el laboratorio .................................................. 622.15.2. Equipos de protección individual ............................................................ 62

2.16. El trabajo en el laboratorio ............................................................................ 632.16.1. Cuaderno de laboratorio ......................................................................... 632.16.2. Informes de laboratorio ........................................................................... 632.16.3. El orden en el laboratorio ........................................................................ 64

2.17. Legislación ........................................................................................................ 642.17.1. Legislación sobre prevención de riesgos laborales ..................................... 642.17.2. Legislación sobre agentes biológicos ........................................................ 652.17.3. Legislación sobre organismos modificados genéticamente ......................... 652.17.4. Legislación sobre riesgos químicos ........................................................... 652.17.5. Legislación sobre residuos ....................................................................... 652.17.6. Legislación sobre radiaciones ionizantes ................................................... 652.17.7. Notas técnicas de prevención .................................................................. 66

Resumen ........................................................................................................................ 67Actividades de autoevaluación .................................................................................. 68

ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS

ÍNDICE

6

3. Técnicas de análisis de macromoléculas ............................................................... 69

Objetivos ........................................................................................................................ 69Mapa conceptual ........................................................................................................... 70Glosario .......................................................................................................................... 713.1. Introducción ..................................................................................................... 723.2. Cromatografía ................................................................................................... 72

3.2.1. Definición ............................................................................................... 723.2.2. Clasificación ........................................................................................... 72

3.3. Cromatografía sobre papel y capa fina ......................................................... 743.4. Cromatografía en columna .............................................................................. 753.5. Métodos usuales en cromatografía ................................................................ 76

3.5.1. Cromatografía de adsorción ..................................................................... 763.5.2. Cromatografía de exclusión molecular ...................................................... 763.5.3. Cromatografía de afinidad ....................................................................... 773.5.4. Cromatografía de intercambio iónico ........................................................ 773.5. . Cromatografía de líquidos de alta eficacia ................................................. 78

3.6. Electroforesis .................................................................................................... 793.6.1. Definición ............................................................................................... 793.6.2. Principios básicos ................................................................................... 793.6.3. Técnicas ................................................................................................. 80

3.7. Electroforesis capilar ....................................................................................... 813.8. Espectrofotometría de absorción UV-V ......................................................... 823.9. Técnicas de dispersión de radiación ............................................................. 83

3.9.1. Turbidimetría .......................................................................................... 843.9.2. Nefelometría ........................................................................................... 84

3.10. Difracción de Rayos X ...................................................................................... 853.11. Resonancia magnética nuclear ....................................................................... 863.12. Espectrometría de masas ................................................................................ 873.13. Ultracentrifugación .......................................................................................... 883.14. Transferencia .................................................................................................... 883.15. Fluorescencia .................................................................................................... 893.16. Radiactividad .................................................................................................... 90Resumen ........................................................................................................................ 91Actividades de autoevaluación .................................................................................. 92

4. Las proteínas .............................................................................................................. 93

Objetivos ........................................................................................................................ 93Mapa conceptual ........................................................................................................... 94Glosario .......................................................................................................................... 954.1. Proteínas ........................................................................................................... 95

4.1.1. Definición ................................................................................................ 964.1.2. Clasificación de las proteínas .................................................................... 964.1.3. Funciones de las proteínas ........................................................................ 96

4.2. Aminoácidos ..................................................................................................... 974.3. Función de los aminoácidos ........................................................................... 974.4. Clasificación y propiedades de los aminoácidos ......................................... 98


ÍNDICE

7

4.4.1. Clasificación ............................................................................................ 984.4.2. Propiedades ............................................................................................ 98

4.5. Estructura de las proteínas ............................................................................. 1004.5.1. Estructura primaria ................................................................................... 1004.5.2. Estructura secundaria ............................................................................... 1004.5.3. Estructura terciaria .................................................................................... 1014.5.4. Estructura cuaternaria ............................................................................... 101

4.6. Propiedades de las proteínas ........................................................................ 1024.7. Extracción de proteínas .................................................................................. 1024.8. Separación y purificación de proteínas ........................................................ 1034.9. Cromatografía de proteínas ............................................................................ 104

4.9.1. Cromatografía de exclusión molecular ....................................................... 1044.9.2. Cromatografía de intercambio iónico ......................................................... 1044.9.3. Cromatografía hidrofóbica ........................................................................ 1054.9.4. Cromatografía de afinidad ........................................................................ 1054.9.5. Cromatografía de HPLC ............................................................................. 105

4.10. Electroforesis de proteínas ............................................................................. 1064.11. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) ........................................ 107

4.11.1. Tipos de desarrollo ................................................................................. 1074.11.2. Isoelectroenfoque ................................................................................... 1084.11.3. Electroforesis bidimensional ..................................................................... 108

4.12. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes ......................................... 1094.12.1. Detergentes ............................................................................................. 1094.12.2. SDS-PAGE ............................................................................................... 1094.12.3. Ventajas .................................................................................................. 110

4.13. Tinción de proteínas ........................................................................................ 1104.13.1. Azul de Coomassie .................................................................................. 1104.13.2. Nitrato de plata ........................................................................................ 1114.13.3. Fluorescencia ........................................................................................... 1114.13.4. Autorradiografía ....................................................................................... 111

4.14. Transferencia de proteínas a membranas ..................................................... 1124.15. Secuenciación de proteínas ........................................................................... 112

4.15.1. Importancia de la secuenciación ............................................................... 1134.15.2. Métodos ................................................................................................. 113

4.16. Determinación estructural ............................................................................... 1144.16.1. Difracción de rayos X ............................................................................... 1154.16.2. Resonancia magnética nuclear ................................................................... 115

4.17. Cuantificación de proteínas ............................................................................ 1164.17.1. Espectrofotometría visible ........................................................................ 1164.17.2. Técnicas dispersivas ................................................................................. 1174.17.3. Método Kjeldahl ...................................................................................... 1184.17.4. Espectrometría total ................................................................................. 119

Resumen ........................................................................................................................ 119Ejercicios propuestos .................................................................................................. 120Práctica n.º 1 ................................................................................................................. 121Práctica n.º 2 ................................................................................................................. 122Práctica n.º 3 ................................................................................................................. 123Actividades de autoevaluación ........................................................................ 125


ÍNDICE

8

5. Los ácidos nucleicos ................................................................................................. 127

Objetivos ........................................................................................................................ 127Mapa conceptual ........................................................................................................... 128Glosario .......................................................................................................................... 1295.1. Los ácidos nucleicos ........................................................................................ 129

5.1.1. Definición ............................................................................................... 1295.1.2. Bases nitrogenadas .................................................................................. 1305.1.3. Azúcares ................................................................................................ 1315.1.4. Nucleósidos ........................................................................................... 1315.1.5. Nucleótidos ........................................................................................... 131

5.2. Polinucleótidos ................................................................................................ 1325.3. Estructura del ADN .......................................................................................... 1335.4. Estructura del ARN ........................................................................................... 1345.5. Ácidos nucleicos víricos .................................................................................. 1355.6. Plásmidos .......................................................................................................... 1355.7. Propiedades de los ácidos nucleicos ............................................................ 136

5.7.1. Proporción de bases nitrogenadas ........................................................... 1375.7.2. Densidad de los ácidos nucleicos ............................................................ 1375.7.3. Desnaturalización: temperatura de fusión .................................................. 1385.7.4. Absorbancia a 260 nm ............................................................................ 1385.7.5. Cinética de renaturalización: Curvas CoT ................................................... 1395.7.6. Hibridación de los ácidos nucleicos ........................................................ 140

5.8. Extracción de los ácidos nucleicos ................................................................ 1405.8.1. ADN en solución acuosa .......................................................................... 1415.8.2. ADN genómico........................................................................................ 1415.8.3. ADN plasmídico ..................................................................................... 1425.8.4. ARN ....................................................................................................... 1425.8.5. ARN poliadenilado .................................................................................. 143

5.9. Purificación de los ácidos nucleicos ............................................................. 1435.9.1. Centrifugación y ultracentrifugación .......................................................... 1445.9.2. Bolas magnéticas ..................................................................................... 144

5.10. Cromatografía de los ácidos nucleicos ......................................................... 1455.10.1. Cromatografía de penetrabilidad .............................................................. 1455.10.2. Cromatografía de intercambio iónico ........................................................ 1455.10.3. Cromatografía de adsorción ..................................................................... 146

5.11. Electroforesis de los ácidos nucleicos .......................................................... 1465.11.1. Electroforesis en geles de agarosa (AGE) .................................................. 1465.11.2. Movilidad electroforética del ADN ........................................................... 1485.11.3. Electroforesis bidimensional .................................................................... 1485.11.4. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes ........................................ 1495.11.5. Electroforesis en campo pulsante (PFGE) .................................................. 149

5.12. Enzimas de restricción .................................................................................... 1505.13. Detección de ácidos nucleicos ...................................................................... 1515.14. Transferencia a membranas ............................................................................ 152

5.14.1. Southern blot .......................................................................................... 1535.14.2. Northern blot .......................................................................................... 1545.14.3. Northern blot reverso .............................................................................. 154

5.15. Secuenciación de ADN .................................................................................... 154


ÍNDICE

9

5.15.1. Método de Sanger .................................................................................. 1545.15.2. Método automático de secuenciación ...................................................... 155

5.16. Elucidación estructural .................................................................................... 1565.16.1. Revisión histórica ..................................................................................... 1565.16.2. Alternativas al modelo de la doble hélice ................................................. 1585.16.3. Ácidos nucleicos especiales .................................................................... 158

5.17. Cuantificación de ADN .................................................................................... 1595.17.1. Espectrofotometría ................................................................................. 1595.17.2. Fluorescencia .......................................................................................... 159

Resumen ........................................................................................................................ 160Ejercicios propuestos .................................................................................................. 161Práctica n.º 4 ................................................................................................................. 162Práctica n.º 5 ................................................................................................................. 163Práctica n.º 6 ................................................................................................................. 166Actividades de autoevaluación ........................................................................ 168

6. Expresión génica ........................................................................................................ 169

Objetivos ........................................................................................................................ 169Mapa conceptual ........................................................................................................... 170Glosario .......................................................................................................................... 1716.1. Genes ................................................................................................................ 171

6.1.1. Concepto de gen .................................................................................... 1716.1.2. Tipos de genes ....................................................................................... 1726.1.3. Número de genes ................................................................................... 173

6.2. Cromosomas ..................................................................................................... 1736.3. El código genético ........................................................................................... 1746.4. La información genética .................................................................................. 1766.5. Duplicación del ADN ....................................................................................... 177

6.5.1. Duplicación en procariontes .................................................................... 1776.5.2. Duplicación en eucariontes ...................................................................... 178

6.6. Transcripción .................................................................................................... 1796.6.1. Transcripción en procariontes .................................................................. 1796.6.2. Transcripción en eucariontes .................................................................... 179

6.7. Traducción ........................................................................................................ 1806.8. Control de la expresión génica ...................................................................... 181

6.8.1. Controles transcripcionales ...................................................................... 1816.8.2. Controles postranscripcionales ................................................................. 1826.8.3. Controles postraduccionales .................................................................... 183

6.9. Técnicas de estudio de la expresión génica ................................................. 1846.9.1. Inmunolocalización ................................................................................. 1846.9.2. Hibridación in situ ................................................................................... 184

6.10. ¿Un gen, una proteína? ................................................................................... 1856.11. Teoría del operón ............................................................................................ 1856.12. Otros conceptos aplicados a los genes ........................................................ 186

6.12.1. Transgenes .............................................................................................. 1866.12.2. Genes antisentido ................................................................................... 1866.12.3. Silenciamiento génico ............................................................................. 188


ÍNDICE

10

6.13. Otras formas de transmisión de la información genética ........................... 1886.13.1. Transformación ....................................................................................... 1896.13.2. Conjugación bacteriana ........................................................................... 1896.13.3. Transducción .......................................................................................... 1906.13.4. Transfección ........................................................................................... 1906.13.5. Recombinación ....................................................................................... 191

Resumen ........................................................................................................................ 191Ejercicios propuestos .................................................................................................. 192Actividades de autoevaluación ........................................................................ 194

7. Nuevas herramientas en biotecnología ................................................................. 195

Objetivos ........................................................................................................................ 195Mapa conceptual ........................................................................................................... 196Glosario .......................................................................................................................... 1977.1. Introducción ..................................................................................................... 1987.2. Reacción en cadena de la polimerasa .......................................................... 198

7.2.1. Termociclador ........................................................................................ 1987.2.2. Reactivos ................................................................................................ 1997.2.3. Ciclo de amplificación ............................................................................ 1997.2.4. Verificación y optimización ..................................................................... 201

7.3. Tipos de PCR ..................................................................................................... 2027.4. PCR en tiempo real .......................................................................................... 204

7.4.1. Agentes intercalantes .............................................................................. 2047.4.2. Sondas de hibridación específicas ........................................................... 2047.4.3. Opciones de los equipos de PCR a tiempo real ......................................... 2057.4.4. Ventajas de la PCR a tiempo real ............................................................... 206

7.5. PCR automatizada en tiempo real .................................................................. 2067.6. Aplicaciones de la PCR .................................................................................... 207

7.6.1. Investigación .......................................................................................... 2077.6.2. Medicina ................................................................................................ 2087.6.3. Paleontología, antropología biológica y ciencias forenses .......................... 2087.6.4. Agronomía y diversidad .......................................................................... 209

7.7. Marcadores moleculares ................................................................................. 2097.7.1. RFLP. Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción ..................... 2107.7.2. MAAP. Múltiples perfiles arbitrarios de amplificación ................................. 2107.7.3. STS. Sitios etiquetados por la secuencia ................................................... 211

7.8. Biosensores ....................................................................................................... 2117.9. Chip de ADN ..................................................................................................... 212

7.9.1. Fabricación ............................................................................................. 2137.9.2. Chips de doble canal .............................................................................. 2137.9.3. Chips de ADN de oligonucleótidos .......................................................... 2137.9.4. Chips de ADN para genotipificación ........................................................ 213

7.10. Secuenciación de ADN .................................................................................... 2147.11. Bioinformática ................................................................................................... 216

7.11.1. Principales áreas de investigación ............................................................. 2167.11.2. Herramientas .......................................................................................... 221

7.12. Nanobiotecnología .......................................................................................... 222


ÍNDICE

11

7.13. Tiempos nuevos, paradigmas nuevos ............................................................ 223Resumen ........................................................................................................................ 225Práctica n.º 7 ................................................................................................................. 225Actividades de autoevaluación ........................................................................ 228

8. Clonación .................................................................................................................... 231

Objetivos ........................................................................................................................ 231Mapa conceptual ........................................................................................................... 232Glosario .......................................................................................................................... 2338.1. Ingeniería genética .......................................................................................... 2338.2. Aislamiento del ADN foráneo ......................................................................... 2348.3. Enzimas de restricción .................................................................................... 234

8.3.1. Definición y tipos .................................................................................... 2348.3.2. Nomenclatura ......................................................................................... 2358.3.3. Tipos de cortes ....................................................................................... 2368.3.4. Aplicaciones .......................................................................................... 237

8.4. Vectores de clonación .................................................................................... 2388.4.1. Plásmidos ............................................................................................... 2388.4.2. Virus ...................................................................................................... 2398.4.3. Cósmidos ............................................................................................... 2408.4.4. Vectores YAC (Yeast Artificial Chromosomes) ............................................ 2408.4.5. Vectores BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) ....................................... 241

8.5. Unión ADN-vectores de clonación ................................................................ 2418.6. Introducción del vector .................................................................................. 242

8.6.1. Métodos biológicos ................................................................................ 2428.6.2. Métodos físicos ...................................................................................... 2438.6.3. Medios químicos .................................................................................... 2438.6.4. Limitaciones ........................................................................................... 244

8.7. Métodos de selección ..................................................................................... 2448.7.1. Resistencia a antibiótico .......................................................................... 2448.7.2. Inactivación insercional ............................................................................ 2448.7.3. Inserción génica positiva ......................................................................... 2458.7.4. Hibridación de colonias .......................................................................... 2458.7.5. Técnicas genéticas .................................................................................. 246

8.8. Obtención de genotecas ................................................................................ 2468.9. Identificación del clon deseado .................................................................... 247

8.9.1. Sondas moleculares ................................................................................ 2478.9.2. Obtención de sondas moleculares ........................................................... 2488.9.3. Marcaje .................................................................................................. 248

8.10. Sondas de ácidos nucleicos ........................................................................... 2498.10.1. Sondas de ADN ...................................................................................... 2498.10.2. Sondas de ARN ...................................................................................... 250

Resumen ........................................................................................................................ 250Ejercicios propuestos .................................................................................................. 251Actividades de autoevaluación ........................................................................ 252


ÍNDICE

12

9. Aplicaciones de la Tecnología del ADN ................................................................ 255

Objetivos ........................................................................................................................ 255Mapa conceptual ........................................................................................................... 256Glosario .......................................................................................................................... 2579.1. Tecnología del ADN ......................................................................................... 2579.2. Aplicaciones ..................................................................................................... 2589.3. Clasificación de las aplicaciones de la biotecnología ................................. 2599.4. Biotecnología roja ............................................................................................ 2609.5. Biotecnología blanca ....................................................................................... 2619.6. Biotecnología verde ........................................................................................ 2639.7. Biotecnología azul ........................................................................................... 2659.8. Biotecnología gris ............................................................................................. 2669.9. Organismos modificados genéticamente ...................................................... 268

9.9.1. Bacterias y levaduras transgénicas ............................................................. 2699.9.2. Plantas transgénicas ................................................................................. 2709.9.3. Animales transgénicos ............................................................................. 271

9.10. Fermentación .................................................................................................... 2719.11. Rutas fermentativas .......................................................................................... 272

9.11.1. Rutas fermentativas para la utilización del piruvato ..................................... 2729.11.2. Rutas fermentativas de utilización de aminoácidos ..................................... 274

9.12. Fermentaciones industriales ........................................................................... 2759.13. Biorrefinerías ..................................................................................................... 276

9.13.1. Materias primas ....................................................................................... 2779.13.2. Productos ............................................................................................... 277

Resumen ........................................................................................................................ 280Ejercicios propuestos .................................................................................................. 280Práctica n.º 8 ................................................................................................................. 281Actividades de autoevaluación ........................................................................ 283

10. Identificación de proteínas ..................................................................................... 285

Objetivos ........................................................................................................................ 285Mapa conceptual ........................................................................................................... 286Glosario .......................................................................................................................... 28710.1. Proteómica ........................................................................................................ 28810.2. Análisis MS/MS .................................................................................................. 289

10.2.1. Ionización por electroespray ................................................................... 28910.2.2. Uso de las bases de datos ....................................................................... 290

10.3. Identificación por huella peptídica ............................................................... 29010.3.1. MALDI-TOF ............................................................................................. 29110.3.2. ESI-TOF .................................................................................................. 291

10.4. Otras técnicas usuales ..................................................................................... 29110.4.1. Electroforesis automática ......................................................................... 29210.4.2. Electroforesis microfluídica ...................................................................... 29210.4.3. Células artificiales .................................................................................... 292

10.5. Técnicas inmunológicas ................................................................................... 29210.6. El sistema inmunitario ...................................................................................... 293


ÍNDICE

13

10.6.1. Inmunización .......................................................................................... 29410.6.2. Respuesta inmunológica .......................................................................... 29410.6.3. Disfunciones ........................................................................................... 294

10.7. Antígenos y anticuerpos ................................................................................. 29410.8. El sistema linfoide ............................................................................................ 295

10.8.1. Órganos linfoides primarios ..................................................................... 29610.8.2. Órganos linfoides secundarios ................................................................. 29610.8.3. Las células del sistema inmunitario ............................................................ 296

10.9. Ensayos inmunológicos ................................................................................... 29810.9.1. Anticuerpos policlonales ......................................................................... 29810.9.2. Anticuerpos monoclonales ...................................................................... 29810.9.3. Una clasificación ..................................................................................... 299

10.10. Técnicas de precipitación en gel ................................................................... 30010.10.1. Inmunodifusión en gel de agar ................................................................. 30010.10.2. Técnicas de doble difusión ...................................................................... 30010.10.3. Inmunodifusión radial .............................................................................. 30110.10.4. Inmunoelectroforesis ............................................................................... 30110.10.5. Inmunofijación ........................................................................................ 301

10.11. Técnicas de precipitación en disolución ...................................................... 30210.11.1. Inmunoprecipitación ............................................................................... 30210.11.2. Detección .............................................................................................. 302

10.12. Técnicas de aglutinación ................................................................................. 30310.12.1. Aglutinación directa ................................................................................ 30310.12.2. Aglutinación indirecta ............................................................................. 30310.12.3. Aglutinación indirecta pasiva ................................................................... 30310.12.4. Test de Coombs ...................................................................................... 30410.12.5. Inhibición de la aglutinación .................................................................... 30510.12.6. Hemoaglutinación por virus ..................................................................... 305

10.13. Técnicas de inmunofluorescencia .................................................................. 30510.13.1. Inmunofluorescencia directa .................................................................... 30610.13.2. Inmunofluorescencia indirecta ................................................................. 30610.13.3. Inmunofluorescencia con Qdots .............................................................. 307

10.14. Técnicas de radioinmunoensayo .................................................................... 30710.14.1. RIA directo ............................................................................................. 30710.14.2. RIA de inhibición .................................................................................... 30810.14.3. RIA de sándwich ..................................................................................... 308

10.15. Técnicas de enzimoinmunoensayo ................................................................ 30910.15.1. Dot blot y slot blot .................................................................................. 30910.15.2. Inmunoblot ............................................................................................ 31010.15.3. Western blot ........................................................................................... 31010.15.4. Ensayo Zestem ........................................................................................ 31010.15.5. Inmunohistoquímica ................................................................................ 311

10.16. ELISA .................................................................................................................. 31210.16.1. Ventajas y desventajas ............................................................................. 31210.16.2. Dispositivos ............................................................................................ 31310.16.3. Fases de un ensayo ELISA ........................................................................ 31310.16.4. Tipos de ensayos ELISA ........................................................................... 314

10.17. Otras técnicas afines ....................................................................................... 31510.17.1. Técnicas de citometría ............................................................................. 31510.17.2. Reacción de fijación de complemento ..................................................... 316


ÍNDICE

14

10.17.3. Seroneutralizacion .................................................................................. 31610.17.4. Pruebas de protección ............................................................................ 31610.17.5. Test de histocompatibilidad .................................................................... 316

10.18. Sistemas comerciales y automatizados ......................................................... 31710.18.1. Respi-Strip .............................................................................................. 31710.18.2. Serodia .................................................................................................. 31810.18.3. Sistema Vidas ......................................................................................... 318

Resumen ........................................................................................................................ 318Práctica n.º 9 ................................................................................................................. 319Práctica n.º 10 ............................................................................................................... 322Actividades de autoevaluación ........................................................................ 323

11. Seguridad alimentaria y tipificación de organismos ........................................... 325

Objetivos ........................................................................................................................ 325Mapa conceptual ........................................................................................................... 326Glosario .......................................................................................................................... 32711.1. Seguridad alimentaria ...................................................................................... 328

11.1.1. Seguridad .............................................................................................. 32811.1.2. Calidad .................................................................................................. 329

11.2. Inocuidad de los alimentos ............................................................................ 32911.3. Ensayos de tipo genético ............................................................................... 331

11.3.1. Técnicas de ensayos genéticos ................................................................. 33111.3.2. Metodología de los ensayos genéticos ..................................................... 33211.3.3. Características de los ensayos genéticos ................................................... 332

11.4. Técnicas moleculares de análisis de alimentos ............................................ 33311.4.1. Chip de ADN .......................................................................................... 33311.4.2. Los organismos modificados genéticamente ............................................. 334

11.5. Especiación ....................................................................................................... 33411.5.1. FINS ....................................................................................................... 33511.5.2. SSCP ...................................................................................................... 33511.5.3. RFLP ....................................................................................................... 33611.5.4. PCR en tiempo real .................................................................................. 336

11.6. Individualización .............................................................................................. 33611.6.1. Secuenciación ........................................................................................ 33611.6.2. ADN-Fingerprinting ................................................................................. 33711.6.3. Análisis RFLP ............................................................................................ 33711.6.4. Análisis STR ............................................................................................. 33711.6.5. Análisis por PCR ...................................................................................... 33811.6.6. Análisis por AmpFLP ................................................................................ 338

11.7. Tipado de microorganismos ........................................................................... 33911.7.1. Técnicas clásicas ..................................................................................... 33911.7.2. Técnicas inmunológicas ........................................................................... 34011.7.3. Técnicas moleculares ............................................................................... 340

11.8. Técnicas basadas en la PCR ............................................................................. 34011.8.1. Secuenciación ........................................................................................ 34011.8.2. AP-PCR ................................................................................................... 34111.8.3. ERIC-PCR ................................................................................................. 34111.8.4. REP-PCR .................................................................................................. 342


ÍNDICE

15

11.8.5. PCR-ribotipado ....................................................................................... 34211.8.6. MLST ...................................................................................................... 34211.8.7. PCR-Real time .......................................................................................... 343

11.9. Técnicas basadas en la hibridación ............................................................... 34411.9.1. Southern blot .......................................................................................... 34411.9.2. Northern blot .......................................................................................... 345

11.10. Técnicas basadas en la electroforesis ........................................................... 34611.10.1. Técnica de electroforesis en gel de campos pulsantes ............................... 34511.10.2. Técnica de electroforesis en gel con un gradiente desnaturalizante ..................... 346

11.11. Técnicas basadas en el ADN-fingerprinter .................................................... 34611.11.1. PF .......................................................................................................... 34611.11.2. REAP ...................................................................................................... 34611.11.3. AFLP ....................................................................................................... 347

11.12. Cuantificación de microorganismos ............................................................... 34711.12.1. PCR en tiempo real .................................................................................. 34811.12.2. FISH ....................................................................................................... 348

11.13. Sistemas comerciales ....................................................................................... 34911.13.1. OligoC-Test ............................................................................................ 34911.13.2. ADN-Strip .............................................................................................. 34911.13.3. Sistema HybriScan .................................................................................. 350

11.14. Sistemas automatizados fingerprinting .......................................................... 350Resumen ........................................................................................................................ 352Práctica n.º 11 ............................................................................................................... 353Actividades de autoevaluación ........................................................................ 355

12. Identificación de agentes tóxicos y mutagénicos ............................................... 357

Objetivos ........................................................................................................................ 357Mapa conceptual ........................................................................................................... 358Glosario .......................................................................................................................... 35912.1. Toxinas: clasificación ........................................................................................ 360

12.1.1. Según función de propiedades químicas y origen ..................................... 36012.1.2. Según las partes que atacan y sus consecuencias ...................................... 361

12.2. Toxinas vegetales ............................................................................................. 36112.3. Toxinas animales ............................................................................................... 36312.4. Toxinas marinas ................................................................................................. 36412.5. Toxinas microbianas ......................................................................................... 36512.6. Toxinas en los alimentos ................................................................................. 36612.7. Tóxicos: clasificación ....................................................................................... 367

12.7.1. Clasificación fisiopatológica ..................................................................... 36712.7.2. Clasificación según la vía de entrada ......................................................... 36712.7.3. Clasificación según el mecanismo de acción ............................................. 368

12.8. Ensayos de toxicidad ....................................................................................... 36812.8.1. Efectos del tóxico en las pruebas ............................................................. 36912.8.2. Especies implicadas ................................................................................ 369

12.9. Medida de toxicidad ....................................................................................... 37012.9.1. Índices de toxicidad ............................................................................... 37012.9.2. Unidades ............................................................................................... 370


ÍNDICE

16

12.9.3. Protección de la toxicidad ....................................................................... 37112.10. Clasificación de los ensayos de toxicidad .................................................... 371

12.10.1. Clasificación ........................................................................................... 37212.10.2. Métodos ................................................................................................ 372

12.11. Mutaciones ....................................................................................................... 37312.12. Mutación génica ............................................................................................... 375

12.12.1. Mutación por sustitución de bases ........................................................... 37612.12.2. Mutaciones de corrimiento estructural ...................................................... 37612.12.3. Mutaciones en los sitios de corte y empalme (splicing) ............................. 37612.12.4. Otras clasificaciones ................................................................................ 377

12.13. Aberraciones cromosómicas .......................................................................... 37712.13.1. Mutaciones cromosómicas ...................................................................... 37712.13.2. Mutaciones genómicas ............................................................................ 378

12.14. Causas de las mutaciones ............................................................................... 38012.14.1. Mutaciones naturales o espontáneas ......................................................... 38012.14.2. Mutaciones inducidas ............................................................................. 38012.14.3. Errores de replicación ............................................................................. 38112.14.4. Cambios químicos espontáneos .............................................................. 381

12.15. Elementos genéticos transponibles ............................................................... 38212.15.1. Transposones en bacterias ....................................................................... 38212.15.2. Transposones en plantas .......................................................................... 38212.15.3. Transposones en mamíferos ..................................................................... 383

12.16. Otros conceptos en las mutaciones .............................................................. 38412.16.1. Reversión y supresión de mutaciones ....................................................... 38412.16.2. Tasa de mutación .................................................................................... 38412.16.3. Dominancia y recesividad ........................................................................ 38512.16.4. Polimorfismo .......................................................................................... 38512.16.5. Mutación y cáncer ................................................................................... 38512.16.6. Hipermutación somática .......................................................................... 386

12.17. Efectos de las mutaciones .............................................................................. 38712.17.1. Efectos nocivos ...................................................................................... 38712.17.2. Efectos beneficiosos ............................................................................... 387

12.18. Ensayos de mutagenicidad ............................................................................. 38712.18.1. Tipos de ensayos .................................................................................... 38912.18.2. Métodos ................................................................................................ 389

12.19. Test de Ames .................................................................................................... 39012.19.1. Procedimiento general ............................................................................. 39012.19.2. Problemas y modificaciones .................................................................... 391

Resumen ........................................................................................................................ 394Práctica n.º 12 ............................................................................................................... 394Actividades de autoevaluación ........................................................................ 397


ÍNDICE

17

1. Evaluar la dificultad de trabajar con muestras biológicas.2. Identificar las moléculas diana de la biotecnología. 3. Describir técnicas instrumentales propias de la química y adaptadas a la bio-

logía molecular.4. Distinguir técnicas instrumentales propias de la biología molecular.5. Conocer las diferentes técnicas de cromatografía.6. Concretar las diferentes técnicas de electroforesis.7. Identificar las diferentes técnicas ópticas (absorción, dispersión y difracción

de radiación electromagnética).8. Explicar la técnica de espectrometría de masas.9. Estudiar las técnicas de transferencia de biomacromoléculas.10. Mostrar la técnica de ultracentrifugación.

Objetivos

3Técnicas de análisis de macromoléculas

Mapa conceptual

CAPÍTULO 3

70 ENSAYOS BIOTECNOLÓGICOS

TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE MACROMOLÉCULAS

INTRODUCCIÓN

CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA SOBREPAPEL Y CAPA FINA

Definición

Clasificación

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

MÉTODOS USUALES EN CROMATOGRAFÍA

ELECTROFORESIS

ELECTROFORESIS CAPILAR

ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN UV-V

TÉCNICAS DE DISPERSIÓNDE RADIACIÓN

DIFRACCIÓN DE RAYOS X

Cromatografía de adsorción

Cromatografía de exclusión molecular

Cromatografía de afinidad

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de líquidos de alta eficacia

Definición

Principios básicos

Técnicas

Turbidimetría

Nefelometría

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

ESPECTROMETRÍA DE MASAS

ULTRACENTRIFUGACIÓN

TRANSFERENCIA

FLUORESCENCIA

RADIACTIVIDAD

3.1. Introducción

El uso de las biotecnologías implica, en no pocos casos, la separación de un determinado com-puesto o fragmento de un compuesto, para su posterior elucidación estructural, identificacióny cuantificación. Si el problema analítico de la separación o purificación de un determinadocompuesto en una matriz es un problema arduo en las muestras normales, es mucho más pro-blemático cuando la muestra es biológica, por tres causas:

1. En principio el componente puede estar en un nivel de concentración de la traza o ultra-traza.

2. Las sustancias interferentes, en el mejor de los casos, no se cuentan sino por decenas ocentenas.

3. Las sustancias objeto de nuestro estudio, proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos buscados,tienen propiedades muy similares al resto de proteínas y fragmentos de ácidos nucleicos.

Por ello se deben utilizar técnicas muy específicas, como pueda ser la ultracentrifugación, oadaptar para nuestros analitos las técnicas generales del análisis químico, principalmente instru-mentales, como la espectrofotometría de absorción UV.


CAPÍTULO 3

71

Analito. Componente en la muestra que se quiere determinar.

Colimado. Se dice que un haz de luz está colimado cuando todos los rayos son pa-ralelos entre sí.

Densitómetro. Es básicamente una fuente de luz que apunta a una celda fotoeléc-trica, que determina la densidad de la muestra a partir de diferencias en las lecturas.Los densitómetros modernos tienen además electrónica integrada para mejorar laslecturas y si es digital mide los píxeles.

Eluyente. Fluido en movimiento en un proceso cromatográfico. Equivale a fase móvil.

Espectroscopia Raman. Técnica espectroscópica basada en los fenómenos de disper-sión inelástica, o dispersión Raman, de la luz monocromática, generalmente de unláser en el rango de luz visible, el infrarrojo próximo, o el ultravioleta cercano.

Plato. En cromatografía, generalmente denominado plato teórico, es el volumen re-querido por una molécula para establecer un equilibrio entre ella, la matriz y la fasemóvil en el sistema.

Punto isoeléctrico. Generalmente consignado como PI, es el valor del pH al cualuna proteína o aminoácido tiene carga eléctrica neta igual a cero, y, por tanto, carecede movilidad electroforética.

Traza. Escala de trabajo donde el analito se encuentra en una proporción entre100 ppm y 1 ppb.

Ultratraza. Escala de trabajo donde el analito se encuentra en una proporción inferiora la ppt.

Glosario

Dentro de estas técnicas, podemos diferenciar entre:

• Técnicas de separación selectiva.• Técnicas de determinación o elucidación estructural.• Técnicas de identificación.• Técnicas de cuantificación.

3.2. Cromatografía

3.2.1. Definición

La cromatografía es una técnica de separación de los componentes de una mezcla compleja, envirtud de la diferencia de velocidad que adquieren al atravesar un medio poroso, denominadofase estacionaria, al ser arrastrados por un eluyente en movimiento, o fase móvil.Actualmente, y sobre todos en las cromatografías instrumentales, además de una técnica de

separación (cromatografía preparativa), es una técnica de identificación y cuantificación de losdiferentes componentes de una mezcla.

3.2.2. Clasificación

Para clasificar los diferentes tipos de cromatografía, se pueden atender a varios criterios:

a) Según la naturaleza de las fases. Pueden existir dos tipos de fases estacionarias (sólido y lí-quido) y tres tipos de fase móvil (gas, líquido y fluido supercrítico). En general, la deno-minación primaria de una cromatografía hace referencia a la fase móvil.La siguiente tabla, describe las diferentes modalidades.

CAPÍTULO 3


Fase estacionariaFase móvil Gas Fluido supercrítico Líquido

Líquido

Gas

GLC

GSC

SFC

CFC

LLC

LSC

CUADRO 3.1Acrónimo de la cromatografía en función del estado de la fase móvil y estacionaria

b) Según el mecanismo de separación

1. Cuando la fase estacionaria es un líquido:

� Cromatografía de reparto. Se da un reparto múltiple y continuo del analito entrela fase móvil y la fase estacionaria.

2. Cuando la fase estacionaria es un sólido pueden darse diferentes mecanismos, en fun-ción de la naturaleza del sólido:

� Cromatografía de adsorción. Se da un proceso continuo de adsorción-desorcióndel analito entre la fase móvil y la fase estacionaria.

� Cromatografía de intercambio iónico. Auténtica reacción química, en la que in-tervienen diferentes iones, con ruptura y formación de enlaces, y donde la faseestacionaria tiene capacidad de intercambiar iones con la fase móvil.

� Cromatografía de exclusión molecular.También denominada cromatografía sobregel filtrante, donde la fase estacionaria es un sólido reticular, con diferente tamañosde poros, y donde los analitos penetran en dicha matriz más o menos en funciónde su tamaño, carga, naturaleza, etc.

� Cromatografía de afinidad. Donde el mecanismo de separación es la interacciónespecífica entre el analito y la fase estacionaria. Generalmente la afinidad es detipo biológico o bioafinidad, como la que existen entre antígeno-anticuerpo ysustrato-enzima.

c) Según la relación de polaridades de las fases

1. Cromatografía en fase normal. Cuando la fase móvil es menos polar que la fase es-tacionaria, como ocurre en la cromatografía de gases (GC).

2. Cromatografía en fase inversa. Cuando la fase móvil es más polar que la fase estacio-naria, como ocurre en la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).

d) Según la forma del desarrollo del proceso

1. Cromatografía frontal. Se introduce la muestra de forma continua en el sistema cons-tituyendo ella misma la fase móvil.

2. Cromatografía de desplazamiento. La fase móvil contiene un componente más afína la fase estacionaria que los componentes de la muestra, por lo cual es capaz de des-plazarlos de ella.

3. Cromatografía de elución. La muestra se introduce en un momento determinado yla fase móvil circula continuamente.

e) Según la disposición geométrica de las fases

1. Cromatografía en columna. Si la fase estacionaria se sitúa en un tubo.2. Cromatografía en plano. La fase estacionaria se deposita sobre una superficie abierta(papel, o capa fina sobre metal o polímero).

f) Según el objetivo a alcanzar

1. Cromatografía preparativa. Para separar los componentes de una mezcla y obtenercomponentes puros.

2. Cromatografía analítica. Análisis cualitativo y cuantitativo de una mezcla com-pleja.


CAPÍTULO 3

73

3.3. Cromatografía sobre papel y capa fina

El papel usado, de calidad especial, se introduce en un recinto cerrado para evitar su desecacióny se mantiene saturado de agua o del disolvente orgánico utilizado, para ser sometido al eluyenteque penetra por capilaridad. El desarrollo puede efectuarse como:

• Cromatografía ascendente. Es el método más sencillo y utilizado, donde el eluyente asciendepor acción capilar.

• Cromatografía descendente. El disolvente desciende tanto por capilaridad como por la fuerzade la gravedad.

• Cromatografía radial o circular. La muestra se deposita en el centro de un disco de papel co-locado horizontalmente donde se hace llegar el eluyente hasta el centro, separando loscomponentes en círculos concéntricos.

• Cromatografía bidimensional. Se recurre a utilizar una de las dos primeras técnicas, pero re-pitiendo el proceso en dos direcciones perpendiculares, utilizando el mismo o diferenteeluyente, y permitiendo una separación más completa.

En cuanto a las aplicaciones, son escasas, pero interesantes. Permiten visualizar el númerode componentes de una mezcla compleja, y desde el punto de vista del análisis cualitativo sepuede utilizar para identificar una sustancia mediante el denominado Rf, único para una sustanciadado un sistema cromatográfico definido.

Cuando para conseguir la separación se debe perder el frente de disolvente, se puede utilizarcomo referencia una sustancia determinada y afín al analito en cuestión. Obteniéndose el Rx:

Desde el punto de vista cuantitativo, el análisis solo puede ser semicuantitativo y utilizandopara ello microdensitómetros o aplicaciones informáticas de tratamiento de imágenes.

Radf =

Raxx =

CAPÍTULO 3


Figura 3.1Determinación del Rf

La cromatografía sobre papel tiene la limitación de que la celulosa no es universalmente sa-tisfactoria para la separación de todos los compuestos, por lo que otros componentes (gel de sí-lice, alúmina, tierra de infusorios, celulosa, poliamida, etc.), se han fijado a superficies diversas(vidrio, metales como aluminio, polímeros como plásticos, etc.), en diversos grosores 0,2-0,3 mm(para fines analíticos) y de 2-10 mm (para fines preparativos), dando unos resultados que se pue-den considerar como autenticas cromatografías en columnas abiertas.Comparándola con la cromatografía en papel, la cromatografía en capa fina, TLC (Thin Layer

Chromatography) es:

� Más rápida.� Más versátil.� Más reproducible.� Con manchas más definidas y menos difusas.� Se pueden utilizar reveladores más enérgicos.� El análisis semicuantitativo es más fiable.


CAPÍTULO 3

75

Figura 3.2Determinación del Rx

Figura 3.3Separación de aminoácidos por TLC. Desarrollo y revelado

3.4. Cromatografía en columna

Aún conserva su interés para la cromatografía preparativa. Como fase estacionaria se utiliza gelde sílice, “tierra de infusorios” o un gel de almidón o celulosa.

Se preparan poniendo la fase estacionaria, seca o en suspensión en el primer eluyente, en la co-lumna, introduciendo la mezcla posteriormente y eluyendo con un único o diferentes eluyentes.Las fracciones obtenidas, o eluatos, son posteriormente analizadas, según la técnica más adecuada.Es el soporte habitual para el resto de las técnicas, incluidas las grandes cromatografías ins-

trumentales:

• Cromatografía de adsorción.• Cromatografía de exclusión molecular.• Cromatografía de intercambio iónico.• Cromatografía hidrofóbica.• Cromatografía de afinidad.• Cromatografía de líquidos de alta eficacia.• Cromatografía de fluidos supercríticos. • Cromatografía de gases.• Cromatografía iónica.

Algunas de ellas son de escasa aplicación para las biomacromoléculas, como son la croma-tografía de gases, la cromatografía iónica, la cromatografía de fluidos supercríticos y la cromato-grafía de reparto, por lo que no se tratarán.

3.5. Métodos usuales en cromatografía

3.5.1. Cromatografía de adsorción

La adsorción es la propiedad que tienen ciertos sólidos de aumentar la concentración de otrassustancias en su superficie. La separación se debe a las diferencias de adsorción de los compo-nentes de una mezcla sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria ha de ser un sólido polar degran superficie (adsorbente). La fase móvil puede ser un gas o un líquido dando lugar a la cro-matografía gas-sólido (CGS) o líquido-sólido (CLS). El grado de adsorción varía según la naturaleza y superficie específica de los adsorbentes y

naturaleza de los solutos. Los enlaces entre las moléculas adsorbidas y el adsorbente han de serdébiles para que su fijación sea reversible; las uniones son debidas a fuerzas intermoleculares(interacciones dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno). Como regla general, las polaridades deladsorbente y de los solutos han de ser opuestas.La fase móvil está constituida por una mezcla de disolventes que deben ser, al menos, par-

cialmente solubles. Para una fase móvil determinada, cuanto más polar sea la sustancia de lamuestra, más va a ser retenida por la fase estacionaria (o menos arrastrada por la fase móvil); enlo que respecta a la velocidad de elución de una sustancia determinada, depende de la naturalezade la fase móvil: cuanto más polar sea la fase móvil más se desactivará la fase estacionaria y, porlo tanto, menos retenida quedará la sustancia en cuestión.

3.5.2. Cromatografía de exclusión molecular

También denominada cromatografía de tamiz molecular y (inadecuadamente según algunos autores)como cromatografía de filtración sobre gel y cromatografía de permeación en gel, es una técnica para la

CAPÍTULO 3


separación de productos macromoleculares sobre geles hinchables por el agua con ayuda deun medio acuoso (aunque se puede utilizar geles hidrófobos en medios con disolventes orgá-nicos).Los geles (de dextrano, almidones, celulosa, agar y agarosa y preparaciones de poliacrilamida,

polimetacrilato y poliestireno, en forma de pequeñas esferas y dispuestas en una columna), pre-sentan una estructura muy abierta, formando una estructura tridimensional y reticular que ase-meja una formación de oquedades cónicas de diferente tamaño (límite de exclusión), en las queen función del tamaño molecular y otros efectos menores, tendrán un camino de migración dediferente longitud, por lo que pueden ser separadas las diferentes fracciones al ser eluidas.Este tipo de cromatografía separa en función de los tamaños moleculares, y aunque en prin-

cipio pudiera parecer ilógico, salen primero las moléculas de mayor tamaño.Las aplicaciones analíticas más importantes son:

� El análisis de muestras multicomponentes.� La determinación y distribución de masas moleculares de polímeros.� La concentración de disoluciones diluidas de macromoléculas.

3.5.3. Cromatografía de afinidad

También conocida como cromatografía de bioselectividad, es aquella en la que la fase estacionariacontiene un grupo funcional ligado covalentemente que enlaza a una sola especie, o a un grupode especies. La sustancia a separar se mantiene en contacto en la mezcla con el grupo funcional adecuado

y soportado dentro de una columna, a la cual se une, para eluir el resto de los componentes dela mezcla, y una vez eliminados, eluir el componente retenido.Esta técnica, muy selectiva, es aplicable en bioquímica donde se puede sacar ventaja a las

interacciones específicas conocidas, tales como, enzimas y substratos y coenzimas, antígenos yanticuerpos, hormonas y receptores, etc.Aunque presenta el inconveniente de que la preparación de la columna específica puede ser

tediosa, una vez alcanzada, la separación se efectúa en unos pocos minutos y con un rendimientoexcepcional.

3.5.4. Cromatografía de intercambio iónico

Es una técnica que a pesar de tener más de ochenta años sigue siendo utilizada, al disponer ac-tualmente de un arsenal de resinas intercambiadoras de naturaleza orgánica, que han sustituidoa las primitivas permutitas y zeolitas.La fase estacionaria muestra en la superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con

iones de carga opuesta del analito. Este tipo de cromatografía se subdivide, a su vez, en la cro-matografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico, según la natura-leza del grupo funcional.El tamaño de partícula afecta a la velocidad de cambio y permeabilidad de una columna,

mientras que el grado de enlace es responsable de la rigidez, porosidad e hinchamiento, la fuerza


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del grupo funcional da el coeficiente de distribución y el número de grupos funcionales pro-porciona la capacidad de la resina.Las aplicaciones pueden resumirse en:

• Concentración de disoluciones diluidas.• Aislamiento de mínimas cantidades de una sustancia.• Separación de iones de propiedades analíticas semejantes.• Separación de iones interferentes.

3.5. . Cromatografía de líquidos de alta eficacia

La cromatografía de líquidos comprende todas las técnicas en la que la fase móvil es un líquido.Dentro de ella, se encuentran las más antiguas técnicas sobre papel, capa fina, columna y columnaabierta, pero dentro de este epígrafe solo vamos a considerar los métodos instrumentales. Se co-noce con el acrónimo HPLC (High Performance Liquid Chromatography), y los modos más usualesson la fase inversa, el intercambio iónico, los pares iónicos y la exclusión molecular, adquiriendocada vez más entidad la cromatografía quiral y la de afinidad. Hay que puntualizar que, la cro-matografía de líquidos se realiza a temperatura ambiente y, por tanto, se puede considerar a efec-tos prácticos, como un proceso isotérmico.La fase estacionaria es de naturaleza apolar, y son las más usuales:

� Fases monoméricas: como los n-alquilsilanos.� Fases oligoméricas: producidas por una reacción de entrecruzamiento entre un n-alquilpolímero en varias capas con los grupos silanol del silano.

� Fases poliméricas: polímeros sintéticos. El más usual es un copolímero de estireno-divi-nilbenceno.

Se denomina fuerza eluyente o poder de elución de una fase móvil a la capacidad de eluir unsoluto dado desde una fase estacionaria determinada, y se puede hablar en términos generalesde eluyentes fuertes y débiles. En cromatografía de líquidos en fase inversa, cualquier modificadororgánico (metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF)), es un disolvente fuerte en comparacióncon el agua.En cromatografía de líquidos, existen dos estrategias generales de elución:

1. Elución isocrítica: la fuerza eluyente de la fasemóvil permanece constante durante la separa-ción. Se suele emplear cuando los componen-tes de una muestra tienen factores de retenciónsemejantes.

2. Elución en gradiente: en las que se hace variar elpoder de elución de la fase móvil a lo largodel análisis, cambiando su composición deacuerdo a un programa establecido. Se sueleemplear para la separación de mezclas muycomplejas.

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Figura 3.4Cromatógrafo de HPLC. CC-By-AS-3.0.Jascobrasil

3.6. Electroforesis

3.6.1. Definición

La electroforesis es una técnica de separación que se basa en la migración diferencial (en sentido y ve-locidad) de partículas cargadas en un campo eléctrico establecido al efecto (gradiente de potencial).Estas partículas cargadas pueden ser muy diversas: iones simples, complejos, macromoléculas, coloides,materia corpuscular, células vivas como las bacterias o hematíes, o materia inerte como arcillas.Se trata de una técnica en que las fuerzas puestas en juego son de origen físico (electrostático)

aunque otros fenómenos físico-químicos son fundamentales. Se asemeja a las cromatografías enque es una técnica de separación con semejanzas a la cromatografía plana, y también se asemejaa las técnicas electroanalíticas, si bien no llega a producirse electrolisis al no llegar las especiescargadas a sus respectivos electrodos (reducción catódica y oxidación anódica).En un principio, podemos hablar de dos tipos de técnicas:

� Técnicas de electroforesis libre.Aplicación de un potencial eléctrico a una disolución en es-tado estacionario o no, en la que las especies se mueven libremente, sin más implicacionesque las derivadas de las características de la disolución y de las especies cargadas.

� Técnicas de electroforesis de zona. También denominada electroforesis en medio estabilizada, enlas que el movimiento se realiza a través de un medio sólido impregnado de disoluciónelectrolítica, y que dificulta el movimiento iónico libre.

3.6.2. Principios básicos

En función de que el fenómeno de transporte sea en disolución, o en un medio estabilizante,podemos tener en cuenta los siguientes fenómenos:

a) Fenómenos de transporte de disolución: pueden originarse diversos fenómenos que se tradu-cen en transporte de materia:

1. Difusión: provocado por la existencia de gradientes de concentración. 2. Migración: movimiento producido por la fuerza externa, en este caso el campo eléc-trico y su intensidad.

3. Convección: fenómeno no deseado, que consiste en el transporte de todas las especies.

b) Fenómenos de transporte en un medio estabilizante: en general, el empleo de un medio esta-bilizante situado entre los electrodos, en lugar de una disolución electrolítica, minimizalos efectos indeseables que se presentan en la denominada electroforesis libre.


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Figura 3.5El proceso electroforético

Los medios estabilizantes más empleados son de dos tipos:

1. Soportes compactos: con una microestructura interna capilar como el polvo decelulosa, vidrio pulverizado o membranas de acetato de celulosa.

2. Geles: de agar-agar o de poliacrilamida.

3.6.3. Técnicas

Aunque puedan existir otras técnicas electroforéticas y formas de clasificación, vamos a teneren cuenta las siguientes.

1. Electroforesis libre: también denominado método electroforético de límite móvil, es la técnicamás antigua y menos usual, solo válida para la determinación de movilidades absolutasde proteínas solubles. La detección se suele realizar por la medición de los índices de re-fracción a lo largo de tubos.

2. Isotacoforesis: técnica más usual, al poseer elevado poder de resolución, alta frecuencia demuestreo, precisión elevada y gran flexibilidad, pero solo puede separar especies iónicascargadas con el mismo signo. La detección se suele conseguir con varios detectores enserie, un termopar o un termistor de conductividad de alta frecuencia o fotométrico.

3. Electroforesis zonal: se caracteriza por la existencia de un medio estabilizante. Se puedellevar a cabo en una superficie plana o en una columna.

• Electroforesis zonal con soporte sólido.

� Soporte material plano:

a) Electroforesis sobre papel.b) Electroforesis sobre acetato de celulosa.c) Electrocromatografía.d) Inmunoelectroforesis.

� Soporte en columna: el soporte (celulosa, almidón o Sephadex™), en forma depolvo se coloca en una columna al estilo cromatográfico.

• Electroforesis zonal en gel: además del empleo como los anteriores soportes, en planoo en columna, admite dos variaciones:

� Electroforesis en gel con gradiente de porosidad. La electromigración se ve impe-dida por fenómenos de filtración.

� Electroforesis en gel en presencia de detergente aniónico: utiliza el dodecil sulfo-nato sódico (SDS) que interacciona reversiblemente con las proteínas eliminandolas diferencias de carga, dándose la separación, solo en función de su tamaño mo-lecular, al igualar la carga de todas las proteínas.

4. Enfoque isoeléctrico: se basa en la formación de un gradiente de pH (lineal, cóncavo, con-vexo o por etapas) en el medio estabilizante, donde al colocar la mezcla de sustancias aseparar, que necesariamente deben ser anfolitos, estos se mueven hacia el cátodo o elánodo hasta llegar a la zona de pH en que se alcanza el punto isoeléctrico (PI).

5. Electroforesis capilar: su importancia naciente hace que merezca tratamiento aparte.

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Figura 3.6Electroforesis en acetato de celulosa

3.7. Electroforesis capilar

Es una técnica de separación que se basa en la diferente movilidad electroforética de las sustanciasa analizar bajo la acción de un campo eléctrico, en el interior de un tubo capilar. Por tanto com-bina el poder de separación de la electroforesis convencional con el instrumental propio de laHPLC, y que se traduce en:

� Elevada rapidez de análisis, inferiores a los 30 minutos.� Elevada eficacia 105-106 platos por metro.� Bajos volúmenes, del orden de nL.� Universalidad.� Facilidad de automatización.

Las columnas capilares son tubos cuyas dimensiones varían entre las 25-100 μm de diámetro,y 25-100 cm de longitud, generalmente construidas en sílice fundida o teflón.Para técnicas especiales se ha recurrido a utilizar columnas capilares rellenas de partículas o

geles como son:

• Electroforesis con micelas con el uso de SDS.• Redes poliméricas con el uso del ADN, polisacáridos o complejos proteínas-SDS.• Geles anclados, con el uso de poliacrilamida lineal, polietilenglicol, metilcelulosa o alcoholpolivinílico.

El empleo de columnas especiales también da lugar a técnicas diferenciadas en columna ca-pilar como son:

� Isoelectroenfoque capilar.� Electrocromatografía capilar.� Isotacoforesis capilar.

La aparición de la electroforesis capilar como una importante técnica analítica de separación,ha originado la adaptación de un variado número de detectores ya existentes para hacerlos com-patibles con la técnica. Así, se han modificado detectores UV-V, comprobándose la utilidad deotros, como son los espectrómetros de masas, los amperométricos y los de fluorescencia. Menos

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