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Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault Année 2008-2009. I – Equilibre acide-base. Exercice 1 Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Enseignements dirigésBiochimiePCEM 1
Acides Aminés – OligopeptidesMéthodes d’étude
L. Coulbault
Année 2008-2009
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I – Equilibre acide-base
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Exercice 1
Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait intervenir une constante.C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).D – La constante pKa peut être déterminée par des courbes de titrage.E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne peuvent pas être déterminées par titration.
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Ka = constante de dissociation
[H+].[A-]Ka = ________
[AH]
Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])
EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES
HA A- + H+
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+ B
+ A
A = point d'équivalence où le pH varie beaucoup
B = Point de demi-neutralisation = pKa où le pH varie peuDonc [A-] = [AH]
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* Autour de son pKa , [A-] = [AH] et le tampon maintient le pH d'une solutionRésistant aux modifications de pH quand ajout de H+ ou OH-
SOLUTIONS TAMPONS
* Un tampon est généralement constitué d’une solutiond’acide faible et d’un de ses sels de base forte oud’une solution de base faible et d’un de ses selsd’acide fort
pH = pKa + log10 [Sel]/[AH]
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Exercice 1
Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.
FAUX
B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait intervenir une constante
VRAI
C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).FAUX
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Exercice 1
D – La constante pKa peut être déterminée par des courbes de titrage
VRAI
E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne peuvent pas être déterminées par titration
FAUX
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Exercice 2
Parmi les produits suivants, quel(s) est (sont) celui (ceux) qui peut (pourront) en théorie être utilisé(s) pour le dosage de l’activité d’un enzyme dont le pH optimum d’activité est de 7,5 ?
A/ Tris hydroxyméthyl aminométhane pKa=8.06B/ Acide propionique pKa=4.87C/ Pipéridine pKa=11.2D/ Acide phosphorique pKa1 = 2.15, pKa2 = 7.2, pKa3 = 12.33E/ Hydroxyde d’ammonium pKa=9.25F/ Acide acétique pKa=4.76
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pH = 7,5
pKa de la molécule doit être proche de la valeur de pH voulue
donc Acide phosphorique à son pKa2 = 7,2
éventuellement Tris (8,06)
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Propriétés Structurales des Acides Aminés
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Définition d’un acide aminé
H
NH2/ NH3+ - C* - COO-/COOH
R
* Chaine latérale variable
* 20 AA impliqués dans la structure des protéines
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AA ALIPHATIQUES NEUTRES
Aliphatique :
R = chaîne latérale hydrocarbonée linéaire ou ramifiée
Neutre :
Ne possède pas de fonction carboxylique (COOH) ou
aminée (NH2) supplémentaire sur R
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* A CHAINE HYDROCARBONEE.
Glycine ou Gly R = H seul AA sans C asymétrique
donc dépourvu de pouvoir rotatoire
Alanine ou Ala R = - CH3
CH3
Valine ou Val R = - CH- CH3
CH3
Leucine ou Leu R = - CH2- CH - CH3
Isoleucine ou Ile R = - CH – CH2 - CH3
CH3
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* A FONCTION ALCOOL –OH.
Sérine ou Ser
R = - CH2-OH fonction alcool primaire
Thréonine ou Thr
R = -CHOH-CH3 fonction alcool IIre
* A FONCTION SOUFREE -SH.
Cystéine ou Cys R = - CH2 – SH (SH = gpt thiol)
Méthionine ou Met R = - CH2- CH2- S- CH3
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AA AROMATIQUES NEUTRES(possèdent une structure cyclique de type
benzénique)
Responsables de l’absorption dans l’UV des protéines Phénylalanine ou Phé
Tyrosine ou Tyr qui possède une fonction phénolique
Tryptophane ou Trp Absorbe à 280 nm
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AA NEUTRE HETEROCYCLIQUE Proline ou Pro
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AA ACIDES(possédent un groupement acide carboxylique
supplémentaire sur la chaîne latérale)
NB :leurs dérivés : la glutamine (Gln) , l’asparagine (Asn)
sont considérés comme des AA neutres
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AA BASIQUES(possédant une fonction aminée supplémentaire
sur la chaîne latérale)
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C
COO-
R
HNH3+ C
COO-
R
NH3+H
série L série D
perspective
STEREOCHIMIE
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Notion de polarité
Ex de l’eau : Atome O très électronégatif (attraction des électrons ++)Formation d’un dipôle permanent + -Favorise la formation des liaisons hydrogène.
Fonction acide carboxylique/Gpt phosphate/Gpt Ammonium+ Hydroxyles
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AA avec Groupement polaire:
Polaires non ionisables : Ser(OH),Thr (OH), Asn, Gln
Polaires ionisables en fonction du pH :Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr
seuls les AA ionisables (Lys , Arg, His, Asp, Glu) peuvent
intervenir dans une liaison ionique à pH physiologique (car groupements NH3+ ou COO-)
NB : Pour Tyr (O-/OH) et la Cys (S-/SH) au pH physiologique, pas de dissociation de Tyr (OH) et Cys (SH) au regard de leur pKa(groupement chargé seulement à pH basique)
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Leu IleValAlaGly
Phe
MetCys
TrpTyr
Thr ProSer
HisGluGln AspAsn
Lys
Arg
M
Polarité
Le caractère polaire ou apolaire d’une molécule dépendra de la
présence ou non d’une ou plusieurs fonctions chimiques supplémentaires.
Hydrosolubilité est fonction de la proportion de
groupements polaires dans la molécule.
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Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun :
A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latérale
B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latérale
C/ Une chaîne latérale chargée
D/ Une chaîne latérale apolaire
E/ Elles n’ont aucun point commun
Exercice 3
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Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun :
A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latéraleFAUX
B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latéraleVRAI
C/ Une chaîne latérale chargéeFAUX
D/ Une chaîne latérale apolaireVRAI
E/ Elles n’ont aucun point communFAUX
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Exercice 4Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes :La sérine et la thréonine sont :A/ des acides aminés avec une chaîne latérale
de nature phénolique
B/ de la série D à l’état naturel
C/ des acides aminés basiques
D/ des acides aminés alcool
E/ des acides dicarboxyliques.
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Exercice 4
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
La sérine et la thréonine sont :
A/ des acides aminés avec une chaîne latérale de nature phénolique
FAUX
B/ de la série D à l’état naturel
Série L (série D ex : glucose)
C/ des acides aminés basiques
FAUX
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D/ des acides aminés alcool
VRAI
E/ des acides dicarboxyliques.
FAUX
* A FONCTION ALCOOL –OH.
Sérine ou Ser
R = - CH2-OH
fonction alcool primaire
Thréonine ou Thr
R = -CHOH-CH3
fonction alcool IIre
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Exercice 5Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont : A. La phénylalanine.B. L’arginine.C. La glutamine.D. L’acide aspartique.E. La glycine.
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Les acides aminés pouvant participer à des interactionsélectrostatiques dans les protéines sont des AA présentant une chaîne latérale ionisable
AA acides
AA basiques
Polaires ionisables en fonction du pH :
Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr
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Exercice 5
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont :
A. La phénylalanine
FAUX
B. L’arginine
VRAI
C. La glutamine
FAUX
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D. L’acide aspartique
VRAI
E. La glycine.
FAUX
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Exercice 6
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
Parmi les acides aminés suivants, les acides aminés essentiels sont :
A/ La leucine
B/ Le tryptophane
C/ La glycine
D/ L’alanine
E/ La lysine
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AA essentiels : Pas de synthèse par l’organisme
Val / Leu / Ile / Lys / Phe / Trp / Met / Thr / His / Arg
Arg et His sont synthétisés par les tissus, mais en quantité insuffisante pour le soutien de la croissance chez les enfants
Réponses A, B, E
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Exercice 7 Certains neurotransmetteurs proviennent de la transformation biochimique d’un acide aminé ; le(s)quel(s) ?Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ AcétylcholineB/ NoradrénalineC/ SérotonineD/ DopamineE/ Acide -amino butyrique (GABA)
![Page 37: Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681469a550346895db3b231/html5/thumbnails/37.jpg)
Ex : Dopamine
Sérotonine
Histamine
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A/ AcétylcholineFAUX
B/ NoradrénalineVRAI (tyrosineDOPADopamineNorAdAd)
C/ Sérotonine VRAI (tryptophane)
D/ Dopamine VRAI (tyrosine)
E/ Acide -amino butyrique (GABA) VRAI (précurseur : glutamate)
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Exercice 8 Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5. Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes :
A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5
B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25
C. Le pHi calculé pour X est de 10,75
D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation
E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé
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Propriétés acido-basiques
des acides aminés
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Ka = constante de dissociation
[H+].[A-]Ka = ________
[AH]
Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])
EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES
HA A- + H+
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SIGNIFICATION DES pKA DES AA
(Valable pour tous les AA)
Gpt (COO-/COOH) pKa1 (# 2-2,5)
pKa1 = pH pour lequel [COO-] = [COOH]
Gpt (NH2/NH3+) pKa2 (# 9-10)
pKa2 = pH pour lequel [NH2] = [NH3+]
POINT ISOELECTRIQUE (pI ou pHi)
pH pour lequel le nombre de charges positives est égal au nombre de charges négatives
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O-
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![Page 45: Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681469a550346895db3b231/html5/thumbnails/45.jpg)
![Page 46: Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681469a550346895db3b231/html5/thumbnails/46.jpg)
![Page 47: Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681469a550346895db3b231/html5/thumbnails/47.jpg)
à pH << pKa1 (donc < 2) = pH acide
Les 2 Gpts sont sous forme protonée
COOH et NH3+
COOH-CHR-NH3+ charge nette = +1
cation
à pH = pKa1
[COO-] = [COOH]
et forme majoritaire NH3+ (pH < pKa2)
charge nette :Pour 2 molécules, CN= (2 charges (+) + 1 charge (-))/2= +0,5
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTECas de l’Alanine
O-
O-
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A pH compris entre pKa1 et pKa2
forme majoritaire [COO-] (pH > pKa1)forme majoritaire NH3
+ (pH < pKa2)
Forme majoritaire de l’AA = zwitterion
COO- - CHR – NH3+ charge nette = 0
pI = pH pour lequel la molécule estélectriquement neutre
pI = (pKa1 + pKa2)/2
O-
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à pH = pKa2[NH2] = [NH3+]et forme majoritaire COO- (pH >>> pKa1)
charge nette = ((1 x +1)+ (2x-1))/2 = -0,5 (en moyenne)
à pH >> pKa2 (donc > 10) donc pH basique
gpts sous forme déprotonée COO- et NH2
COO- – CHR – NH2
charge nette = -1anion
O-
O-
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Une fonction acide carboxylique supplémentaire
NH2 - CH – CH2- CH2 - COOH
COOH
Caractérisé par 3 pKa :
- pKa1 = pH pour lequel [COO-] = [COOH]
- pKa2 = pH pour lequel [NH2] = [NH3+]
- pKa3 = pH pour lequel [CLCOO-] = [CLCOOH]
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTECas de l’acide glutamique
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pH << pKa1
Tous les gpts sous forme protonée :COOH, CLCOOH et NH3
+
charge nette : +1
pH compris entre pKa1 et pKa3
Gpts sous forme COO-, CLCOOH et NH3+
charge nette :0 (zwitterion)
pI = (pKa1+ pKa3)/2 = 3,25
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pH compris entre pKa3 et pKa2
Gpts sous forme COO-, CLCOO- et NH3+
charge nette : -1
pH >> pKa2
Gpts sous forme COO-, CLCOO- et NH2
charge nette : -2
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Ex : Lys ; une fonction amine supplémentaire
NH2 - CH – CH2- CH2 – NH2
COOH
Présence de 3 pKa- pKa1 = pH pour lequel [COO-] = [COOH]
- pKa2 = pH pour lequel [NH2] = [NH3+]
-pKa3 = pH pour lequel [CLNH2] = [CLNH3+]
pI = (pKa2 + pKa3)/ 2
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTECas des acides aminés basiques
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Exercice 8 Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5. Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes :
A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5
B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25
C. Le pHi calculé pour X est de 10,75
D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation
E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé
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Exercice 8 Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5. Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes :
A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5
Zwitterion majoritaire si pH proche du pHi
Valeur pKa3 élevée d’où acide aminé basique
Calcul du pHi
pHi = ( 9 + 12,5) / 2 = 10,75
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B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25
Faux
C. Le pHi calculé pour X est de 10,75
Vrai
D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation Faux
pH << pHi , charge nette +
pH # pHi, charge nette nulle
pH >> pHi, charge nette -
E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé
Faux
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Exercice 9 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :Les techniques permettant la séparation des acides aminésen solution sont :
A/ L’électrophorèse
B/ L’ultracentrifugation
C/ La chromatographie liquide
D/ L’électrophorèse capillaire
E/ La chromatographie d’échange d’ions
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ELECTROPHORESE Principe Une molécule chargée se déplace dans un champ électrique vers l’électrode de signe opposé à sa charge.
Cathode : électrode chargée négativementAnode : électrode chargée positivement
Gel d’agarose
Gel d’acétate decellulose
ELECTROPHORESE CAPILLAIRE : principe identique,Séparation d’un mélange complexe dans un capillaire soumis à une différence depotentiel élevée ; Pouvoir de séparation très important.Utilisé par exemple pour la détermination de séquences nucléotidiques(=séquenceur)
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La vitesse de migration d’un AA dans un champ électrique est
- fonction de la charge globale de l’AA donc
- fonction du pH de la solution d’électrophorèse
A retenir
pH << pHi , charge nette + = cation migrant vers la cathode
pH # pHi, charge nette nulle = zwitterion ne migrant pas
pH >> pHi, charge nette - = anion migrant vers l’anode
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ULTRACENTRIFUGATION DE ZONE.M. (1-v.r)
S= ____________
fAvec M : masse moléculaireS : coefficient de sédimentationV : volume spécifique partiel de la particuleR : densité de la solutionF : coefficient de friction.
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METHODES CHROMATOGRAPHIQUES :
Chromatographie en couche mince
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METHODES CHROMATOGRAPHIQUES :
Chromatographie liquide (CLHP)
Pompe Injecteur Colonne Détecteur
Solvants Echantillons
SéparationEx :- C18- Echange d’ions
Ex :-UV-visible- Fluorimétrie
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CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS
Colonne : résine synthétique munie de groupementschargés
résine échangeuse de cations : charges –
Ex résine de polystyrène sulfoné (ions SO3-)
carboxyméthylcellulose : C02- - CH2 – O – cellulose
résine échangeuse d’anions : charges +
DEAE-cellulose : (CH3-CH2)2NH+ - (CH2)2 - cellulose
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Technique reposant sur l’interaction électrostatique entre un AA chargé et une particule stationnaire portant une charge de signe opposé.
L’interaction peut-être modifiée en faisant varier le pH, donc en variant les charges des AA et donc leur vitesse de migration le long de la colonne
Résine portant des charges - (échangeuses de cations)
À pH 2, tous les AA sous forme de cations = fixation de tous les AA sur la colonne
Si on augmente le pH, les 1ers AA à se retrouver sous forme de zwitterion sont les AA à pHi bas (AA acides) qui se détachent de la colonne et sont élués les 1ers en bas de la colonne
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Exercice 9 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :Les techniques permettant la séparation des acides aminésen solution sont :
A/ L’électrophorèseVRAI
B/ L’ultracentrifugation FAUX
C/ La chromatographie liquideVRAI
D/ L’électrophorèse capillaireVRAI
E/ La chromatographie d’échange d’ionsVRAI
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Exercice 10On dispose d’un mélange de 4 acides aminés appartenant à la liste suivante : Glu, His, Val, Arg. Valeurs des différents pKGlu pKa1=2,2 pKa2=9,9 pKa3=4,4Ala pKa1=2,3 pKa2=9,7Arg pKa1=2,2 pKa2=9,4 pKa3=12,5Asp pKa1=2 pKa2=10 pKa3=3,9Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminésB/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminésC/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux électrophorèses à pH=3 et pH=7.D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du pH imposé.E/ Aucune réponse bonne.
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Glutamate pKa1=2,2 pKa2=9,9 pKa3=4,4
Alanine pKa1=2,3 pKa2=9,7
Arginine pKa1=2,2 pKa2=9,4pKa3=12,5
Aspartate pKa1=2 pKa2=10pKa3=3,9
1ère étape : calcul du pHi
Glutamate pHi =3,3
Alanine pHi = 6
Arginine pHi = 10,95
Aspartate pHi = 2,95
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Glutamate pHi =3,3
Alanine pHi = 6
Arginine pHi = 10,95
Aspartate pHi = 2,95
pH = 7
pH >>> pHipH >> pHi + 2Charge nette ---
pH =~pHiCharge nette -
pH<<<pHipH << pHi – 2Charge nette +
pH >>> pHipH >> pHi + 2Charge nette ---
pH = 3
pH ~ pHiZwitterion +++
pH <<< pHi - 2Charge nette +++
pH<<<pHipH << pHi – 2
Charge nette +++
pH ~ pHiZwitterion +++
![Page 69: Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681469a550346895db3b231/html5/thumbnails/69.jpg)
Glutamate pHi =3,3
Alanine pHi = 6
Arginine pHi = 10,95
Aspartate pHi = 2,95
pH = 7
pH >>> pHipH >> pHi + 2Charge nette ---
pH =~pHiCharge nette -
pH<<<pHipH << pHi – 2Charge nette +
pH >>> pHipH >> pHi + 2Charge nette ---
pH = 3
pH ~ pHiZwitterion +++
pH <<< pHi - 2Charge nette +++
pH<<<pHipH << pHi – 2
Charge nette +++
pH ~ pHiZwitterion +++
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Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :
A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminés
Faux
B/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminés
Faux
C/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux électrophorèses à pH=3 et pH=7.
Faux
D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du pH imposé.
Vrai
E/ Aucune réponse bonne.
Faux
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x
4
2 3
1
Exercice 11 Un mélange de quatre acides aminés (Leu, His, Thr, Lys) est séparé par la technique de Finger Print (électrophorèse sur papier à pH 6 suivie d’une chromatographie ascendante en solvant organique). Après coloration à la ninhydrine, on obtient la cartographie suivante :
+ Electrophorèse -
Dépôt
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On donne :Leu pKa1 = 2,3 pKa2= 9,7His pKa1 = 1,7 pKa2= 9,1 pKa3= 6,0Ala pKa1 = 2,3 pKa2= 9,9Lys pKa1 = 2,0 pKa2= 9,1 pKa3= 10,7 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :A/ Le spot 1 est un acide aminé aliphatique.B/ Le spot 2 correspond à l’histidine.C/ Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une valeur de pHi supérieure à 6.D/ Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une chaîne latérale ionisée.E/ Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à l’alanine.
![Page 73: Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude L. Coulbault](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062322/5681469a550346895db3b231/html5/thumbnails/73.jpg)
Leu pKa1 = 2,3 pKa2= 9,7 pHi= 6
His pKa1 = 1,7 pKa2= 9,1 pKa3= 6,0 pHi = 7,05
Ala pKa1 = 2,3 pKa2= 9,9 pHi = 6,1
Lys pKa1 = 2,0 pKa2= 9,1 pKa3= 10,7 pHi = 9,9
Electrophorèse sur papier à pH = 6
Leu et Ala ne migrent pas
His et Lys chargés positivement avec la charge la plus importante pour Lys (d’où migre le plus loin)
Chromatographie avec une phase organiqueLes solutés migrent avec un solvant organiqueLes acides aminés avec une chaîne latérale très apolaire migreront en même temps que le front de solvant de la phase organique (donc migrent plus loin par comparaison aux composés les plus polaires)
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+ Electrophorèse -
x
4
2 3
1
Dépôt
LysHis
Leu
Ala
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Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :A/ Le spot 1 est un acide aminé aliphatique
Faux
B/ Le spot 2 correspond à l’histidineFaux
C/ Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une valeur de pHi supérieure à 6
Vrai
D/ Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une chaîne latérale ionisée
Faux
E/ Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à l’alanine.
Faux
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Exercice 12 La chromatographie sur résine échangeuse de cations :
1 – indique que la colonne porte des charges négatives
2 – indique que la colonne porte des charges positives
3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au temps
4 – permet la séparation de la valine et de la lysine
5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13
6 – ne peut échanger que des cations
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1 – indique que la colonne porte des charges négativesVRAI
2 – indique que la colonne porte des charges positives
FAUX3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au temps
FAUX
4 – permet la séparation de la valine et de la lysine VRAI
5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13 FAUX
6 – ne peut échanger que des cations Réponse D : 1,4,6
VRAI
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Exercice 13 Soit un mélange de 3 oligopeptides1/ Phe-Gly-Leu-Lys2/ Val-Ile-Thr-Asp3/ Ala–Gly-Trp-Ser Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié permettra la séparation du mélangeB/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la cathodeD/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basiqueE/ La chromatographie d’exclusion est une technique appropriée pour la séparation du mélange
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Valeur du pH
1 6 13
Phe-Gly-Leu-Lys +2 +1 -1
Val-Ile-Thr-Asp +1 -1 -2
Ala–Gly-Trp-Ser +1 0 -1
Exemple à pH=6 :
+H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COO-
NH3+ CN=(2x+1) + (1x-1)=+1
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Valeur du pH
1 6 13
A Phe-Gly-Leu-Lys +2 +1 -1
B Val-Ile-Thr-Asp +1 -1 -2
C Ala–Gly-Trp-Ser +1 0 -1
Exemple à pH=6 :
+H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COO-
NH3+ CN=(2x+1) + (1x-1)=+1
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dépôt
Cathode (-) Anode (+)
A B C
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A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié permettra la séparation du mélange
VRAIB/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse
FAUX C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la cathode
FAUXD/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basique
VRAIE/ La chromatographie d’exclusion est une technique appropriée pour la séparation du mélange
FAUX
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Exercice 14 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les
propositions suivantes : Voici cinq peptides :A/ Ala-Asp-Arg-Asp-GlyB/ Arg-Ala-Arg-Ala-PheC/ Asp-Lys-Asp-Ala-LysD/ Glu-Lys-Trp-Lys-ValE/ Glu-Asp-Ala-Asp-Val et quatre critères 1) Hydrolyse/HCl = 3 spots2) Hydrolyse trypsique = 3 spots3) Electrophorèse à pH 6 = migration vers la cathode4) Absorption UV à 280 nm Lequel (ou lesquels) de ces peptides répond(ent) à
tous ces critères ?
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Hydrolyse par HCl = séparation des AA avec destruction du TrpAla-Asp-Arg-Asp-Gly 4 spots = Ala, Asp, Arg et Gly
Arg-Ala-Arg-Ala-Phe 3 spots : Arg, Ala et PheAsp-Lys-Asp-Ala-Lys 3 spots : Asp, Lys, AlaGlu-Lys-Trp-Lys-Val 3 spots : Glu, Lys et ValGlu-Asp-Ala-Asp-Val 4 spots : Glu, Asp, Ala et Val
Hydrolyse trypsique = 3 spotsTrypsine = coupe la liaison peptidique du coté carboxyliquedes AA basiques Lys et Arg
Arg Ala-Arg et Ala-Phe 3 spots
Asp-Lys et Asp-Ala-Lys 2 spots
Glu-Lys Trp-Lys et Val 3 spots
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Électrophorèse à pH 6 ; migration vers la cathode donc sous forme de cation chargé positivement
Arg-Ala-Arg-Ala-Phe 2 AA basiques et 3 AA neutres
3 NH3+ et 1 COO- charge nette = +2 vrai
Glu-Lys-Trp-Lys-Val
1 AA acide, 2 AA basiques et 2 AA neutres
3 NH3+ et 2 COO- charge nette = +1 vrai
Absorption dans l’UV à 280nm : oligopeptide d)
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Hydrolyse acide (Hcl) Séparation des AA avec destruction du Trp
Trypsine : Endopeptidase coupant l’AA basique Lys ou Arg
à son extrémité carboxylique
Carboxypeptidase B : Exopeptidase permettant de séparer
l’AA du côté carboxylique
Chymotrypsine : Endopeptidase coupant essentiellement les
AA aromatiques du côté carboxylique
Bromure de cyanogène : Coupe du côté carboxylique de la Met.
= Coupure des liaisons peptidiques
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-mercaptoéthanol : rupture des ponts disulfures établis entre 2 Cys
Urée 8M / Dodécylsulfate de sodium : rupture des liaisons hydrogène,ioniques
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Exercice 15 Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides aminés différents.L’action du -mercaptoéthanol sur le composé A libère un hexapeptide B et un dipeptide C.L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur le peptide C et Ile sur le peptide B.L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH-Asp.L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide. Le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir rotatoire.L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obtention de deux tripeptides.Indiquer la séquence des peptides A, B et C.
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Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides aminés différents.
Attention à la terminologie : A possède huit AA et il n’est pas spécifié qu’il s’agit d’un octapeptide c-à-d enchainement de 8 AA
Hydrolyse : 6 AAPossibilité de Trp (1 ou 2) détruit lors de l’hydrolyse acideou de la présence d’un ou deux AA identiques
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L’action du -mercaptoéthanol sur le composé A libère un hexapeptide B et un dipeptide C.Mercaptoéthanol : rupture d’un pont disulfure entre 2 Cys
Donc 2 Cys l’un sur l’hexapeptide B (a-b-c-d-e-f)l’autre sur le dipeptide C (g-h)
B et C étants reliés par un pont disulfure pour former A
L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur le peptide C et Ile sur le peptide B.
Carboxypeptidase B : exopeptidase permettant de séparer
l’AA du côté carboxylique
Donc f = Ile h = Arg et g = Cys
Donc B = a-b-c-d-e-Ile (dont 1 cys) et C = Cys-Arg
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L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH-Asp
Réactif d’Edman : Réaction qui permet de séquencer
l’oligopeptide à partir de son extrémité aminée
Donc a = Asp
L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide.
Deux info :Tétrapeptide contient 1 Trp détruit par l’hydrolyse acide
Donc 8 AA : Cys (2), Trp, Asp, Ile, Arg, Lys, X
Par hydrolyse acide, 6 spots correspondant à 6 AA différentsCys, Asp, Ile, Arg, Lys et X
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B = tétrapetide-dipeptide ou dipeptide-tétrapeptide
Or le tétrapeptide contient Asp = a-b-c-d =
Tétrapeptide = Asp – (Trp,X)- Lys
Donc B = Asp – (Trp, Gly) – Lys – Cys – Ile
Car le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir rotatoire. Il s’agit de Gly.
L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obtention de deux tripeptides.
Donc c = Trp et b = Gly pour obtenir deux tripeptides
Asp-Gly-Trp et Lys-Cys-Ile
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C = Cys-Arg
B = Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile
A Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile
SS
Cys -Arg