entwicklung molekularbiologischer nachweise für alicyclobacillus … · 2013-03-14 ·...
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Entwicklung molekularbiologischer Nachweise für Alicyclobacillus-Sporen nach einer Aptamer-basierten Anreicherung
Hünniger, Tim; Herrmann, Luise; Haase, Ilka; Fischer, Markus
HAMBURG SCHOOL OF FOOD SCIENCE , Institut für Lebensmittelchemie, Universität Hamburg, www.hsfs.org, www.chemie.uni-hamburg.de/lc Ansprechpartner: [email protected]
Literatur: [1] Connor, C. J., et al. (2005). "Development of a real-time PCR-based system targeting the 16S rRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products." Int J Food Microbiol 99(3): 229-235. [2] Chen, J., et al. (2011). "Sensitive and rapid detection of Alicyclobacillus acidoterrestris using loop-mediated isothermal amplification." J Sci Food Agric 91(6): 1070-1074. Diese Arbeit ist Teil des Projektes „Affinitätsanreicherung von Sporen von Alicyclobacillus acidoterrestris, A. acidiphilus und A. herbarius aus wirtschaftlich relevanten Säften und Saftkonzentraten für die Qualitätskontrolle im Routinebetrieb“ in Kooperation mit der Universität München, Lehrstuhl für Hygiene und Technologie der Milch, Oberschleißheim, sowie dem Verband der deutschen Fruchtsaft-Industrie (VdF) e.V., Bonn. Das Forschungsvorhaben (AiF 17245 N) wird im „Programm zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF)“ vom Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie (via AiF) über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie e.V. (FEI) gefördert.
Einführung und Zielsetzung
Derzeit stehen der Fruchtsaftindustrie nur bedingt analytische Methoden zur Verfügung, die während des Routinebetriebes einen zeitnahen Nachweis von Alicyclobacillus-Sporen ermöglichen, da stets ein zeitaufwendiger Anreicherungsschritt durch Kultivierung notwendig ist. Die nach Auskeimung der Sporen vorliegenden Mikroorganismen produzieren durch ihren Stoffwechsel ein rauchig bzw. nach Desinfektionsmitteln riechendes off-Flavour (hauptsächlich verursacht durch Guajacol). Dieses Fehlaroma führt bei entsprechenden Kontaminationen zu erheblichen Produktausfällen. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines Aptamer-basierten Bioaffinitäts-Anreicherungssystems für Alicyclobacillus-Sporen über modifizierte Nanopartikel für die Lebensmittelmatrices Orangen- und Apfelsaft, wobei der anschließende Sporennachweis mittels PCR- oder Sonden-basierten Verfahren erfolgen soll. Die verwendeten Sporen-spezifischen Aptamere dienen dabei als Rezeptormoleküle und ersetzen die zeitaufwendige mikrobiologische Anreicherung der Alicyclobacillus-Sporen. Bei möglichen Kontaminationen von Orangen- und Apfelsäften ist somit innerhalb kurzer Zeit eine sichere Analytik mit dieser molekularbiologischen Methode möglich.
• DNA-Isolierung aus Alicyclobacillus-Sporen »Die DNA-Isolierung ist für einen sicheren Nachweis der Alicyclobacillus-Sporen essentiell. Dabei ist die Sporenlyse bei dieser Anwendung aufgrund der Sporenhülle ausschließlich durch mechanische Behandlung (A: Ultraschallbehandlung mittels Sonotrode, B: Verwendung von Glasperlen in einer Kugelmühle) möglich. Anschließend erfolgen unterschiedliche molekularbiologische Nachweisverfahren.
A B
Glasperlen
1-minütige gepulste Ultraschallbehandlung
mittels Sonotrode
• klassische Endpunkts-PCR »Als qualitativer Nachweis wurde eine klassische Endpunkts-PCR, die als real time-Methode für die vegetativen Zellen publiziert wurde, erfolgreich auf die Sporen adaptiert[1]. Hierbei wird ein 134 bp langes Fragment aus der 16S rDNA amplifiziert und detektiert.
BW = Blindwert PK = Positivkontrolle 1 = 106 Sporen/mL 2 = 106 Sporen/mL 3 = 105 Sporen/mL 4 = 105 Sporen/mL 5 = 104 Sporen/mL 6 = 104 Sporen/mL 7 = 103 Sporen/mL 8 = 103 Sporen/mL 9 = 102 Sporen/mL 10 = 102 Sporen/mL
• real time-PCR »Die Weiterentwicklung der klassischen Endpunkts-PCR zur real time-PCR bietet die Möglichkeit der Sporenquantifizierung.
• LAMP »Als Alternative zur Endpunkts-PCR stellt die LAMP (loop-mediated isothermal amplification) eine isothermale qualitative Nachweismethode dar. Diese basiert ebenfalls auf der Detektion eines Amplifikates der 16S rDNA, wobei der Nachweis deutlich schneller erfolgt[2].
BW = Blindwert 1 = 102 Sporen/mL 2 = 103 Sporen/mL 3 = 104 Sporen/mL 4 = 105 Sporen/mL 5 = 106 Sporen/mL 6 = 107 Sporen/mL PK = Positivkontrolle
• Detektionsmöglichkeiten »Aufgrund der hohen Produktbildung während der Amplifikation bietet die LAMP die Möglichkeit (bspw. durch Verwendung von SYBR® Green I) eine Detektion mit UV-Licht (siehe Bild) oder bloßem Auge vorzunehmen.
BW = Blindwert 1 = 102 Sporen/mL 2 = 103 Sporen/mL 3 = 104 Sporen/mL 4 = 105 Sporen/mL 5 = 106 Sporen/mL 6 = 107 Sporen/mL PK = Positivkontrolle
5-minütige Zentrifugation bei 12000 g
2 x 5-minütige Behandlung mittels Kugelmühle (30 Hz)
5-minütige Zentrifugation bei 12000 g