CURSUL 6

CURSUL 6

ENZIME UTILIZATE N TEHNOLOGIA ADN RECOMBINATTehnologia ADN recombinat sau altfel intitulat clonare genic sau molecular este o denumire general care cuprinde o serie de protocoale experimentale ce conduc la transferul informaiei genetice (ADN) de la un organism la altul. n practic sunt mai multe metode care conduc la acest obiectiv, totui un experiment n urma cruia se obine un ADN recombinat are paii generali descrii n figura 6.1.

Figura 6.1 Obinerea ADN recombinat (clonare). A) vector clonare-plasmid (ADN int cu dimensiuni mici) i B) vector de clonare bacteriofag (ADN int cu dimensiuni mari). ADN int este tiat cu enzime de restricie iar vectorul este tiat cu acelai tip de enzime de restricie sau cu enzime care conduc la formarea unor capete complementare cu ale ADN int. Cele dou tipuri de fragmente ADN cu capete complementare sunt sudate n prezena ADN ligazelor lund natere un ADN recombinat.ADN-ul (ADN ce urmeaz a fi clonat, ADN inserat, ADN int sau ADN strin) de la un organism donor este extras, tiat (digerat) enzimatic i legat (inserat) la un alt ADN (vector de clonare) formnd o nou molecul ADN recombinat sau ADN construct. Apoi ADN recombinat este transferat i meninut ntr-o celul gazd. Procesul prin care are loc transferarea unui ADN ntr-o bacterie poart numele de transformare. Celulele ce conin ADN recombinat (transformate) sunt identificate i selectate (separate sau izolate de cele ce nu conin ADN recombinat pe baza unei proprieti) iar ADN int este clonat.Tehnologia ADN recombinat s-a dezvoltat pe baza descoperirilor din biologia molecular, enzimologia acizilor nucleici i genetica microrganismelor (att a virusurilor ct i a bacterilor). Totui, tehnologia ADN recombinat nu ar fi existat fr enzimele care recunosc secvene dublu catenare ADN i care au capacitatea de a tia ADN la nivelul ambelor catene denumite generic enzime de restricie sau endonucleaze de restricie. 6.1. Endonucleaze de restricie n cazul tehnicii de clonare molecular, att sursa ADN ce conine ADN int ct i vectorul de clonare trebuie tiate n fragmente discrete i reproductibile. Acest fapt a fost posibil numai dup descoperirea unor enzime de origine bacterian care au capacitatea de recunoate o anumit secven ADN i de a tia moleculele de ADN la nivelul aceleiai secvene sau la nivelul unor secvene aflate fie n aval fie n amonte fa de situsul de recunoatere. Aceste enzime au fost formal numite endonucleaze de restricie de tip II sau simplu enzime de restricie. n cadrul acestui grup de enzime fac parte i alte tipuri de endonucleaze de restricie fiind ncadrate n cadrul tipului I, III i IV. Endonucleaze de restricie/metilare de tipul II a fost pentru prima oar observate atunci cnd s-a analizat atacul bacteriofagilor asupra bacteriilor obsevndu-se c un anumit bacteriofag poate infecta un anumit tip de tulpin bacterian putnd urma ciclul litic (Fig.6.2). ns dac fagii care au fost propagai pe o anumit tulpin bacterian (tulpina 1) sunt transferai pe o alta (tulpina 2), ADN-ul bacteriofagului este digerat de enzimele de restricie ale noii gazde (tulpina 2), deoarece nu mai prezint acelai model de modificare ca i ADN-ul noii tulpini sau altfel spus, fagul este restricionat la o anumit tulpin bacterian.

Figura 6.2. Ciclul lizogenic i ciclul litic al fagului Bacteriile prezint sisteme specifice de restricie-metilare formate fie din endonuleaze i metilaze distincte (tipul II) care au aceeai specificitate de secven (Fig.6.2), fie aceeai enzim are o funcie dual de restricie-metilare (tipul I i III). Metilaza are capacitatea de a metila un rest de citozin sau adenin din cadrul secvenei recunoscut de enzima de restricie. Astfel, n urma modificrii prin metilare situsul int devine rezistent la restricie.

Figura 6.2. Sistemul restricie-metilare EcoRISistemul de restricie-metilare ajut tulpina bacterien s fac distincia ntre ADN-ul self i ADN non-self(fagic, plasmidial, cromosomal) pe care l atac i l taie cu enzimele de restricie. Prima endonucleaz de restricie de tip II caracterizat a fost izolat din Escherichia coli i a fost denumit EcoRI (prima liter desemneaz genul, iar celelalte dou specia bacterian, fiind scrise italic iar cea de a patra n format normal provine de la tulpina bacterian; numerele romane indic ordinea n care au fost descoperite sistemele de restricie ale unei tulpini). Endonucleaza EcoRI este o protein homodimeric (format din dou subuniti proteice identice) care se leag la o regiune ADN ce prezint o secven palindromic (secven celor dou catene complementare este identic dac este citit ntr-un singur sens 5-3). Secvena recunoscut de EcoRI este format din 6 pb i este tiat ntre resturile de guanin i adenin pe fiecare caten (Figura 6.2). EcoRI hidrolizeaz legtura fosfoesteric dintre oxigenul carbonului 3 al deoxiribozei nucleotidei ce areca baza azotat guanidine i gruparea fosfat ataat la carbonul 5 al deoxiribozei nucleotidei adiacente. Clivarea simetric a catenelor complementare a secvenei palindromice ADN formeaz dou monocatene complementare avnd fiecare ctre captul 5 o extensie de 4 nucleotide care se termin ntr-un rest de fosfat, denumite capete coezive sau lipicioase (Figura 6.2 a).

De la izolarea endonucleazei EcoRI au fost caracterizate mai mult de 3700 endonucleaze de restricie de tipul II cu peste 250 de situsuri de recunoatere diferite din variate tipuri bacteriene. Nomenclatura acestor enzime de restricie pstreaz aceleai reguli ca cele utilizate pentru EcoRI. n plus la ora actual se dorete renunarea scrierii italice a denumirii enzimelor de restricie. Astfel genul bacteriei este scris cu litere mari,urmtoarele dou litere scrise cu minuscule desemneaz specia bacterian. Tipul bacteriei este ocazional trecut cu litere mari ca R n EcoRI iar serotipul este desemnat cu o liter mic precum d n HindIII. Numerele romane sunt utilizate pentru a desemna ordinea n care au fost caracterizate enzimele de restricie provenite de la aceeai bacterie. De exemplu HapI i HapII sunt prima i a doua enzim de restricie de tip II izolat de la Haemophilus parainfluenzae.

Secvenele palindromice unde majoritatea enzimelor de restricie de tipul II se leag i taie molecula de ADN sunt n interiorul situsului de recunoatere. Unele endonucleaze de restricie cliveaz molecula de ADN genernd extensii monocatenare la captul 5 fosfat (capete coezive) (Figura 6.3 a), altele genereaz capete coezive la captul 3 (Figura 6.3 b) iar unele genereaz capete oarbe, tind simetric cele dou catene ADN complementare (Figura 6.3 c).

Figura 6.3. Enzime de restricie de tip II care genereaz capete a) 5 coezive, b) 3 coezive i c) oarbe

Lungimea situsului de recunoatere pentru diferite enzime poate fi de patru, cinci, ase, opt sau mai multe pb (Tabelul 6.1). Datorit frecvenei mari n care apar n molecula de ADN, enzimele de restricie care taie la nivelul situsurilor de patru i ase pb sunt cele mai utilizate n tehnicile de clonare.

Tabelul 6.1 Situsurile de recunoatere ale unor endonucleaze de restricie de tipII

EndonucleazSitusul de restricieTipul captului

BamHI

5coezive

PstI

3coezive

Sau3AI

5coezive

HaeIII

oarbe

NotI

5coezive

Tipul IIS de endonucleaze de restricie formeaz un subgrup aparte al tipului II de enzime de restricie care sunt utilizate ocazional n strategii de clonare sau n secvenierea multiplex. Aceste enzime taie molecula de ADN la nivelul ambelor catene la un numar fix de nucleotide fa de situsul de recunoatere. De exemplu, endonucleaza de restricie FokI de leag la secvena i taie dup 9 nucleotide la nivelul catenei 5-3 i la 13 dup situsul de recunoatere la nivelul catenei 3-5, reprezentarea schematic a situsului de recunoatere i a modului de tiere este: , formnd un capt coeziv de 4 nucleotide la captul 5 (unde N poate fi A, C, G sau T). Pe scurt acest motiv poate fi notat astfel: . Exemple de endonucleaze de restricie de tipul IIS sunt redate n tabelul 6.2. Unele dintre aceste tipuri de endonucleaze pot cliva molecula de ADN att n aval ct i n amonte fa de situsul de recunoatere.Tabelul 6.2 Endonucleaze de restricie de tip IIS

Endonucleaz de restricie IISSitus de recunoatere

AcuI

BfuAI

BsmBI

EciI

FokI

HgaI

MlyI

MmeI

n unele cazuri, diferite legturi fosfodiesterice din interiorul aceluia situs de recunoatere sunt tiate de endonucleaze de restricie provenite de la diferite specii bacteriene. De exemplu, enzimele de restricie XmaI i SmaI recunosc amndou secvena dar XmaI taie dup prima citozin 5 la nivelul fiecrei catene complementare formnd capete coezive la captul 5 pe cnd SmaI genereaz capete oarbe prin tierea ntre n mijlocul situsului de recunoatere. Prima n ordinea descoperirii dintre endonucleazele de restricie care se leag la un anumit situs poart numele de prototip. Orice alt enzim de restricie care atac acelai situs de restricie ca i prototipul se numete izoschizomer. De exemplu, endonucleazele de restricie XhoI i PaeRI izolate din surse diferite au aceelai situs de recunoatere i de tiere. Enzimele de restricie care recunosc acelai situs dar taie n poziii diferite se numesc neoschizomere (Figura 6.4).

Figura 6.4 Enzime neoschizomere-endonucleazele KasI, NarI, SfoI i BbeI se leag la acelai situs de recunoatere dar taie molecula de ADN n poziii diferite

Endonucleazele de restricie care produc aceleai tipuri de capete coezive (aceeai extensie de nucleotide) dar care au situsuri de recunoatere diferite sunt denumite izocaudomere, cum ar fi BamHI i Sau3AI (Figura 6.1B i Tabelul 6.1).

n unele cazuri, unele endonucleaze de restricie taie o secven din molecula de ADN numai dac citozina situsului de recunoatere este nemetilat pe cnd altele pot cliva aceeai secven de nucleotide doar dac citozina este metilat. Astfel, HpaII taie numai situsul nemetilat iar MspI izoschizomera enzimei HpaII cliveaz acelai situs indiferent de starea de metilare a citozinei. Aceste perechi de endonucleaze de restricie sunt adesea utilizate pentru a determina statusul metilrii ADN genomic. Dac o molecul de ADN nu este tiat de enzima HpaII, dar este tiat de MspI, atunci situsul de recunoatere este metilat. Dac ambele enzime taie molecula de ADN, atunci situsurile de recunoatere sunt nemetilate.

Realizarea hartilor situsurilor de restricie ale endonucleazelor pentru o molecul/fragment ADN. Harille ce redau situsurile de restricie la nivelul unui fragment ADN se realizeaz prin tratarea respectivului fragment cu cte o enzim de restricie iar apoi cu combinaii ale acelorai enzime de restricie. Poziia situsurilor unde enzimele de restricie taie se pot deduce prin analiza marimii fragmentelor ADN rezultate n urma digestiilor prin electroforez n gel de agaroz. n figura 6.5 sunt redate mrimile fragmentelor ADN rezultate n urma digestiei unui fragment ADN liniar de 16500 pb cu enzima EcoRI, BamHI i cu un amestec al ambelor enzime (EcoRI i BamHI). Fiindc digestia separat cu fiecare enzim n parte produce trei fragmente ADN, nseamn c la nivelul fragmentului ADN supus analizei exist dou situsuri de restricie pentru enzima EcoRI i dou pentru enzima BamHI. n urma digestiei duble (EcoRI i BamHI), fragmentul de 3000 pb rezultat n urma digestei doar cu EcoRI rmne intact, pe cnd fragmentele de 8500 pb i 5000 pb sunt fragmentate. Astfel, cele dou situsuri de restricie ale EcoRI sunt la o distan de 3000 pb fr s conin un situs al BamHI, n schimb fragmentele EcoRI de 8500 pb i 5000 pb conin fiecare cte un situs de restricie BamHI. Fragmentul BamHI de 9500 pb este tiat de EcoRI n digestia dubl n trei fragmente (2500+3000+4000=9500pb). Astfel, cele dou situsuri de restricie ale BamHI se gsesc de o parte i de alta a fragmentului EcoRI de 3000 pb, delimitnd fragmentele de 4000 pb i 2500 pb rezultate din digestia dubl. Fragmentul EcoRI de 8500 pb este fragmentat de BamHI n dou fragmente de 2500 i 6000 pb iar unul din situsurile EcoRI se afl la 2500 pb de BamHI, astfel fragmentul de 6000 pb conine unul din capetele fragmentului original de 16500 pb. Fragmentul EcoRI de 5000 pb este tiat de BamHI ntr-un fragment de 4000 pb i unul de 1000 pb, iar un situs al BamHI se afl la o distan de 4000 pb fa de un situs EcoRI, deci fragmentul de 1000 pb conine cellalt capt al fragmentului original de 16500. n figura 6.5 B este redat harta situsurilor de restricie ale fragmentului de 16500 pb rezultat n urma analizei redat mai sus.

n cazul moleculelor de ADN circular modul de construire al hrilor situsurilor de restricie este similar cu excepia c dac o enzim de restricie prezint trei situsuri de clivare n cadrul moleculei de ADN circulare se formeaz trei fragmente. Astfel, un plasmid de 12 kpb dac este analizat prin digestie cu enzimele EcoRI, BamHI, HindIII i HaeII i cu combinaii luate cte dou ale acestor enzime se obin fragmentele din tabelul 6.3 i harta situsuilor de restricie din figura 6.6.

Tabelul 6.3 Mrimea fragmentelor ADN (kpb) rezultate n urma digestiei simple i duble a ADN plasmidial de 12 kpb cu enzimele de restricie EcoRI, BamHI, HindIII i HaeII

EcoRIBamHIHindIIIHaeIIEcoRI+

HaeIIBamHI+

HaeIIHindIII+

HaeIIEcoRI+

HindIIIEcoRI+

BamHIBamHI+

HindIII

12,012,012,06,05,06,06,06,510,58,0

4,04,04,02,55,51,54,0

2,02,01,52,0

1,00,51,5

n urma experimentelor de digestie cu enzime de restricie a unui fragment ADN exist posibilitatea s rezulte fragmente de aceeai mrime (pb) iar suma mrimii fragmentelor rezultate s fie mai mic dect a fragmentului iniial. n urma electroforezei fragmentele de aceeai mrime migreaz ntr-o singur band, care este ns mai intens colorat sau mai groas fa de celelalte fragmente, fiind un indiciu c n urma digestiei s-au obinut fragmente identice ca mrime.

La ora actual exist programe de calculator care sunt utilizate n configurarea hrilor situsurilor de restricie pentru fragmente mai mari de ADN care sunt cuplate la un sistem de electroforez capilar ce poate separa fragmente ADN care difer printr-o singur pb.

Figura 6.6 Harta situsurilor de restricie ale enzimelor EcoRI, BamHI, HindIII i HaeII la nivelul unui ADN plasmidial de 12.0 kpb

PAGE 10

_1417809589.unknown

_1417810051.unknown

_1417810242.unknown

_1417810918.unknown

_1417811136.unknown

_1418117386.unknown

_1417810382.unknown

_1417810126.unknown

_1417809837.unknown

_1417809926.unknown

_1417809716.unknown

_1417806553.unknown

_1417808521.unknown

_1417809223.unknown

_1417808242.unknown

_1417806489.unknown

_1417806500.unknown

_1417806478.unknown

_1417806431.unknown