Enzyme Amylase Lơp 08DTP06

Giơi thiệu chung

Tinh bột, cùng vơi protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc

nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác.

Người La Mã gọi là amilum, một từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon ). Trong

quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn

năng lượng chính trong thực phẩm.

Ngoài ra tinh bột còn giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm

do những tính chất hóa lý của chúng. Tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ

nhơt sánh cho các thực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng

keo, là các yếu tố kết dính và làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại

thực phẩm. Bên cạnh đó, tinh bột còn được dùng trong các ngành công nghiệp

khác như sản xuất giấy, rượu,....

Nhiều nươc trên thế giơi sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô

(sắn), còn riêng ở nươc ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu.

Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột

về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người

ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các

loại acid hữu cơ, amino acid,… Trươc đây người ta hay dùng acid hoặc H2SO4 để

thủy phân tinh bột. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát

và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an

toàn thực phẩm trong khi giá thành lại cao. Cho nên hiện nay để thủy phân tinh bột

người ta thường sử dụng Enzyme Amylase thu nhận từ thực vật hoặc các loại vi

sinh vật.

Ngoài ra, Amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân

tinh bột như năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm

chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn Amylase có thể lấy từ mầm

thóc, mầm đại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó

Amylase được thu nhận từ malt vơi số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản

xuất bia. Nguyên liệu cho sản xuất Enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… đây là

những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nươc ta. Cho nên đây là

một lợi thế và là hương phát triển mạnh có thể làm cơ sở cho nhiều ngành khác

phát triển.

A. Giơi Thiệu I. Khái niệm Enzyme:

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự

trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất

là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản ứng này có liên

quan chặt chẽ vơi nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là hợp chất protein xúc tác

cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng

hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hương nhất

định vơi tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống.

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những

tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn được gọi là các chất xúc

tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt vơi các chất xúc tác hóa học

Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá

trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng

trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong

công nghệ gen và bảo vệ mội trường.

II. Enzyme Amylase là gì?

Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giơi sinh vật . Các

Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử

trong nhóm polysaccharide vơi sự tham gia của nươc.

RR’ + H-OH RH + R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và

dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nươc bọt (còn được gọi là

ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi,

xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nươc bọt của người có ptyalin nhưng ở

một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy

phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của

tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa

mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men.

Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. - 4 – III. Lịch sử phát hiện 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C.

Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được

kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất

phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này

theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột được gọi là Amylase.

Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nươc bọt cũng có khả năng phân giải tinh

bột thành đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nươc bọt, trong dịch tiêu hóa

của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt

đầu được quan tâm nghiên cứu.

Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp

thụ chọn lọc.

Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000.

Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển củaβ -Amylase là 250000.

Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme α-Amylase.

Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel

poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lơn α-Amylase và

glucoamylase trong canh trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có

hoạt lực dextrinase và transglucosilase.

Hiện nay các nươc trên thế giơi sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme,

trong đó Nhật là nươc có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ,

Đan Mạch, Thụy Điển,... đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng

sản xuất Enzyme nổi tiếng trên thế giơi. Bên cạnh đó trong những năm gần đây

các nươc Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme.

Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho

việc chuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông Amylase thường được sản

xuất từ nấm mốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột.

Như hãng Novo đã có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang được sử dụng rộng

rãi trong các ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp

sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy…

- 5 –

Nhóm 4 Enzyme Amylase

Lơp 08DTP06

B. Tổng quan về Enzyme Amylase I. Phân loại : Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ). - Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm

Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay

α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase

(hay oligo-1,6- glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC

3.2.1.10). Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi

polysaccharide.

-Exoam ylas e. Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi

polysaccharide. Nhóm này gồm có:

+ β-Amylase (EC 3.2.1.2)

+ Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3)

Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase * Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase: - Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định vơi nhiệt

- Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ

polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính

chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau.

- 6 – Amylase Exoamylase β-Amylase γ-Amylase Endoamylase Enzym khử nhánh α-Amylase

Khử trực tiếpα-dextrin 6-glucanohydrolase(pullulanase)

Khử gián tiếpoligo-1,6-glucosidase(transglucosylase)Và amylo 1,6-glucosidase

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06 - Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau. II. Hệ Enzyme Amylase: 1. Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): a) Cấu tạo: Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu

trúc bậc 3. Mơi đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin

và về vùng kị nươc cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-

Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.

Cấu trúc không gian của α-Amylase b) Cơ chế tác dụng của α-Amylase:

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-

Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong

phân tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một

trật tự nào cả. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt

tinh bột nguyên song vơi tốc độ rất chậm.

- 7 –

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn:

+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị

thủy phân tạo thành một lượng lơn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhơt của

hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ).

+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo

thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu vơi iodine.

Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tơi disaccharide và

monosaccharide. Dươi tác dụng của α- Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh

thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-

Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 ).

+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch

polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose,

maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của

amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên

amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-

glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng

lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19%

glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.

Tóm lại, dươi tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành

maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-

Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu

vơi Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất

đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase

dextrin hóa hay Amylase dịch hóa.

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose c) Đặc tính α-Amylase α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu tyrosine, - 8 – α-Amylase

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột của các Enzyme Amylase IV. Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase: 1. Nguồn thu nhận: Enzyme Amylase có trong các tế bào sinh vật , động thực vật , các loại nấm mốc. Muốn thu nhận Enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào.

Trong cơ thể sinh vật, Enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế

bào như nhân microsom … Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào, để đi

vào dung dịch chiết. Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào. Việc phá

vỡ cấu trúc tế bào có thể sử dụng một số cách sau :

+ Biện pháp cơ học như nghiền xay vơi bột thuỷ tinh , cát thạch anh hoặc máy xay

đồng hoá…

+ Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton, glycerin, etyl axetat …

+ Bằng sóng siêu âm, tia X, tia UV…

Sau khi nghiền nhỏ Enzyme được chiết rút bằng nuơc hay dung dịch đệm thích hợp, hoặc dung dịch muối trung tính … Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài Enzyme còn có các tạp chất khác như protein phi Enzyme, muối, gluxit …

Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận Enzyme có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều

phương pháp tinh sạch Enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử

dụng rộng rãi và có hiệu quả :

Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm. Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua . Các chất có trọng lượng phân tử lơn bị giữ lại (Enzyme , protein... ).+ Để loại prôtein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiềuphương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ , sắc kí trao đổi ion , điện di lọc gel…a) Động vật:

Enzyme Amylase có trong tụy tạng của động vật. Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lơn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng. Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm, và nặng khoảng 80-150g. Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ. Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết.

Thu nhận Amylase từ động vật phần lơn là từ dịch tụy tạng. 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến. Các tế bào này tiết Enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng.b) Thực vật:Được lấy từ nhiều nguồn như:

- Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc.- Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

- Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng, màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyaninc) Vi sinh vật:

Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, VSV trở thành nguồn thu Enzyme Amylase chủ đạo. Những chủng VSV tạo nhiều Amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên. VSV tạo Amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.- Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợiAs per gillus,Rhiz opus- Nấm men và giả nấm men thuộc các giốngCandida, Saccharomyces. Endomycopsy,Endomyces cũng tạo Amylase.- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lơn Amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonasdestructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila…Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06 nuôi chúng ít bị nhiễm VSV khác. Đáng chú ý là Bac. diastaticus, Bac. stearothermophilus, Bac. coagulans, Bac. circulans

- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loại tạo Amylase mạnh mẽ, tuy nhiên cũng

có một số chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora vulgaris 42 có khả

năng tạo một lượng nhỏ α-Amylase hoạt động ở 650C cùng vơi proteinase và các

Enzyme khác.

2. Thu nhận Enzyme từ thực vật: a) Malt đại mạch: Malt là từ chỉ trạng thái hạt nảy mầm . Quá trình sản xuất malt gồm các bươc sau : Ngâm hạt, ủ hạt cho nảy mầm, sấy malt tươi, tách mầm, bảo quản malt khô . * Yêu cầu về nguồn nguyên liệu

- Hạt có màu vàng vàng óng ánh , thơm mùi rạ tươi .

- Hạt phải thuần , tỷ lệ hạt ngoại lai chỉ được chiếm 5% . Không có hạt bị bệnh

- Vỏ hạt < 7-9% trọng lượng hạt . Trọng lượng 1000 hạt khoảng 40-44g .

- Sức nảy mầm ( qua ngày thứ 3 của quá trình nảy mầm ) : 80 -90%

- Khả năng nảy mầm ( tính đến ngày thứ 5 của quá trình nảy mầm : > 95% )

- Độ ẩm của hạt khoảng 15%

- Dung trọng : 650 – 680g/l

- Hàm lượng protein : 9 – 12%

- Hàm lượng tinh bột > 63 – 65%

* Sản xuất Malt

Các bươc trong quy trình sản xuất malt đại mạch :

Đại mạch----- > làm sạch------ > sấy bảo quản------ > ngâm hạt------- > ủ

mầm------ > malt

tươi------ > sấy malt----- > tách mầm rễ------ > malt khô

Ngâm Hạt : Đại mạch được ngâm trong nươc sạch cho đến khi đạt đến sự

cân bàng về độ ẩm. Chú ý đến sự thông khí trong khối hạt bằng cách đảo trộn khối

hạt thường xuyên. Mục đích của giai đoạn này là tạo độ ẩm cho hạt có điều kiện

lấy đủ oxy, đẩy CO2 và các sản phẩm bất lợi cho quá trình nảy mầm của hạt ra

ngoài khối hạt .

Khi ngâm hạt, nươc sẽ ngấm vào hạt làm cho thể tích hạt tăng nên, các

Enzyme đang ở trạng thái không hoạt động chuyển sang trạng thái hoạt động và

hoạt tính của Enzyme sẽ mạnh dần và thuỷ phân các chất dự trữ có phân tử lượng

cao ở trong hạt thành các chất có phân tử lượng nhỏ hơn như đường , amino acid .

Vì vậy , cần phải luôn luôn chú ý đến sự thông khí , độ ẩm của hạt và nhiệt độ .

Hạt đại mạch khô hầu như không có hoạt lực của α-Amylase. Khi hạt chuẩn bị nảy mầm thì xuất hiện hoạt lực của α-Amylase và hoạt lực này tăng dần. Đến ngày thứ 7 và thứ 8 của quá trình nảy mầm ( nhiệt độ18 – 200C), hoạt lực này đạt đến mức độ tối đa, sau đó giảm xuống. Vào lúc hoạt lực của Enzyme đạt đến mức tối đa thì phải ngừng quá trình nảy mầm bằng cách sấy hạt đang nảy mầm ở nhiệt độ thích hợp .Các bươc quy trình sản xuất malt khôb) Malt thóc:

Đại mạch là loại ngũ cốc trồng ở vùng ôn đơi có khí hậu lạnh. Ở những vùng nhiệt đơi người ta nghiên cứu việc sử dụng malt thóc, bắp để thay thế một phần hay toàn bộ malt đại mạch.* Các bươc trong quy trình sản xuất malt thócHạt lúa------- > làm sạch, phân loại-------- > sấy bảo quản--------- > ngâm hạt---- > ủ mầm------- > malt tươi ---------> sấy malt --------- > tách mầm rễ ------ > malt khô

Trong qúa trình nảy mầm của hạt, các Enzyme như Amylase, protease,… hoạt động mạnh xúc tác cho các biến đổi sinh lý, sinh hoá trong hạt như thuỷ phân các chất cao phân tử như tinh bột và cellulose, protein thành những chất đơn giản hơn. Quá trình nảy mầm xảy ra khi hạt có đầy đủ các điều kiện thích hợp về độ ẩm, nhiệt độ.

Ngâm Hạt : trong hạt lúa có sẵn một lượng nươc ở dạng liên kết. Nươc từ bên ngoài khi thấm vào hạt sẽ hoà tan các chất dự trữ, hoạt hóa các Enzyme xúc tác quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử trong hạt thành những chất đơn giản cung cấp cho hoạt động tăng Nhóm 4 Enzyme Amylase

Lơp 08DTP06

trưởng của phôi để hình thành cây mầm. Phôi là nơi hút nươc mạnh nhất. Tốc độ

hút nươc rất

mạnh ở thời gian đầu do có sự chênh lệch áp suất thẩm thấu rất lơn giữa môi

trường bên ngoài

và các tế bào bên trong hạt, đồng thời các chất keo háo nươc trương nở rất mạnh,

càng về sau,

sức hút nươc của hạt càng giảm .

Ủ hạt : việc ủ hạt trải qua 3 giai đoạn + Giai đoạn 1 : kéo dài 3 ngày. Ở ngày thứ ba bắt đầu nảy mầm, nhiệt độ của khối hạt tăng nhanh do hoạt động hô hấp mạnh. Khối hạt cần được đảo 2 - 3 lần/ngày .

+ Giai đoạn 2 : kéo dài 3 ngày . Lúc này chồi mầm và rễ mầm tăng trưởng

nhanh , nhiệt độ khối hạt cũng tăng nhanh do hoạt động hô hấp cao. Khối hạt cần

được đảo 2 - 3 lần/ngày .

+ Giai đoạn 3 : những ngày sau quá trình nảy mầm xảy ra chậm dầm, nhiệt độ tăng yếu và khối hạt cũng cần được đảo 2 - 3 lần/ngày. * Các quá trình xảy ra trong quá trình nảy mầm của Hạt

Khi nươc ở bên ngoài thấm vào hạt, các hợp chất cao phân tử bên trong hạt

thấm nươc và trương lên, các Enzyme thuỷ phân hoạt động, phân cắt các chất này

thành những chất đơn giản hơn ở trạng thái hoà tan. Các chất này một phần được

chuyển đến để nuôi phôi, một phần bị tiêu hao do hoạt động hô hấp và phần lơn

được sử dụng để chuyển hoá thành những chất cao phân tử mơi ở các mô của cây

nảy mầm. Hoạt động hô hấp trong hạt cần được cung cấp oxy đồng thời thải ra khí

CO2 và toả nhiệt làm cho nhiệt độ của khối tăng lên, do đó cần phải chú ý tơi đảo

trộn khối hạt.

Hoạt động của Enzyme : trong khối hạt, Enzyme ở dạng liên kết và chúng

được chuyển sang trạng thái hoạt động khi hạt nảy mầm. Ngoài ra còn có một số

Enzyme được tổng hợp mơi. Các Enzyme hoạt động trong quá trình nảy mầm của

hạt lúa .

- α-Amylase : Enzyme này không hoàn toàn hoạt động ở hạt chín. Hoạt tính

của Enzyme α-Amylase tăng dần trong quá trình nảy mầm của hạt. Ở nhiệt độ 15 -

170C, hoạt tính của α-Amylase đạt đến cực đại vào ngày thứ 10 – 12 của quá trình

nảy mầm; Ở nhiệt độ 28 – 300C, hoạt tính của α-Amylase đạt cực đại vào ngày 5 –

8 .

- β-Amylase : Enzyme β-Amylase tồn tại ở dạng liên kết và một số ít hoạt

động rất yếu trong hạt chín hoàn toàn. Hoạt động này tăng nên trong quá trình hạt

nảy mầm. Thời gian để hoạt động của Enzyme này đạt đến cực đại cũng tuỳ thuộc

vào nhiệt độ .

- Enzyme Oxy Hoá Khử : Trong quá trình nảy mầm , hoạt động của các

ezyme này tăng nên mạnh do đó hoạt động hô hấp của hạt cũng gia tăng. Hoạt

động hô hấp của hạt mạnh nhất vào ngày thứ 4–6 ở nhiệt độ 27 - 280C và cường

độ hô hấp phụ thuộc vào độ ẩm của hạt, nhiệt độ vào lượng O2 cung cấp.

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06 * Phương pháp tinh sạch Amylase: Có hai phương pháp - Tinh sạch Enzyme Amylase bằng phương pháp sắc ký - Thu nhận Enzyme Amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis – PAGE) 3. Thu nhận Enzyme từ vi sinh vật: Nguồn thu nhận chủ yếu là : nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn… Khi nuôi VSV tạo Amylase có hai quá trình liên quan mật thiết vơi nhau. Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ Enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Ở một số VSV, quá trình tổng hợp Amylase tiến hành song song vơi quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ Enzyme phụ thuộc vào tuyến tính của sự tăng khối. * Yêu cầu chung

Muốn thu nhận các Enzyme Amylase vơi hiệu suất cao cần phải tiến hành

phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng

thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích

cũng như tiêu chuẩn hoá các điều kiện nuôi. Như vậy sự tổng hợp Enzyme

Amylase không những phụ thuộc vào tính chất di truyền của VSV mà còn phụ

thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu.

Ngoài các yếu tố hoá học (thành phần môi trường) ra, thì các điều kiện lý hoá của quá trình nuôi cấy cũng có một ý nghĩa rất lơn đối vơi sinh tổng hợp Enzyme Amylase.

Trong các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các Enzyme Amylase trong

quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường , tính chất cơ lý của môi trường, độ

tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… Là

những yếu tố cơ bản tối quan trọng

* Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề mặt: • Yêu cầu đối vơi môi trường thành phần dinh dưỡng.

Yêu cầu cơ bản đối vơi thành phần của môi trường nuôi VSV tạo Amylase

cũng giống như yêu cầu đối vơi môi trường nuôi VSV tạo Enzyme khác là tính

hoàn thiện. Hầu hết các VSV tạo Amylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng

hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu

cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.

Cấu tử chính của môi trường VSV tạo Amylase bằng phương pháp lên men

bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là

một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các

chất khác nữa. Cám mì có 16–22%

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06

tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine

(0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4%

chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% ,

P - 0.94% ) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng

20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8–16% celulose, các chất hoà

tan không chứa nitơ (37 –5 9 %)

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lơn tơi hoạt lực của enzyme.

Cám không được chứa tinh bột dươi 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mơi không

có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp

chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám

cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi VSV, các chất dinh dưỡng

không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn.

Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20 %), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 - 10%)…

Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của

môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất

phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng

nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai.

Cần thanh trùng dươi áp suất hơi 1 - 5atm trong vòng 4 -6 giờ, có thể thanh trùng

bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2%

formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường.

• Độ ẩm tối thích cuả môi trường: Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích (đối vơi Asp.niger , Asp.awamort, Asp.flavus , Asp.arysee) của môi trường là 58 – 60% và phải giữ cho môi trường có độ ẩm đó

trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng

khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV

cũng như sự tạo Enzyme Amylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường

trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Amylase cao nhất thu

ở độ ẩm 65 –68%). Cần nhơ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng

tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao

hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng

ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của

nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lơn hơn đối vơi sự tạo thành Enzyme. Ảnh hưởng

của độ ẩm môi trường đến sinh tổng hợp Enzyme Amylase như sau :

Ảnh hưởng của việc giữ độ ẩm trong quá trình sinh trưởng tơi sự tạo α-Amylase

của

Asp.ozysee nuôi bằng phương pháp bề mặt .

Phương án thí

nghiệm

20 giờ

34 giờ

42 giờ

Độ

ẩm

%

Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô

Độ

ẩm

%

Hoạt độ của Amylase đv/g canh trường khô

Độ

ẩm

%

Hoạt độ của

Amylase

đv/g

canh trường khô

Khay để hở

27,8

15.0

23.8

18.0

22.0

20.5

Khay đậy nắp 46,4

20.4

42.4

32.9

42.4

36.7

Qua bảng số liệu trên thấy rõ là hoạt lực α-Amylase của canh trường nuôi nấm

sợi , khi bị hong khô giảm gần hai lần. Điều đó khẳng định sự cần thiết phải giữ

ẩm cho môi trường ở mức độ tối thích. Cần thông khí liên tục trong suốt thời kì

sinh trưởng của VSV. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25 –

35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lơn nhiệt sinh lý và

CO2 . Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng thông gió vơi không khí vô trùng có độ

ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục , gián đoạn (hoặc

không khí tự nhiên) tuỳ thuộc vào chiều dày của lơp môi trường nuôi , vào khoảng

cách giữa các tầng khay và đĩa khay. Thường là giai đoạn sinh trưởng thứ nhất

phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4 - 5 lần thể tích không khí trên một thể

tích phòng trong 1 giờ , còn ở giai đoạn thứ 2 là 30 – 60 thể tích không khí trên thể

tích phòng nuôi/1 giờ, còn ở giai đoạn thứ 3 giảm đi chỉ còn 10 – 12 thể tích

không khí .

•Nhiệt độ nuôi :

Toàn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ :

+ Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử (đối vơi nấm mốc 10 – 11 giờ đầu

tiên, đối vơi vi khuẩn 3 – 4 giờ). Trong thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng

nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23 – 300C đối vơi nấm mốc

và duy trì nhiệt độ 32– 380C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí là 96 -

100% .

+ Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi (kéo dài trong vòng 4- 18giờ). Ở giai đoạn

này nấm mốc hô hấp rất mạnh và tạo ra một lượng nhiệt sinh lý rất lơn. Kết quả là

trong lơp sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37 - 400C , đôi khi cao hơn tơi

470C. Vì vậy cần phải hạ nhiệt độ phòng nuôi giúp cho sợi nấm mọc đều và đẹp.

Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28 – 290C và độ ẩm cao

vào phòng nuôi.

+ Thời kỳ tạo Enzyme Amylase mạnh mẽ (kéo dài từ 10 - 20 giờ). Trong thời kỳ này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự toả nhiệt giảm mạnh. Các Enzyme Amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu ở giai đoạn Nhóm 4 Enzyme Amylase Lơp 08DTP06

sinh trưởng thứ nhất, thứ hai, nấm mốcAsp.ozysee chỉ được tạo được 7,5 – 8%

Enzyme , trong vòng 12h sau, hoạt lực của oligo–1,6– glucosidase tăng lên gấp 10

lần. Đối vơi đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3 – 40C so vơi giai

đoạn đầu. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường

rắn là 28 - 300C , choBac.s ubtilis là 35– 370C.

Thời gian nuôi để có lượng Amylase cực lơn thường được xác định bằng

thực nghiệm. Tuỳ thuộc vào tính chất của chủng VSV và sự ngừng tổng hợp

Enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần

thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực

của Enzyme. Đối vơi đa số nấm mốcAs per gillus, sự tạo Enzyme Amylase cực

đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. Trong điều kiện sản

xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi để có thể tích luỹ Amylase cực đại đối vơi

từng loại nấm sợi và vi khuẩn như sau :

Chủng Thời gian nuôi ( giờ ) -As p.or ys ee – 476 24 -25 -As p.or yae – KC

30 – 36 -As p.or yae 8F1 24 – 30 -As p.awam or i 22 36 - Ba c. s u b tilis 68 – 72 ( ở 300C ) * Nuôi VSV tạo Amylase bằng phương pháp bề sâu: • Môi trường dinh dưỡng :

Đặc điểm chung cho mọi môi trường nuôi VSV tạo Enzyme Amylase là có

chất cảm ứng: tinh bột, dextrin hay maltose. Nguồn nitơ dinh dưỡng thường dùng

là nitơ vô cơ (NaNO3). Sinh tổng hợp α-Amylase hoạt động của chủngAspergillus

thường chỉ thấy trong các môi trường có các muối của acid sulfuric. Đối vơi sinh

trưởng của một số nấm sợi tạo maltase và oligo–1,6–glucoamylase hoạt động lại

rất cần có sự có mặt của Mg trong môi trường. Để tạo điều kiện cho VSV phát

triển tốt và sinh nhiều Amylase người ta cho thêm vào môi trường các loại nươc

chiết như nươc chiết mầm mạch, nươc chiết ngô, nươc chiết đậu nành,… đó là

nguồn bổ sung amino acid, vitamin và các tạp chất sinh trưởng. Dươi đây là một

số môi trường lỏng dùng để VSV tạo các Enzyme Amylase. Đối vơiAs per gillus,

người ta thường nuôi bằng môi trường Sapeck cải tiến gồm : 6% tinh bột ; 0,9%

NaNO3 ; 0,001% FeSO4 ; 0,1% KH2PO4 ; 0,05%MgSO4; 0,05% KCl và nươc máy.

Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo Enzyme có thể thêm nươc chiết mầm mạch, nươc chiết ngô, nươc cám nấu, nươc chiết bột đậu nành