Correction of junctional epidermolysis bullosa by transplantation of genetically modified epidermal stem cells

Fulvio Mavilio1, Graziella Pellegrini1,2, Stefano Ferrari2, Francesca Di Nunzio1, Enzo Di Iorio2, Alessandra Recchia1, Giulietta Maruggi1, Giuliana Ferrari3, Elena Provasi4, Chiara Bonini4, Sergio Capurro5, Andrea Conti6, Cristina Magnoni6, Alberto Giannetti6 & Michele De Luca1,2

1Department of Biomedical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Via Campi 287, 41100 Modena, Italy. 2Epithelial Stem Cell Research Center, VenetoEye Bank Foundation, H. SS Giovanni and Paolo, Castello 6777, 30100 Venice, Italy. 3Istituto Scientifico H. San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy (HSRTIGET) and Vita-Salute University, and 4Cancer Immunotherapy and Gene Therapy Program, Istituto Scientifico H. San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italy. 5Division of Plastic Surgery, H. San Martino, Largo Rosanna Benzi 10, 16132 Genova, Italy. 6Department of Internal Medicine, University of Modena and Reggio Emilia, Via del Pozzo 71, 41100 Modena, Italy.

Epidermolyse Bulleuse Epidermolyse Bulleuse JonctionnelleJonctionnelle

Gp des Maladie Bulleuses HéréditaireGp des Maladie Bulleuses Héréditaire Bulles ou érosions spontanées ou Bulles ou érosions spontanées ou

suite à trauma minimessuite à trauma minimes 3 gp selon niveau de clivage dans zone 3 gp selon niveau de clivage dans zone

dermo-épidermiquedermo-épidermique EB jonctionnelles :EB jonctionnelles : pars lucida pars lucida

Mutations affectant les ligands Mutations affectant les ligands d’adhésion épithélialed’adhésion épithéliale

laminine-5 laminine-5 intégrine α6β4intégrine α6β4 BP180BP180

Mutation prédominante : gène Mutation prédominante : gène LAMB3LAMB3

Epidermolyse Bulleuse Epidermolyse Bulleuse JonctionnelleJonctionnelle

Patient de 36 ans (KEP25) atteint de EBJNLPatient de 36 ans (KEP25) atteint de EBJNL Mutation dbl hétérozygote LAMB3- / LAMB3 (E210K)Mutation dbl hétérozygote LAMB3- / LAMB3 (E210K) Décollements cutanés depuis naissanceDécollements cutanés depuis naissance Surinfection des lésionsSurinfection des lésions

Candidat à la transplantation de

de cellules souches épidermiques

génétiquement modifiées

Biopsie-punch trypsinéesBiopsie-punch trypsinéesCulture sur tapis de cellules nourricières 3T3-J2 Culture sur tapis de cellules nourricières 3T3-J2 irradiéesirradiées

Test « clonogéniques »Test « clonogéniques »Holoclones : colonies larges à croissance rapide, <5% des Holoclones : colonies larges à croissance rapide, <5% des colonies à différenciation terminalecolonies à différenciation terminaleParaclones : petites colonies à différenciation terminale et Paraclones : petites colonies à différenciation terminale et prolifération limitéeprolifération limitéeMeroclones : mélangeMeroclones : mélange

Obtention des cellules transfectéesObtention des cellules transfectées

Construction rétroviraleConstruction rétrovirale Squelette du vecteur MFGSquelette du vecteur MFG LTR du MLVLTR du MLV cDNA complet de LAMB3cDNA complet de LAMB3

Transfection de cellules Gp+envAm12Transfection de cellules Gp+envAm12Coculture cellules vectrices + holoclonesCoculture cellules vectrices + holoclones

Obtention des cellules transfectéesObtention des cellules transfectées

Efficacité de transduction Efficacité de transduction par MFG-LAMB3par MFG-LAMB3

Southern BlotSouthern BlotKératinocytes témoinKératinocytes KEP25 non transfectésKératinocytes KEP25 transfectés

Bandes de taille attendue : pas de

réarrangement proviral

Fragments de LAMB3 endogènes

Northern BlotNorthern BlotKératinocytes témoinKératinocytes KEP25 non transfectésKératinocytes KEP25 transfectés

Surexpression importante (x5) de l’ARN

LAMB3

ARN LAMB3 endogène

ImmunoprécipitationImmunoprécipitationKératinocytes témoinKératinocytes KEP25 non transfectésKératinocytes KEP25 transfectés

Expression du trimère comparable aux

kératinocytes témoin

Expression du transgène persistante (>120 doublements)

Greffe de tissus transgéniqueGreffe de tissus transgénique

Greffe au niveau région antéro-Greffe au niveau région antéro-supérieure de la jambesupérieure de la jambe

Exérèse chirurgicale épiderme léséExérèse chirurgicale épiderme lésé Greffe de tissus GM de 55cm2Greffe de tissus GM de 55cm2

4 à gauche4 à gauche

5 à droite5 à droite

Régénération normale à J8Régénération normale à J8

Epiderme normal au cours de la Epiderme normal au cours de la première annéepremière année

Pas de lésions après stress mécaniquePas de lésions après stress mécanique

Analyse du greffonAnalyse du greffon

PCRPCR semi-Qsemi-Q

Transduction complète

Hybridation in situ

Reconstitution d’un épithélium complètement différencié

Analyse du greffon par Analyse du greffon par immunofluorescenceimmunofluorescence

Expression normalement diminuée dans EBJ

Expression du FT ΔNp63 corrélée à capacité de

renouvellement de l’épiderme

Mutation LAMB3 E210K permet synthèse d’une faible quantité Mutation LAMB3 E210K permet synthèse d’une faible quantité de LAM5-de LAM5-ββ3 anormale3 anormale

Analyse mathématique du potentiel de présentation de tous les Analyse mathématique du potentiel de présentation de tous les 9-mer recouvrant la mutation9-mer recouvrant la mutation

Phénotype HLA-I : Phénotype HLA-I : HLA-A*01/*0301HLA-B*3503/*3801HLA-Cw*0401/*1203

Score potentiel de présentation faibleScore potentiel de présentation faible

Potentiel de réponse humoralePotentiel de réponse humorale Phénotype HLA-II : Phénotype HLA-II :

DRB1*1101/*1301DQB1*0301/*0603

Faible potentiel de réponseFaible potentiel de réponse

Absence de réponse humorale ou Absence de réponse humorale ou cellulaire contre LAM5-cellulaire contre LAM5-ββ3 endogène3 endogène

Exploration de l’immunité anti LAM5-Exploration de l’immunité anti LAM5-ββ33

Recherche d’Ac anti- LAM5-Recherche d’Ac anti- LAM5-ββ33

Exploration de l’immunité anti LAM5-Exploration de l’immunité anti LAM5-ββ33

Test de cytotoxicitéTest de cytotoxicité

PBMC stimulés parPBMC stimulés par LT autologues irradiés LT autologues irradiés

transfectés par MFG-transfectés par MFG-LAMB3LAMB3

LT allogéniques irradiésLT allogéniques irradiés

Activité lytique évaluée Activité lytique évaluée 10 jours plus tard par 10 jours plus tard par relarguage relarguage 5151CrCr

Exploration de Exploration de l’immunité anti l’immunité anti

LAM5-LAM5-ββ33

Libération d’IFN-Libération d’IFN-γγ

Aucun signe histologique d’infiltrat inflammatoire

dans les biopsies au cours du suivi

Innocuité du traitementInnocuité du traitement

Analyse des sites d’intégration dans le génomeAnalyse des sites d’intégration dans le génome Librairies de jonctions vecteur / génome par Linker-Mediated Nested Librairies de jonctions vecteur / génome par Linker-Mediated Nested

PCRPCR Séquençage des sites de jonctionsSéquençage des sites de jonctions

Innocuité du traitementInnocuité du traitement

Analyse des sites d’intégration dans le génomeAnalyse des sites d’intégration dans le génome 36 sites d’intégration à 1 mois36 sites d’intégration à 1 mois 26 sites d’intégration à 4 mois26 sites d’intégration à 4 mois 3 sites d’intégration aux deux temps3 sites d’intégration aux deux temps

Plus de 30% des intégrations à Plus de 30% des intégrations à 10kb des sites 10kb des sites d’initiation de transcription (TSS)d’initiation de transcription (TSS)

Intégration préférentielle des gamma-rétrovirus

Des cellules souches de kératinocytes sont capables de régénérer un épiderme Des cellules souches de kératinocytes sont capables de régénérer un épiderme auto-renouvelé in vivoauto-renouvelé in vivo

Progéniteurs ont une activité transitoire d’environ 1 moisProgéniteurs ont une activité transitoire d’environ 1 mois Greffe de peau autologue chez les brulésGreffe de peau autologue chez les brulés

Rejet dans le premier moisRejet dans le premier mois

Quasi jamais de rejet après 2 moisQuasi jamais de rejet après 2 mois

Rejet précoce quand les CSK ne sont pas maintenues dans le greffonRejet précoce quand les CSK ne sont pas maintenues dans le greffon

Remplacement pas à pas de tout l'épiderme est envisageableRemplacement pas à pas de tout l'épiderme est envisageable Procédé Timedsurgery peu invasifProcédé Timedsurgery peu invasif Sous anesthésie localeSous anesthésie locale Programmé sur 2-3 ans pour KEP25Programmé sur 2-3 ans pour KEP25

Preuve de l’inocuité du traitementPreuve de l’inocuité du traitement Génotoxicité observé dans un seul protocole de traitement de l’X-SCIDGénotoxicité observé dans un seul protocole de traitement de l’X-SCID Pas de signes d’expansion clonale ou de sites spécifiques d’insertion in vivoPas de signes d’expansion clonale ou de sites spécifiques d’insertion in vivo Pas de prolifération clonale reliée à un site d’insertion particulier in vitroPas de prolifération clonale reliée à un site d’insertion particulier in vitro Récurrence des sites d’insertion à différentes zones et à différents temps suggère que Récurrence des sites d’insertion à différentes zones et à différents temps suggère que

les nombre de sites chez un patient est finiles nombre de sites chez un patient est fini

DiscussionDiscussion