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UNIVERSITE OUAGA I Pr Joseph KI-ZERBO

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École Doctorale

Sciences et Technologies

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Laboratoire de Biologie et de Génétique

Moléculaires (LABIOGENE)

Thèse de Doctorat Unique

Présentée par

DIARRA Birama

Pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO

Option : Sciences Biologiques Appliquées

Spécialité : Biologie Moléculaire/Génétique

Epidémiologie moléculaire du virus de l’hépatite B au

Burkina Faso : séroprévalence, rôle de l’APOBEC3G dans la

coïnfection VHB/VIH-1, détermination des cas d’infection

occulte, séquençage et caractérisation des génotypes.

Soutenue le, 06 Novembre 2017 devant le jury composé de :

Président : Alain BOUGOUMA, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (Rapporteur)

Membres :

Moussa Tiémoko DIARRA, Professeur Titulaire, Université des Sciences, des Techniques, et des

Technologies de Bamako (USTTB), Mali (Rapporteur)

Rokia SANOGO, Professeur Titulaire, Université des Sciences, des Techniques, et des Technologies de

Bamako (USTTB), Mali

Yves TRAORE, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO

Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (Directeur de thèse)

Djeneba OUERMI, Maître de Conférences, Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama i

DEDICACES

A mon père Zan et à ma mère Sounkoura MALE qui ont donné tout ce qu’ils pouvaient

pour que je sois là aujourd’hui. Soyez honorés pour tous vos efforts.

A mon épouse Kadidiatou SYLLA et mes enfants Sounkoura dite Batôma, Ousmane dit

Bazoumana et Aminata dite Iyatôma (Mimi), mes plus grandes joies de vivre, pour ces

temps passés loin de vous alors que vous avez si besoin de moi. Je vous dédie cette thèse.

Au Professeur Rokia SANOGO, ce travail est le fruit de votre générosité et engagement

dans la formation des étudiants. Soyez honoré pour les efforts consentis.

A Docteur ZONGO Cheikna et sa famille pour votre accueil chaleureux, et votre soutien

moral et matériel. Je vous dédie cette thèse.

A mes Frères, Sœurs, Parents et Amis pour votre soutien moral et vos encouragements tout au

long de mes études.

A tous ceux ou toutes celles qui ont accepté librement et volontairement de participer à cette

étude.

A tous ceux, qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à l’aboutissement de ce travail.

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama ii

REMERCIEMENTS

Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE

de l’UFR-SVT), au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) et à

l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO). Nous exprimons notre profonde gratitude

:

A notre Directeur de thèse, le Pr Jacques SIMPORE, Professeur titulaire de Biologie

moléculaire et de génétique (Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO) Responsable du

Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE) labélisé Centre

d’Excellence UEMOA, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni

(CERBA) érigé en Laboratoire National de Référence pour le HPV (LNR-HPV), Recteur de

l’Université Saint Thomas d’Aquin (USTA), Officier de l’ordre National, Officier des Palmes

Académiques, Chevalier international des Palmes Académiques du CAMES, Membre de

l’Académie Africaine des sciences, des arts et des lettres du Burkina Faso, Membre de

l’Académie Africaine des Sciences (AAS); Membre du Comité d’éthique et de déontologie

du CAMES. Merci pour ce thème de recherche pertinent que vous m’avez proposé, pour votre

encadrement exceptionnel, vos précieux conseils, vos encouragements et votre disponibilité

malgré vos multiples fonctions ;

Aux honorables membres du jury :

Professeur Alain BOUGOUMA, Professeur Titulaire d’Hépato-gastroentérologie,

Coordonnateur du Diplôme d’Etudes Spécialisées (D.E.S.) d’Hépato-gastroentérologie,

Coordonnateur des enseignements d’Hépato gastroentérologie A l’UFR/SDS, l’USTA, CE de

Ouahigouya, Chef de service d’Endoscopies diagnostique et interventionnelle du CHU YO,

Directeur de la Prospective Hospitalo-universitaire et de la Coopération du CHU YO,

Chevalier de l’Ordre national, Chevalier de l’Ordre des palmes académiques. Merci pour

l’honneur que vous nous faites en acceptant de présider le jury de notre thèse ;

Professeur Moussa Tiémoko DIARRA, Professeur Titulaire d’Hépato-gastroentérologie à

l’Université des Sciences, des Techniques, et des Technologies de Bamako (USTTB) ; service

d’Hépato-gastroentérologie du CHU Gabriel TOURE de Bamako ; pour avoir accepté de

suivre et de juger ce travail malgré vos multiples occupations. Recevez toute notre profonde

gratitude ;

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama iii

Professeur Rokia SANOGO, Professeur Titulaire de Pharmacognosie à l’USTTB, Chef du

Département Médecine Traditionnelle (DMT) de l’Institut Nationale de Recherche en Santé

Publique (INRSP) de Bamako, Lauréate du prix Kwame Nkrouma 2016 pour les Femmes

Scientifiques, Présidente de l’Ong "Aide au Développement de la Médecine Traditionnelle"

(Aidemet Ong) ; pour avoir accepté de suivre et de juger ce travail malgré vos multiples

occupations. Trouvez ici l’expression de toute notre gratitude ;

Professeur Yves TRAORE, Professeur Titulaire d’immunologie, Directeur du Laboratoire

de Biochimie et d’Immunologie Appliquée (LaBIA) à l’Université Ouaga I Pr Joseph Ki-

Zerbo. Merci d’avoir accepté de faire partie du jury malgré vos multiples occupations.

Recevez toute notre profonde gratitude ;

Docteur Djeneba OUERMI, Maître de conférences en Biologie Moléculaire de l’Université

Ouaga I Pr Joseph Ki-Zerbo, pour avoir accepté de lire et de faire partie du Jury. Merci pour

votre contribution dans l’amélioration de ce document. Recevez notre salutation les plus

distinguées ;

Aux Dr, Wenkuuni Florencia DJIGMA, Issoufou TAO, Tegwindé Rébéca COMPAORE,

Théodora Mahoukèdè ZOHONCON, Ragnagnewendé Serge Théophile SOUBEIGA,

Abdoul Karim OUATTARA pour leurs contributions à l’amélioration de la qualité de ce

document et particulièrement le Dr Cyrille BISSEYE pour son soutien inconditionnel, sa

compréhension et ses encouragements pendant toutes ces années ;

Au Père Albert Théophane YONLI particulièrement pour sa disponibilité, sa

compréhension et ses encouragements tout au long de ce travail ;

A tous les camarades du Master de BioGeMA toute promotion confondue pour leurs

soutiens lors des manipulations et/ou pendant la rédaction de cette thèse ainsi que pour les

remarques et suggestions constructives à chaque fois que c’était nécessaire ;

Au corps professoral de l’UFR/SVT en général et celui du Master II de BioGeMA en

particulier. Vous avez contribué à notre formation en nous dispensant des enseignements de

hauts niveaux. Nous vous en serons toujours reconnaissants et en ferons bon usage ;

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama iv

A l’Union Economique et Monétaire Ouest Africaine (UEMOA) à travers son programme

d'appui et de développement des centres d'excellence régionaux et son soutien à la formation

et la recherche, partenaire financier de LABIOGENE pour son appui financier. Soyez assuré

de nos sincères remerciements ;

Au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) pour la disponibilité de

son plateau technique ;

A la Conférence Épiscopale Italienne (C.E.I.) pour son soutien financier dans l’achat des

réactifs.

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama v

TABLE DES MATIERES

DEDICACES .............................................................................................................................. i

REMERCIEMENTS .................................................................................................................. ii

TABLE DES MATIERES ......................................................................................................... v

LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. xi

LISTE DES TABLEAUX ........................................................................................................ xii

SIGLES ET ABREVIATIONS ............................................................................................... xiii

RESUME .................................................................................................................................. xv

ABSTRACT ............................................................................................................................ xvi

INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1

Objectif général .......................................................................................................................... 5

Objectifs spécifiques .................................................................................................................. 5

CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................ 6

1. Virus de l’hépatite B .............................................................................................................. 6

1.1. Historique ....................................................................................................................... 6

1.2. Les hepadnaviridae ......................................................................................................... 6

1.3. Morphologie et structure génétique du VHB .................................................................. 7

1.3.1. Structure des particules virales ................................................................................. 7

1.3.1.1. Les virions VHB (particules de Dane) ............................................................... 7

1.3.1.2. Organisation du génome ..................................................................................... 8

1.3.1.2.1. La polymérase .............................................................................................. 9

1.3.1.2.2. Les protéines de l’enveloppe ..................................................................... 10

1.3.1.2.3. Les protéines HBc et HBe ......................................................................... 11

1.3.1.2.4. La protéine X (HBx) .................................................................................. 11

1.4. Cycle de réplication du VHB ......................................................................................... 11

1.4.1. L’entrée virale ......................................................................................................... 12

1.4.2. Transport des nucléocapsides du VHB au noyau.................................................... 12

1.4.3. Réparation et conversion du brin d’ADN-Rc en ADN-ccc .................................... 13

1.4.4. La transcription ....................................................................................................... 13

1.4.5. La traduction ........................................................................................................... 14

1.4.6. Réplication du génome viral ................................................................................... 14

1.4.7. Enveloppement des nucléocapsides et sécrétion virale........................................... 15

1.5. Mode de transmission du VHB .................................................................................. 15

1.5.1. Transmission sexuelle ............................................................................................. 15

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama vi

1.5.2. Transmission parentérale ........................................................................................ 15

1.5.3. Transmission horizontale ........................................................................................ 16

1.5.4. Transmission périnatale .......................................................................................... 16

1.6. Histoire naturelle de l’infection par VHB ..................................................................... 16

1.6.1. Tropisme cellulaire ................................................................................................. 16

1.6.2. Pathogenèse ............................................................................................................. 17

1.6.3. Profils sérologiques ................................................................................................. 17

1.6.4. L’hépatite B aiguë ................................................................................................... 18

1.6.5. L’hépatite chronique ............................................................................................... 18

1.7. Les coïnfections VHB/VHC et VHB/VIH .................................................................... 20

1.7.1. Coïnfection VHB/VHC ........................................................................................... 20

1.7.2. Coïnfection VHB/VIH ............................................................................................ 21

1.8. Hépatite B occulte ......................................................................................................... 22

1.9. Epidémiologie du VHB ................................................................................................. 23

1.10. Diagnostic du VHB chez l’homme .............................................................................. 24

1.10.1. Recherche des marqueurs sérologiques : .............................................................. 24

1.10.1.1. Antigènes viraux ............................................................................................ 24

1.10.1.2. Les anticorps .................................................................................................. 24

1.10.2. Détection et quantification de l’ADN du VHB ..................................................... 25

1.10.3. Méthodes d’étude de la variabilité du génome du VHB ....................................... 25

1.10.3.1. Séquençage et analyse phylogénétique .......................................................... 25

1.10.3.2. Analyse par polymorphisme de restriction ..................................................... 25

1.10.3.3. Utilisation d’amorces spécifiques .................................................................. 26

1.10.4. Diversité génétique du VHB ................................................................................. 26

1.10.4.1. Sérotypes HBs ................................................................................................ 26

1.10.4.2. Mutations du VHB ......................................................................................... 26

1.10.4.2.1. Mutations au niveau du gène S ................................................................ 26

1.10.4.2.2. Les mutants "pré-core" ou pré-C, au niveau du gène C .......................... 27

1.10.4.2.3. Mutations du gène de la polymérase virale ............................................. 28

1.10.4.2.4. Mutation au niveau du gène X ................................................................. 29

1.10.4.3. Génotype, sous génotype et épidémiologie moléculaire ................................ 29

1.11. Traitement et Prévention ............................................................................................. 32

1.11.1. Les analogues de nucléos(t)ides ............................................................................ 32

1.11.2. Les traitements « immuno-modulateurs » ............................................................. 33

1.11.3. La vaccinothérapie ................................................................................................ 33

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama vii

2. APOBEC3G ET INTERACTION AVEC LE VIH ET LE VHB ....................................... 34

2.1 Famille d’APOBEC ............................................................................................................ 34

2.1.1 Activation-Induced Deaminase (AID) ......................................................................... 35

2.1.2 APOBEC1 ................................................................................................................... 35

2.1.3 APOBEC2 ................................................................................................................... 35

2.1.4 APOBEC3 ................................................................................................................... 35

2.1.5 APOBEC4 ................................................................................................................... 36

2.2 Particularité d’APOBEC3G ............................................................................................... 37

2.2.1 Structure et rôle ........................................................................................................... 37

2.2.2 APOBEC3G et VIH ..................................................................................................... 38

2.2.2.1 La protéine vif (delta-Vif) et son mécanisme d’action ......................................... 38

2.2.2.2 Rôle antiviral et mécanisme d’action d’APOBEC3G ........................................... 39

2.2.3 APOBEC3G et VHB ................................................................................................... 41

2.2.4 Polymorphismes génétiques d’APOBEC3G ............................................................... 41

CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES ........................................................................ 42

1. Cadre d’étude ....................................................................................................................... 42

2. Méthodologie de la première étude ...................................................................................... 43

2.1. Type et populations d’étude .......................................................................................... 43

2.2. Echantillonnage ............................................................................................................. 44

2.3. Tests sérologiques de diagnostic rapide (TDR) ............................................................. 44

2.4 Limites de l’étude ........................................................................................................... 45

3. Méthodologie de la deuxième étude ..................................................................................... 45

3.1. Type et population d’étude ............................................................................................ 45


3.3. Tests sérologiques de diagnostic rapide (TDR) : Identique à la première étude ........... 45

3.4. Diagnostic de la coïnfection au VIH-1/VH B par PCR en temps réel .......................... 45

3.4.1. Extraction d’ADN et d’ARN .................................................................................. 45

3.4.2. Amplification .......................................................................................................... 46

3.5. Caractérisation des génotypes du VHB ......................................................................... 46

3.6. Charge virale du VHB .................................................................................................. 47

3.6.1. Extraction d'ADN ................................................................................................... 47

3.6.2. Amplification ......................................................................................................... 48

3.7. Caractérisation moléculaire des rs8177832, rs35228531 et rs6001417 d’APOBEC3G 48

3.7.1. Amplification .......................................................................................................... 49

4. Méthodologie de la troisième étude ..................................................................................... 50

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama viii



4.3. Sérologie de l’AgHBs .................................................................................................... 50

4.4. Extraction et purification de l’ADN du VHB ................................................................ 52

4.5. Amplification et séquençage de l'ADN du VHB ........................................................... 52

4.5.1. Amplification de l’ADN ......................................................................................... 52

4.5.2. Le clonage des produits PCR et séquençage ........................................................... 55

4.6. L'analyse phylogénétique .............................................................................................. 55

5. Méthodologie de la quatrième étude .................................................................................... 55



5.3. Test sérologique des marqueurs du VHB ...................................................................... 56

5.4. Extraction et purification de l’ADN du VHB ................................................................ 57

5.5. Quantification de l’ADN du VHB ................................................................................. 57

5.6. Amplification et le séquençage de l'ADN du VHB ....................................................... 58

5.6.1. Amplification de l'ADN du VHB ........................................................................... 58

5.6.2. Séquençage des produits PCR ................................................................................ 59

5.7. L'analyse phylogénétique .............................................................................................. 59

6. Analyses statistiques ............................................................................................................ 59

7. Considérations éthiques ........................................................................................................ 60

CHAPITRE III : RESULTATS ................................................................................................ 60

I. Résultats des travaux de la première étude ........................................................................... 60

1. Première campagne .............................................................................................................. 60

1.1. Contexte et but de la première campagne ...................................................................... 60

1.2. Caractéristiques sociodémographiques de la population ............................................... 60

1.3. L’infection par le VHB en fonction du genre et des classes d’âge ................................ 61

1.4. L’infection par le VHB en fonction de la profession et du statut matrimonial de la

population d’étude ................................................................................................................ 62

1.5. Pratiques socioculturelles et infection par le VHB à travers la population ................... 63

1.6. Les antécédents médicaux et infection par le VHB dans la population ........................ 63

1.7. Conclusion partielle ....................................................................................................... 64

2. Deuxième campagne ............................................................................................................ 64

2.1. Contexte et but de la deuxième campagne .................................................................... 64

2.2. Caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude .................................. 65

2.3. Analyse multivariée des facteurs associés à l’infection au VHB et statut vaccinal en

fonction des caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude ..................... 65

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama ix

2.4. Prévalences des marqueurs du VHB et de l’hépatite C en fonction des caractéristiques

sociodémographiques de la population d’étude .................................................................... 68

2.5. Taux de vaccination après dépistage du VHB ............................................................... 69

2.6. Conclusion partielle ....................................................................................................... 69

IV. Résultats des travaux de la deuxième étude ....................................................................... 69

1. Contexte et but de l’étude ..................................................................................................... 69

2. Les caractéristiques de la population d’étude ...................................................................... 70

3. Fréquences des polymorphismes d’APOBEC3G (Cas vs. Témoins) .................................. 71

4. Association entre les 3 variants et le statut de Coïnfection VIH-1/VHB basée sur le modèle

additif, dominant et récessif ..................................................................................................... 74

5. Haplotypes des cas et témoins dans le cadre de la coïnfection VIH-1/VHB ....................... 74

6. Déséquilibre de Liaison entre les 3 variants d’APOBEC3G chez les cas et les témoins ..... 75

7. Conclusion partielle .............................................................................................................. 76

II. Résultats des travaux de la troisième étude ......................................................................... 76


2. Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang ............................................. 77

3. L'amplification de l'ADN du VHB et le génotypage ........................................................... 77

4. Analyse des séquences de génotype E du VHB du Burkina Faso........................................ 79

5. Analyse des séquences de génotype A du HBV du Burkina Faso ....................................... 83

6. Investigation des événements de recombinaison inter-génotype dans les séquences

Burkinabè ................................................................................................................................. 87


III. Résultats des travaux de la quatrième étude ....................................................................... 90


2. Caractéristiques sociodémographiques et sérologiques de la population d’étude ............... 90

3. Caractéristiques des échantillons présentant l’ADN viral du VHB (n= 56) en fonction de

leurs charges virales ................................................................................................................. 91

4. Séquençage et génotypage des ADN du VHB ..................................................................... 92

5. Mutations dans le gène S en fonction des génotypes et les cas d'hépatite B ........................ 95


CHAPITRE IV : DISCUSSION .............................................................................................. 96

1. Séroprévalence du virus de l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou et la

nécessité de vaccination contre l’hépatite B............................................................................. 96

1.1. Séroprévalence de l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou ......... 96

1.2. Sensibilisation sur l’hépatites B et détermination la couverture vaccinale contre

l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou. ................................................. 98

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama x

2. Modulation de la coïnfection VIH-1/VHB par les polymorphismes d’APOBEC3G au

Burkina Faso .......................................................................................................................... 100

3. La caractérisation moléculaire du virus de l'hépatite B chez les donneurs de sang du

Burkina Faso .......................................................................................................................... 102

4. Détermination de l’infection occulte par le virus de l’hépatite B et les génotypes associés

chez les sujets séronégatifs à l’AgHBs au Burkina Faso. ...................................................... 107

CONCLUSION GENERALE ................................................................................................ 110

PERSPECTIVES .................................................................................................................... 111

REFERENCES ....................................................................................................................... 112

ANNEXES ............................................................................................................................. 129

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xi

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Structure du virus de l’hépatite B .............................................................................. 7

Figure 2: Organisation du génome du VHB . ............................................................................. 8

Figure 3 : Représentation schématique de la structure de l'ADN polymérase du VHB .......... 10

Figure 4: Cycle de réplication du génome des hepadnavirus .................................................. 12

Figure 5: Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’infection au VHB ................. 17

Figure 6: Histoire naturelle de l'infection virale B ................................................................... 20

Figure 7: Distribution géographique de l'VHB dans le monde ............................................... 24

Figure 8: Les principales mutations du gène de la polymérase virale responsable de résistance

aux antiviraux . ........................................................................................................................ 29

Figure 9: Distribution géographique des génotypes et sous-génotypes du VHB .................... 32

Figure 10 : Disposition des protéines d’APOBEC3 sur le chromosome 22 13.2 ................... 36

Figure 11 : Structures des protéines d’APOBEC .................................................................... 36

Figure 12 : Structure du domaine catalytique de la cytidine désaminase APOBEC3G . ......... 38

Figure 13 : Mécanisme de désamination par APOBEC3G ..................................................... 40

Figure 14: Activité antivirale d'APOBEC3G .......................................................................... 40

Figure 15 : Hyper-mutation du VHB ...................................................................................... 41

Figure 16: ARCHITECT i 1000 SR®TM ................................................................................. 51

Figure 17: Thermocycleur GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA) ........... 54

Figure 18: Cobas e 411 Analyzer (Roche Diagnostics GmbH Mannheim Germany) ............. 57

Figure 19: Appareil 7500 Fast Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA) ............. 58

Figure 20 : Déséquilibre de Liaison entre les 3 variants d’APOBEC3G chez les cas et les

témoins ..................................................................................................................................... 76

Figure 21: : L’arbre phylogénétique des séquences pré-S/S partielles (1072 nt) à partir de 99

souches du VHB des donneurs de sang Burkinabè. ................................................................. 78

Figure 22: L'analyse phylogénétique des 65 séquences complètes pré-S/S (1 204 nt) de

génotype E identifiées dans cette étude . .................................................................................. 80

Figure 23: L'analyse phylogénétique des 22 séquences complètes pré-S/S (1 204 nt) de

génotype A identifiées dans cette étude . ................................................................................. 86

Figure 24: Représentation schématique de la diversité des clones isolés à partir de souches

burkinabè aberrantes. ............................................................................................................... 89

Figure 25: L’arbre phylogénétique des 17 séquences pré-S/S du génotype E du VHB

identifiées dans cette étude ....................................................................................................... 93

Figure 26: L'analyse phylogénétique des 4 séquences pré-S/S du génotype A du VHB

identifiées dans cette étude . ..................................................................................................... 94

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xii

LISTE DES TABLEAUX

Tableau I : Les paires d’amorces spécifiques à l’amplification des génotypes A-F du VHB .. 47

Tableau II : Dilution des standards de la charge virale du VHB .............................................. 48

Tableau III: Caractéristiques des différents marqueurs d’APOBEC3G ................................... 49

Tableau IV : La paire d’amorces utilisée ................................................................................. 53

Tableau V: Caractéristiques sociodémographiques de la population ....................................... 61

Tableau VI: Infection par le VHB en fonction du genre et des classes d’âge .......................... 62

Tableau VII : L’infection par le VHB en fonction de la profession et du statut matrimonial de

la population d’étude ................................................................................................................ 62

Tableau VIII: Pratiques socioculturelles et infection par le VHB à travers la population ....... 63

Tableau IX: Les antécédents médicaux et infection par le VHB dans la population ............... 64

Tableau X: Caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude (n= 2207). ........ 66

Tableau XI: Analyse multivariée des facteurs associés à l’infection au VHB et statut vaccinal

en fonction des caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude (N : 2207). . 67

Tableau XII : Prévalences des marqueurs du VHB et de l’hépatite C en fonction des

caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude (n= 217). ............................. 68

Tableau XIII : Taux de vaccination après dépistage du VHB .................................................. 69

Tableau XIV: Caractéristiques de la population d’étude ......................................................... 71

Tableau XV: Fréquences des gènes de polymorphismes d’APOBEC3G (Cas vs. Témoins) .. 73

Tableau XVI : Association entre les 3 variants d’APOBEC3G et le statut de coïnfection VIH-

1/VHB basée sur les modèles additifs, dominants et récessifs ................................................ 74

Tableau XVII: Haplotypes des cas et témoins dans le cadre de la coïnfection VIH-1/VHB ... 75

Tableau XVIII: Diversité génétique intra-sous-groupes des souches du VHB ........................ 81

Tableau XIX: Souches du VHB de différentes origines montrant des séquences pré-S/S

identiques. ................................................................................................................................ 82

Tableau XX: Les séquences nucléotidiques utilisées dans l'étude ........................................... 82

Tableau XXI: Caractéristiques sociodémographiques et sérologiques de la population d’étude

.................................................................................................................................................. 91

Tableau XXII : Caractéristiques des échantillons présentant l’ADN viral du VHB (n= 56) en

fonction de leurs charges virales .............................................................................................. 92

Tableau XXIII : Mutations dans le gène S en fonction des génotypes et les cas d'hépatite B. 95

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xiii

SIGLES ET ABREVIATIONS

aa : Acide aminé

A3G APOBEC3G

ADN RC : ADN relâché circulaire

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNccc : covalently closed circular DNA (ADN circulaire fermé de façon covalente)

AgHBc Antigène de la capside du HBV

AgHBe : Antigène e du HBV

AgHBs : Antigène de surface du HBV

AID Activation-Induced Deaminase

ALAT : Alanine amino-transférase

Anti-HBc : Anticorps dirigé contre la protéine core du virus de l’hépatite B

Anti-HBe : Anticorps dirigé contre la protéine e du virus de l’hépatite B

Anti-HBs : Anticorps dirigé contre la protéine de surface du virus de l’hépatite B

APOBEC Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like

ARN : Acide ribonucléique

ARNm : Acide ribonucléique messager

ARNpg : Acide ribonucléique pré-génomique

CHC : Carcinome hépatocellulaire

ChHBV : Chimpanzee Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du Chimpanzé)

CTL : Lymphocyte T cytotoxique

DHBV : Duck Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du canard)

DR1 et DR2 : Direct repeat

ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Gag Group antigens

GAPDH Gène de la Glycéraldéhyde-3-phosphate Déshydrogénase

GiHBV Gibbon Hepatitis B virus (virus de l’hépatite B du Gibbon)

GoHBV : Gorilla Heaptitis B virus (virus de l’hépatite B du Gorille)

Gp Glycoprotéine

HSp90 : Heat shock protein 90 (Protéine de choc thermique 90)

IFN : Interféron

INSD Institut national de la statistique et de la Démographie

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xiv

IOB Infection occulte par le virus de l’hépatite B (Hépatite B occulte)

NLS : Nuclear localization signal

OMS : Organisation Mondiale de Santé

OuHBV : Orang-outan Hepatitis B virus (virus de l’hépatite B de l’Orang-outan)

ORF Open reading frame (cadres ouverts de lecture)

PCR Polymerase Chain Reaction

RE : Réticulum endoplasmique

SIDA Syndrome de l’immunodéficience Acquise

SIV Simian Immunodeficiency Virus

SNP Single Nucleotide Polymorphism

TLM : Translocation motif

UV : Ultra-violet

VHB : Virus de l’Hépatite B

VHD : Virus de l’Hépatite Delta

Vif Facteur d’infectivité du virion

VIH : Virus de l'immunodéficience humaine

WHBV : Woodchuck Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B de la marmotte)

WMHBV : Wooly Monkey Hepatitis B Virus (virus de l’hépatite B du singe laineux)

YMDD Tyrosine-Méthionine-Aspartate-Aspartate

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xv

RESUME

L'infection chronique au VHB est un facteur de risque au développement de la cirrhose et du

carcinome hépatocellulaire (CHC). Dans les zones à forte endémicité au VHB, la coïnfection

VIH-1/VHB expose à un risque plus élevé de développer précocement ces pathologies.

L’APOBEC3G est un facteur de restriction de l’hôte dont les polymorphismes ont un effet sur

les virus ayant une étape de transcription reverse notamment le VIH-1 et le VHB. L’objectif

de notre étude était de contribuer à la lutte contre les hépatites virales au Burkina Faso.

Au total 6 045 participants ont adhéré à cette étude dont 3 202 pour la partie séroprévalence,

424 pour la détermination du polymorphisme du gène APOBEC3G, 2 200 pour la

caractérisation des génotypes, et 219 pour la recherche de l’hépatite occulte. Nous avons

réalisé entre autres des tests sérologiques (TDR et ELISA) suivis des tests moléculaires (PCR

classique et PCR en temps réel puis Séquençage).

L’étude a rapporté une séroprévalence de 14,47% du VHB et de 1% du VHC lors de la

première campagne, et de 9,8% du VHB durant la seconde. La couverture vaccinale est passée

de 6,8% (avant le dépistage) à 31,6% (après le dépistage) dans notre population d’étude.

L’étude a aussi montré une prévalence élevée du VHB chez les sujets séropositifs au VIH-1

comparé aux séronégatifs. Nos résultats ont montré que les allèles mineurs des variants

rs6001417 et rs35228531 d’APOBEC3G pourraient conférer une protection contre la

coïnfection VIH-1/VHB, tandis que l’allèle normale du rs35228531 augmenterait le risque de

la coïnfection. L’étude a rapporté une prévalence de 72% du génotype E du VHB, de 25% de

quasi-sous-génotype A3 (A3QS) et de 3% d’infection mixte aux deux génotypes du VHB.

Une prévalence de 7,3% d'infection occulte au virus de l’hépatite B (IOB) a été observée dans

cette étude. Les mêmes génotypes ont été caractérisés dans les cas d’IOB avec une

prédominance du génotype E. Elle a aussi fourni des informations sur l’existence de « fausse

IOB ». Elle a observé des mutations dans la région MHR du gène pré S/S du VHB E. L’étude

a pu déposer quatre-vingt-neuf (89) séquences du VHB dans GenBank (Numéro d’accès :

KU702845 à KU702933).

La présente étude a confirmé l’endémicité du VHB au Burkina Faso. Elle a montré que

contrairement aux études antérieures, les polymorphismes d’APOBEC3G peuvent être

protecteurs contre la coïnfection VIH-1/VHB. Elle a aussi révélé une prévalence élevée du

A3QS du VHB co-circulant avec les souches prédominantes du génotype

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xvi

Mots clés : VHB, VHC, VHB/VIH-1, Génotypage, IOB, APOBEC3G

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama xvi

ABSTRACT

Chronic HBV infection is a risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular

carcinoma (HCC). In areas with high HBV endemicity, HIV-1/HBV coïnfection is at a higher

risk of early development of these pathologies. APOBEC3G (apolipoprotein B mRNA

enzyme-editing catalytic polypeptide-like 3G) is a host restriction gene that can interfere with

retroviruses or viruses having a reverse transcription step life cycle such as the HIV-1 and the

HBV. The aim of our study was to contribute to the fight against viral hepatitis in Burkina

Faso.

A total of 6,045 people participated in this study, including 3 202 for seroprevalence part, 424

for determining of APOBEC3G gene polymorphism, 2,200 for the characterization of

genotypes, and 219 for characterization of occult hepatitis B. We carried out serological tests

(TDR and ELISA) followed by molecular tests (classic and real time PCR and then

sequencing).

The study reported a prevalence of 14.47% of HBV and 1% of HCV in the first campaign,

and 9.8% of HBV in the second. Vaccination coverage increased from 6.8% (before

screening) to 31.6% (after screening) in our study population. It also showed a high

prevalence of HBV among HIV-1 patients compared to seronegative subjects. It also showed

that the minor alleles of rs6001417 and rs35228531 of APOBEC3G could protect against

HIV-1/HBV coïnfection, while the rs35228531 normal allele would increase the risk of

coïnfection. The study reported a prevalence of 72% of genotype E, 25% of quasi-

subgenotype A3 (A3QS) and 3% of mixed infection with both HBV genotypes. The

prevalence of 7.3% of the occult hepatitis B virus infection (OBI) was observed in this study.

The same genotypes were characterized in OBI cases with a predominance of genotype E. She

also provided information on the existence of "false BOI". She observed mutations in the

MHR region of the pre-S/S HBV gene. This study was able to deposit eighty-nine (89) HBV

sequences in the GenBank (accession numbers: KU702845 to KU702933).

This study confirmed the endemicity of HBV in Burkina Faso. It showed that unlike previous

studies, APOBEC3G polymorphisms could be protective against HIV-1/HBV coïnfection. It

also revealed a remarkably high prevalence of A3QS of HBV co-circulating with the

predominant strains of genotype E.

Key words: HBV, HCV, HBV / HIV-1, Genotyping, OBI, APOBEC3G

INTRODUCTION

Thèse de Doctorat Unique (PhD) DIARRA Birama 1

INTRODUCTION

L'infection au virus de l’hépatite B (VHB) constitue un problème majeur de santé publique

dans le monde. On estime à deux (02) milliards le nombre d’individus infectés par le VHB

dans le monde et à plus de 240 millions les cas d’infections chroniques, dont environ 80 à 120

millions en Afrique subsaharienne (Livinec, 2016, Stanaway et al., 2016). Environ 686 milles

décès par an sont dus aux conséquences de cette infection (OMS, 2016). En Afrique

subsaharienne, 44% des cas de cirrhose du foie et 47% des cas de carcinome hépatocellulaire

(CHC) ont été attribués au VHB (Perz et al., 2006). En raison de la similarité des voies de

transmissions, les coïnfections VHB/VHC et VHB/VIH sont fréquentes. Ainsi dans les

régions endémiques, un nombre important de patients infectés par le VHB sont coinfectés par

le VHC ou le VIH et présentent un risque accru de développement de la cirrhose et du

carcinome hépatocellulaire par rapport aux patients mono-infectés (Konstantinou and

Deutsch, 2015). Les facteurs viraux, tels que les génotypes et leur variant, se sont révélés être

associés à la pathogenèse du CHC (Zhou et al., 2012).

Le Burkina Faso (BF) est un pays à forte endémicité avec une prévalence du VHB supérieure

à 8% dans la population générale (Simpore et al., 2006). Chez les donneurs de sang, des

prévalences du VHB de 14,3% et 17% ont été observées respectivement dans les zones rurale

(Nouna) et urbaine (Ouagadougou). Celles des Ac anti HBc étaient de 69,6 % (Nouna) et de

76,4 % (Ouagadougou) (Collenberg et al., 2006). Bien qu’une prévalence plus faible du VHC

ait été signalée au Burkina Faso (Zeba et al., 2011), actuellement la disponibilité des

traitements antiviraux efficaces pour traiter les patients infectés par le VHC montre

l'importance du dépistage de cette infection (Pol and Corouge, 2014).

Les lacunes de la politique de vaccination contre l'hépatite B ont d'abord été abordées en 1992

lorsque l'Organisation Mondiale de la santé (OMS) a demandé à tous les pays d'intégrer la

vaccination contre l'hépatite B dans leurs programmes nationaux de vaccination infantile. Le

programme de vaccination contre le VHB est entré en vigueur en 2006 au Burkina Faso chez

les enfants à 8 semaines après la naissance. Tandis que, pour protéger contre la transmission

périnatale du VHB, le vaccin devrait être administré à la naissance. Depuis, il n’y a pas une

véritable stratégie de contrôle du VHB dans la population. Récemment, l'OMS a annoncé sa

stratégie pour prioriser la lutte contre l'hépatite virale, et a appelé à des actions visant à son

élimination dans la plupart des régions du monde, et son contrôle dans d'autres régions d'ici

2030 [Lancet (2016)]. La prévention semble être l'intervention de santé publique la plus


efficace pour éliminer l'hépatite virale (Brahm et al., 2016). Aussi, malgré la disponibilité

d’un vaccin efficace, la population reste sous informée sur les risques et les conséquences

liées à l’infection par le virus de l’hépatite B. Cela contribue à une baisse du taux de

couverture sanitaire et une augmentation du risque de l’infection au VHB dans la population.

Le dépistage des personnes non encore diagnostiquées constitue un enjeu majeur car la

majorité des personnes infectées ne le savent pas.

Bien que l'infection par le VHB soit un facteur de risque élevé de maladies hépatiques, les

tableaux cliniques après une exposition au VHB sont très variables. Les facteurs génétiques et

environnementaux modulent de façon importante la susceptibilité et la progression de la

maladie hépatique (Beasley, 1988, Kamatani et al., 2009, Mbarek et al., 2011). Ainsi, les

APOBEC3 (A3) sont des composants de l'immunité innée qui jouent un rôle important dans la

défense contre les virus envahissants, y compris le VHB et le Virus de l'Immunodéficience

Humaine (VIH). Chez l'homme, les A3s sont constitués de sept protéines : APOBEC-3A, -3B,

-3C, -3DE, -3F, -3G et -3H (Teng et al., 1993). Les A3s, en particulier A3G, peuvent inhiber

le VHB par des mécanismes d’hyper-mutation dépendante et indépendante (Rosler et al.,

2005, Nguyen et al., 2007). L’A3G est l'une des désaminases les plus actives, avec un fort

effet inhibiteur sur la réplication et l'édition de l'ADN du VHB in vivo (Turelli et al., 2004,

Suspene et al., 2005, Kock and Blum, 2008). L’A3G est largement exprimé dans les tissus

humains, et ses niveaux d'ARNm sont largement corrélés avec la teneur en cellules

lymphoïdes (Koning et al., 2009). Les niveaux d'A3G se sont révélés être les plus élevés

parmi les A3 dans le tissu hépatique humain (Kock and Blum, 2008). Il existe très peu ou pas

d’informations disponibles sur les polymorphismes du gène APOBEC3G en Afrique de

l’Ouest en général et au Burkina Faso en particulier.

Le génome du VHB est génétiquement variable. Des études phylogénétiques de différents

génomes viraux ont permis de les classer en 10 génotypes (A-J) (Tatematsu et al., 2009, Ma et

al., 2011). Les génotypes du VHB ont une distribution géographique distincte. Le tableau

clinique, la réponse au traitement, le pronostic à long terme ainsi que le profil de

séroconversion sont tous influencés par le génotype du VHB infectant le patient (Lu et al.,

2012, Ghosh et al., 2013). Ainsi, le génotype C est associé à des hépatites plus sévères que le

génotype B (Kao, 2002). Le génotype D semble prédisposer à un risque élevé du

développement du CHC, et un taux de mortalité plus élevé après transplantation hépatique

que le génotype A (Lusida et al., 2008). En outre, les patients porteurs des génotypes C et D

ont un faible taux de réponse au traitement par interféron α (IFN-α) par rapport à ceux des


génotypes A et B. Toutefois en Afrique, le génotype D du VHB est le génotype le plus

répandu en Afrique du Nord alors que les génotypes A et E prédominent en Afrique

subsaharienne. Par conséquent, le génotypage du VHB est d'une grande importance dans

l'orientation du traitement, l'amélioration du vaccin et le contrôle des maladies hépatiques (Ma

et al., 2011). Peu d’études se sont intéressées à l'épidémiologie moléculaire des souches du

VHB circulantes au Burkina Faso.

Le diagnostic sérologique de l'infection par le VHB est principalement basé sur les tests de

détection de l'antigène de surface du virus (AgHBs), et son absence est censée exclure

l'infection. Les tests sérologiques de routine permettent généralement de poser le diagnostic

de l’hépatite B chronique et de surveiller l’évolution de la maladie. Cependant, certains

patients atteints d'hépatite B chronique présentent des profils sérologiques atypiques, mettant

en défaut les tests diagnostiques classiques. Notamment dans la banque de sang, les dons

provenant de donneurs en phase de séroconversion, de porteurs chroniques du VHB avec un

niveau bas d’AgHBs circulant ainsi que de donneurs infectés par certains mutants du VHB, ne

peuvent pas être détectés par les tests AgHBs actuellement employés. Par conséquent,

l'infection par le VHB reste un défi majeur pour la sécurité du sang. L’utilisation des tests

moléculaires a conduit à la détection de l'ADN et au typage du VHB chez les personnes à

AgHBs négatif [Infection occulte par le virus de l’hépatite B (IOB)] (Panigrahi et al., 2010).

La détection de l’IOB a été rapportée chez des sujets présentant des manifestations cliniques,

telles que les maladies chroniques du foie et le carcinome hépatocellulaire (Said, 2011). Bien

que la plupart des porteurs d’IOB sont asymptomatiques, elle a été détectée chez les patients

atteints d’une maladie chronique du foie « cryptogénétique » (Chemin et al., 2001, Castillo et

al., 2007) et pourrait être associée à la progression de la fibrose hépatique et le développement

de la cirrhose (Said, 2011).

De ces observations, qu’elle serait la séro- épidémiologie de l’hépatite B dans la population

générale de Ouagadougou ? Qu’elles peuvent être les rôles de la sensibilisation et de la

vaccination contre l’hépatite B dans l’amélioration de la couverture vaccinale du VHB au

Burkina Faso ? Qu’elle serait la fréquence des polymorphismes d’APOBEC3G chez les

personnes séropositives au VHB coinfectées ou non par le VIH-1 et chez les témoins

séronégatifs au deux virus au Burkina Faso ? Qu’elles seraient les génotypes du VHB

circulant au Burkina Faso ? Et en fin, qu’elles seraient la prévalence de l’infection occulte au

VHB et les génotypes associés ?


Pour répondre à ces questions, deux campagnes de sensibilisations, du dépistage et de

vaccination ont été réalisées afin d’estimer la prévalence de l’hépatite B et la couverture

vaccinale contre l’hépatite B à Ouagadougou, Burkina Faso. Aussi, la recherche des

polymorphismes du gène APOBEC3G, la caractérisation des génotypes du VHB circulant,

ainsi que la détermination de la prévalence de l’IOB et les génotypes associés ont également

été réalisés afin de fournir aux cliniciens des éléments pour une prise en charge adéquate des

patients.

OBJECTIFS DE LA

THESE


Objectif général

Contribuer à la lutte contre l’hépatite virale B au Burkina Faso.

Objectifs spécifiques

1. Déterminer la séroprévalence de l’hépatites B et la couverture vaccinale contre

l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou ;

2. Déterminer la fréquence des polymorphismes d’APOBEC3G chez les personnes

coinfectées VIH-1/VHB et les témoins séronégatifs au VIH-1/VHB ;

3. Caractériser les génotypes du virus de l’hépatite B circulant au Burkina Faso ;

4. Déterminer les cas d’infection occulte par le VHB et les génotypes associés chez les

sujets séronégatifs à l’AgHBs.

REVUE

BIBLIOGRAPHIQUE


CHAPITRE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Virus de l’hépatite B

1.1. Historique

L’hépatite virale B est une inflammation du foie consécutive à l’infection par le virus de

l’hépatite B et s’accompagne parfois d’ictère (jaunisse). L’origine virale de l’hépatite B fut

évoquée pour la première fois en 1947 (Borensztejn, 1948).

En 1965, Baruch Blumberg a découvert l’antigène « Australia » (Blumberg et al., 1965).

Après plusieurs études, il publia un article montrant la relation entre cet antigène et l’hépatite

(Blumberg et al., 1967). Le nom d’antigène HBs fut, par la suite, adopté pour désigner cet

antigène. Dane et ses collaborateurs découvrirent en 1970 un troisième type de particules plus

dense, sphériques de 42 nm de diamètre au microscope électronique : « la particule de Dane ».

Ces particules constituaient la forme complète et infectieuse du virus de l’hépatite B (Dane et

al., 1970). Au début des années 1980 le génome du virus a été séquencé et les premiers

clonages réussis par Pierre Tiollais, a permis la production de masse des vaccins anti-hépatite

B par recombinaison génétique (Tiollais et al., 1981). Le VHB devient le « chef de file »

d’une nouvelle classe de virus, les Hepadnaviridae.

1.2. Les hepadnaviridae

La famille des hépadnavirus rassemble de petits virus à ADN hépatotrope, scindés en deux

genres les orthohepadnavirus qui infectent seulement les mammifères et les avihepadnavirus

qui infectent les oiseaux. Le représentant type de la famille des orthohepadnavirus est le

VHB qui infecte l’être humain et expérimentalement peut aussi infecter le chimpanzé (Dane

et al., 1970). Cette famille comprend également des virus trouvés chez les primates de

l’ancien monde (gorille, chimpanzé, gibbon, orang-outan) et du nouveau monde le singe

laineux (Grethe et al., 2000). Le DHBV (Duck Hepatitis B Virus) est le chef de file des

Avihepadnavirus qui inclut également le HHBV (Heron hepatitis B virus), le SGHV (snow

goose hepatitis virus) qui infectent respectivement le héron cendré Ardea cinerea et l'oie

Anser caerulescens, le STHBV (Stork Hepatitis B virus) infectant la cigogne et enfin le

CHBV (Crane Hepatitis B Virus) qui infecte la grue (Schaefer, 2007).


1.3. Morphologie et structure génétique du VHB

1.3.1. Structure des particules virales

Les particules virales, visibles en microscopie électronique, se présentent sous trois formes

morphologiquement différentes dans le sérum des patients infectés. Les Particules Sous

Virales (PSV), sphériques (filamenteuses) et les virions infectieux du VHB ou particules de

Dane sont constitués d’une enveloppe lipidique dans laquelle sont insérées les 3 protéines de

surface du virus : les petites (S ou S-AgHBs), moyennes (M ou M-AgHBs) et grandes (L ou

L-AgHBs) protéines d’enveloppe du VHB. La protéine S est le constituant principal de

l’enveloppe des 3 types de particules et un marqueur important de l’infection par VHB

(Gilbert et al., 2005).

1.3.1.1. Les virions VHB (particules de Dane)

Les virions VHB (Figure 1) ont un diamètre de 42 nm et une symétrie icosaédrique, imposée

par la nucléocapside de 27 nm qu’ils renferment. L’enveloppe lipoprotéique des virions VHB

est riche en protéine L-AgHBs (environ 20 % des protéines d’enveloppe totale) (Gilbert et al.,

2005). Une étude a démontré la présence de cholestérol dans cette enveloppe (Bremer et al.,

2009). Au cœur de chaque virion, protégé par l’enveloppe virale, on retrouve la nucléocapside

composée de 240 protéines de capside ou AgHBc qui renferme le génome VHB lié de

manière covalente à la polymérase virale, ainsi que des protéines chaperonnes et des kinases

cellulaires (Dryden et al., 2006)

Figure 1: Structure du virus de l’hépatite B (Source : http://toutsavoir-ist.fr/hepatite-b)


1.3.1.2. Organisation du génome

Le virus de l’hépatite B est l’un des plus petits génomes décrits avec un ADN circulaire

relâché d’environ 3200 paires de base (pb) partiellement double brin appelé ADN-RC (Figure

2). Il est constitué d’un long brin codant de polarité négative [brin (-)] d’environ 3200 pb qui

possède une courte redondance terminale de 8 à 9 nucléotides sur ces deux extrémités 5’ et 3’

appelée « r ». Ces structures redondantes sont essentielles à la réplication virale. La

polymérase virale est liée de façon covalente à l’extrémité 5’ du brin (–) par une liaison

phospho-tyrosine. Le brin complémentaire de polarité positive non codant ou brin (+) est de

longueur variable et possède une courte séquence d’ARN à son extrémité 5’ (Figure 2).

L’extrémité 5’ du brin (+) chevauche les deux extrémités du brin (-). La complémentarité de

200 pb entre les régions 5’ des deux brins définit la « région cohésive » qui permet la

circularisation du génome. Cette région contient deux séquences directement répétées DR1 et

DR2 (Direct repeat 1 et 2) qui jouent un rôle crucial dans la réplication du virus (Locarnini,

2004).

Figure 2: Organisation du génome du VHB (Beck et Nassal, 2007).

Légende : La partie double brin, circulaire RCDNA est indiqué par des traits noirs épais, avec P liée de manière

covalente à l'extrémité 5 'de l’ADN (-), l'ARN et l'amorce (ligne en zigzag) à l'extrémité 5' du ADN (+). La partie

en pointillés symbolise les longueurs hétérogènes des brins (+). DR1 et DR2 sont les répétitions directes. Le

cercle extérieur symbolise l’ARNpg terminale redondante avec ɛ proche de l’extrémité 5’, et la queue poly-A à

l’extrémité 3’. L'ARNm pré-core est presque identique, sauf qu'elle commence un peu en amont. Les positions


relatives des cadres ouverts de lecture pour noyau (C), P, pré-S/S, et X sont représentées à l'intérieur. TP,

domaine protéique Terminal.

Le génome du VHB code pour les protéines structurales constituant l’enveloppe (3 protéines

de surface) et la capside (la protéine core, la protéine pré-core ou AgHBe), une ADN

polymérase qui possède une fonction de reverse transcriptase, un transactivateur

transcriptionnel (protéine X) (Beck and Nassal, 2007).

1.3.1.2.1. La polymérase

Le cadre ouvert de lecture codant pour la protéine P, ou polymérase virale, couvre près de

80% du génome des hépadnavirus. Les particules virales ne contiennent qu’une seule protéine

P par particule (Locarnini, 2004). L'ADN polymérase est une protéine d’environ 850 acides

aminés, elle possède plusieurs fonctions : une fonction d’ADN polymérase ADN-dépendante,

une fonction de transcriptase inverse (ADN polymérase ARN-dépendante) et en fin une

activité RNase H. La polymérase possède 3 domaines fonctionnels impliqués dans la

réplication et un domaine non essentiel (Figure 3) :

- l’extrémité N-terminale ou TP (Terminal Protein) permet la liaison covalente de la

protéine avec l’extrémité 5’ du brin (-) d’ADN (Locarnini, 2004) ;

- le domaine SPACER n’est pas indispensable aux activités de la polymérase car

l’introduction de substitutions, délétions et insertions dans cette région n’affecte en

rien son fonctionnement (Lok et al., 2007) ;

- la région ADN polymérase/transcriptase inverse contient un motif peptidique

Tyrosine-Méthionine-Aspartate-Aspartate (YMDD) important pour l’activité de

transcription inverse (Schildgen et al., 2010) ;

- le domaine RNAse H est responsable de la dégradation de l’ARN pré-génomique lors

de la synthèse du brin (-) de l’ADN viral (Locarnini, 2004).


Figure 3 : Représentation schématique de la structure de l'ADN polymérase du VHB (Lok et

al., 2007).

1.3.1.2.2. Les protéines de l’enveloppe

L’enveloppe des particules virales contient 3 types de protéines de surface codés à partir d’un

même cadre ouvert de lecture possédant 3 codons d’initiation de la traduction. La protéine

majoritaire (S ou AgHBs) de 226 aa et 24 kDa est constituée exclusivement de la région S,

commune aux 3 protéines de surface. Elle assure leur ancrage dans la bicouche lipidique de la

membrane cellulaire qui enveloppe le virus ou dans la membrane du réticulum endoplasmique

(RE), où elles sont synthétisées. L’AgHBs est présente dans le sang et dans les hépatocytes, et

il est le marqueur sérologique le plus couramment utilisé pour le diagnostic des infections

aiguës et chroniques dues au VHB, et pour le dépistage des donneurs de sang et d’organes

(Roque-Afonso et al., 2005). La protéine pré-S2 est constituée de 55 acides aminés et forme

avec l’AgHBs la protéine moyenne (protéine M de 30 kDa) de l’enveloppe du VHB (281 aa).

Quant à la protéine pré S1 elle est de longueur variable et constitue avec l’AgHBs et la

protéine pré-S2 la grande protéine de l’enveloppe ou la protéine L (Figure 2). Elles possèdent

toutes un site potentiel de N-glycosylation situé au niveau de leur domaine commun

(Locarnini, 2004).

Les trois protéines d’enveloppe sont présentes en quantités différentes à la surface des

particules virales avec prédominance de la protéine S. La protéine moyenne (M) est un

composant mineur des trois types de particules virales ; elle est présente à un taux d’environ

10%, alors que la grande protéine est abondante dans les filaments (10%) et les virions (25%),

mais rare dans les sphères (1%) (Poisson et al., 1997, Mahoney, 1999). Elle a en outre

l'étonnante propriété d'adopter deux topologies transmembranaires : l'une, en exposant les

domaines pré-S1/pré-S2 sur la face cytoplasmique du réticulum endoplasmique, permet le

bourgeonnement du virus ; l'autre, en exposant ces mêmes domaines sur la face interne du


réticulum endoplasmique, est essentielle à la reconnaissance du récepteur du VHB à la surface

des hépatocytes (Poisson et al., 1997).

1.3.1.2.3. Les protéines HBc et HBe

L'antigène HBc est exprimé à la surface des hépatocytes où il induit des réactions de cytolyse

de la part des lymphocytes T CD8+. L’antigène du core (AgHBc) est la protéine structurale

majeure de la capside. Elle possède une extrémité C-terminale basique permettant sa liaison à

l’ADN viral. De plus, l’initiation de la traduction en 5’ de la séquence pré-C, située en amont

du gène C et dans le même cadre de lecture, aboutit à la synthèse d’une protéine pré-C. La

présence de cette séquence supplémentaire en position N-terminale de la protéine HBc,

correspondant à un peptide signal, dirige la protéine vers le RE. Au cours de ce processus, la

protéine perd son extrémité C-terminale basique. Cependant, contrairement à l'antigène HBs,

l'antigène HBc n'apparaît pas dans le sérum. Finalement, c’est une protéine de 16 kDa,

nommée antigène HBe, que l’on retrouve dans le sérum des malades (Locarnini, 2004).

1.3.1.2.4. La protéine X (HBx)

C’est une protéine de 154 aa et de 17 kDa découverte en 1985 grâce à l’identification

d’anticorps dirigés contre des épitopes de celle-ci (Bouchard and Schneider, 2004). C’est un

régulateur multifonctionnel qui module la transcription, la transduction du signal, le cycle

cellulaire, les voies de dégradation des protéines, l’apoptose et la stabilité génétique en

interagissant directement ou indirectement avec des facteurs cellulaires (Tang et al., 2006).

Elle permet d’augmenter l’expression des gènes du VHB ainsi que la réplication virale en

agissant comme un coactivateur transcriptionnel des facteurs de transcription cellulaire. Ainsi,

son inactivation grâce à des méthodes utilisant des ARNs interférents diminue la transcription

et la réplication du VHB. De ce fait, le développement d’antiviraux ciblant la protéine X

pourrait en théorie permettre de limiter la réplication virale et de diminuer le développement

de CHC associés au VHB (Bouchard and Schneider, 2004, Yang and Cho, 2013).

1.4. Cycle de réplication du VHB

Sa principale originalité réside dans le fait que le VHB, qui est un virus à ADN, n’utilise pas

un mécanisme semi-conservatif mais une étape de transcription inverse (Figure 4) à partir de

l’ARNpg (ARN pré-génomique) pour répliquer son génome (Beck and Nassal, 2007).


1.4.1. L’entrée virale

La première étape pour l’infection par le VHB est l’attachement de la particule infectieuse à

une structure exposée accessible à la surface des hépatocytes de l’hôte. Ce premier contact est

souvent décrit comme réversible, de faible affinité et rapide. L’attachement initial et la

reconnaissance du récepteur spécifique contribuent à la spécificité de l’hôte et au tropisme

cellulaire. Il nécessite cependant le domaine Pré-S1 de la grande protéine (L) de surface. La

myristylation de cette protéine serait essentielle à l’infectivité des particules virales (Glebe

and Urban, 2007). Grâce à cette interaction, les virions seraient internalisés lentement (jusqu’à

16 heures) dans les hépatocytes par endocytose pH indépendant (Chojnacki et al., 2005). Une

autre étude suggère un rôle crucial des motifs de translocation (TLM) dans la voie de

l’endocytose (Stoeckl et al., 2006).

Figure 4: Cycle de réplication du génome des hepadnavirus (Beck et Nassal, 2007).

Légende : Virion enveloppé infecte la cellule, libère dans le cytoplasme l’ADN-RC contenant nucléocapside. (1)

ADN-RC est transporté vers le noyau, pour former ADNccc. (2) La transcription de ADNccc par l'ARN

polymérase Ⅱ produit l’ARNpg. (3) L’ARNpg est encapsidé, conjointement avec la protéine P, et une

transcription inverse à l'intérieur de la nucléocapside. La synthèse de l'ADN (+) à partir de la matrice ADN (-)

engendre une nouvelle ADN-RC. De nouveaux cycles cation intracellulaire conduisent à l’amplification

ADNccc, ou alternativement, les nucléocapsides contenant ADN-RC sont enveloppés et libérés comme virions.

PM, la membrane plasmique (Beck et Nassal, 2007).

1.4.2. Transport des nucléocapsides du VHB au noyau

Les nucléocapsides, relargués dans le cytoplasme des hépatocytes empruntent le réseau de

microtubules (MT) pour atteindre le centre organisateur des microtubules ou microtubule

organizing center (MOTC) à proximité du noyau et des pores nucléaires. Une fraction des


protéines de capsides expose à la surface des nucléocapsides le domaine C-terminal portant le

NLS (Séquence de Localisation Nucléaire) (Roseman et al., 2005, Rabe et al., 2006).

Cette séquence NLS interagit avec les importines α (Imp α) pour former un complexe

nucléocapside VHB-imp α puis l’importine β (Imp β) lie ce complexe ce qui favoriserait le

contact avec le pore nucléaire et entraînerait sa translocation dans ce dernier (Kann et al.,

2007). Après dissociation des importines α et β, les nucléocapsides du VHB se désassemblent

en dimères d’AgHBc à l’intérieur du pore et libèrent le génome viral dans le noyau cellulaire

(Rabe et al., 2009). Les protéines de capside diffusent dans le noyau et se réassemblent en

capsides vides lorsqu’elles atteignent une concentration critique (Kann et al., 2007).

1.4.3. Réparation et conversion du brin d’ADN-Rc en ADN-ccc

Dans les hépatocytes infectés, l’ADN-RC est immédiatement transformé en une forme

circulaire double brin stable et persistante appelé ADNccc ou « covalently closed circular

DNA » par les enzymes cellulaires. L’ADNccc prend la forme d’un minichromosome viral qui

sert de matrice pour la transcription des gènes viraux. La conversion de l’ADN-RC en

ADNccc résulte de la complétion du brin (+) par la polymérase virale, de la dégradation de

l’oligoribonucléotide fixé en 5’ du brin (+) et de la ligation des extrémités du brin (+). La

polymérase virale liée au brin (–) de façon covalente est ensuite éliminée tout comme la partie

redondante située sur le brin (-). Enfin, le surenroulement nécessaire à la formation finale de

l’ADNccc est assuré par les histones et les protéines de la capside (Nassal, 2008).

1.4.4. La transcription

La transcription des ARN viraux messagers et de l’ARN pré-génomique est réalisée par

l’ARN polymérase II cellulaire à partir de l’ADNccc. Tous les transcrits du VHB sont coiffés

en 5’ et polyadénylés en 3’ à une position commune. La polyadénylation est dirigée par un

signal unique non-canonique situé dans l’ORF pré-C/C. La transcription des gènes du VHB

est contrôlée par 4 promoteurs viraux et deux régions « enhancers ». Il a été observé que

cette étape de transcription était régulée aussi par des phénomènes épigénétiques tels que le

statut d’acétylation des histones H3 et H4 liés à l’ADNccc et par le recrutement des

acétyltransférases cellulaires (p300 et CBP), et des désacétylases cellulaires (HDACI)

(Levrero et al., 2009).

Le promoteur C localisé dans l’ORF X dirige la synthèse des ARNm pré-C et pré-génomique

(pg) de 3,5 kb. La polyadénylation des ARNm pré-C et ARNpg n’a lieu qu’au deuxième

passage de la polymérase cellulaire au niveau du signal de polyadénylation (Kay and Zoulim,


2007, Nassal, 2008). Par conséquent, l’ARNpg contient l’ensemble de l’information

génétique virale, ainsi qu’une région redondante terminale de 120 nt contenant une deuxième

copie de la séquence DR1 (Direct repeat 1), le signal d’encapsidation ε en épingle à cheveux,

et la queue polyA. L’ARNpg est encapsidé avec la polymérase virale, des kinases cellulaires

et des protéines chaperonnes (hsp90, hsp60 et p23) pour permettre le repliement correct de la

polymérase virale et son interaction avec les protéines de capside Le promoteur S1 dirige la

synthèse de l’ARNm pré-S1 de 2,4 kb qui code la protéine d’enveloppe L (AgHBs). Les

transcrits sous génomiques de 0,7 kb sont sous le contrôle du promoteur X et permettent la

synthèse de la protéine X (Beck and Nassal, 2007).

1.4.5. La traduction

Tous les transcrits du VHB coiffés et polyadénylés recrutent les facteurs eucaryotes

d’initiation de la traduction (eIF) indispensables à la liaison des ribosomes aux extrémités 5’

des ARNm du VHB. La traduction active de la protéine pré-C à partir d’un AUG en amont du

signal d’encapsidation ε de la région 5’ de l’ARNm pré-C empêche l’interaction de la

polymérase et ε, et par conséquent l’encapsidation de l’ARNm pré-C. Les ARNm sont

traduits dans le cytoplasme au niveau du réticulum endoplasmique (RE) en différents produits

viraux capables de s’assembler en de nouvelles particules virales. Une partie de

l’encapsidation se ferait par réassemblage des dimères d’AgHBc obtenus après la dissolution

à l’entrée du noyau. Au sein de la capside, la polymérase possède différentes activités

enzymatiques pour convertir l’ARNpg en ADN-RC (Rabe et al., 2009).

1.4.6. Réplication du génome viral

La synthèse du brin (-) s’opère par formation d’une liaison covalente entre le résidu tyrosine

du domaine TP de la polymérase virale et une courte amorce désoxyribonucléotidique. Cette

amorce est synthétisée par la polymérase virale elle-même, en complément d’une séquence de

4 bases UUAC situées au sommet de la boucle de la structure ε. Ce complexe polymérase-

amorce, contenant aussi des protéines cellulaires [Hsp90, Hsp60 (Heat shock protein) et p23],

est ensuite transféré au niveau de la séquence DR1 située en 3’ de l’ARNpg, qui contient une

séquence d’ARN homologue à celle de la région ε. Ce transfert est régulé par plusieurs

éléments en cis de l’ARNpg (Beck and Nassal, 2007, Nassal, 2008).

A partir de ce moment, la synthèse du brin (-) débute, et l’ARNpg est simultanément dégradé

par l’activité RNAse H de la polymérase virale à l’exception de 15 à 18 nucléotides de

l’extrémité 5’ protégée par la coiffe. Cet oligonucléotide d’ARN coiffé, contenant les 11


nucléotides de la séquence DR1 de la région 5’ va être transloqué au niveau de la région DR2

du brin (-) et va servir d’amorce pour la synthèse du brin (+). La forte homologie de séquence

existant entre DR1 et DR2 permet l’appariement de l’oligonucléotide sur la séquence DR2

située en 5’ du brin (-) (Beck and Nassal, 2007, Nassal, 2008).

1.4.7. Enveloppement des nucléocapsides et sécrétion virale

Les nucléocapsides contenant l’ADN-RC peuvent avoir deux devenirs : soit elles interagissent

avec les protéines d’enveloppe insérées dans la membrane du RE, pour conduire à la

formation de virions infectieux et à leur sécrétion par exocytose (Watanabe et al., 2007), soit

elles vont être redirigées vers le noyau de l’hépatocyte afin de maintenir ou d’amplifier le

pool d’ADNccc nucléaire (Niedre-Otomere et al., 2013).

1.5. Mode de transmission du VHB

Les modes de transmission du VHB sont identiques à ceux du virus de l’immunodéficience

humaine (VIH), mais le virus de l’hépatite B est 50 à 100 fois plus infectieux. A la différence

du VIH, le VHB peut survivre à l’extérieur du corps pendant au moins sept jours. Durant ce

laps de temps, il reste capable d’occasionner une infection s’il pénètre dans le corps d’une

personne non protégée par le vaccin (OMS, 2016).

1.5.1. Transmission sexuelle

Le risque de contamination par voie sexuelle peut varier de 30 à 80%. Il augmente avec le

nombre de partenaires sexuels, les années d’activité sexuelle, les autres infections

sexuellement transmissibles (IST), et le type de rapports notamment les rapports anaux

réceptifs. Ce mode de contamination est surtout observé en zone de faible endémie où la

contamination survient principalement à l’âge adulte (Liaw and Chu, 2009).

1.5.2. Transmission parentérale

Le virus de l’hépatite B peut être transmis par transfusion de sang ou de produits sanguins

provenant de porteurs du VHB. Ce mode de transmission peut toucher le personnel soignant,

lors d’accidents d’exposition au sang, et les usagers des drogues injectables. Les « piercings »,

manucure, pédicure, circoncision traditionnelle, scarifications rituelles et/ou thérapeutiques

traditionnelles, l’excision et les tatouages pratiqués sans respect des règles de stérilisation du

matériel utilisé, peuvent constituer un mode de transmission d’individu à individu.


1.5.3. Transmission horizontale

La transmission du VHB entre enfants est très fréquente et principalement décrite en Afrique

noire. La dissémination intrafamiliale du virus est le plus souvent aggravée par les mauvaises

conditions d’hygiène et la promiscuité importante. Dans les régions d’endémie intermédiaire,

la transmission est surtout horizontale (le grand enfant, l'adolescent et l'adulte jeune). Elle

résulte le plus souvent du contact de lésions cutanées ou muqueuses avec du sang contaminé,

ou le partage d’objets souillés (Liaw and Chu, 2009).

1.5.4. Transmission périnatale

La transmission périnatale de mère atteinte d’une infection chronique à son nouveau-né se

produit au moment de la naissance. Le risque est plus élevé chez les enfants nés de mère ayant

un AgHBe positif : l’incidence de l’infection est de 90% alors qu’elle est de 10 à 20 % pour

les enfants nés de mère AgHBe négatif. La prévalence de l’AgHBe chez les mères porteuses

d’AgHBs est plus importante en Asie (40%) qu’en Afrique (15%) (Van Herck et al., 2008).

La présence du VHB et son ADN dans le lait maternel a été confirmée depuis des décennies

(Pronczuk et al., 2002). Bien que l'antigène VHB ait été détecté dans le lait maternel, rien ne

prouve que l'allaitement augmente le risque de transmission de la mère à l'enfant (Chen et al.,

2013). L'Organisation mondiale de la santé postule que l'infection chronique par le VHB de la

mère ne peut pas être un argument contre l'allaitement maternel (Pronczuk et al., 2002, Chen

et al., 2013). Cependant, certains chercheurs et cliniciens le désapprouvent en fonction des

résultats de certaines études qui ont étudié le contenu des marqueurs viraux dans le lait

maternel (Chen et al., 2013). Récemment une étude a conclu que l'allaitement maternel n'est

pas un facteur de risque de transmission maternelle et infantile du VHB après la mise en place

de la prophylaxie recommandée (Wang et al., 2015).

1.6. Histoire naturelle de l’infection par VHB

1.6.1. Tropisme cellulaire

Le VHB est un virus essentiellement hépatotrope. L’hépatocyte est le principal site de

réplication pour l’ensemble de la famille des Hepadnaviridae. En effet, l’ADN viral et les

antigènes viraux sont retrouvés d’une façon prédominante dans les cellules hépatiques qui

contiennent toutes les formes réplicatives de l’ADN viral (Mulrooney-Cousins and Michalak,

2007, Fattovich et al., 2008).


Figure 5: Evolution des marqueurs sérologiques au cours de l’infection au VHB

(http://t2.gstatic.com/images)

1.6.2. Pathogenèse

L’infection par le VHB est à l’origine d’atteintes hépatiques aiguës ou chroniques qui peuvent

évoluer vers la cirrhose et le CHC. Le virus n’est pas directement cytopathogène, c’est la

réponse immune qui induit les lésions hépatiques chez les patients. Au cours de l’infection par

le VHB, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisent l’apoptose des hépatocytes infectés

et activent en parallèle une série de réactions inflammatoires dues à la production du facteur

de nécrose tumoral (TNF), des radicaux libres, ou des protéases. Ces réactions exacerbent la

mort hépatocellulaire et aboutissent à l’apparition de foyers d’inflammation nécrotiques dans

le foie. Les lésions hépatiques s’accompagnent d’une régénération active des hépatocytes. Ces

deux processus multiplient par 100 le risque de cancer du foie chez les patients infectés

(Ganem and Prince, 2004).

1.6.3. Profils sérologiques

Le diagnostic d’une hépatite aiguë est fondé sur la présence dans le sang de l’AgHBs et des

Ac anti-HBc de type IgM dans un contexte cytolytique hépatique. L’AgHBs est le premier

marqueur détecté dans le sérum, il apparait pendant la période d’incubation, en moyenne de

deux semaines à trois mois après le contage du VHB (Figure 5). Cette phase d’incubation

correspond à la fenêtre immunologique silencieuse dont la durée est estimée à 56 jours et

pendant laquelle le VHB est indétectable par les tests sérologiques classiques.

Les Ac anti-HBc totaux apparaissent 2 à 4 semaines après l’AgHBs, pendant la phase aiguë

de la maladie. L’AgHBe apparait peu de temps après l’AgHBs puis disparait rapidement (sa

persistance au-delà de 3 semaines serait un indicateur de passage à la chronicité) (Figure 5).

Lors de la phase aiguë de l’hépatite, environ 1013

virions sont produits par jour et la charge

virale peut atteindre 1010

copies/ml de sérum. La recherche de ces deux marqueurs de

multiplication virale n’est pas utile au cours de l’hépatite aigue.


1.6.4. L’hépatite B aiguë

L’intensité des symptômes d’une infection aiguë varie d’un individu à l’autre. Dans 75% des

cas d’exposition au VHB, l’infection aiguë est asymptomatique et n’est pas, par conséquent,

diagnostiquée. Dans les autres cas, les patients atteints ont un ictère et des symptômes tels que

des malaises, une anorexie, etc. Le taux des alanine-amino-transaminases (ALAT) est

également très élevé (20 à 100 fois supérieure à la normale) (Fattovich et al., 2008).

Après la contamination, l’incubation est longue et peut durer de 30 à 120 jours. Après cette

période, des manifestions pseudo-grippales (fièvre, frissons, céphalées, myalgies, douleurs

articulaires) et, dans la moitié des cas, de troubles digestifs peuvent être observés. Le

diagnostic de l’infection aiguë repose sur la présence de l’AgHBs avec Ac anti-HBc.

L’évolution verra la disparition de l’AgHBs et l’apparition de l’Ac anti-HBs après un délai

variable (Fattovich et al., 2008). Parmi ces hépatites aiguës on distingue différentes formes :

- Hépatite asymptomatique : on distingue des formes anictériques dans 70 à 80% des

cas. La symptomatologie est directement liée à l’âge, et l’infection est le plus souvent

asymptomatique chez le jeune enfant.

- Hépatite fulminante : Les hépatites fulminantes ou sub-fulminantes (0,1% des cas),

avec nécrose hépatique massive qui s’accompagne d’un ictère à bilirubine conjuguée,

d’une atrophie hépatique avec des transaminases très élevées et un syndrome

hémorragique dû, en partie, au défaut de synthèse des facteurs de coagulation

fabriqués par le foie, ou des phénomènes de coagulation intravasculaire. La mortalité

globale est de l’ordre de 80% en l’absence de greffe hépatique (Fattovich et al., 2008).

1.6.5. L’hépatite chronique

L’histoire naturelle de l’hépatite B chronique est un processus dynamique et complexe qui

présente une évolution variable dépendant des paramètres viraux et la réponse immunitaire de

l’hôte. Alors que 90 % des nouveau-nés infectés et 30 % des enfants développent une hépatite

chronique B, seulement 5 % des individus infectés à l’âge adulte deviennent porteur

chronique. Ceci illustre le rôle essentiel du système immunitaire du patient. L’infection

chronique par le VHB présente cinq phases distinctes : la phase de tolérance immunitaire, la

phase de clairance immunitaire, la phase de portage inactif, l’hépatite B chronique à AgHBe

négative et la phase à AgHBs négative (Hoofnagle et al., 2007, Shi and Shi, 2009).

La phase de tolérance immunitaire est caractérisée par la présence de l’AgHBe, une

importante réplication virale (ADN du VHB) et des lésions hépatiques minimes


(transaminases normales). Cette phase est plus fréquente et plus longue chez les patients

infectés pendant la période périnatale ou la première année de vie. Pendant cette phase, la

contagiosité est élevée (Fattovich et al., 2008).

La phase de clairance immunitaire est définie par la présence de l’AgHBe, la diminution de la

réplication virale, l’augmentation de la réponse immunitaire avec augmentation des

transaminases et des lésions inflammatoires. Le taux de séroconversion AgHBs - Ac Anti-

HBs augmente. Cette phase est plus fréquente chez les patients infectés à l’âge adulte. La

durée de cette phase ainsi que la sévérité des lésons hépatiques qu’elle engendre sont

corrélées avec le risque de progression vers la cirrhose et le CHC (Ikeda et al., 2009, Chan et

al., 2011).

La phase de portage inactif de l’AgHBs suit la séroconversion AgHBe en Ac Anti-HBe. Elle

se caractérise par un taux d’ADN viral très faible ou indétectable, des transaminases

normales. L’évolution est bonne avec un très faible risque de cirrhose et de CHC (Fattovich et

al., 2008).

Nous notons qu’à tout moment, les réactivations virales sont possibles (chez les porteurs

chroniques et les porteurs inactifs) : la réplication virale redémarre, les ALAT (Alanine

Amino Transférase) s’élèvent, l’AgHBe réapparaît chez des sujets qui étaient AgHBe

négatifs. Les réactivations virales sont spontanées ou iatrogènes et peuvent survenir après un

traitement cytotoxique ou immunosuppresseur (corticoïdes, rituximab, infliximab...) ces

épisodes de réactivation peuvent évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie (Fattovich et

al., 2008).

L’histoire naturelle de l’infection par le VHB peut être représentée dans la figure (6) suivante

:


Figure 6: Histoire naturelle de l'infection virale B (Pol, 2005).

1.7. Les coïnfections VHB/VHC et VHB/VIH

1.7.1. Coïnfection VHB/VHC

Une coïnfection par le VHB/VHC est possible en raison de modes communs de transmission

(Liu and Hou, 2006). Une coïnfection par VHB/VHC est responsable de multiples dommages

hépatiques allant de troubles histologiques mineurs, à la cirrhose et au carcinome

hépatocellulaire (CHC). L'interaction entre les deux virus en termes d'activité de réplication

et de la contribution de chaque virus dans la genèse des dommages hépatiques restent encore

mal connue. Cependant certaines études ont montré une susceptibilité de cette coïnfection à

réduire le niveau de réplication du VHB suggérant un effet suppressif du VHC sur le VHB

(Halima et al., 2010, Emara and Radwan, 2011); alors que d'autres études n'ont trouvé aucune

différence significative (Bellecave et al., 2009) ou même trouvé que le VHB supprime la

Porteur inactif


réplication du VHC (Pan et al., 2007). Selon Pontisso et al., l'interaction entre ces deux virus

entraine un ralentissement de la réplication de l’un ou de l’autre (Pontisso et al., 1993). Un

des mécanismes possibles du ralentissement de la réplication de l’ADN du VHB, pourrait être

l'inhibition de l'encapsidation par la capside du VHC (Chen et al., 2001). Ainsi, Chu et Lee

(2008) avaient observé chez les patients doublement infectés par le VHB et le VHC, une

faible concentration de l’ADN du VHB, une réduction de l’activité de l’ADN polymérase du

VHB ainsi qu’une réduction de l’expression des antigènes HBs et HBc au niveau du foie (Chu

and Lee, 2008). Certains auteurs avaient également montré que le VHB pouvait inhiber

réciproquement la réplication du VHC, la réplication de l’ADN du VHB étant corrélée à une

faible charge plasmatique de l’ARN du VHC chez les patients doublement infectés. Aussi,

chez ce type de patients, les valeurs de la charge virale des deux virus étaient inférieures à

celles des cas de mono infection (Emara and Radwan, 2011).

La coïnfection VHB/VHC serait aussi fortement associée à un risque accru de carcinome

hépatocellulaire. Le mécanisme de cette augmentation n’est pas parfaitement élucidé. Une

hypothèse suggère un rôle potentiel de l'ADN du VHB dans le développement de

l’hépatocarcinome cellulaire (Benvegnu et al., 1994, Koike et al., 1996).

1.7.2. Coïnfection VHB/VIH

En raison des modes de transmission communs, la coïnfection VHB/VIH est aussi fréquente.

Les études cliniques qui ont évalué l'impact du VHB sur la progression du VIH avant la

disponibilité générale d'une thérapie antirétrovirale hautement active (HAART), ont montré

des résultats contradictoires. En effet Landrum et al., (2010) ont rapporté qu’une préservation

immunologique grâce à l'utilisation accrue de la HAART serait susceptible de réduire le

risque d’une infection chronique par le VHB chez les sujets positifs au VIH (Landrum et al.,

2010). Une étude récente vient de montrer que la Coïnfection (VHB chronique/VIH) a un

impact significatif chez les sujets positifs au VIH car le risque d’évolution vers le stade SIDA

ou le décès, suite aux conséquences (cancer du foie) du VHB, est presque le double (Chun et

al., 2012). Une étude menée au Nigeria a montré que les personnes coinfectées par le

VIH/VHB étaient cinq fois plus susceptibles d'avoir une fibrose hépatique avancée

comparativement aux personnes mono infectées par le VIH (Hawkins et al., 2013). En outre,

plusieurs facteurs de risque de l'hôte (le sexe masculin, la vieillesse) et du virus (la charge

virale élevée et des génotypes spécifiques du VHB) ont été associés au développement de la

fibrose hépatique, de la cirrhose et du CHC. Cependant, les données de l'Afrique

subsaharienne, où la prévalence du VHB est plus élevée, sont rares. En Afrique


subsaharienne, la plupart des infections surviennent au cours de la petite enfance,

contrairement à l'Europe occidentale, où la majorité des patients sont infectés à l'âge adulte

(Martinson et al., 1998). Comme les modes de transmission du VHB et la durée de l'infection

peuvent influer sur le développement de la fibrose hépatique et du CHC, les patients

coinfectés par le VIH/VHB en Afrique subsaharienne pourraient être exposés à un risque

élevé de développer une maladie hépatique précoce (Fattovich et al., 2008).

1.8. Hépatite B occulte

Pendant longtemps, la séroconversion HBs a été considérée comme l’indicateur essentiel de la

« guérison » d’une hépatite B aiguë ou chronique, notamment après traitement. Cependant,

Alter et al., ont décrit en 1978 la transmission d’une infection au VHB via la transfusion du

sang d’un donneur négatif pour l’AgHBs et les Ac anti-HBs mais positif pour les Ac anti-HBc

(Alter et al., 1978). L’amélioration des méthodes de diagnostic moléculaire, et en particulier

le développement de techniques de PCR de plus en plus sensibles, ont permis de détecter des

traces d’ADN du VHB dans le sérum et le foie de patients ayant éliminé l’AgHBs. Ainsi est

apparu le concept « d’infection occulte par le VHB (IOB) », défini par la persistance de la

réplication virale en l’absence d’AgHBs détectable. En outre, l'IOB se caractérise par une

charge virale très faible (< 200 UI/mL) et la détection des anticorps anti-HBc dans 80% des

cas. Par contre, dans 20% des cas, il n'y a aucune preuve de marqueur sérologique du VHB

(Raimondo et al., 2008).

Bien que les hépatites B occultes soient caractérisées depuis trois décennies, les mécanismes

moléculaires et/ou immunologiques sous-jacents ne sont pas complètement élucidés. L'hôte et

les facteurs viraux contribuent à l'apparition de l’IOB. Plusieurs hypothèses ont été évoquées,

comme la persistance de l'ADN circulaire fermé de façon covalente (ADNccc) dans des

cellules hépatiques, une réplication virale extra-hépatique, la suppression et la non-détection

de la réplication du virion, les mutations dans les gènes pré-S/S, C, X et P ; une altération de

la réponse immune ou des coïnfections par d’autres virus, et la sécrétion de protéines (Levrero

et al., 2009, Zhu et al., 2016). L’IOB recèle le risque potentiel de transmission du VHB par

transfusion sanguine, la transplantation d'organes et l'hémodialyse ainsi que des mères

infectées à leurs nouveau-nés (Candotti and Allain, 2009, Walz et al., 2009). Bien que les

symptômes cliniques et biochimiques de la plupart des IOB ne soient pas sévères, il existe

encore un risque de développer des maladies hépatiques graves, telles que la cirrhose et le

carcinome hépatocellulaire (CHC) (Chemin and Trepo, 2005).


1.9. Epidémiologie du VHB

L’hépatite B est une maladie infectieuse grave, extrêmement contagieuse, qui provoquerait

plus de 686 000 décès par an dans le monde. On estime à 2 milliards le nombre de personnes

touchées par cette maladie, dont plus de 240 millions sont des porteurs chroniques capables de

transmettre le virus pendant des années (OMS, 2016). Entre 15 et 40 % de ces derniers

développent des complications hépatiques de type cirrhose ou hépatocarcinome. Ce dernier

constitue le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde (Zhou et al., 2012).

Au Burkina Faso les prévalences de l’AgHBs chez les donneurs de sang de premier don en

zones rurale et urbaine étaient respectivement de 13,0% et 16,2% à Ouagadougou, 10,9% et

11,5% à Bobo Dioulasso, 17,9% et 19,8% à Fada N’gourma et de 13% et 19% à Koudougou

(Nagalo et al., 2011a).

Le virus présent dans de nombreux fluides corporels tels que le sang (108

à 109 virions/ ml), la

salive (105 à 10

7/ml), le sperme et les sécrétions vaginales (10

6 à 10

7/ml) et à un titre plus

faible dans le lait maternel, les urines et la sueur des individus infectés (Lavanchy, 2004); est

facilement transmis par contact avec ces fluides et est 50 à 100 fois plus infectieux que le

virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Cette contagiosité est également liée à la

résistance du virus dans le milieu extérieur et à sa capacité de garder son pouvoir infectieux

pendant plus de 7 jours à température ambiante (Van Herck et al., 2008). L’infection par le

VHB peut être classée en trois zones (Figure 7) (Kew, 2010):

- Les zones de forte endémie, telles que l'Afrique sub-saharienne, l'Asie du Sud-est et le

bassin amazonien, où 7 à 20% de la population sont des porteurs de l'AgHBs.

- Les zones de moyenne endémie qui sont : l’Europe du Sud et de l’Est, le bassin

méditerranéen, le Moyen-Orient, une partie de l'Amérique Centrale et de l'Amérique

du Sud ont une prévalence de 2 à 5% de porteurs chroniques de l’AgHBs.


Figure 7: Distribution géographique de l'VHB dans le monde (Kew 2010).

- Les zones de faible endémie, telles que l'Amérique du Nord, l'Europe occidentale et du

Nord, l’Australie et la Nouvelle Zélande où le taux de porteurs chroniques du VHB est

inférieur à 2%. Dans ces régions, le pourcentage de porteurs chroniques peut

cependant être plus élevé parmi les populations dites à risques, notamment les

toxicomanes, les homosexuels, les sujets à partenaires multiples, les professionnels de

la santé (OMS, 2016).

1.10. Diagnostic du VHB chez l’homme

1.10.1. Recherche des marqueurs sérologiques :

1.10.1.1. Antigènes viraux

En pratique, les AgHBs et AgHBe sont mis en évidence dans le sérum par des techniques

immuno-enzymatiques chez les sujets porteurs du VHB. L'élément essentiel du diagnostic

d'une infection par le VHB en cours repose sur la mise en évidence dans le sérum de l'AgHBs.

L’AgHBe est recherché dans le bilan d’une hépatite chronique (Bottero et al., 2013).

1.10.1.2. Les anticorps

Le diagnostic sérologique permet la recherche et éventuellement la quantification des

anticorps dirigés contre les différents antigènes viraux : anticorps anti-HBs, anticorps anti-

HBc totaux et de type IgM, et anticorps anti-HBe (Bottero et al., 2013).


1.10.2. Détection et quantification de l’ADN du VHB

L’ADN du VHB peut être détecté et éventuellement quantifié dans le sérum, soit par des

techniques d’hybridation au moyen de sondes spécifiques, soit par amplification génique. Les

techniques d’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) du génome viral sont les

plus sensibles et permettent également après séquençage de révéler des variants ou mutants.

La quantification permet de suivre l'évolution de la charge virale. Différentes techniques sont

actuellement proposées (Valsamakis, 2007):

- L’ADN branché : Quantitex HBV DNA assay (bDNA), Laboratoires Bayer (seuil de

détection 3,3x103

copies/mL) ;

- La PCR : Cobas AmplicorTM

HBV MONITOR Test, Roche Diagnostics (2x102

copies/ml) ;

- Les PCR en temps réel : Real Time TM

HBV PCR Kit, Laboratoires Abbott (4 IU/ml)

et Real Time PCR System Cobas TaqMan 48, Roche Diagnostics (35 copies/ml).

1.10.3. Méthodes d’étude de la variabilité du génome du VHB

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour différencier les génotypes du VHB, le choix de

la technique dépendant de l’objectif des études menées.

1.10.3.1. Séquençage et analyse phylogénétique

Actuellement, le séquençage du génome entier du VHB et l’analyse phylogénétique

constituent la méthode de référence pour le génotypage des souches de VHB. Toutefois, la

comparaison des séquences obtenues sur le génome entier et dans la région du gène S a

montré que les séquences dans la région S permettaient également d’identifier précisément les

génotypes A à H. Une région intéressante pour le génotypage est la région du gène P

chevauchant le gène S, dont l’amplification puis le séquençage permet l’identification du

génotype dans le cadre de lecture du gène S et la détection simultanée des mutations de

résistance au traitement dans le cadre de lecture du gène P (Yeh et al., 2004).

1.10.3.2. Analyse par polymorphisme de restriction

L’analyse par polymorphisme de restriction (restriction fragment length polymorphism :

RFLP) repose sur la différence de taille des amplicons du gène S après digestion enzymatique.

Une étude a comparé les séquences du gène S et a identifié des sites de restriction spécifiques

de chaque génotype. Après une étape d’amplification, les séquences sont digérées par

plusieurs endonucléases (HphI, NciI, AlwI, EarI et NlaIV) et les fragments obtenus sont

séparés par électrophorèse. La taille des différents fragments est caractéristique de chaque


génotype. Cependant, toute mutation portant sur la région analysée peut entraîner la

suppression ou, la création d’un site de restriction et fausser les résultats du génotypage (Wu

et al., 2012).

1.10.3.3. Utilisation d’amorces spécifiques

La méthode développée par Naito et al. (Naito et al., 2001) repose sur l’existence d’une

divergence intergroupe de la séquence nucléotidique au niveau d’une région conservée des

gènes préS1/S. L’ADN du VHB est amplifié par PCR nichée : alors que les amorces utilisées

lors de la première PCR permettent l’amplification des génotypes A à F, les amorces de la

seconde PCR sont spécifiques de chacun. L’identification des génotypes est fondée sur la

différence de taille des amplicons. Kirschberg et al. ont développé une PCR multiplex, qui

permet d’amplifier spécifiquement chacun des six génotypes en une seule étape (Kirschberg

et al., 2004).

1.10.4. Diversité génétique du VHB

La polymérase est une enzyme qui ne possède pas d’activité exonucléase 3'→5’ et qui ne

corrige donc pas les erreurs de lecture. Il existe au moins une mutation tous les 104 à 10

5

nucléotides. Chez un patient avec une infection chronique, avec le temps, des mutations

s’accumulent et plusieurs souches virales peuvent coexister (quasi-espèces) (Weber et al.,

2005).

1.10.4.1. Sérotypes HBs

Le déterminant « a » de l’AgHBs est conservé parmi tous les génotypes du VHB et parmi les

orthohepadnavirus (Le Bouvier, 1971). Des mutations naturelles ont été décrites comme les

mutations G145R la plus fréquente (Zanetti et al., 1988), P120S/T, T123N/S, M133I, Y134N,

K141E, S143L et D144A (Mele et al., 2001). Ces mutations peuvent affecter la conformation

du déterminant « a » ce qui affecte sa reconnaissance par les Ac anti-HBs et ainsi permet

l’échappement à la réponse immunitaire et aux kits de détections de l’AgHBs (Tian et al.,

2007). Le déterminant « a » est associé à deux autres déterminants sous deux formes

mutuellement exclusives d/y (Le Bouvier, 1971) et w/r (Bancroft et al., 1972) dont les

positions déterminent les sérotypes d’AgHBs.

1.10.4.2. Mutations du VHB

1.10.4.2.1. Mutations au niveau du gène S

Dans le génome viral du VHB, la région S est subdivisée en sous-régions S, pré-S1 et pré-S2

qui codent pour les protéines de l’enveloppe virale (AgHBs, protéines pré-S1 et pré-S2).


Les mutants affectant l’AgHBs sont souvent appelés “mutants d’échappement à la

vaccination”. Ils sont responsables de phénomènes d’échappements à la vaccination, et à la

sérothérapie préventive utilisée pour éviter l'infection du greffon chez les transplantés de foie

(Ozaslan et al., 2007).

L’AgHBs du premier mutant du VHB identifié possédait à la position 145 une substitution

d’un résidu glycine par un résidu arginine (G145R). Ce mutant est aujourd’hui le mutant

d’échappement le plus fréquent (Sticchi et al., 2013).

Les mutations affectant les protéines pré-S1 et pré-S2 sont généralement des délétions. Une

mutation modifiant le codon initiateur de la protéine pré-S2, et éliminant donc l’expression de

cette protéine, a été décrite (Francois et al., 2001).

1.10.4.2.2. Les mutants "pré-core" ou pré-C, au niveau du gène C

La région C se compose de deux séquences dénommées respectivement pré-C et C.

L’extrémité 3’ du gène C code pour la protéine de capside (AgHBc). Les deux séquences pré-

C et C sont nécessaires pour la synthèse de la protéine AgHBe (Li et al., 1993). En effet, Les

premiers nucléotides de la région pré-C codent pour 19 acides aminés qui correspondent à un

peptide signal facilitant la sécrétion de l’antigène HBe dans le sérum après passage dans le

réticulum endoplasmique cellulaire.

Étant donné qu’il n’y a pas de chevauchement d’une grande partie du cadre de lecture ouvert

(ORF) de la région pré-core/core par un autre ORF, il peut se produire plus de mutations du

génome viral dans cette région. La mutation la plus courante et la plus étudiée est la

substitution de la guanine (G) par l’adénine (A) au niveau du gène pré-C (en position 1896).

Cette mutation transforme le codon 28 TGG en un codon stop TAG, qui termine la

transcription à cet endroit entraînant un arrêt de lecture et l’arrêt de l’expression de l’AgHBe.

En revanche, la protéine de capside peut toujours être synthétisée et donc la réplication virale

peut se poursuivre (Lebarbier et al., 2004, Bourliere, 2005).

Les personnes infectées sont donc AgHBe négatifs mais continuent à répliquer activement ce

virus à mutation pré-C, avec une abondance d'ADN viral dans le sérum, et donc une évolution

possible vers l'hépatite fulminante ou vers une hépatite chronique sévère. Dans ces cas, une

recherche d’AgHBe négative chez le malade ne signifie pas qu’il est guéri et cette recherche

ne peut être utilisée comme marqueur pour suivre l’évolution de la maladie (Han et al., 2015).


Cette même mutation apporte une plus grande stabilité au génome viral, étant donné que le

site nucléotidique 1896 qui est maintenant occupé par « A » se fixe plus avidement au

nucléotide « T » correspondant à la position 1858, ce qui assure une plus grande stabilité, une

encapsulation pré-génomique et l’initiation de la synthèse de l’ADN (Lebarbier et al., 2004).

Les autres mutations les plus communément décrites sont la transversion « A » à « T » en

position 1762 et la transition « G » à « A » en position 1764 situées dans la région du

promoteur basal du core (BCP) (Fang et al., 2009). Ces mutations entraînent une altération de

la production de l’AgHBe au niveau transcriptionnel (Lebarbier et al., 2004). Une étude a

trouvé que les mutations A1762T/ G1764A étaient associées à un niveau plus bas de

l'antigène de surface de l'hépatite B (AgHBs) chez les patients atteints d'hépatite B chronique

(CHB) AgHBe-positive (Yan et al., 2012).

1.10.4.2.3. Mutations du gène de la polymérase virale

Le plus souvent, les mutations décrites touchent le site catalytique de la transcriptase inverse,

en particulier le motif peptidique YMDD (résidus 551 à 554) du domaine C de la polymérase

virale (Figure 8). Ces mutations sont sélectionnées par les traitements antiviraux de type

analogues nucléosidiques tels que la lamivudine (LAM) et le famciclovir (Lok et al., 2007).

Du point de vue de la nomenclature, les mutations sont identifiées et nommées en désignant la

région de la mutation, l'acide aminé original, sa position relative au début de la région et

l'acide aminé mutant (Stuyver et al., 2001). Par exemple, la mutation rtM204I décrit une

mutation de la « rt » avec en position 204 un remplacement de la méthionine par l'isoleucine.

Les mutations les plus fréquemment à l'origine d'une résistance à la LAM affectent le centre

catalytique de la rt (domaine C : YMDD) entraînant le remplacement de la méthionine en

position 204 par une valine/Isoleucine ou sérine (rtM204V, rtM204I, rtM204S) (Figure 8).

Souvent, une mutation au sein de la rt induit de manière transitoire une diminution du pouvoir

de réplication viral. De telles mutations sont alors accompagnées par des mutations

compensatrices qui restaurent une réplication virale efficace. Pour la résistance à la LAM, la

mutation compensatrice la plus reconnue est la rtL180M qui se trouve dans le domaine

conservé B. Cependant, seule, cette mutation n'induit pas de résistance virale à la LAM.

Aussi, si la mutation rtM204I peut être isolée, les mutations rtM204V et rtM204S sont

toujours associées à d'autres mutations compensatrices de type rtL180M ou rtV173L (Lok et

al., 2007).


La mutation rtA181T de la polymérase du virus de l'hépatite B est sélectionnée au cours d'une

thérapie antivirale à long terme. Comme le gène de la polymérase chevauche complètement le

gène de l'enveloppe (S), la mutation rtA181T du VHB s’accompagne également de mutation

sW172 (Zhou et al., 2016).

En 2011, l'apparition du mutant rtA181T/sW172* a été associé à un risque accru de

carcinome hépatocellulaire chez des patients traités par la LAM ou l’ADV (Adefovir

dipivoxil) (Yeh et al., 2011).

Figure 8: Les principales mutations du gène de la polymérase virale responsable de résistance

aux antiviraux (Lok et al., 2007). LAM : lamivudine, ADV : Adéfovir, ETV : Entécavir, LdT

: Telbivudine, RT : Reverse Transcriptase.

1.10.4.2.4. Mutation au niveau du gène X

Des études ont montré que la protéine X interagit avec plusieurs systèmes de signalisation

intracellulaire et possède un rôle anti-apoptotique. Il a été suggéré que certaines mutations

dans le gène X pourraient jouer un rôle dans la transformation cellulaire (Rosmorduc et al.,

1999). Enfin une corrélation entre le type de mutation du gène X et l'état clinique des patients

atteints d’une hépatite B chronique a été décrite (Cho et al., 2011).

1.10.4.3. Génotype, sous génotype et épidémiologie moléculaire

Durant la dernière décennie, la classification selon les sérotypes a progressivement été

remplacée par celle des génotypes. Cependant, les sérotypes sont corrélés aux génotypes bien


qu’ils puissent regrouper plusieurs génotypes. Les études phylogénétiques menées à partir des

séquences nucléotidiques de différents génomes viraux ont permis de classer provisoirement

le VHB en 10 génotypes (A à J) (Tatematsu et al., 2009). Les génotypes du VHB sont définis

par une divergence d’au moins 8 % de la séquence nucléotidique du génome entier et d’au

moins 4,1 % dans le gène S (Norder et al., 2004). Les principaux génotypes ont été divisés en

sous génotype à partir d’analyses phylogénétiques et ils sont définis par la divergence

comprise entre 4,1 % et 8 % de leur séquence nucléotidique complète (Schaefer, 2005). La

distribution géographique et épidémiologique des génotypes du VHB est continuellement

recherchée dans différentes parties du monde. A partir des différentes données accumulées, il

a été observé que chaque génotype/sous génotype a une distribution géographique spécifique

(Figure 9). Ainsi :

Le génotype A est ubiquitaire mais prédomine en Europe du Nord-ouest, en Amérique du

Nord et en Afrique Centrale. Le génotype A est le seul génotype prédominant en Afrique de

l’Est où la prévalence des autres génotypes est inférieure à 5% (Kurbanov et al., 2010). Il a

été divisé en 6 sous génotypes allant de 1 à 6. Le sous génotype A1 est prédominant en

Afrique, en Asie et en Indonésie (Kramvis and Kew, 2007b) ; A2 est prévalent en Europe du

Nord-Ouest (McMahon, 2009) et A3-A6 sont trouvés en Afrique centrale et en Afrique de

l’Ouest (Kramvis and Kew, 2007a, Pourkarim et al., 2010).

Les génotypes B et C sont principalement retrouvés en Asie et dans les îles du pacifique et

sont divisés en 8 sous génotypes chacun. B1 et C2 sont prévalent au Japon, en Corée et au

Nord de la Chine ; C2 est trouvé en Alaska, alors que B2 et C1 sont prévalent au Sud de la

Chine, en Taiwan et en Asie du Sud Est (McMahon, 2009) ; B3-B5 et B7-B8 comme C3-C8

sont prédominants dans le pacifique et B6 est prévalent en Alaska, au Nord du Canada et au

Groenland (Lusida et al., 2008, Mulyanto et al., 2009, Chan et al., 2011).

Le génotype D subdivisé en 7 sous génotypes est endémique et très fréquent sur le pourtour

du bassin méditerranéen et au Moyen-Orient. Il est le seul génotype prédominant en Asie de

l’Ouest. D1 est fortement prévalent en Asie central, dans le pourtour du bassin méditerranéen

mais aussi en Inde et en Afrique de l’Est (Banerjee et al., 2006). D2 est prévalent en Europe

de l’Est incluant la Russie et la région de la Baltique. D3 est distribué en Russie, au Nord de

l’Inde, au Pakistan et est fréquemment retrouvé chez les toxicomanes à travers le monde

(Tallo et al., 2008). D5 a été caractérisé à l’Est de l’Inde (Chandra et al., 2009). D4 et D6 sont

endémiques en Océanie et en Indonésie respectivement (Lusida et al., 2008). D7 a été isolé en


Tunisie (Meldal et al., 2009). D8 a été caractérisé au Niger (Abdou Chekaraou et al., 2010).

Le sous génotype D9, un nouveau recombinant D/C, a été retrouvé en Inde orientale (Ghosh

et al., 2013).

L’Afrique de l’Ouest est le foyer principal du génotype E (Norder et al., 2004).

Le génotype F est prédominant en Amérique Latine et Centrale, F1 a été trouvé en Alaska, à

Mexico, en Amérique central et a été disséminé au Pérou et en Argentine, alors que F2-F4

sont prévalent en Amérique du Sud (Devesa et al., 2008).

Le génotype G a été identifié aux Etats-Unis et en France (Stuyver et al., 2000). C’est le seul

génotype qui semble ne pas être associé à un foyer principal.

Le génotype H a été décrit chez les Amérindiens en Amérique Centrale et aux USA (Arauz-

Ruiz et al., 2002). Un neuvième génotype provisoire I a été identifié en Asie et au Vietnam

(Olinger et al., 2008). Récemment le dixième génotype provisoire J a été signalé au Japon

(Tatematsu et al., 2009).

Cependant, de nombreux génotypes hybrides ont été observés dans certaines régions du

monde : A/C au Vietnam, C/D au Tibet, A/D en Afrique ou B/C en Asie. Des recherches

supplémentaires sont donc nécessaires afin de déterminer si les échanges entre génotypes sont

la conséquence d’une recombinaison génétique directe entre deux souches virales ou si elles

sont la conséquence d’une adaptation rapide du VHB à un environnement génétique et

immunologique particulier associé à certaines populations humaines (Schaefer, 2007).


Figure 9: Distribution géographique des génotypes et sous-génotypes du VHB (Schaefer,

2007)

1.11. Traitement et Prévention

Les hépatites aiguës ne représentent généralement pas un problème grave vu que les formes

fulminantes ne représentent que 0,1% des cas. En revanche, pour les patients qui développent

une infection chronique, il faut diminuer les troubles hépatiques, en réduisant la charge virale.

Des stratégies antivirales ont été élaborées selon trois voies : les analogues de nucléos(t)ides,

les immuno-modulateurs et la vaccinothérapie.

1.11.1. Les analogues de nucléos(t)ides

La thérapie par des analogues de nucléos(t)ides des adultes atteints d’hépatite B chronique

réduirait le risque de complication à long terme. Les analogues de nucléos(t)ides

appartiennent à 3 classes : les L-nucléosides (lamivudine, telbivudine et emtricitabine), les

analogues de la déoxyguanosine (entécavir) et les nucléosides acycliques phosphanates

(adéfovir et tenofovir). Parmi ces traitements antiviraux, le corps médical a d’abord porté

beaucoup d’intérêt à la Lamivudine (Zeffix®), issue des recherches contre le VIH où elle est

connue sous le nom d’« Epivir ». En effet, l’Epivir® utilisé dans le traitement de l’infection à

VIH est de la lamivudine dosée à 150 mg, alors que le Zeffix® spécialement destiné au

traitement de l’infection chronique du foie par le VHB est de la lamivudine dosée à 100 mg.

L’entécavir n’induit que très peu de résistance, même après 4 ans de traitement et a une


activité antivirale plus importante que la lamivudine (Zhang et al., 2011a, Kumada et al.,

2013).

L’adévofir est capable d’inhiber la réplication virale chez les patients atteints d’hépatite

chronique et d’induire une importante séroconversion de l’AgHBe (Hadziyannis et al., 2005).

Le Ténofovir permet de réduire la multiplication virale. Il a été utilisé aussi chez les patients

coïnfectés VIH/VHB qui recevaient déjà un traitement par la Lamivudine ou l’Emtricitabine

dans le cadre de leur trithérapie antirétrovirale hautement active (HAART) (Kumada et al.,

2013). Le Ténofovir, à la différence des autres molécules n’a pas de résistance connue à ce

jour.

1.11.2. Les traitements « immuno-modulateurs »

Afin de limiter la propagation virale, la stimulation de la réponse immunitaire via différentes

cytokines a été envisagée. A ce jour plusieurs molécules ont été testées avec plus ou moins un

succès. Aujourd’hui, l’OMS préconise le Ténofovir ou Entécavir dans le traitement de

première intention du VHB (OMS, 2016). Il ralentit ou arrête la fibrose, favorise une moindre

fréquence de survenue de la cirrhose et peut entraîner une séroconversion de l’AgHBe

(Zhijian et al., 2010, Liang et al., 2011). Une étude a monté que l'hétérogénéité dans la région

promotrice du gène de l'IL-10 joue un rôle important dans la détermination de la réponse

initiale de l'hépatite B chronique à l'IFN-thérapie (Wang et al., 2011).

1.11.3. La vaccinothérapie

Le vaccin a été produit à partir d’antigène HBs purifié (vaccin dérivé du plasma) puis par

biologie moléculaire avec la synthèse d’anticorps dirigés contre l’antigène de surface du virus

de l’hépatite B. Ces deux types de vaccin (plasmatiques et recombinants) ont une

immunogénicité comparable induisant l’apparition d’anticorps anti-HBs à un titre protecteur

(>10 mU/mL) dans 90 à 95 % des cas (Zhu et al., 2017).

Le vaccin du VHB porte le déterminant HBs (Engérix) ou HBs (+) pré-S2 (Génhévac B). La

forme adulte est de 20 μg et de 10 μg pour celle enfant, avec 5 μg pour le nouveau-né. Le

protocole standard recommandé chez l'adulte est de trois injections à des intervalles d'un

mois, avec une dose de rappel un an plus tard. Le calendrier pour les nourrissons et les

adolescents comprend trois injections administrées à 0, 1 et 6-12 mois (Michel and Tiollais,

2010). L’efficacité vaccinale se définira donc par la capacité du vaccin à réduire


significativement l’incidence de l’hépatite B chez les sujets vaccinés comparativement à des

sujets non vaccinés.

Le vaccin contre l’hépatite B est le premier vaccin contre un cancer humain qui est celui du

foie (Pineau and Tiollais, 2010), suivit du vaccin contre le papillomavirus.

La protection conférée par la vaccination contre l’hépatite B peut être objectivée directement

par la détermination des titres d’anticorps anti-HBs. La présence d’un titre d’anticorps

supérieur à 10 UI/l a été démontrée comme protectrice, établissant ainsi un seuil minimal de

protection des anticorps. La durée de persistance de ces anticorps est directement liée au taux

atteint un à trois mois après la troisième dose vaccinale ; dose indispensable à l’installation de

la mémoire immunitaire. Les lymphocytes T mémoire et les lymphocytes B mémoires ne sont

réactivés que lorsqu’ils sont à nouveau mis au contact de l’antigène dont ils sont spécifiques.

En réponse à une exposition infectieuse (ou vaccinale en cas de rappel), les cellules mémoires

prolifèrent très rapidement et se différencient en 3 à 5 jours en plasmocytes producteurs de

taux élevés d’anticorps ou en lymphocytes T CD8 capables d’éliminer les particules virales

et/ou les cellules infectées (Michel et Tiollais, 2010).

L’intérêt de la vaccinothérapie associée à un traitement antiviral est suggéré par certaines

études mais son effet reste inconstant. Une meilleure connaissance des réponses T antivirales

devrait permettre de mieux sélectionner les patients pouvant bénéficier de ces traitements. Les

différentes expérimentations visant à induire une rupture de tolérance immunitaire par le biais

d'une vaccinothérapie spécifique sont prometteuses et indiquent que cette approche pourrait

être efficace (Zhang et al., 2011b).

2. APOBEC3G ET INTERACTION AVEC LE VIH ET LE VHB

2.1 Famille d’APOBEC

La famille des Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like

(APOBEC) par leur activité enzymatique d’édition des ARNm, sont des inhibiteurs potentiels

des virus ayant une phase de transcription réverse. Elle est composée de 5 classes qui sont :

Activation-Induced Deaminase (AID), APOBEC1, APOBEC2, APOBEC3 et APOBEC4

(Harris et al., 2003). Ils agissent pour empêcher l’infection rétrovirale soit par induction d’une

hyper-mutation de l’ADNc rétroviral, soit par inhibition de la reverse transcription virale ou

l’intégration des provirus.


2.1.1 Activation-Induced Deaminase (AID)

L’AID est nécessaire pour l’évolution normale de la réponse immunitaire. Il est exprimé dans

les cellules germinales B, où il catalyse la désamination de dC en dU au niveau de l’ADN. Il

permet la diversité des gènes de l’immunoglobuline à travers une hyper-mutation somatique

et un changement de classe par recombinaison (Chiu and Greene, 2008)

2.1.2 APOBEC1

Le gène qui code pour APOBEC1 est situé sur le chromosome 12. Il est essentiellement

exprimé dans les tissus gastro-intestinaux. Il est le principal élément du complexe ARN

éditosome qui facilite la désamination de la cytosine-6666 en Apolipoprotein B mRNA. Il agit

de la conversion de la glutamine en codon stop (Chiu and Greene, 2008).

2.1.3 APOBEC2

Le gène est localisé sur le chromosome 6. L’APOBEC2, par sa propriété physico-

biochimique, est un membre du groupe des enzymes qui édite les ARNm. Sa fonction réelle

est toujours méconnue, mais il serait plus exprimé dans les muscles striés (avec des taux

élevés pendant la différentiation du myoblaste). Il a principalement été associé aux muscles à

contraction lente, et particulièrement dans le muscle soléaire (Jarmuz et al., 2002).

2.1.4 APOBEC3

Le gène qui code pour APOBEC3 est situé sur le chromosome 22 à la position q13.2. Les

différents exons de la séquence du gène codent au moins pour six (6) protéines (APOBEC3A,


APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G, et APOBEC3H) à activité cytidine-

désaminase avec une spécificité pour les ADN monobrin (Figure 10) (Henry et al., 2009).

Les séquences codantes pour APOBEC3B et APOBEC3G sont composées de huit exons.

Celles codantes pour APOBEC3F, APOBEC3A, APOBEC3C et APOBEC3E, et APOBEC3D

sont respectivement composées de sept exons, cinq exons, quatre exons, et de trois exons

(Figure 10) (Jarmuz et al., 2002).

Figure 10 : Disposition des protéines d’APOBEC3 sur le chromosome 22 13.2.(Jarmuz et al.,

2002)

Les séquences codantes pour APOBEC3B, APOBEC3F, et APOBEC3G sont complètes et

celles codantes pour APOBEC3A, APOBEC3C, APOBEC3D, et APOBEC3E sont

incomplètes (Figure 11). Les séquences codantes pour APOBEC3B, APOBEC3G et

APOBEC3F contiennent un duplicata du site actif, un insert et un « linker peptide » dans les

exons 6 et 7 par rapport aux séquences incomplètes (Jarmuz et al., 2002).

Figure 11 : Structures des protéines d’APOBEC. (Jarmuz et al., 2002)

2.1.5 APOBEC4

Le gène qui code pour cette protéine est situé sur le chromosome 1 à la position q25.3 chez

l’homme. Elle est principalement exprimée dans les testicules et aurait une activité


enzymatique d’édition des ARNm impliqués dans la spermatogenèse. Les motifs de

coordination de Zinc (Zn) et la structure secondaire du domaine désaminase d’APOBEC4

sont conservés et possèderaient une activité cytidine-désaminase des polynucléotides (Jarmuz

et al., 2002).

2.2 Particularité d’APOBEC3G

2.2.1 Structure et rôle

L’APOBEC3G ou CEM15 est présent de façon stable dans des cellules qui n’expriment pas

normalement la protéine vif (delta-Vif). La présence de cette dernière abroge l’activité

antivirale d’APOBEC3G (Sheehy et al., 2002). CEM15, un inhibiteur endogène de la

réplication du VIH-1, est une cytidine désaminase capable d’induire une hyper-mutation de G

en A dans les nouveaux ADN viraux synthétisés.

APOBEC3G contient un domaine de liaison conservé du Zinc et de glutamate, impliqué dans

le transport des protons retrouvés sur tous les sites actifs des cytidines désaminases. La liaison

de Zn2+

de la région C-terminal est catalytiquement active comparée à celle N-terminal. La

structure d’APOBEC3G est composée de 5 feuillets β entourés de chaque côté par 6 hélices α

(Harjes et al., 2009, Shandilya et al., 2010) (Figure 12). La particularité de la structure

d’APOBEC3G, est que l’hélice α 3 entre les feuillets β4 et β5 est proche du résidu 128 associé

à l’interaction avec vif (Huthoff and Malim, 2005). L’expression d’APOBEC3G dans la rate,

les testicules, les ovaires, les leucocytes du sang périphérique et dans plusieurs lignées

cellulaires tumorales a été démontrée par Northern blot (Jarmuz et al., 2002).


Figure 12 : Structure du domaine catalytique de la cytidine désaminase APOBEC3G

(Adaptée de Huthoff, et Malim 2005). Légende : Les hélices α sont représentées en rouge et les

feuillets β en jaune. Entre les feuillets β4 et β5 toutes les protéines d’APOBEC contiennent une

insertion qui prédit un repliement en une hélice structural α3. Dans la protéine APOBEC3G, cette

hélice est proche de du résidu 128 qui est associe avec interaction de vif spécifique à l’espèce

humaine ou Simienne.

2.2.2 APOBEC3G et VIH

2.2.2.1 La protéine vif (delta-Vif) et son mécanisme d’action

Les virus de l’immunodéficience des primates particulièrement le VIH-1, codent pour la

protéine Vif de 198 acides aminés et de 23 kDa. C’est un régulateur potentiel (puissant) de

l’infection et de la réplication du virus. Elle est par conséquent importante pour une infection

pathogénique in vivo. La protéine Vif semble être nécessaire pendant les dernières étapes de

la production du virus, pour la suppression des antiviraux du système immunitaire inné (les

lymphocytes T et APOBEC3G). De ce fait, en l’absence de protéine Vif, l’expression de

l’APOBEC3G rend la progéniture non-infectieuse. Lorsque la protéine Vif est présente, elle

recrute une ubiquitine ligase E3 qui provoque la polyubiquitination d'APOBEC3G et dirige

ainsi cette dernière vers la voie de dégradation par le protéasome (Henriet et al., 2009).

La protéine Vif du VIH-1 inhibe l’action d’APOBEC3G dans les cellules humaines, et facilite

la libération de virions infectieux. Mais elle n’arrive pas à inhiber les protéines similaires

d’APOBEC3G dans les cellules simiennes (Bogerd et al., 2004).


2.2.2.2 Rôle antiviral et mécanisme d’action d’APOBEC3G

L’APOBEC3G est incorporée dans un virion dépourvu de Vif à travers des interactions avec

la protéine Gag, la nucléocapside et l’ARN viral (Khan et al., 2005). Une fois que le virion

infecte une nouvelle cellule, APOBEC3G reste attaché aux protéines virales et à l’ARN pour

la désamination pendant la transcription reverse. Cela induit une hyper-mutation de G en A

dans le génome du VIH (Zhang et al., 2003, Harris et al., 2003) (Figure 13).

Par conséquent, lors de l’infection des cellules cibles par le VIH, APOBEC3G catalyse une

désamination de cytidine (C) en uridine (U) sur le premier brin d’ADN (de polarité négative).

Cela entraine une mutation de Guanine (G) en Adénine (A) sur le brin positif du VIH-1 lors

de la synthèse du deuxième brin d’ADNc. Le taux très élevé de mutation de G en A a été

qualifié d’hyper-mutation. Ces mutations se réalisent dans un contexte nucléotidique où la

base mutante est influencée par le nucléotide en 3’. Ainsi APOBEC3G induit des mutations

de GG en AG. Suite à cette hyper mutation l’ADN est non viable par apparition de codons

non-sens ou de codons stop. Les hyper-mutants G en A sont des séquences dans lesquelles le

résidu G sur le brin de polarité positive est substitué par A (Vartanian et al., 1991). L’ADN

hyper muté subit deux destinées. Une partie est reconnue et dégradée par les enzymes

cellulaires (Uracile DNA glycosylases et endonucléases). L’autre partie s’intégrera dans le

génome cellulaire mais ne pourra pas assurer la synthèse de protéines virales à cause du

nombre élevé de mutations. L’APOBEC3G est capable de réduire la réplication rétrovirale, et

de fonctionner indépendamment de la transcription reverse (Suspene et al., 2004, Chiu and

Greene, 2008) (Figure 14). Ceci, explique comment des cellules non-permissibles peuvent

produire des niveaux normaux de virions, mais ces virions ne peuvent pas se répliquer

normalement dans la prochaine cellule (Farrow and Sheehy, 2008).


Figure 13 : Mécanisme de désamination par APOBEC3G.(Harris et al., 2003)

Figure 14: Activité antivirale d'APOBEC3G (Chiu et Greene, 2008)


2.2.3 APOBEC3G et VHB

Des études ont montré qu’APOBEC3G pouvait inhiber la réplication du virus de l’hépatite B

(VHB) (Turelli et al., 2004, Suspene et al., 2004, Nguyen et al., 2007). APOBEC3G agit sur

le VHB en désaminant le brin négatif de l’ADN naissant (Rosler et al., 2005, Noguchi et al.,

2005). Parmi les membres de la famille d’APOBEC3 ; APOBEC3B, APOBEC3C,

APOBEC3F et principalement APOBEC3G ont été beaucoup plus étudiés. Ils ont été associés

à la survenue d’hyper-mutation et l’inhibition de la réplication du VHB (Suspene et al., 2005).

Une régulation à la hausse d’APOBEC3G par les interférons inhibent la réplication du VHB

(Noguchi et al., 2007) (Figure 15).

Figure 15 : Hyper-mutation du VHB (adaptée de Noguchi et al., 2005)

2.2.4 Polymorphismes génétiques d’APOBEC3G

APOBEC3G est caractérisé par des polymorphismes mono nucléotidiques appelés SNPs

(Single nucleotide Polymorphisms). Un groupe de chercheurs a identifié 7 polymorphismes

d’APOBEC3G sur une cohorte basée aux Etats-Unis (An et al., 2004) dont le variant

rs8177832 (H186R). Ce dernier accélérerait la progression vers le stade SIDA chez les Noirs

Américains. Il existe donc des variants polymorphiques pouvant ainsi moduler la progression

du VIH. En 2010, 24 SNPs de l’APOBEC3G dont 16 SNPs déjà connues et 8 nouveaux ont

été identifiés dans une cohorte Sud-Africaine. Trois variants alléliques ont été analysés dans


cette étude, le rs8177832 (H186R), le rs6001417 et le rs35228531. Les génotypes normaux

respectifs de ces trois SNPs sont : AA (avec une substitution A en G), CC (avec une

substitution C en G) et CC (avec une substitution C en T) (Reddy et al., 2010). Ces études ont

montré que les polymorphismes d’APOBEC3G moduleraient positivement ou négativement

l’évolution vers le stade SIDA. Le génotypage de ces variants alléliques montre que les

individus porteurs de mutation H186R ont en général une charge virale élevée et un faible

taux de lymphocyte T CD4+ (Reddy et al., 2010).

MATERIEL

ET

METHODES


CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES

1. Cadre d’étude

Nos travaux de recherches ont été menés au Burkina Faso au Centre de Recherche

Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) et au Laboratoire de Biologie Moléculaire et de

Génétique (LABIOGENE) qui ont servi de cadre d’étude. Le Burkina Faso est un pays

sahélien enclavé situé au cœur de l’Afrique Occidentale. Il fait frontière avec le Mali, le

Niger, le Bénin, le Togo, le Ghana, et la Côte d’Ivoire. Il s’étend sur une superficie de 274

222 Km2 pour une population de 17 880 386 habitants en 2014 (INSD, 2015). Ouagadougou

sa capitale administrative concentrait près de 1 915 102 habitants en 2012 (INSD, 2015).

Le LABIOGENE est un laboratoire de recherche de l’Ecole Doctorale Sciences et

Technologies (ED/ST) de l’Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO ayant reçu le

label de Centre d’Excellence de l’UEMOA.

Le CERBA est situé au secteur 51 de la ville de Ouagadougou. Il a été érigé en

Laboratoire National de Référence du HPV (LNR-HPV) depuis février 2015. Tout comme

l’Hôpital Saint Camille de Ouagadougou (HOSCO), il est dans le district sanitaire de

l’arrondissement 11. La capitale burkinabè compte 4 districts sanitaires (districts sanitaires de

Pissy, de l’ex secteur 30, de Kossodo et de Paul VI). Dans le cadre d’un partenariat solide, ces

structures œuvrent à la promotion du développement de la santé au Burkina Faso et en

Afrique par la formation de jeunes médecins, pharmaciens et biologistes.

Centre Régional de Transfusion Sanguine de Ouagadougou

Le centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou (CRTS-O) a pour objectif général

la couverture adéquate des besoins régionaux en produits sanguins dans le respect de la

sécurité du donneur et du receveur.

C’est l’un des centres chargés de la collecte du sang, la qualification, la préparation des

produits sanguins, la conservation et la distribution aux formations sanitaires (publiques

comme privées) habilitées à pratiquer la transfusion sanguine.

Association SOS hépatite Burkina

« SOS hépatites Burkina » est une association créée en 2011 par des professionnels de santé.

Elle a fait de la lutte contre les hépatites virales au Burkina Faso un sacerdoce. Elle mène des

campagnes de sensibilisation, tient des conférences afin que les populations voient, entendent,


parlent et agissent contre les Hépatites. Depuis sa création elle commémore avec succès le 28

juillet de chaque année, la journée mondiale de lutte contre l’hépatite. Elle organise à cette

occasion des campagnes de dépistage et de vaccination à moindre coût ou entièrement

gratuites au profit des populations. Elle est membre de l’Alliance Mondiale des Hépatites

(www.worldhepatitisalliance.org).

2. Méthodologie de la première étude

2.1. Type et populations d’étude

Il s’est agi d’une étude transversale réalisée entre le 25 Juillet 2013 et le 29 Juillet 2016. Elle a

concerné la population générale de la ville de Ouagadougou et des localités environnantes.

Cette étude a été réalisée durant deux campagnes. Elle a été effectuée en collaboration avec

l’Association "SOS Hépatites Burkina" pendant les campagnes de sensibilisations et de

dépistages de la journée mondiale de lutte contre les hépatites. Les campagnes ont eu lieu

dans plusieurs localités de Ouagadougou (tous les arrondissements) et environnants [Les

communes rurales de Tanghin-Dassouri, de Komsilga et de Koubri ; mais aussi la commune

rurale de Ziniaré (Loumbila)]. La sensibilisation à travers les médias (Radio, Télévision), des

spots publicitaires, des dépliants et des conférences a précédé le dépistage. Elle a porté sur les

modes de transmissions et les groupes à risques, les symptômes, les complications et les

moyens de préventions contre les hépatites B et C. La participation était libre et volontaire, et

les participants répondaient à un questionnaire sur l’âge, le sexe, les statuts matrimoniale et

sérologique du VIH, l’utilisation de drogues intraveineuses, le casier judiciaire, l’histoire

clinique, la profession et le statut vaccinal contre l’hépatite B (Annexe I). Les parents

biologiques ou à défaut, les tuteurs ont donné leur consentement libre et éclairé pour la

participation des mineurs.

La première campagne s’est déroulée du 25 juillet au 27 juillet 2013. Au total 995

personnes ont été enrôlées.

La deuxième campagne s’est déroulée du 10 au 29 Juillet 2016. Au total 2 207

personnes ont été enrôlées.

Nous notons qu’en absence d’échantillonnage à travers tout le pays, les professions et les

genres ne peuvent pas inférer la population générale du pays. Aussi, l’échantillonnage n’étant

pas aléatoire mais sur base de volontariat, les prévalences observées doivent être considérées

avec prudence.


2.2. Echantillonnage

L’échantillonnage a été précédé par des conseils individuels. Le consentement libre et éclairé

des participants a été indispensable à la participation aux deux campagnes de cette études. Les

échantillons de sang veineux (4mL) prélevés chez les participants ont été centrifugés et les

plasmas ont été conservés à - 20° C jusqu’à l’usage.

2.3. Tests sérologiques de diagnostic rapide (TDR)

Ces tests se basent sur le principe de l’immuno-chromatographie sur membrane. Le sérum, le

plasma ou le sang total déposé sur le support va, soit migrer par capillarité en entraînant avec

lui des réactifs déjà présents sur le TDR, soit rencontrer les antigènes préalablement déposés

sur la membrane. Lorsque les anticorps recherchés sont présents, ils réagissent avec les

antigènes fixés sur la membrane pour donner une coloration visible à l’œil nu. La recherche

des anticorps dirigés contre le VHB a consisté à déposer une goutte de sang total dans la zone

de dépôt de la bandelette test puis à lire les résultats au plus tard 15 minutes après le début de

la migration. La présence des anticorps se traduit par l’apparition de deux traits distincts

rouges : un trait dans la zone de contrôle C et un autre trait dans la zone de test T.

L’intensité de la coloration dans la zone de test varie en fonction de la concentration

d’anticorps dans l’échantillon testé. Par conséquent un test avec une faible coloration est

considéré positif. L’absence d’anticorps est signifiée par l’apparition d’un seul trait rouge

dans la zone de contrôle C et aucun trait dans la zone de test T. Les résultats sont invalides si

le trait du contrôle n’apparait pas. Cela peut être dû à l’insuffisance de la quantité de sang

déposé ou au non-respect des procédures d’utilisation du test. Le Kit Hepatitis B Virus Rapid

Test Device « Abon Biopharm Guangzhou, Co., Ltd Chine ; Sensibilité : ˃ 99,0%, spécificité

: 96,8%, Précision : 98,3% » a été utilisé pour le diagnostic rapide de l’AgHBs sur les sites de

l’étude. Au laboratoire, la recherche des marqueurs du VHB a été réalisée en utilisant le Kit

HBV One Step Hepatitis B Virus Combo Test « Abon Biopharm Guangzhou, Co., Ltd Chine ;

Sensibilité : ˃ 99,0%, spécificité : 97,5%, précision : 97,8% ». Le kit HCV Hepatitis C Virus

Rapid Test Device « Abon Biopharm Guangzhou, Co., Ltd Chine ; Sensibilité : ˃ 99,0%,

spécificité : 96,8%, précision : 98,3% » a été utilisé pour déterminer l’anticorps du VHC chez

les personnes positives à l’AgHBs. Les résultats ont été remis aux participants au cours d’un

counseling individuel post-test. La vaccination a été proposée à ceux qui n’étaient pas infectés

par le VHB.


2.4 Limites de l’étude

En raison d'une ressource financière limitée et de l’absence de subvention du vaccin, la

deuxième campagne de cette étude n’a pas pu réaliser le dépistage du VHC chez tous les

participants et les deux campagnes de l’étude n’ont pas pu vacciner toutes les personnes

négatives à l’AgHBs. Néanmoins, les personnes vaccinées ont reçu la première dose du

vaccin anti-VHB après le dépistage, puis la deuxième et troisième dose respectivement à un et

six mois après la première.

3. Méthodologie de la deuxième étude

3.1. Type et population d’étude

Il s’est agi d’une étude descriptive de type cas-témoins qui s’est déroulée du 28 Juillet au 20

Décembre 2014. La population d’étude était constituée de 424 personnes dont 150 séropositifs

au VIH-1 et 274 séronégatifs âgés de 2 à 79 ans chez lesquels une collecte d’échantillons

biologiques a été effectuée aux laboratoires de LABIOGENE, du CERBA et de l’hôpital Saint

Camille de Ouagadougou.


Quatre millilitres de sang veineux ont été prélevés sur tube EDTA et centrifugés à 5000 rpm

pendant 5 minutes. Le plasma et le culot globulaire ont été conservés à - 20° C jusqu’à

l’usage.

3.3. Tests sérologiques de diagnostic rapide (TDR) : Identique à la première étude

3.4. Diagnostic de la coïnfection au VIH-1/VH B par PCR en temps réel

Les plasmas ont été testés pour les infections à VHB, et VIH-1 en utilisant le kit

HCV/HBV/HIV Real Time PCR (Sacace Biotechnologies, Italy). La charge virale du VHB a

été déterminée en utilisant le Genesig HBV Real Time Quantitative kit.

3.4.1. Extraction d’ADN et d’ARN

Elle a été réalisée en utilisant le kit Genomic Column DNA Express (Sacace Biotechnologies,

Como Italy) selon le protocole du fabricant (Annexe II). Le protocole utilise une méthode

d’extraction sur colonne basée sur un principe de rétention des molécules d’acide nucléique


sur une membrane silicatée contenue dans une colonne. Les cellules sont d’abord lysées par

une solution contenant des ions chaotropiques en présence de la protéinase K. Les conditions

appropriées pour rattacher l’acide nucléique à la membrane silicatée sont assurées par

l’éthanol. Après une étape de lavage qui débarrasse l’échantillon des contaminants, l’acide

nucléique est récupéré par élution dans une solution légèrement alcaline. Le produit (l’acide

nucléique) pur peut donc être directement amplifié.

3.4.2. Amplification

Elle a été réalisée à l’aide de l’appareil 7500 Fast real Time PCR (Applied Biosystems, CA,

USA) par PCR multiplex en temps réel en utilisant le kit HCV/HBV/HIV Real-TM PCR

(Sacace Biotechnologies, Como, Italy) selon les indications du fabricant. Le volume

réactionnel de la PCR était de 25 µL contenant du RT-PCR-mix-1-TM, RT-PCR-mix-2-TM,

de la Taq Polymérase, du M-MLV Revertase, du RT-G-mix-2 et 15 µL d’extrait

d’ADN/ARN.

Le mélange a été amplifié selon le programme composé d’un cycle à 50° C pendant 20

minutes pour la transcription reverse ; un cycle à 95° C pendant 15 minutes pour l’activation

de la Taq polymérase, suivit de 47 cycles comprenant une étape de dénaturation à 95° C

pendant 15 secondes, une hybridation à 60° C pendant 40 secondes et une élongation à 45° C

pendant 40 secondes.

3.5. Caractérisation des génotypes du VHB

L’ADN du VHB a été amplifié par PCR multiplex en utilisant la méthode décrite par Chen et

al. (Chen et al., 2007) avec quelques modifications. L’amplification a été réalisée avec le

Gene Amp® 9700 PCR System (Applied Biosystems, USA), en utilisant deux mix avec 3

paires d’amorces chacun (ABC ; et DEF), dans un volume total de 20 µL contenant la Taq

ADN polymérase 2,5 U, le MgCl2 2 mM, les dNTPs 0,2 mM, le Buffer 1X, les amorces

(Tableau I) sens et anti-sens 0,4 µL, l’eau stérilisée et 5µL d’acides nucléiques précédemment

extrait. Le thermocycleur était programmé pour l’activation de l’ADN polymérase à 95° C

pendant 15 minutes suivi de 35 cycles composés de 94° C pendant 1mn, 58° C pendant

1minute et 72° C pendant 1minute ; ensuite une étape finale d’élongation à 72° C pendant 10

minutes. Les produits PCR ont été soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose 2 % et

visualisés sous lumière UV 320 nm.


Tableau I : Les paires d’amorces spécifiques à l’amplification des génotypes A-F du VHB

3.6. Charge virale du VHB

3.6.1. Extraction d'ADN

L’ADN génomique a été extrait à partir des plasma en utilisant la technique "Rapid Salting-

Out" (Annexe III) comme décrite par Miller et al en 1988 (Miller et al., 1988). Cette

technique est basée sur l’utilisation du NaCl à la place du phénol-chloroforme habituellement

utilisé dans les méthodes classiques d’extraction de l’ADN. Elle comporte plusieurs étapes

résumées comme suit :

Cinq cent microlitres de plasma ont été mélangé à un tampon de lyse (0,32 mM de sucrose,

5mM de MgCl2, 12mM de Tris-HCl, 1% de Triton X-100 et 5X de PK Buffer) pour lyser les

cellules. Les débris cellulaires sont ensuite éliminés par centrifugation. A la fin de la série de

lavage à l’eau distillée, le culot cellulaire contenant les leucocytes est traité par un mix

contenant le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) et la protéinase K. Le SDS permet l’élimination


ou la séparation des lipides membranaires tandis que la protéinase K entraine l’élimination

des protéines de l’extrait cellulaire. Ces dernières seront par la suite relarguées par

l'intermédiaire de la force ionique du NaCl (5M). La précipitation de l'ADN génomique est

effectuée en utilisant une solution d'éthanol absolu suivie de deux lavages à l’éthanol 70%

frais. Les tubes sont ensuite séchés à bouchon ouvert pour faire évaporé toute l’éthanol et

l’ADN est enfin élué par un tampon d’élution et conservé à -20° C jusqu’aux analyses

moléculaires.


Elle a été réalisée dans un volume de 20 µL contenant 10 µL d’oasigTM 2 X qPCR Master

Mix, 1 µL du VHB Primer/Probe mix et 4 µL d’eau sans nucléases et 5 µL d’ADN. La

quantité de la charge virale des échantillons est relative à la droite standard que l’on obtient en

diluant le témoin positif (fourni) au dixième (1/10) cinq fois en cascade (Tableau II).

L’appareil 7500 Fast Real time PCR a été utilisé selon le programme suivant : Une étape à

95°C pendant 10 minutes suivit de 50 Cycles de 95 °C pendant 10 secondes et 60°C pendant 1

minute.

Tableau II : Dilution des standards de la charge virale du VHB

Droites des Standards Nombres de copies

Tube 1 : Témoin positif 2x107

Tube 2 2x 106

Tube 3 2x105

Tube 4 2x104

Tube 5 2x103

Tube 6 2x102

3.7. Caractérisation moléculaire des rs8177832, rs35228531 et rs6001417 d’APOBEC3G

La sélection des SNPs d’APOBEC3G concernait les variants les plus importantes décrites par

Reddy et al, 2010 à savoir les rs8177832, rs35228531 et rs6001417. Le chromosome, les

changements d'acides aminés, et la fonction du marqueur relatifs à ces SNPs sont décrits dans

le tableau III. Ces SNPs ont été identifiés dans une étude précédente en utilisant la version 4.0

du logiciel SNP Browser (Applied Biosystems). Les trois marqueurs d’APOBEC3G étudiés


ont été caractérisés en utilisant la méthode standards TaqMan SNP assay (ABI, Foster City,

CA) réalisé sur le 7500 Fast Real-Time PCR Systems (Life Technologies, California, USA).

Tous les échantillons ont été caractérisés pour les rs8177832, rs6001417 et rs35228531 ayant

respectivement les génotypes AA (avec une mutation d’A→G), CC (C→G) et CC (C→T).

Tableau III: Caractéristiques des différents marqueurs d’APOBEC3G

Gène SNP rs# Position Allèles

Allèle

Référence Fonction

A3G, Chr

22

rs6001417 37807323 C/G C Intron

rs8177832

(H186R) 37807511 A/G A

Région

codante Exon

4

rs35228531 37813790 C/T C

Extragénique,

près de la

Région 3’


Les ADN utilisés ont été extraits à partir de culots globulaires selon la méthode du salting-out

décrite précédemment (Miller et al., 1988).

La PCR en temps réel a été réalisée dans un volume réactionnel total de 25 µL comprenant 5

µL d’ADN (4ng/µL), 12,5 µL de TaqMan Universal PCR Master Mix (2X), 6,25 µL d’eau

stérile et 1,25 µL de SNP mix (40X). Les rs8177832, rs6001417, et rs35228531

d’APOBEC3G ont été génotypés selon la technique de discrimination allélique à l’aide des

sondes TaqMan (Applied Biosystem, Foster City, California, USA)

Programme d’amplification sur le 7500 Fast Real-Time PCR System :

95° C pendant 10 minutes

92° C pendant 15 secondes

60° C pendant 1 minute

x 40 cycles

1 cycle


4. Méthodologie de la troisième étude


Il s’est agi d’une étude transversale avec une collecte rétrospective des données visant à

rechercher les génotypes circulants du VHB. L’étude s’est déroulée d’Août 2013 à Juillet

2015. La population de cette seconde étude était composée des donneurs de sang de premier

don positifs à l’AgHBs, âgée d’au moins 17 ans, de toutes professions et catégories sociales

confondues. La collecte de sang a d’abord concerné tous les types de donneurs rencontrés au

CRTS-O (donneurs réguliers et donneurs de premier don, bénévoles recrutés sur place ou

provenant des équipes mobiles de collecte). Environ 2 200 donneurs de sang (soit 91% de

donneurs de premier don) âgés de 17 - 65 ans ont été sélectionnés après avoir adhérer

librement à l’étude. Ils ont tous été soumis à un questionnaire visant à 'exclure les

bénéficiaires d’une transfusion précédente, les personnes ayant un ictère ou des signes de

l'hépatite, les femmes enceintes connues, les personnes ayant connu un comportement sexuel

à risque ou subies une chirurgie invasive dans les six mois précédant le don (Annexe IV).

Critères d’inclusion à l’étude

Tous les donneurs de sang de premier don positifs à l’AgHBs ont été inclus dans cette étude.

Critères de non inclusion

Les donneurs séronégatifs à l’AgHBs n’ont pas été inclus dans cette étude.


Les échantillons de sangs (4mL) ont été prélevés dans le laboratoire du CRTS-O dans des

tubes imprégnés d’EDTA sur les poches positives à l’AgHBs. Après centrifugation à 4 000g

pendant 5 mn, les sera ont été collectés dans des tubes Eppendorf et conservés à -20°C

jusqu’à l’usage.

4.3. Sérologie de l’AgHBs

L’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs), les anticorps dirigés contre le VIH ont été

détectés en utilisant respectivement les tests suivants :

Dosage sur ARCHITECT i 1000 SR®

TM

Les dépistages de l’hépatite B et du VIH ont été réalisés par la technique d’ELISA

automatisée de quatrième génération sur ARCHITECT i 1000SR®TM (Figure 16) en suivant


Figure 16: ARCHITECT i 1000 SR®TM

les instructions du fabricant. Il s’est agi d’un dosage immunologique en deux étapes utilisant

la technique du dosage immunologique des microparticules par chimiluminescence (CMIA)

pour la détection qualitative de l’AgHBs et des anticorps anti-VIH dans le sérum et le plasma.

Dans un premier temps, l'échantillon, les microparticules magnétiques et les réactifs de

dosage sont mis en présence. La réaction chimiluminescente qui en résulte est mesurée en

unités relatives de lumière (URL). Il existe une relation directe entre la quantité d’AgHBs

présente dans l'échantillon et le nombre d'URL détectées par le système optique de l’automate

ARCHITECT i 1000 SR®TM.

Test Hepanostika HBsAg Ultra (Biomérieux, Boxtel, Pays-Bas)

Le kit ELISA Hepanostika HBsAg Ultra, est un test immunoenzymatique basé sur le principe

de « sandwich » en une étape utilisant trois anticorps monoclonaux sélectionnés pour leur

capacité à se lier aux différents sous-types de l’AgHBs actuellement reconnu par l’OMS. La

phase solide est constituée de 12 barrettes de 8 cupules en polystyrène sensibilisées avec le

premier anticorps monoclonal anti-HBs (murin, IgG2b). Les deux autres anticorps

monoclonaux sont couplés à la peroxydase.


Après les tests, les échantillons dont la densité optique était inférieure à la valeur seuil étaient

considérés négatifs. Toutefois, les résultats situés juste au-dessous de la valeur seuil (VS-

10%) ont été interprétés avec prudence (Echantillons indéterminés). Les échantillons dont la

densité optique (DO) était supérieure ou égale à la valeur seuil étaient considérés comme

initialement positifs et ont été ré-testés en double avant l’interprétation finale.

Valeur seuil = Moyenne des DO des 4 contrôles négatifs (R3) + 0,040

4.4. Extraction et purification de l’ADN du VHB

L’extraction et la purification de l’ADN ont été faites à l’aide du Kit « QIAamp DNA Blood

Mini kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) » en suivant le protocole fourni par le fabriquant

(Annexe V).

C’est une extraction sur colonne. Deux cent microlitres de sérum ont été mélangés dans un

tube contenant une solution de lyse et de la Protéinase K pour lyser les cellules. L’ADN a été

précipité avec de l'éthanol absolu. Le mélange a ensuite été transféré dans la colonne. Les

débris cellulaires ont ensuite été éliminés par centrifugation. Une série de deux lavages a été

effectuée pour éliminer les restes des débris cellulaires et de l’éthanol. L’ADN a ensuite été

élué de la colonne avec 200µl de tampon d’élution et conservé à -20°C jusqu’aux analyses

moléculaires.

L'ADN purifié a été expédié en deux lots séparés au centre de transfusion de Cambridge,

Royaume-Uni en 2013 (45 échantillons) et aux INTS de Paris, France (228 échantillons) en

2014 pour les investigations moléculaires.

4.5. Amplification et séquençage de l'ADN du VHB

4.5.1. Amplification de l’ADN

PCR qualitative

Mode opératoire

La PCR a été réalisée avec l’appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems,

USA) (Figure 17), dans un volume réactionnel de 50 µl qui contenait 0,5 µl de Taq ADN

polymérase 2,5 U/µl (Applied Biosystems, USA), 5 µl de Buffer 1X, 0,75 µl d’amorces sens

et anti-sens (Tableau IV), 2 µl de MgCl2 2 mM, 5 µl de dNTP 0,2 mM, 31 µl d’eau stérile et 5

µl d’ADN.


Tableau IV : La paire d’amorces utilisée

Séquençage Séquences d’ADN (5’→3’) Positions Taille (pb)

P1 - S TTTGCGGGTCACCATATTCTTGG 2815– 2837

P1 - AS CGAACCACTGAACAAATGGCACTAG

pb : paire de base.

Programme d’amplification

1- 95°C pendant 15 minutes

94°C pendant 60 secondes

2- 58°C pendant 60 secondes 35 Cycles


3- 72°C pendant 10 minutes.

Les produits PCR ont été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose 2 % et visualisés

sous lumière UV à 312 nm puis photographié grâce à l’appareil « GENE FLASH ».

Interprétation des résultats

Elle a été faite sur la base de la taille du fragment d’ADN (bande) sur le gel d’agarose 2 %

après électrophorèse des produits PCR.


Figure 17: Thermocycleur GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)

PCR nichée

La région pré-S/S du génome du VHB a été amplifié en utilisant une PCR nichée comme

décrit ci-dessous.

Mode opératoire de la PCR nichée

La PCR nichée a été utilisée pour amplifier un fragment de 1434 pb comprenant le gène prés-

S/S entier. Les amorces PSS2 (59-ACATACTCTTTGGAAGGCKG-39, positions 2761-

2781) et PSS8 (59-CGTCAGCAAACACTTGGC-39, positions 1194-1177) ont été utilisées

dans la première PCR ; et les amorces PSS9 (59-GCCTCATTTTGYGGGTCA-39, positions

2814-2831), PSS5 (59-AGCAAARCCCAAAAGACC-39, positions 1022-1005) à la

deuxième PCR. Les deux PCR conventionnelles ont été réalisées dans un volume réactionnel

de 50µL contenant 2,25 mM de MgCl2, 0,2 mM de chaque dNTP, 1 M de chaque amorce, 1X

de PCR buffer II, 1 U AmpliTaq (Applied Biosystems, Warrington, Royaume-Uni) et10 µL

de l'ADN. Les amplifications ont été réalisées avec l’appareil GeneAmp PCR System 9700

(Applied Biosystems, USA) selon le programme ci-dessous.

Programme d’amplification de la PCR Nichée


1- 48°C pendant 30 secondes 35 Cycles



4.5.2. Le clonage des produits PCR et séquençage

Les amplicons du Pré-S/S obtenus ont été clonés avec le kit de clonage TOPO®TA

(Invitrogen Ltd, Paisley, Royaume-Uni) selon les instructions du fabricant (Annexe VI). Pour

chaque échantillon a étudié, l'ADN plasmidique a été purifié à partir de 10 clones avec le kit

QIAprep spin miniprep (Qiagen) et séquencé.

4.6. L'analyse phylogénétique

L’alignement multiple des séquences a été réalisé avec le logiciel Clustal X sur des séquences

complètes des génotypes (A-H) du VHB disponibles dans GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html) et sur demande. Le modèle Kimura à deux

paramètres a été utilisé pour l'estimation de la distance génétique et les comparaisons de

distances appariées en ignorant toutes les positions avec des lacunes. L’arbre phylogénétique

a été construit en utilisant les méthodes neighbor-joining et le maximum de vraisemblance a

été mise en œuvre avec le logiciel MEGA version 5.1. Pour confirmer la fiabilité des arbres

phylogénétiques, une reconstruction bootstrap a été réalisée avec 1000 réplications et les

valeurs de bootstrap > 70% ont été considérées comme importantes. Des séquences de

recombinaisons possibles ont été testées avec le logiciel SIMPLOT version 3.5.1. Les tailles

de fenêtres de 200 nucléotides et les étapes de 20 nucléotides ont été utilisées.

5. Méthodologie de la quatrième étude


Il s’est agi d’une étude transversale qui s’est déroulée d’Octobre 2014 à Décembre 2016.

La population de cette quatrième étude était composée des sujets séronégatifs à l’AgHBs sans

distinction d’âge ni de catégorie sociale, qui ont librement adhéré à cette étude. Les

participants ont ensuite répondu à un questionnaire sur les caractéristiques

sociodémographiques.

Critères d’inclusion à l’étude

Tous les participants séronégatifs à l’AgHBs et non vaccinés contre l’hépatite B ont été

inclus dans cette étude.

Critères de non inclusion

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html


Les participants séropositifs à l’AgHBs et vaccinés contre l’hépatite B n’ont pas été inclus

dans cette étude.


Quatre millilitres de sang veineux ont été prélevés chez 219 sujets ayant volontairement

adhérés à l’étude. Après centrifugation à 4 000 g pendant 5mn, les plasmas ont été conservés

à - 20° C jusqu’a l’usage.

5.3. Test sérologique des marqueurs du VHB

Les diagnostics des marqueurs du virus de l’hépatite B ont été réalisés par la technique

d’ELISA automatisée sur Cobas e 411 Analyzer (Roche Diagnostics GmbH Mannheim

Germany) (Figure 18). Il utilise un test immunologique par électrochimiluminescence

(ECLIA) pour le dosage qualitatif d’un anticorps ou antigène dirigé respectivement contre un

antigène ou anticorps du VHB dans le sérum et le plasma humains. Les marqueurs du VHB

(AgHBs, anti-HBs, anti-HBc, AgHBe, Anti-HBe) ont été déterminés chez les patients

séronégatifs à l’AgHBs.

Principe

Une quantité de 40 μL de plasma de patient est incubée avec un agent réducteur afin de faire

passer le système de réaction dans un état redox défini. Il est ajouté une quantité d’antigène ou

d’anticorps recombinant pour former un complexe immun avec les anticorps ou l’antigène de

l'échantillon. Des anticorps ou antigène murins monoclonaux biotinylés et ruthénylés ainsi

que des microparticules paramagnétiques recouvertes de streptavidine sont ajoutés. Il se

forme un complexe immunitaire avec le ruthénium et la biotine. La biotine est liée aux

microparticules. Le mélange de réactifs est transféré dans la cellule de mesure où les

microparticules sont immobilisées par magnétisme à la surface de l’électrode. Les substances

libres sont ensuite évacuées. Une différence de potentiel appliquée à l’électrode déclenche la

production de luminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur. Le signal résultant

d’une hausse du titre de l’anticorps ou de l’antigène présente des propriétés hyperboliques. Le

logiciel détermine automatiquement les résultats en comparant le signal électro-

chimiluminescent généré par la réaction avec la valeur seuil ayant été obtenue lors de la

calibration.


Figure 18: Cobas e 411 Analyzer (Roche Diagnostics GmbH Mannheim Germany)

5.4. Extraction et purification de l’ADN du VHB

L’extraction et la purification de l’ADN ont été faites à l’aide des Kits QIAamp DNA Blood

Mini Kit (Qiagen, Hilden, Allemagne) et QIAamp MinElute (QIAGEN GmbH, Hilden,

Allemagne) en suivant le protocole fourni par le fabriquant. C’est une extraction sur colonne.

Deux cent microlitres de sérum ont été mélangés dans un tube contenant une solution de lyse

et de la Protéinase K pour lyser les cellules. L’ADN a été précipité avec de l'éthanol absolu.

Le mélange a ensuite été transféré dans la colonne. Les débris cellulaires ont ensuite été

éliminés par centrifugation. Une série de deux lavages a été effectuée pour éliminer les restes

des débris cellulaires et de l’éthanol. L’ADN a ensuite été élué de la colonne avec 200µl de

tampon d’élution et conservé à -20°C jusqu’aux analyses moléculaires.

5.5. Quantification de l’ADN du VHB

La quantification de l'ADN du VHB a été réalisée par PCR quantitative en temps réel à l’aide

de l’appareil 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) (Figure 19).

L'ADN plasmide du VHB a été utilisé pour générer une courbe standard après une dilution en


série au dixième. Nos analyses quantitatives de PCR spécifiques au VHB ont été

systématiquement standardisées en utilisant la norme OMS (code NIBSC : 97/750).

Figure 19: Appareil 7500 Fast Real Time PCR system (Applied Biosystems, USA)

5.6. Amplification et le séquençage de l'ADN du VHB

5.6.1. Amplification de l'ADN du VHB

La région pré-S/S du génome du VHB a été amplifiée en utilisant une PCR nichée et

directement séquencée (Chen et al., 2007).

Mode opératoire de la PCR nichée

Les amorces 5’-AAAATTAATTATCCTGCTAGG-3’ (nt 2627-2648) et 5’-

GAGAAGTCCACCACGAGTC-3’ (nt 269-251) ont été utilisées dans la première PCR ; et

les amorces 5’-TTTACAACTCTGTGGAAGGC-3’ (nt 2747-2767) et 5’-

GAGTCTAGACTCTGTGGTATTGTG-3’ (nt 232-255) à la seconde PCR. Les deux PCR ont

été réalisée dans un volume réactionnel de 50 µL contenant 5 µL d'ADN, du tampon PCR

10X (20mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mMKCl; Qiagen), de dNTP mM, 50 ng de chaque amorce

et 1U AmpliTaq or DNA polymerase (Applied Biosystems). Les amplifications ont été

réalisées avec l’appareil GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA) (Figure

17) selon le programme ci-dessous.

Programme d’amplification de la PCR Nichée

1- 95°C pendant 2 minutes



2- 50°C pendant 50 secondes 30Cycles

72°C pendant 2 minutes

3- 72°C pendant 7 minutes.

5.6.2. Séquençage des produits PCR

Les produits PCR ont ensuite été purifiés en l’utilisant le GFX PCR purification kit

(Healthcare, Buckinghamshire, UK) selon les instructions du fabricant. Le séquençage a été

réalisé en utilisant le kit « BD Terminator cycle Sequencing kit » et analysé sur ABI PRISM

Genetic analyzer 3130XL (Applied Biosystems, CA) selon les instructions du fabricant.

5.7. L'analyse phylogénétique

Les séquences ont été analysées en utilisant BioEdit 7.2.6. L'alignement multiple de

séquences a été réalisé avec le logiciel Clustal W sur des séquences complètes des génotypes

A-H du VHB et des séquences spécifiques au Burkina Faso de notre deuxième étude, toutes

disponibles dans GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html). L’arbre

phylogénétique a été construit en utilisant la méthode neighbor-joining. Le maximum de

vraisemblance a été mise en œuvre avec le logiciel MEGA version 5.1.

6. Analyses statistiques

Les données ont été analysées à l’aide du logiciel SPSS (Statistical Package for Social

Sciences) version 21.0 et Epi Info version 6. Le test de Chi carré a été utilisé pour les

comparaisons. La différence a été considérée statistiquement significative pour p < 0, 05. Les

odds ratio (OR) et les intervalles de confiance (IC) à 95% ont été calculés en utilisant la

version 3.5 d’Epi Info, pour estimer les associations de l’infection au VIH-1 avec les

polymorphismes rs8177832 (H186R), rs35228531 et rs6001417 d’APOBEC3G. La régression

logistique a été réalisée sur tous les SNPs et allèles statistiquement significatifs ou un test de

génotype, additif associant, les modèles dominants et récessifs avec l’allèle mineur comme

l'allèle à risque.

Le déséquilibre de liaison (LD) a été caractérisée et les fréquences ont été calculées. La

fréquence des haplotypes a été déterminée en utilisant les logiciels statistiques Power-Marker

(Liu and Muse, 2005) et Haploview (Gabriel et al., 2002). Les valeurs de D 'et r2 ont été

calculées en utilisant Haploview (Gabriel et al., 2002). Power Marker et Haploview utilisent


tous les deux un algorithme (EM) pour déterminer les distributions de fréquences des

haplotypes en cas de phase inconnue. Seuls les haplotypes avec une fréquence minimale de

5% ont été pris en compte dans l'analyse. L’odd ratio et l’intervalle de confiance à 95 % ont

été utilisés pour l'analyse des haplotypes pour estimer le risque d’infection par le VIH-1. Le

logiciel GRAPHPAD a été utilisé pour les analyses des travaux sur l’expression. Les

différences entre les groupes comparés ont été évaluées à l’aide du test de Mann-Whitney U

pour les analyses non-paramétriques.

7. Considérations éthiques

Cette étude a obtenu l’approbation du Comité d’Ethique pour la Recherche en Santé du

Burkina Faso (CERS) (Délibération numéro 2014-7-086) et du comité d’éthique institutionnel

du CERBA/LABIOGENE (Délibération N° 2014/III-14/0135). Tous les participants ont

donné leur consentement libre et éclairé. Le respect de la confidentialité et de l’anonymat par

rapport aux informations fournies était de mise.

RESULTATS


CHAPITRE III : RESULTATS

I. Résultats des travaux de la première étude

1. Première campagne

Séro- épidémiologie de l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou.

1.1. Contexte et but de la première campagne

Le virus de l'hépatite B est responsable d’une hépatite chronique, la cirrhose et le cancer du

foie. Il est facilement transmissible par voie sexuelle, parentérale ou verticale. En plus la

coïnfection VHB/VHC est un facteur de risque important au développement de ces

pathologies. Au Burkina Faso, certaines études ont rapporté des prévalences des hépatites B et

C chez les femmes enceintes, les donneurs de sang et les personnels de santé. Peu d’études se

sont intéressées à la prévalence de ces hépatites dans la population générale. L’objectif de

cette campagne était d’évaluer la prévalence de ces deux virus dans la population générale de

Ouagadougou.

1.2. Caractéristiques sociodémographiques de la population

Au total, neuf cent quatre-vingt-quinze (995) participants dont 409 (41,10 %) hommes et 586

(58,89 %) femmes ont adhéré à cette campagne. L’âge des participants était compris entre 8 et

75 ans avec une moyenne de 41,5 ± 12,6. Suivant le statut matrimonial, 53,80 % (535/995)

étaient célibataires, 439 (44,10 %) étaient mariés, et le reste était soit veuf ou divorcé. Selon

l’activité, la majorité était des fonctionnaires, suivis des travailleurs du secteur informel, des

étudiants et des élèves (Tableau V).


Tableau V: Caractéristiques sociodémographiques de la population

Caractéristiques Nombre Pourcentage (%)

Genre

Hommes 409 41,1

Femmes 586 58,9

Groupe d’âge (ans)

< 20 155 15,57

21-30 358 35,97

31-40 251 25,22

41-50 133 13,36

˃ 50 98 09,88

Activité

Fonctionnaires 246 24,70

Secteur informel 201 20,20

Etudiants 189 19,00

Elèves 170 17,10

Femme au foyer 129 13,00

Commerçants 60 06,00

Situation matrimoniale

Célibataires 535 53,8

Mariés 439 44,1

Veufs 14 01,4

Divorcés 07 0,7

1.3. L’infection par le VHB en fonction du genre et des classes d’âge

La prévalence du VHB était plus élevée chez les hommes (18,58 %) que chez les femmes

(11,60 %) avec une différence statistiquement significative (p = 0,002) (Tableau VI). La

prévalence du VHB était pratiquement élevée dans toutes les tranches d’âge avec un pic de

16,33 % dans celle de 31 à 40 ans (Tableau VI).


Tableau VI: Infection par le VHB en fonction du genre et des classes d’âge

Genre Classes d’âge

Homme Femme < 20 21-30 31-40 41-50 ≥ 50

Total 409 586 155 358 251 133 98

VHB (+) 76 68 19 57 41 15 12

% 18,58 11,60 12,25 15,92 16,33 11,27 12,24

OR (95%) 1,7(1,2-2,4) 1 - - - - -

Valeur P 0,002 -

1.4. L’infection par le VHB en fonction de la profession et du statut matrimonial de la

population d’étude

L’infection par le VHB était plus élevée chez les élèves (19,57 %) suivi des travailleurs du

secteur informel (15,98 %) (Tableau VII). Environ 15,52 % des personnes mariées étaient

porteuses du VHB contre 14,95 % des célibataires.

Tableau VII : L’infection par le VHB en fonction de la profession et du statut matrimonial de

la population d’étude

Activité Statut matrimonial

Fonc. S.I Etud.(sup) Elèves F foyer. Com. Céliba Mariés Veufs Div.

Total 211 169 155 152 112 52 535 439 14 7

HBV (+) 35 32 15 37 17 8 80 59 4 1

% 14,22 15,98 8,82 19,57 13,17 13,33 14,95 15,52 28,57 14,28

OR (95%) - - - - - - - - - -

P 0,10 0,43

Fonc : fonctionnaire ; S. I. : Secteur informel ; Etud.(sup) : Etudiants(université) ; F foyer : Femme

au foyer ; Com : commerçants ; Céliba. : célibataires ; Div : divorcés


1.5. Pratiques socioculturelles et infection par le VHB à travers la population

Environ soixante-neuf pour cent (68,73 %) de la population d’étude était circoncise ou a déjà

eu recours au piercing, au tatouage, ou la scarification. Presque 35,60 % des participants ont

affirmé avoir eu des rapports sexuels non protégés. De façon générale les pratiques culturelles

apparaissent comme un facteur de risque associé à l’infection par le VHB mais les différences

ne sont pas statistiquement significatives (Tableau VIII). Cependant, la prévalence du VHB

était plus élevée chez les personnes circoncises (16,18 %) par rapport aux personnes non

circoncises (11,22 %) avec une différence statistiquement significative (p = 0,04).

Tableau VIII: Pratiques socioculturelles et infection par le VHB dans la population d’étude.

Pratiques culturelles Prison

Examen transcutané

ou acupuncture

Excision, circoncision et

tatouage

Rapports sexuels

non protégés

Oui Non Circoncisi

on et

MGF

Piercing,

scarification et

tatouage

Oui Non Oui Non

Total 37 958 649 34 354 641 04 991

VHB (+) 03 141 105 04 54 90 0,00 144

% 8,10 14,71 32,28 11,76 15,25 14,04 14,53

OR 1 1,5 - 1,1 1

95% IC 0,1-1,6 0,7-1,5 -

P 0,34 - 0,63 -

1.6. Les antécédents médicaux et infection par le VHB dans la population

De façon générale, les antécédents médicaux étaient importants dans notre population d’étude.

Nous n’avons pas noté de différence significative entre l’association de ces antécédents et

l’infection par le VHB (Tableau IX). Dans cette étude, seulement 1% de la population était

positive à l’anticorps Anti-VHC.


Tableau IX: Les antécédents médicaux et infection par le VHB dans la population

Transfusé Chirurgie Hospitalisé Mères VHB VIH VHC

Oui Non Oui Non Oui Non Oui Non Oui Non Oui Non

Total 37 958 143 852 135 860 28 967 9 986 10 985

VHB + 6 138 16 128 21 123 6 138 2 142 0 144

% 16,21 14,40 11,18 15,02 15,55 14,30 21,42 14,27 22,22 14,4 0,00 14,21

OR 1,15 1 1 0,7 1,1 1 1,6 1 1,6 1

95% IC 0,4-2,8 0,4 –1,2 0,6 –1,8 0,1 –1,6 0,3 – 8,2

P 0,81 0,25 0,69 0,27 0,62 -

1.7. Conclusion partielle

Cette première campagne rapporte une forte prévalence du virus de l’hépatite B (14,5%) et

confirme l’endémicité de cette infection au Burkina Faso. La réduction du coût du vaccin

permettra de réduire l’expansion du VHB dans notre pays.

2. Deuxième campagne

Sensibilisation sur les hépatites B et C à Ouagadougou et nécessité de vaccination contre

l’hépatite B.

2.1. Contexte et but de la deuxième campagne

Le Burkina Faso (BF) est un pays à forte endémicité du VHB. La première campagne a

rapporté une prévalence de 14,5% du VHB dans la population générale ; et elle variait entre

13% et 19% chez les donneurs de sang. Aussi, malgré la disponibilité d’un vaccin efficace, la

population reste sous informée sur les risques et les conséquences liées à cette infection. En

absence d’une véritable stratégie de contrôle du VHB dans la population, le dépistage des

personnes non encore diagnostiquées constitue un enjeu majeur car la majorité des personnes

infectées ne le savent pas. Au regard de ces informations, nous pensons qu’une meilleure

organisation des campagnes de sensibilisations, de dépistages et de vaccination contre


l’hépatite B permettra de réduire considérablement la prévalence du VHB dans la population

générale. Par conséquent, le but de cette campagne était de sensibiliser, de dépister et de

proposer la vaccination à ceux qui n’ont pas été infectés par le VHB. Elle visait également à

identifier les marqueurs du VHB chez les personnes infectées et de les orienter en gastro-

entérologie.

2.2. Caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude

Un total de 2 207 individus, ayant un âge compris entre 1 et 85 ans, (moyenne d’âge de 31,4

±15,7 ans), dont 1 237 (56,0 %) femmes et 970 (44,0 %) hommes ont participé à cette

campagne. Les tranches d’âge majoritaires étaient de 21 à 30 ans soit 27,7 % (612/2 207)

suivie de celle ≤ 20 ans soit 24,9 % (550/2 207). Suivant l’activité, la majorité était des

élèves/étudiants (40,1 % soit 884/2 207), suivis des fonctionnaires (23,1 % soit 509/2 207) et

des travailleurs du secteur informel (16,0 % soit 353/2 207). En ce qui concerne le statut

matrimonial, 55,6 % (1226/2 207) étaient célibataires, 43,0 % (949/2 207) étaient mariés, et

les autres étaient soit divorcées ou veuves (Tableau X). La participation était essentiellement

urbaine (96,2 %). Sur les 2 207 personnes dépistées, 217 (9,8 %) étaient positives à l’AgHBs

(Tableau X). Les personnes positives à l’AgHBs ont été orientées en gastro-entérologie.

2.3. Analyse multivariée des facteurs associés à l’infection au VHB et statut vaccinal en

fonction des caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude

L’analyse multivariée a montré des associations entre l’infection par le virus de l’hépatite B et

le sexe, l’âge, les statuts matrimonial et vaccinal. Néanmoins, seule la tranche d’âge de 21 à

30 ans et le statut vaccinal étaient statistiquement significatif (p= 0,002 et p= 0,003).

Cependant, elle a aussi montré que le sexe masculin est un facteur de risque de l’infection au

VHB (p=0,003). Par contre la tranche d’âge de < 20 ans et les élève/étudiants n’étaient pas

associés à l’infection au VHB (p= 0,002 et p= 0,02) (Tableau XI). Le taux de vaccination

avant le dépistage était de 6,8 % (150/2 207) dans la population générale dont 7,0 % chez les

femmes et 6,5 % chez les hommes. Ce taux était plus important dans la tranche d’âge de ≤ 20

ans (16,9 %), chez les élèves/étudiants (10,3 %) et les célibataires (8,2 %). La couverture

vaccinale était statistiquement (p= 0,001) plus élevée dans la zone rurale (14.45 %) que la

zone urbaine (6,25 %) (Tableau XI).


Tableau X: Caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude (n= 2207).

Variables Nombre Pourcentage (%) Moyennes d’âges

Sexe

Féminin 1237 56,00 31,50±15,38

Masculin 970 44,00 31,19±16,05

Age (Ans)

≤ 20 550 24,90 12,37±5,53

21-30 612 27,70 25,84±2,87

31-40 464 21,10 35,28±2,83

41-50 298 13,50 45,29±2,90

˃ 50 283 12,80 59,14±6,97

Activité

Commerçants 194 8,80 37,63±11,21

Elèves/Etudiants 884 40,00 17,62±7,97

Fonctionnaires 509 23,10 42,95±12,84

Femme au foyer 267 12,10 42,78±12,87

Secteur informel 353 16,00 37,01±11,29

Statut matrimonial

Célibataires 1226 55,50 21,84±10,76

Divorcés 10 0,50 48,80±10,41

Mariés 949 43,00 43,00±12,35

Veuves 22 1,00 53,23±8,63

Zone

Rurale 83 3,80 35,32±14,62

Urbaine 2124 96,20 31,21±15,70

Sérologie (AgHBs)

Négative 1990 90,20 31,07±15,97

Positive 217 9,80 34,10±12,32

Statut vaccinal avant dépistage

Non vaccinés 2057 93,20 32,12±15,02

Vaccinés 150 6,80 21,08±20,25


Tableau XI: Analyse multivariée des facteurs associés à l’infection au VHB et statut vaccinal en fonction des caractéristiques

sociodémographiques de la population d’étude (N : 2207).

Variables VHB % p Odds ratio Vacciné % p Odds ratio

Positive/Total (95% IC) Oui/total (95% IC)

Sexe F 101/1237 8,16 0,003 0,65 (0,49 - 0,87) 87/1237 7,03 0,756 1,06 (0,73 - 1,53)

M 116/970 11,96

- 63/970 6,49 - -

Age (Ans) ≤ 20 18/550 3,27 0,002 0,36 (0,19 - 0,68) 93/550 16,91 0,001 7,32 (2,64 - 20,33)

21-30 82/612 13,40 0,036 1,67 (1,04 - 2,69) 10/612 1,63 0,056 0,42 (0,17 - 1,02)

31-40 54/464 11,64 0,173 1,42 (0,86 - 2,36) 13/464 2,80 0,030 0,44 (0,21 - 0,92)

41-50 39/298 13,09 0,076 1,63 (0,95 - 2,78) 14/298 4,70 0,216 0,63 (0,31 - 1,31)

˃ 50 24/283 8,48 - - 20/283 7,08 - -

Activité

Commerçants 21/194 10,82 0,452 0,81 (0,47 - 1,40) 9/194 4,64 0,46 1,43 (0,55 - 3,70)

Elèves/Etudiants 76/884 8,60 0,019 0,63 (0,43 - 0,93) 91/884 10,29 0,752 0,86 (0,35 - 2,14)

Fonctionnaires 51/509 10,02 0,170 0,74 (0,49 - 1,14) 26/509 5,11 0,168 1,73 (0,79 - 3,79)

Femme au foyer 23/267 8,64 0,085 0,63 (0,37 - 1,07) 15/267 5,62 0,511 1,34 (0,56 - 3,25)

Secteur informel 46/353 13,03 - - 10/353 2,83 - -

Statut matrimonial

Célibataires 108/1226 8,81 0,492 2,03 (0,27 - 15,23) 100/1226 8,16 0,94 0,92 (0,11 - 8,05)

Divorcés 1/10 10,00 0,564 2,33 (0,13 - 41,55) 0/10 0,00 - -

Mariés 107/949 11,27 0,340 2,67 (0,35 - 20,04) 49/949 5,16 0,619 1,69 (0,22 - 13,25)

Veuves 1/22 4,54 - - 1/22 4,54 - -

Zone Rurale 6/83 7,23 0,419 0,71 (0,30 - 1,64) 12/83 14,45 0,001 3,05 (1,54 - 6,05)

Urbaine 211/2124 9,93 - - 138/2124 6,25 - -

Vaccinés Non 214/1843 10,40 0,003 5,69 (1,80 - 18,00) - - -

Oui 3/147 2,00 - - - - -


2.4. Prévalences des marqueurs du VHB et de l’hépatite C en fonction des

caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude

Sur les 217 personnes dépistées positives à l’AgHBs, 101 (46,5 %) étaient des femmes contre

116 (53,5 %) hommes (Tableau XII). Les prévalences des marqueurs du VHB étaient de 0,9

%, 6,0 %, 87,6 % et 100,0 % respectivement pour l’Ac anti-HBs, AgHBe, Ac anti-HBe et

l’Ac anti-HBc. Ces prévalences étaient majoritairement plus élevées dans la tranche d’âge de

21 à 30 ans, chez les élèves/étudiants, ainsi que les célibataires. Seulement 0,9 % (2/217) de la

population d’étude présentait une coïnfection au VHC (Tableau XII).

Tableau XII : Prévalences des marqueurs du VHB et de l’hépatite C en fonction des

caractéristiques sociodémographiques de la population d’étude (n= 217).

Caractéristiques Marqueurs du VHB

VHC Ac anti-HBs AgHBe Ac anti-HBe Ac anti-HBc

Pos/Nég Pos/Nég Pos/Nég Pos/Nég Pos/Nég

Sexe

Hommes 1/115 0/116 6/110 100/16 116/0

Femmes 1/100 2/99 7/94 90/11 101/0

Ages (ans)

≤ 20 0/18 0/18 4/14 13/5 18/0

21-30 1/81 1/81 8/74 69/13 82/0

31-40 0/54 1/53 0/84 48/6 54/0

41-50 1/38 0/39 1/38 38/1 39/0

˃ 50 0/24 0/24 0/24 22/2 24/0

Activités

Commerçants 0/21 0/21 0/21 19/2 21/0

Elèves/Etudiants 0/76 1/75 8/68 64/12 76/0

Fonctionnaires 2/49 0/51 1/50 47/4 51/0

Femme au foyer 0/23 0/23 0/23 22/1 23/0

S. Informel 0/46 1/45 4/42 38/8 46/0

Statut matrimonial

Célibataires 1/107 2/106 11/97 89/19 108/0

Divorcé 0/1 0/1 0/1 1/0 1/0

Mariés 1/106 0/107 2/105 99/8 107/0

Veuve 0/1 0/1 0/1 1/0 1/0

Pos : positive, Nég : négative


2.5. Taux de vaccination après dépistage du VHB

Sur les 1990 participants négatifs à l’AgHBs de la présente étude, 628 (31,6 %) ont été

vaccinés dont 347 (17,4 %) femmes et 281 (14,1 %) hommes. Bien que le nombre de femmes

vaccinés fût statistiquement plus élevé que celui des hommes vaccinés, la couverture

vaccinale était similaire dans les deux sexes (p= 0,262) pris individuellement (Tableau XIII).

Tableau XIII : Taux de vaccination après dépistage du VHB

Caractéristiques Total Masculin Féminin P

Nombre d’individus AgHBs négatif 1990 854 (42,91%) 1136 (57,09%) < 0,001

Nombre d’individus vaccinés 628 281 (44,75%) 347 (55,25%) < 0,001

Taux de vaccination (%) 31,56 14,12 17,44 < 0,001

Moyenne d’âge - 30,77±16,45 31,29±15,61 0,478

2.6. Conclusion partielle

Cette seconde campagne a rapporté une prévalence de 9,8 % de l’AgHBs dans la population

étudiée. Son intervention a contribué à réaliser une importante couverture vaccinale contre

l’hépatite B après le dépistage. Cela montre que les campagnes de sensibilisation et du

dépistage mieux accrues sur le VHB peut augmenter sa couverture vaccinale dans la

population. Elle a aussi montré que l’absence de vaccination contre l’hépatite B constitue un

facteur de risque élevé de l’infection par le VHB.

IV. Résultats des travaux de la deuxième étude

Modulation de la coïnfection VIH/VHB par les polymorphismes d’APOBEC3G au Burkina

Faso.

1. Contexte et but de l’étude

Plusieurs études ont été menées sur le rôle des variants d’APOBEC3G pour mieux

comprendre l’hyper-mutation et l’inhibition de l’infection du VHB et du VIH-1. Dans cette

étude cas-témoins, nous avons comparé l’association de trois variants d’APOBEC3G chez des

sujets coinfectés par les VIH-1/VHB, et mono-infectés par le VHB par rapport à des sujets


présumés ”sains” (témoins). Quatre cent vingt-quatre (424) personnes dont 150 VIH-1

positifs et 274 VIH-1 négatifs ont été diagnostiquées pour le portage de l’AgHBs et l’ADN

virale. Les polymorphismes d’APOBEC3G chez 85 sujets coinfectés et 65 mono-infectés par

le VHB ont été comparés chacun à ceux de 239 personnes négatives aux deux virus (témoins).

2. Les caractéristiques de la population d’étude

Le genre et la distribution d'âge sont présentés dans le tableau XIV. La différence de l'âge et

du sexe entre le groupe cas et le groupe témoin n’était pas statistiquement significative. Seul,

le génotype E du virus de l'hépatite B était présent dans notre groupe cas (Tableau XIV). Le

taux d’infection au VHB était de 56,7 % chez les personnes VIH-1 séropositives et de 12,8 %

chez les sujets VIH-1 séronégatifs.


Tableau XIV: Caractéristiques de la population d’étude

+/- SD : Valeur des standards de déviations

3. Fréquences des polymorphismes d’APOBEC3G (Cas vs. Témoins)

Notre population d’étude était en équilibre d’Hardy-Weinberg pour le rs6001417 chez les cas

(p = 0,21) et témoins (p = 0,38). Pour le rs8177832 (H186R) on notait respectivement des

valeurs de p = 0,59 chez les cas et 0,21 chez les témoins. Enfin, le rs3522832 était en

équilibre d’Hardy-Weinberg avec p = 0,87 et 0,56 respectivement pour les cas et les témoins

(Tableau XV).

Le génotype mineur GG du rs6001417 (Tableau XV) était plus fréquent chez les VIH-1(-

)/VHB (-) que chez les VIH-1(+)/VHB (+), cette différence était statistiquement significative

[OR= 0,42, 95 % CI (0,21 – 0,83), p= 0,017]. Les résultats montrent que le génotype GG

serait protecteur contre la coïnfection. L’allèle G du rs6001417 était plus fréquent parmi les

sujets VIH-1(-)/VHB(-) que chez les VIH-1(+)/VHB (+), mais la différence n’était pas

statistiquement significative [OR=,759 ; 95 % CI (0,5 – 1,06), p= 0,06].

Le génotype GG du variant rs8177832 avait une faible fréquence chez les témoins comparés

au cas, mais cette différence n’était pas statistiquement significative [OR= 0,53, 95% CI

(0,28-1,02), p= 0,07] (Tableau XV).

VIH (+) VIH (+)/VHB

(+)

VHB (+) VIH -

/VHB-

p-

Value

35 n=85 (n=65) n=239

Age moyen (Ans) 39,64 ± 11,2 40,84 ± 12,45 38,05

±11,4

35,26

±10,5

0,23

Genre (%)

Homme 37,14 20,20 25,47 23.85 0.11

Femme 62,86 79,80 74,53 76.15 0.47

Charge virale

VHB detectable

- 35 20 - -

Charge virale

moyenne du VHB

- 459390.3 ±

2507446

- - -

Charge virale

moyenne du VIH

6758,13

±30368,61

65963,68 ±

20,25

- - -

Taux Moyen CD4 375,12±277,20 423.45± 300.33 - - -

Génotypes du VHB, E n (%) 100 100 - -


L’allèle mineur G présentait le même profile que le génotype GG chez les cas et les témoins

mais la différence n’était pas statistiquement significative [OR= 0,77, 95 % CI (0,54 – 1,09),

p= 0,15].

Le génotype normal CC du variant rs3522832 était plus fréquents chez les cas que chez les

témoins, cette différence n’était pas statistiquement significative [OR=1,64, 95 % CI (0,99 -2,

71), p=0,07]. La fréquence élevée de l’allèle normal C chez les cas par rapport aux témoins

était associée à un risque d’infection presque double [OR : 1,61, 95 % CI (1,11 – 2,35),

p=0,013]. La fréquence plus élevée du génotype TT chez les témoins par rapport aux cas était

associée à une protection contre l’infection [OR : 0,4, 95 % CI (0,2 – 0,9), p=0,04]. L’allèle T

a aussi un profil protecteur [OR = 0,61, 95 % CI (0, 42 – 0, 90), p=0,013].

Les génotypes et les allèles des différents variants d’APOBEC3G ont été comparés entre les

patients mono-infectés par le VIH-1 dans les groupes cas et témoins. Les différences

observées étaient statistiquement significatives pour l’allèle mineur T (Tableau XV).

La comparaison des témoins aux sujets mono-infectés par le VHB a montré qu’il y avait une

association entre le risque de mono-infection au VHB et le portage des génotypes CG du

rs6001417et AG du rs8177832 (Tableau XV).


Tableau XV: Fréquences des gènes de polymorphismes d’APOBEC3G (Cas vs. Témoins)

VIH (+) versus VIH(-)/VHB(-) VHB(+) versus VIH(-)/VHB(-) VIH(+)/VHB(+) versus VIH(-)/VHB(-)

Polymorphisme VIH(+) VHB(+) VIH(+)/VHB(+) VIH(-)/VHB(-) OR 95% IC p-Value OR 95% IC p-Value OR 95% IC p-Value

(n= 35) (n= 65) (n= 85) (n=239)

rs6001417

CC, n (%) 10

(28,57)

15

(0,23)

26

(30,59)

64

(0,27) 1,09 0,5 – 2,4 0,84 0,82 0,43 – 1,56 0,63

1,2 0,7 – 2,07 0,57

CG, n (%) 17

(48,57)

40

(0,61)

48

(56,47)

114

(0,48) 1,03 0,51 – 2,1 1 1,75 1,01 – 3,07 0,05

1,47 0,89 – 2,42 0,13

GG, n (%) 8

(22,86)

10

(0,15)

11

(12,94)

61

(0,25) 0,415 0,37 - 2 0,84 0,415 0,37 - 2 0,84

0,415 0,207 – 0,83 0,02

G vs C, n (%) 33

(0,94)

60

(0,92)

35

(0,41)

236

(0,99) 0,9 0,55 – 1,51 0,8 0,82 0,55 – 1,2 0,32

0,759 0,5 – 1,06 0,06

HWE 0,74 0,16 0,20 0,38 - - - - - - - - -

rs8177832

AA. n (%) 10

(28,57)

15

(0,23)

27

(31,76)

69

(28,87) 0,98 0,45 – 2,16 1 0,74 0,39 – 1,4 0,43

1,15 0,67 – 1,96 0,7

AG. n (%) 18

(0,51)

40

(0,61)

45

(52,94)

111

(0,46) 1,22 0,60 – 2,48 0,59 1,84 1,05 – 3,23 0,04

1,34 0,82 – 2,2 0,26

GG. n (%) 7(0,2) 10

(0,15)

13

(15,30)

59

(0,25) 0,76 0,32 -1,84 0,67 0,55 0,26 – 1,15 0,13

0,53 0,28 – 1,02 0,07

G vs A. n (%) 32

(0,91)

60

(0,92)

36

(42,35)

229

(0,96) 0,9 0,55 – 1,51 0,8 0,82 0,55 – 1.2 0,32

0,77 0,54 – 1,09 0,15

HWE 0,98 0,16 0,59 0,21 - - - - - - - - -

rs35228531

CC. n (%) 18

(0,51)

18

(0,51)

40

(47,05)

84

(35,15) 1,95 0,96 – 4 0,09 1,15 0,65 – 2,03 0,66

1,64 0,99 – 2,71 0,07

CT. n (%) 15

(0,43)

15

(0,43)

38

(44,70)

113

(0,47) 0,84 0,4 – 1,71 0,17 0,95 0,55 – 1,65 0,89

0,93 0,57 – 1,53 0,80

TT. n (%) 2

(0,06)

2

(0,06)

7

(8,25)

42

(0,17) 0,28 0,06 – 1,23 0,09 0,85 0,40 -1,80 0,85

0,4 0,17 – 0,9 0,04

T vs C. n (%) 19

(0,54)

19

(0,54)

25

(29,88)

197

(0,82) 0,53 0,3 – 0,93 0,03 0,89 0,6 – 1,33 0,615

0,61 0,42 – 0,90 0,01

HWE 0,88 0,98 0,86 0,55 - - - - - - - - -


HWE= Equilibre d’Hardy-Weinberg ; OR= Odds ratio ; IC= Intervalle de Confiance.

4. Association entre les 3 variants et le statut de Coïnfection VIH-1/VHB basée sur le

modèle additif, dominant et récessif

L’association entre les trois loci et le statut de coïnfection VIH-1/VHB par de modèle (additif,

dominant et récessif) montrent que les génotypes sont associés au modèle additif, avec une

augmentation du risque de coïnfection spécialement pour les rs6001417 [OR= 2,4 95 % CI

(1,21 – 4,7), p = 0,01] et rs35228531 [OR= 2,66, 95 % CI (1,16 – 6,07), p= 0,02] (Tableau

XVI).

Tableau XVI : Association entre les 3 variants d’APOBEC3G et le statut de coïnfection VIH-

1/VHB basée sur les modèles additifs, dominants et récessifs

Marqueurs Modèles OR 95% IC p-Value

rs6001417

C/C (referent). C/G. G/G. additive 2,4 1,21 - 4,7 0,01

C/C vs. C/G & G/G. dominant 1,20 0,7 - 2,07 0,5

G/G vs. G/G&G/G. récessive 0,4 0,2 - 0,83 0,01

rs8177832

A/A (referent). A/G. G/G additive 1,88 0,99 - 3,57 0,06

A/A vs. A/G &G//G. dominant 1,15 0,67 – 1,96 0,62

G/G vs. A/A &A/G. récessive 0,53 0,27 – 1,017 0,07

rs35228531

C/C (referent). C/T. T/T. additive 2,66 1,16 – 6,07 0,02

C/C vs. C/T & T/T. dominant 1,64 0.99-2.71 0,07

T/T vs. C/C & C/T. récessive 0,4 0.17-0.92 0,04

OR= Odds ratio ; IC= Intervalle de Confiance

5. Haplotypes des cas et témoins dans le cadre de la coïnfection VIH-1/VHB

L’analyse avec le logiciel Haploview a permis la détection de six (6) haplotypes et leurs

fréquences (Tableau XVII). La fréquence de l’haplotype GGT est plus élevée chez les

témoins (39,27 %) que chez les cas (27,38 %), et cette différence était statistiquement

significative [OR= 0,57, 95 % CI (0,33 – 0,99), p=0,05]. Il n’y avait pas de différences

significatives pour les autres haplotypes.


Tableau XVII: Haplotypes des cas et témoins dans le cadre de la coïnfection VIH-1/VHB

Haplotype VIH (+)/VHB (+) VIH (-)/VHB (-) OR CI p-Value

CAC 0,54 0,51 1,27 0,77 – 2,1 0,38

GGC 0,11 0,11 1,45 0,62 – 3,73 0,37

GGT 0,27 0,31 0,57 0,33 – 0,99 0,05

CGC 0,04 0,02 2,15 0,47 – 9,81 0,40

GAT 0,02 0,02 1,41 0,25 – 7,87 0,65

GAC 0,01 0,01 0,94 0,1 – 9,1 1

OR= Odds ratio ; IC= Intervalle de Confiance

6. Déséquilibre de Liaison entre les 3 variants d’APOBEC3G chez les cas et les témoins

Une analyse de régression de la tendance haplotypique a été faite par détermination du

déséquilibre de liaison (LD) et du r carré (r2) des 3 SNPs du gène APOBEC3G (Figure 20).

Le déséquilibre de liaison entre les rs6001417 et rs35228531 était très fort chez les cas (D '=

0,92 ; r2 = 0,54) et les témoins (D’= 0,98 ; r2 = 0,69). Il existe également un fort déséquilibre

de liaison entre les rs6001417 et rs8177832 pour les cas (D '= 0,87 ; r2 = 0,74) et les témoins

(D’= 0,94, r2 = 0,83). Le déséquilibre de liaison des rs8177832 et rs35228531 était plus faible

chez les cas (D '= 0,8), et les témoins (D’= 0,89) par rapport aux précédents (Figure 20).


a. VIH+/VHB+ b. Témoins

7. Conclusion partielle

Cette étude a permis de montrer qu’APOBEC3G est un gène de susceptibilité contre la

coïnfection à VIH-1/VHB. Le rôle des variants d’APOBEC3G sur la coïnfection à VIH-

1/VHB a été étudié pour la première fois à travers ces travaux.

II. Résultats des travaux de la troisième étude

Caractérisation moléculaire du virus de l'hépatite B chez des donneurs de sang du Burkina

Faso : prévalence du Quasi-sous-génotype A3, du génotype E et des infections mixtes.


L'infection chronique au VHB est un facteur de risque au développement de la cirrhose et du

carcinome hépatocellulaire (CHC). Le Burkina Faso est un pays à forte endémicité avec une

prévalence du VHB supérieure à 8 % dans la population générale. Chez les donneurs de sang,

des prévalences de 14,3 % -17 % d’AgHBs ont été observées. Celles en Ac anti-HBc étaient

de 69,6 % - 76,4 %. Le génome du VHB est génétiquement variable. Dix génotypes (A-J) ont

été caractérisés. Ils ont une distribution géographique distincte et sont associés à la

pathogenèse de la cirrhose et du CHC. Le tableau clinique, la réponse au traitement, le

Figure 20 : Déséquilibre de Liaison entre les 3 variants d’APOBEC3G chez les cas et

les témoins


pronostic à long terme ainsi que le profil de séroconversion sont influencés par ces génotypes.

Peu d’études se sont intéressées aux génotypes du VHB circulant au Burkina Faso. L’objectif

de cette étude était de caractériser les génotypes du virus de l’hépatite B circulant au Burkina

Faso.

2. Caractéristiques sociodémographiques des donneurs de sang

Au total 2 200 donneurs de sang dont 91% de premiers don, âgés de 17-65 ans ont participés à

cette étude. Le sex ratio hommes-femmes était de 11,6 et l'âge moyen se situait entre 19 et 40

ans avec une distribution similaire autour de la médiane, 25 ans chez les hommes et 26 ans

chez les femmes. Aucun donneur n’avait été vacciné contre le VHB ou n’avait reçu un

traitement antiviral. Après le dépistage, 273 (12,4 %) donneurs étaient positifs à l’AgHBs

dont 5 (1,8 %) positifs au VIH. La séroprévalence globale du VIH était de 2,2 % (49/2 200).

3. L'amplification de l'ADN du VHB et le génotypage

L'ADN viral de 273 donneurs de sang positifs à l’AgHBs a été purifié et la région pré-S/S a

été amplifiée avec succès dans 101 (37 %) échantillons. La séquence pré-S/S (1 207 nt)

complète de 94 échantillons a été obtenue. Sept échantillons n'ont pas donné de séquences

complètes probablement en raison de la faible quantité d'ADN purifié. Parmi les quels cinq

séquences pré-S/S étaient plus courtes de 135 nucléotides à l'extrémité 3', et deux séquences

avaient seulement 550 nt de long y compris la région S. Finalement, les séquences pré-S/S

partielles (1 072 nt) de 99 échantillons Burkinabè ont été considérées pour l'analyse

phylogénétique et le génotypage (Figure 21). Vingt-cinq séquences ont été regroupées avec le

génotype A du VHB (VHB/A) et 71 séquences avec le génotype E et soutenues

respectivement par 87 % et 80 % de bootstrap (amorçage) pour 1000 répétitions. Trois

séquences VHB/A étaient aberrantes à la racine (BF258, BF268 et BF276 ; 99 % bootstrap).

Trois séquences (BF275, BF284 et BF311) étaient d’appoints aberrantes sans classification

claire. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant la reconstruction du maximum de

vraisemblance de la phylogénie. L'analyse de la séquence S de 550 nt des deux derniers

échantillons (BF280 et BF238) a identifié le génotype E du VHB. Dans l'ensemble, le

génotype A du VHB a été identifié dans 25 échantillons (25 %), le génotype E dans 73

échantillons (72 %) et trois échantillons sont resté non classifiés (3 %).


Figure 21: : L’arbre phylogénétique des séquences pré-S/S partielles (1072 nt) à partir de 99 souches

du VHB des donneurs de sang Burkinabè.

Légende : Une analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant l'algorithme de neighbor-joining

basé sur la méthode d'estimation de distance Kimura à deux paramètres. Seules les valeurs de

bootstrap > 60% sont représentées (1 000 répétitions). Les séquences de références du VHB

récupérées auprès de GenBank sont désignées par leurs numéros d'accès et les génotypes/sous-

génotypes sont indiqués. Les séquences aberrantes du Burkina sont indiquées par la puce ♦.


4. Analyse des séquences de génotype E du VHB du Burkina Faso

Les séquences pré-S/S complètes du VHB/E (n = 65) Burkinabè ont été analysées en même

temps que 301 séquences de souches africaines du génotype E disponibles dans la base de

données GenBank. Les reconstructions phylogénétiques neighbor-joining et maximum de

vraisemblance ont montré que les séquences du Burkina Faso et les séquences africaines du

VHB/E précédemment caractérisées étaient dispersées au sein du clade E indépendamment de

leurs origines géographiques (Figure 22).

Comme indiqué dans le tableau XVIII, la moyenne de diversité nucléotidique sur l'ensemble

des régions pré-S/S entre les séquences Burkinabè (moyenne : 0,73 % ; intervalle : 0,00 à 2,61

%) était significativement plus faible que celle observée dans d'autres séquences africaines du

VHB/E (moyenne : 0,96 % ; intervalle : 0,00 à 3,82 %) (P = 0,0002). Une diversité intra-

groupe similaire a été trouvée dans des séquences de référence originaires du Cameroun

(moyenne : 0,65 % ; intervalle : 0,00 à 1,36 %), de la Guinée (moyenne : 0,64% ; intervalle :

0,00 à 2,09 %) et la République centrafricaine (moyenne : 0,82 % ; intervalle : 0,00 à 2,34 %).

Des séquences pré-S/S identiques ont été trouvées dans 26 % (17/65) des échantillons

Burkinabè (combinaison des échantillons : 5 X 2, 1 X 3 et 1 X 4), ainsi que dans les

séquences de référence (Tableau XIX). Certaines séquences Burkinabè étaient identiques à

des séquences provenant de la Guinée et de la Côte-d'Ivoire (BF145 et BF337) ; ou le Niger,

le Nigeria et la République centrafricaine (BF235).

La moyenne de la variabilité des acides aminés de la longue protéine S était de 1,45 %

(intervalle : 0,00 à 5,93 %), et 1,81 % (intervalle : 0,00 à 5,32 %) dans le cadre de lecture de

la polymérase (résidus 182-581). Dans les cadres ouverts de lecture pré-S/S, des codons

d'arrêt ont été observés à la position 76 (début pré-S1) de la séquence BF286 et à la position

389 des séquences BF193 et BF314. La mutation G2R était présente dans le site de

myristylation de BF259. Une délétion de 60 aa était présente dans le domaine pré-S1 (résidus

de pré-S1 57-116) de l'échantillon BF327. Dans le chevauchement du domaine espacer pré-

S2/Pol, des suppressions de séquences ont été observées dans les échantillons BF167 (résidus

de pré-S2 18-22), BF306 (résidus 22), BF314 (résidus 15-22) et BF321 (résidus 19-22). La

principale région hydrophile (MRH) de la petite protéine S et le domaine de la transcriptase

inverse (RT) ont été fortement conservés.


Figure 22: L'analyse phylogénétique des 65 séquences complètes pré-S/S (1 204 nt) de génotype E

identifiées dans cette étude (marquées par ♦).

Légende : L’arbre phylogénétique incorpore les 301 souches africaines du VHB/E dont les séquences

génomiques complètes étaient disponibles dans le GenBank (Liste des numéros d'accès dans le tableau

XX) avec l’indication des pays d'origine. Une analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant

l'algorithme de neighbor-joining basé sur la méthode d'estimation de distance Kimura à deux

paramètres.


Tableau XVIII: Diversité génétique intra-sous-groupes des souches du VHB

VHB (sous)génotypes N Divergence nucléotidique a (%)

Moyenne Intervalle

Sous-génotype quasi A3 du VHB 74 1,55 0,00 – 3,83

• Séquences Burkinabè 22 0,92 0,00 – 3,83

- Sous-groupe sans BF254 21 0,75 0,00 – 2,36

• Séquences de référence 52 1,65 0,00 – 3,19

- Sous-groupe de l’Afrique de l'Ouest 7 1,68 0,00 – 2,95

- Sous-groupe du Centre-Ouest Africain 4 1,11 0,59 – 1,69

- Sous-groupe camerounais (A7) 9 1,31 0,27 – 2,09

- Sous-groupe du Sud-Ouest Africain 7 1,76 0,84 – 2,55

- Sous -groupe Haïtienne (A5) 19 0,79 0,00 – 1,84

Génotype E du VHB 366 0,92 0,00 – 3,84

• Séquences Burkinabè 65 0,73 0,00 – 2,86

• Séquences de référence b 301 0,96 0,00 – 3,82

- Angola 26 0,98 0,00 – 2,24

- Benin 6 1,16 0,67 – 1,68

- Cameroun 5 0,65 0,00 – 1,36

- République Centra-Africaine 27 0,82 0,00 – 2,34

- Ghana 46 1,28 0,00 – 3,39

- Guinée 70 0,64 0,00 – 2,09

- Namibie 6 0,36 0,08 – 0,68

- Niger 18 1,47 0,34 – 3,04

- Nigeria 45 1,07 0,00 – 2,37

- Soudan 44 1,35 0,00 – 3,66

a La divergence génétique a été définie comme la valeur moyenne de la distance entre les paires de

séquences, calculée comme le nombre de différences de nucléotides entre les deux séquences

individuelles corrigées pour la longueur de séquence; b

Y compris une séquence de la République démocratique du Congo, deux de Côte d'Ivoire, une de

Madagascar, deux de la République sud-africaine et deux du Sénégal,


Tableau XIX: Souches du VHB de différentes origines montrant des séquences pré-S/S identiques.

Origines Séquences identiques

Burkina Faso

BF141/BF288, BF161/BF295, BF180/BF253,

BF182/BF320, BF315/BF317, BF322/BF329/BF333

& BF281/BF289/BF291/BF292

BF63/BF64/BF69*, BF188/BF194/BF326*,

BF246/BF249/BF271*

Burkina Faso & Guinée BF145/GQ161780

Burkina Faso, Guinée

& Côte d’Ivoire

BF337/AB091255/GQ161787/GQ161791/GQ161793/

GQ161800/GQ161804/GQ161819/GQ161820/GQ161827

Burkina Faso, RCA,

Niger & Nigeria

BF235/AM494702/AM494708/AM494717/FN594754/

HM363567/HM363570/HM363571

Angola DQ060823/KF849726 & KF849719/KF849722

Cameroun FN545827/FN545841

RCA AM494693/AM494715 & AM494694/AM494700

Ghana EF662044/EF662047 & EF662048/EF662051

Guinée

GQ161755/GQ161835, GQ161756/GQ161795,

GQ161763/GQ161777, GQ161765/GQ161769

GQ161773/GQ161802, GQ161778/GQ161810

GQ161782/GQ161814, GQ161783/GQ161824

GQ161758/GQ161766/GQ161774

GQ161776/GQ161784/GQ161789/GQ161828

GQ161837/GQ161838*

Namibie DQ060828/DQ060829

Nigeria HM363579/HM363581

Soudan HQ385246/HQ385250/HQ385252/HQ385255/

HQ385256/HQ385257

Haïti FJ692596/FJ692600*, FJ692609/FJ692610*

* Séquences des génotypes A VHB ;

RCA, République Centra-Africaine.

Tableau XX: Les séquences nucléotidiques utilisées dans l'étude


5. Analyse des séquences de génotype A du HBV du Burkina Faso

A l’exception des valeurs aberrantes (BF258, BF268 et BF276), les séquences Burkinabè du

génotype A apparaissent liées aux séquences de références VHB/A3QS (Figure 23). Toutes

Génotype Pays Numéro d’accession

A3QS

Angola HM195118

Cameroun AB194949-52, AM180624, FN545826, FN545828-FN545840

Gabon AM184125, AM184126, EU054331

Gambie AY934764

Guinée GQ161767, GQ161788 GQ161813, GQ161837, GQ161838

Haïti FJ692593-FJ692600, FJ692602-FJ69211, FJ692613

Mali AM180623

Nigeria FN545825, FJ692554, FJ692556

E

Angola DQ060822, DQ060823, KF849713-KF849726, KF849728-

KF849737

Benin AB274977, AB274983, AB201287-AB201290

Cameroun AB194947, AB194948, FN545827, FN545841, FN545842

RCA AM494689-AM494694, AM494696-AM494715, AM494717

Congo RDC AY738144

Ghana AB106564, AB205129, AB205188-AB205192, EF661997-

EF662007, EF662014-EF662022, EF662043-EF662052,

EU239217, EU239219-EU239226

Guinée GQ161755-GQ161766, GQ161768-GQ161774, GQ161776-

GQ161787, GQ161789-GQ161498, GQ161800-GQ161804,

GQ161807-GQ161812, GQ161814-GQ161817, GQ161819,

GQ161820, GQ161823-GQ161829, GQ161831, GQ161832,

GQ161834-GQ161836

Côte d’Ivoire AB091255, AB091256

Madagascar DQ060830

Namibie DQ060824-DQ060829

Niger FN594748-FN594763, FN594765, FN594766

Nigeria HM363565-HM363607, HM363610, HM363611

Afrique du Sud

KF922438, KF922439

Sénégal X75657, X75664

Soudan HQ385227, HQ385235, HQ385236, HQ385238, HQ385239,

HQ385241, HQ385242, HQ385245, HQ385246, HQ385248-

HQ385257, HQ385260-HQ385265, HQ385267, KF170741,

KF170742, KF170050-KF170053, KF170779-KF170790


les séquences Burkinabè à l’exception du BF254, étaient regroupées sur une branche séparée

mais sans soutien statistique significative (< 40 % de bootstrap). Pour explorer davantage la

phylogénie des séquences VHB/A Burkinabè, 52 séquences pré-S/S du VHB/A3QS provenant

de différentes régions de l'Afrique subsaharienne et de Haïti ont été inclus dans l'analyse (19

sous-génotype A3, 2 "sous-génotype provisoire" A4, 21 "sous-génotype provisoire "A5, et 10

" sous-génotype provisoire" A7). La reconstruction de la phylogénie utilisant les méthodes

neighbor-joining et le maximum de vraisemblance a montré que toutes les séquences pré-S/S

Burkinabè étaient regroupées au sein du clade hétérogène du A3QS avec une faible valeur

bootstrap de 43 % (Figure 23). Toutes les séquences burkinabè à l’exception du BF254

formaient un groupe distinct, bien que la valeur bootstrap était relativement faible (54 %).

Cinq autres sous-groupes ont été observés regroupant sept séquences de l'Afrique de l'Ouest

(Gambie, Guinée et au Mali, 43 % bootstrap), quatre séquences du Centre-Ouest Africain

(Cameroun et le Nigeria, 72 % bootstrap), neuf séquences du Cameroun (ancien " A7

provisoire "; 75 % bootstrap), sept séquences du Sud-Ouest Africain (Cameroun et Gabon, 40

% bootstrap), et 19 séquences de Haïti (ancien sous-génotype A5; 87 % bootstrap). Les

séquences Burkinabè semblent plus proches des séquences de référence de l’Afrique de

l'Ouest par rapport aux séquences du centre et Sud-Ouest africain et de Haïti.

La moyenne de diversité de séquence entre les séquences pré-S/S Burkinabè était de 0,92 %

(intervalle : 0,00 à 3,83 %), ce qui était significativement plus faible (P < 0,0001) que la

diversité globale intra-groupe observée entre les 52 séquences de référence A3QS Africaines

(moyenne : 1,65 % ; intervalle : 0,00 à 3,19 %) (Tableau XVIII). La séquence BF254 possède

la plus grande diversité génétique par rapport aux autres séquences Burkinabè (moyenne :

2,89 % ; intervalle : 2,59 à 3,83 %). En revanche, des séquences pré-S/S identiques ont été

observées dans des échantillons Burkinabè (BF063/BF064/BF069, BF188/BF194/BF326 et

BF246/BF249/ BF271) et parmi les séquences de référence A3QS (Tableau XIX). Lorsque la

séquence BF254 a été exclue, la moyenne de diversité de séquence au sein du sous-groupe

Burkinabè (moyenne : 0,75 % ; intervalle : 0,00 à 2,36 %) était similaire à la diversité intra-

groupe observée au sein du sous-groupe de l’Afrique de l'Ouest et du Centre (moyenne : 1.11

%, intervalle : 0,59 à 1,69 %) et du sous-groupe haïtien (moyenne : 0,79 %, intervalle : 0,00 à

1,84 %). Les variations intra-groupes étaient significativement plus élevées (P < 0,0001) dans

les trois autres sous-groupes (Tableau XVIII).

La moyenne de diversité des acides aminés dans la longue protéine S et la région de la

polymérase (résidus 184-584) de souches Burkinabè était respectivement de 1,44%


(intervalle, 0,00 à 3,08 %) et 1,61 % (intervalle, 0,00 à 6,89 %). Les séquences BF172, BF290

et BF340 présentaient une substitution pré-S1M1R/T/V qui abolie le codon d'initiation de la

longue protéine de surface. Une substitution pré-S1G2R a affecté le site de myristoylation

critique de BF340. Une délétion de neuf acides aminés (résidus 14-23) dans la région espacer

pré-S2/pol et un codon d'initiation S muté (sM1T) ont été observées dans la séquence BF254.

La séquence BF172 avait un codon stop prématuré tronquant la partie C-terminale des

protéines de surface des 11 acides aminés. Aucune mutation connue pour altérer la détection

de l’AgHBs ou responsables de la résistance aux médicaments n’a été détectée dans le MRH

ou dans le domaine RT de souches Burkinabè. Les épitopes CTL CD8 + sont essentiellement

conservés dans les séquences des deux génotypes A3QS et E.

Le ratio des substitutions synonymes et non synonymes (dS/dN) a été calculé par rapport à la

séquence consensus dérivée des séquences VHB/A3QS et VHB/E Burkinabè pour les régions

pré-S/S et polymérase. Les données globales ont montré des rapports (dS/dN) similaires et > 1

pour chaque génotype suggérant une pression sélective négative. Le plus faible rapport dS/dN

a été observé dans le cadre ouvert de lecture du Pol des souches VHB/E, mais il semblait être

lié à des substitutions non synonymes s'accumulant dans la région espacer.


Figure 23: L'analyse phylogénétique des 22 séquences complètes pré-S/S (1 204 nt) de génotype A

identifiées dans cette étude (marquées par ♦). Légende : Les séquences des sous-génotypes Burkinabè

de cette étude sont marquées par ●. L’arbre Neighbor-joining comprend 52 séquences du VHB/A3QS

d’origines sub-saharienne (Tableau XX). Les valeurs bootstrap des nœuds définissant des sous-

groupes provisoires sont indiquées.


6. Investigation des événements de recombinaison inter-génotype dans les séquences

Burkinabè

Trois séquences de génotype A avaient des valeurs aberrantes (BF258, BF268 et BF276) et

trois autres séquences ramifiées (BF275, BF284 et BF311) distinctement entre les génotypes

A et E, ce qui suggère la présence d'événements de recombinaison génétique (Figure 24). Cela

a été encore soutenu par l'analyse phylogénétique du gène S montrant une classification claire

du BF284 et BF311 au sein du clade E (85 % bootstrap) alors que les autres séquences sont

restées avec les valeurs aberrantes. Pour approfondir cette hypothèse, les séquences pré-S/S

ont été analysées avec SIMPLOT (Figure 24). Les résultats ont montré des formes

recombinantes hétérogènes contenant une (A3/E [BF275, BF284 et BF311]) ou deux

(A3/E/A3 [BF258, BF268 et BF276]) des putatives de recombinaison entre le quasi génotype

A3 et le génotype E. Des points d'arrêt ont été identifiés approximativement au niveau des

positions 237 et 311 de la séquence BF258 (position nucléotidique selon la séquence

AB194952 HBV/A3QS), des positions 211 et 344 du BF268, des positions 211 et 667 du

BF276, la position 42 du BF275, la position 3205 du BF284 et la position 3144 de la

séquence BF311 (Figure 24).

Les régions pré-S/S de BF258, BF268, et BF276 ont été ré-amplifiées, clonées et séquencées

(six à dix clones par échantillon). La souche génotype A3 de BF274 a été utilisée comme

témoin. Pour chaque échantillon, les analyses phylogénétiques et SIMPLOT ont été effectuées

en utilisant les séquences de tous les clones (Figure 24). Toutes les séquences clonées de

BF274 et la séquence directe initiale dérivée de la PCR appartenaient à un groupe

monophylétique (100 % de support bootstrap) au sein du A3QS. Quatre et cinq séquences de

clones d'échantillon BF276 étaient regroupées respectivement dans le clade A3QS et E.

L’Analyse SIMPLOT a confirmé l'absence de recombinaison génétique dans BF276. Des

modèles plus complexes de distribution des séquences ont été observées pour les échantillons

BF258 et BF268 avec la présence simultanée de séquences VHB/A3QS (un clone BF258 et

trois de BF268), de séquences VHB/E (Sept BF258 et Cinq BF268) et les différents variants

de l’unique recombinant de ces génotypes (Un de BF258 et deux de BF268) (Figure 24). Dans

chacun de ces clones recombinants, les points de recombinaison diffèrent de ceux observés

dans les séquences consensus correspondantes de la PCR. Ces résultats suggèrent des artefacts

de recombinaison lors de l'amplification par PCR. Pour tester cette hypothèse, un plasma

infecté par le VHB/A1 (2,0 X 104 UI/mL) et un plasma VHB/E infecté (3,6 X 10

4 UI/mL) ont

été mélangés et la région pré-S/S a été amplifiée et séquencée. La séquence du produit PCR a


montré un point d'arrêt de recombinaison (position 241), tandis que les séquences clonées

étaient groupées au sein des clades A1 et E à l’exception du clone MixAE-Cl7 présentant un

éventuel motif recombinant. L'importance des courts segments recombinants (226 nucléotides

[13nt-241nt] dans BF258-CL5 et < 150 pb [nt211-nt344] dans BF258-pcr et BF268-pcr) a été

évaluée. L’alignement des séquences consensus et la reconstruction phylogénétique a montré

que les séquences des génotypes A3QS et E différaient significativement dans le segment

13nt-241nt (≥ 95 % bootstrap), mais pas dans le segment 211nt-344nt (Figure 24).


Figure 24: Représentation schématique de la diversité des clones isolés à partir de souches burkinabè aberrantes.

Légende : Les arbres phylogénétiques des séquences pré-S/S des clones (marquées par ●) sont affichés dans la partie supérieure, et les séquences obtenues

par séquençage direct des produits PCR sont indiquées en caractères gras (▲). L’analyse SIMPLOT des produits PCR et les clones est présentée dans la

partie inférieure ; les chiffres au-dessus des barres représentent les positions du génome (coupe EcoRI) de putatif point d’arrêt.



Dans cette troisième étude nous confirmons non seulement la prédominance du génotype E

(72 %), mais mettons aussi en évidence pour la première fois à notre connaissance l’existence

d’un sous-groupe de quasi-sous-génotype A3 (25 %) du VHB spécifique au Burkina Faso

ainsi que des infections mixtes (3 %).

III. Résultats des travaux de la quatrième étude

Détermination de l’infection occulte par le virus de l'hépatite B et les génotypes associés chez

les sujets séronégatifs à l’AgHBs au Burkina Faso.


Le diagnostic sérologique du virus de l'hépatite B est principalement basé sur la détection de

l'AgHBs ; et son absence est censée exclure une infection au VHB. Cependant, la présence de

l'ADN du VHB chez les sujets à AgHBs indétectable avec la présence ou non de l'anticorps

anti-HBc, est définie comme une infection occulte par le VHB. Le Burkina Faso est un pays à

forte endémicité avec une prévalence de 14,5 % dans la population générale. Le génome du

VHB est génétiquement variable et a été classé en 10 génotypes (A-J). Ces génotypes et leurs

variants ont été associés au développement de la cirrhose et du cancer du foie. En outre, cette

diversité génétique engendre des mutations qui ont été associées aux phénomènes

d’échappements aux tests de diagnostiques sérologiques. Au Burkina Faso, très peu d’études

se sont intéressées à l’infection occulte par le VHB et les génotypes associés. L’objectif de

cette étude était de caractériser les cas d’infection occulte par le VHB et les génotypes

associés chez les sujets séronégatifs à l’AgHBs.

2. Caractéristiques sociodémographiques et sérologiques de la population d’étude

Un total de 219 individus, ayant un âge compris entre 14 et 77 ans, (moyenne d’âge de 38,4

±1 3,5 ans), dont 102 (46,6 %) femmes et 117 (53,4 %) hommes ont participé à cette étude.

La tranche d’âge majoritaire était de 31 à 40 ans soit 52,1 % (114/219). Sur les 219 personnes

séronégatives à l’AgHBs, 44 (20,1 %) étaient positives à l’anticorps Anti-HBc, 3 (1,8 %) à

l’AgHBe et 50 (22,8 %) positives à l’anticorps Anti-HBe (Tableau XXI). Cependant, 25,6 %

(56/219) des échantillons présentaient l’ADN viral du VHB par PCR en temps réel utilisant

des paires d'amorces spécifiques du VHB.


Tableau XXI: Caractéristiques sociodémographiques et sérologiques de la population d’étude

Caractéristiques N Pourcentage

Sexe

Hommes 117 53,4

Femmes 102 46,6

Age (Année)

˂ 30 68 31,1

31-50 114 52,1

˃ 50 37 16,9

Ac Anti-HBc

Positif 44 20,1

Négatif 175 79,9

ADN

Positif 56 25,6

Négatif 163 74,4

AgHBe

Positif 3 1,4

Négatif 216 98,6

Ac Anti-HBe

Positif 50 22,8

Négatif 169 77,2

NB : La moyenne d’âge = 38,4 ± 13,5

3. Caractéristiques des échantillons présentant l’ADN viral du VHB (n= 56) en fonction

de leurs charges virales

Sur les 56 échantillons présentant l’ADN viral, on notait 32 (57,1 %) femmes et 24 (42,9 %)

hommes (Tableau XXII). L'ADN du VHB a été quantifié dans les 56 échantillons par PCR en

temps réel dont 78,5 % (44/56) positifs à l’Ac Anti-HBc. Leurs charges virales variaient entre

4 UI/mL à 13,6 106 UI/mL. Une prévalence de 7,3 % (16/219) de l'infection occulte au virus

de l’hépatite B (IOB) a été observée dans cette étude. La majorité des porteurs de l’IOB était

positive à l’Ac Anti-HBc (14/16), de sexe masculin (9/16) et retrouvée dans la tranche d'âge

de 31-50 ans (Tableau XXII). En générale, les prévalences des marqueurs du VHB étaient de

12,5 %, 87,5 %, et 12,5 % respectivement pour l’Ac Anti-HBs, l’Ac Anti-HBc et l’Ac Anti-

HBe. Ces prévalences étaient majoritairement plus élevées dans les échantillons ayant une

charge virale ˃ 200 UI/mL. Seulement 1,8 % (1/56) des échantillons étaient infectés par le

VIH (Tableau XXII).


Tableau XXII : Caractéristiques des échantillons présentant l’ADN viral du VHB (n= 56) en

fonction de leurs charges virales

Variables Charge virale en UI/mL (%)

< 200 ˃ 200

N = 16 N = 40

Sexe Femmes 7 (43,8) 25 (62,5)

Hommes 9 (56,2) 15 (37,5)

Age (Année)

˂ 30 4 (25,0) 12 (30,0)

31-50 10 (62,5) 22 (55,2)

˃ 50 2 (12,5) 6 (15,50

Ac Anti-HBs

Positif 2 (12,5) 5 (12,5)

Négatif 14 (87,5) 35 (87,5)

Ac Anti-HBc

Positif 14 (87,5) 30 (75,0)

Négatif 2 (12,5) 10 (25,0)

AgHBe

Positif 0 (0,0) 3 (7,5)

Négatif 16 (100,0) 37 (92,5)

Ac Anti-HBe

Positif 2 (12,5) 9 (22,5)

Négatif 14 (87,5) 31 (77,5)

VIH

Positif 1 (1,8) 0 (0,0)

Négatif 15 (26,8) 40 (71,4)

NB : La moyenne d’âge = 37,2 ± 13,1

4. Séquençage et génotypage des ADN du VHB

La région pré-S/S de 21 échantillons a été séquencée dont 16 IOB et 5 « fausses IOB ».

Toutes les séquences ont été considérées pour l'analyse phylogénétique et le génotypage.

Quatre séquences ont été groupées avec le génotype A du VHB et 17 séquences avec le

génotype E et soutenues respectivement par 75 % et 67 % de bootstrap pour 1000 répétitions.


Les séquences pré-S/S des 17 génotype E ont été analysées en même temps que 67 séquences

des souches Burkinabè et 44 séquences de références dont 9 du génotype E, toutes disponibles

dans GenBank. Les reconstructions phylogénétiques neighbor-joining et maximum de

vraisemblance ont montré que les 17 séquences étaient regroupées au sein du même clade E

des séquences Burkinabè du génotype E précédemment caractérisées (Figure 25).

Figure 25: L’arbre phylogénétique des 17 séquences pré-S/S du génotype E du VHB identifiées dans

cette étude (indiquées par ♦). Légende : Une analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant

l'algorithme de neighbor-joining basé sur la méthode d'estimation de distance Kimura à deux

paramètres. Seules les valeurs de bootstrap > 50% sont représentées (1 000 répétitions). Les

séquences de références du VHB récupérées auprès de GenBank sont désignées par leurs numéros

d'accès et les génotypes/sous-génotypes sont indiqués. Les séquences de références spécifiques du

Burkina Faso sont indiquées par ♦.


Aussi, les séquences pré-S/S des 4 génotypes A ont été analysées avec 22 séquences A3 des

souches Burkinabè et 44 séquences de références dont 8 du génotype A3, toutes disponibles

dans GenBank. L'analyse phylogénétique a également montré que les 4 séquences étaient du

sous-génotype A3 du VHB et regroupées sur le même clade A3 (Figure 26).

Figure 26: L'analyse phylogénétique des 4 séquences pré-S/S du génotype A du VHB identifiées dans

cette étude. Légende : L’analyse phylogénétique a été réalisée en utilisant l'algorithme de neighbor-

joining basé sur la méthode d'estimation de distance Kimura à deux paramètres. Seules les valeurs de

bootstrap > 50% sont représentées (1 000 répétitions). Les séquences de références du VHB

récupérées auprès de GenBank sont désignées par leurs numéros d'accès et les génotypes/sous-

génotypes y sont indiqués. Les séquences de références spécifiques du Burkina Faso sont indiquées

par ♦, et celles de la présente étude par ♦.


5. Mutations dans le gène S en fonction des génotypes et les cas d'hépatite B

Sur les 21 région pré-S/S séquencées, 16 (76,2 %) étaient des cas d’IOB et 5 (23,8 %) des cas

de « fausse IOB ». Les souches du génotype A3 ne présentaient pas de mutations

caractéristiques. Une seule souche de « fausses IOB » (hépatite B chronique) portait la

mutation G145R (Tableau XXIII). Toutes les autres substitutions d’acides aminés ont été

observées dans les cas de « fausses IOB » et de l’IOB (Tableau XXIII). D’une manière

générale, toutes les mutations observées étaient situées dans la région hydrophile majeure

(MHR) du gène S (Tableau XXIII).

Tableau XXIII : Mutations dans le gène S en fonction des génotypes et les cas d'hépatite B.

Substitution des acides aminés Génotypes Hépatite B (%)

A3 E Fausse O Occulte

L115I 0 3 1 2

L115E 0 1 0 1

H133F 0 1 0 1

H133A 0 4 3 1

G145R 0 1 1 0

R149A 0 2 1 1

R149D 0 1 1 0

O = Occulte


L’étude a rapporté une prévalence de 7,3% de l'IOB. Elle confirme la prédominance du

génotype E et l’existence d’un sous-groupe de quasi-sous-génotype A3 du VHB au Burkina

Faso. Elle a aussi fourni des informations sur l’existence de « fausse IOB ». L’étude a observé

des mutations dans la région MHR du gène pré-S/S du VHB.

DISCUSSION


CHAPITRE IV : DISCUSSION

1. Séroprévalence du virus de l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou

et la nécessité de vaccination contre l’hépatite B

Les objectifs de cette étude étaient de :

Evaluer la prévalence du virus de l’hépatite B dans la population générale de

Ouagadougou ;

Sensibiliser, dépister, identifier les marqueurs du VHB et de proposer la vaccination à

ceux qui étaient séronégatifs à l’AgHBs.

1.1. Séroprévalence de l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou

La prévalence du VHB était de 14,5% dans la présente campagne et celle du VHC était de

1%. La faible prévalence de l’hépatite C dans cette campagne ne nous permettait pas de

dégager les facteurs de risques associés à cette infection. Cependant, elle était inférieure à

celle de 4,9% rapportée chez les habitants des zones urbaine, suburbaine et rurale de Bobo

Dioulasso, Burkina Faso (Jeannel et al., 1998). Cette différence pourrait s’expliquer par le

type de la population d’étude, mais aussi de la période de l’étude. La prévalence du VHB était

statistiquement plus élevée chez les hommes comparativement aux femmes (p = 0,002). Ce

résultat est similaire à ceux de Makuwa et al., en 2009 au Gabon (16,2 % contre 9,9 %)

(Makuwa et al., 2009), Tsay et al., en 2009 en Taiwan (21,7 % contre 17,2 %) (Tsay et al.,

2009) et Deng et al., en 2013 en Chine (6,54 % contre 3,87 %) (Deng et al., 2013).

La prévalence de 14,5% du VHB de cette campagne est similaire à celle de 14,3 % et 14,7 %

rapportées respectivement chez les donneurs de sang à Nouna (Collenberg et al., 2006) et

dans la population générale de Bamako. Elle est inférieure à celles de 17,3 % rapportées chez

les femmes enceintes à Ouagadougou (Collenberg et al., 2006). Cependant, elle est

supérieure à celle de 12,1% rapportées chez les personnels de santé du district de Nanoro

(Pietra et al., 2008). Ces différences pourraient s’expliquer par le type et taille de la

population étudiée. En effet, plusieurs auteurs s’accordent sur le fait que l’hépatite B est

moins fréquente en zone rurale qu’en zone urbaine (Makuwa et al., 2006, Makuwa et al.,

2009).


Notre campagne a rapporté une prévalence de 21,42 % du VHB chez les enfants de moins de

12 ans nés de mère VIH ou VHB séropositive. A ce stade, elle ne nous permet pas de montrer

une évidence de transmission verticale ou horizontale de l’infection. Cependant, il a été

rapporté que la transmission horizontale est la principale voie de transmission du virus de

l’hépatite B chez les nouveau-nés (Kiire, 1996). En absence d’action entreprise pour prévenir

l’infection au VHB durant la grossesse, la transmission verticale demeure un risque important.

L’absence de différence statistiquement significative entre l’infection par le VHB et les

antécédents médicaux (transfusion sanguine, chirurgie et hospitalisation) peut s’expliquer par

l’amélioration de la sécurité transfusionnelle et du système sanitaire de façon générale au

Burkina Faso. En effet, le VIH, les hépatites B et C et le Treponema pallidum sous espèce

pallidum sont systématiquement dépistés en routine au niveau des banques de sang. Toutefois

la prévalence de 16,2 % du VHB parmi les personnes transfusées contre 14,4 % chez les non

transfusées montre que le risque résiduel de transmission par la transfusion sanguine demeure

toujours.

L’infection du VHB était plus élevée dans les tranches d’âges de 30 à 40 ans (16,3 %) et de

20 à 30 ans (15,9 %). Ces résultats montrent que la population jeune est la plus touchée par

l’infection au VHB. Nos résultats sont similaires à ceux de 22,2 % rapportés chez les jeunes

de la même tranche d’âge en zone urbaine au Gabon (Makuwa et al., 2009).

La faible prévalence de 8,8 % enregistrée chez les étudiants pourrait s’expliquer par le fait

qu’ils soient mieux informés sur les hépatites notamment sur les différents modes de

transmission compte tenu de leur niveau d’instruction. Par contre, la prévalence de l’infection

était plus élevée chez les élèves (19,6 %). Cela s’expliquerait par la susceptibilité à ce niveau

d’avoir plus de comportements à risque, notamment sexuel.

La campagne a rapporté une prévalence de 16% du VHB chez les personnes circoncises ou

ayant eu recours au piercing, au tatouage ou la scarification. Ce résultat confirme celui de

Simporé et al., qui ont rapporté que les pratiques culturelles et la chirurgie médicale

constituaient la troisième voie de transmission du VHB et du VHC en Afrique (Simpore et

al., 2007).

Au Burkina Faso, des stratégies vaccinales ont été mises en place par le Ministère de la santé.

On peut citer l’introduction de la vaccination contre l’hépatite B dans le Programme Elargi de

Vaccination (PEV) depuis Janvier 2006. Malgré l’existence de ces mesures beaucoup de

personnes manque d’informations quant à l’importance de la vaccination contre l’hépatite B


comme premier moyen de prévention. Ils sont nombreux, ceux qui ignorent également les

possibilités de prise en charge médicale des hépatites chroniques. Une meilleure organisation

et une intensification des campagnes de sensibilisation sur les hépatites virales B et C

permettraient de réduire leurs prévalences au sein de la population.

1.2. Sensibilisation sur l’hépatites B et détermination la couverture vaccinale contre

l’hépatite B dans la population générale de Ouagadougou.

Dans cette seconde campagne, 9,8 % de la population générale étaient porteurs de l’AgHBs

du virus de l’hépatite B. Cette prévalence est inférieure à celle de 14,5 % de la campagne

précédente. Elle est également inférieure à celles de 14,3 %, 17,3 % et de 12,9 % rapportées

respectivement chez les donneurs de sang de Nouna, de Ouagadougou et du Centre national

de transfusion sanguine du Burkina Faso (Collenberg et al., 2006, Tao et al., 2013).

Cependant, notre prévalence était similaire à celles de 9,3 % et 9,8 % rapportées chez les

femmes enceintes au Burkina Faso (Simpore et al., 2004, Simpore et al., 2006). D’une

manière générale, ces différences pourraient s’expliquer par la taille et le type de la population

d’étude et d'autres caractéristiques socio-économiques. Il faudra également mentionner que la

participation volontaire à une campagne de dépistage comporte des biais d’auto-sélection. En

outre, elles pourraient aussi s’expliquer par les limites des tests sérologiques utilisés car

l'incapacité de ceux-ci dans certains cas à détecter l’AgHBs peut avoir plusieurs explications

moléculaires (Samal et al., 2012). Aussi, avec une faible expression de l’AgHBs, il est

souvent possible de trouver une personne indétectable à cet antigène mais positive à l’anti-

HBc avec une très faible charge virale (Gerlich, 2004, Seo et al., 2015, Yoshikawa et al.,

2007). Ainsi, la seule détermination de l’AgHBs peut ne pas être le moyen idéal de définir

l'état d’un porteur dans une population d'étude.

Après une analyse multivariée, l’infection au VHB était significativement associée à l’âge

(21-30 ans) et au statut vaccinal. La prévalence de 13,4 % de l'hépatite B dans cette tranche

d’âge de notre campagne demeure néanmoins élevée, bien qu'inférieure aux prévalences de

22,2 % et 16,3 % des études antérieures rapportées respectivement chez les jeunes du Gabon

(Makuwa et al., 2009) et du Burkina Faso lors de notre première campagne. Ce taux de

prévalence élevée pourrait s’expliquer par l’ampleur des comportements sexuels à risque des

jeunes, l’usage des seringues non stériles, des rites coutumiers de scarification, de l’excision

des filles et de la circoncision des garçons avec des lames souillées. La campagne a aussi


trouvé une prévalence élevée du VHB (11,3 %) chez les mariées par rapport aux célibataires

(8,8 %). Cela pourrait augmenter le risque de transmission du VHB dans la population.

Les prévalences élevées de 11,6 % et 13,1 % retrouvées respectivement dans les tranches

d’âges de 31 à 40 ans et de 41 à 50 ans dans cette campagne pourraient s’expliquer par le fait

que la plupart de l'exposition au VHB a été associée à la promiscuité des patients (Harania et

al., 2008, Pietra et al., 2008).

Le taux global de 6,8 % de couverture vaccinale avant le dépistage était très faible dans cette

campagne. Il était plus élevé en milieu rural qu’en milieu urbain. Cela pourrait s’expliquer par

la différence du nombre d’adhésion à l’étude par zone. Cependant, il était de 49,1 % (27/55)

chez les enfants de plus ou moins cinq (05) ans, et de 19,9 % (93/550) dans la tranche d’âge

de plus ou moins vingt (20) ans. En outre, certaines caractéristiques comme le sexe féminin,

la tranche d’âge ≤ 20 ans et les élèves/étudiants n’ont pas été associés à l’infection par le

VHB. L’augmentation de la couverture vaccinale chez les enfants et les jeunes pourrait

s’expliquer par l’impact de la politique vaccinale adoptée par le Ministère de la Santé du

Burkina Faso pour prévenir l’infection au virus de l’hépatite B chez les enfants depuis 2006, à

travers le Programme Élargi de Vaccinations (PEV), qui préconise d’administrer le vaccin

anti-VHB à tous les enfants à 8 semaines après la naissance. En effet, la prévalence du VHB

était de 0,0 % (0/27) chez les enfants de plus ou moins cinq (05) ans vaccinés et de 3,6 %

(1/28) chez les non vaccinés de la présente campagne. La couverture vaccinale de 31,6 %

(628/1 990) contre l’hépatite B obtenue après le dépistage est une preuve tangible que les

campagnes de sensibilisation et du dépistage mieux accrues permettent de réduire la

prévalence de l’infection dans la population. Nous notons qu’en dehors de la tranche d’âge du

PEV, le vaccin est payant. Ce taux de vaccination reste néanmoins faible du fait du coût du

vaccin (entre 21 500 et 27 500F CFA les trois doses) qui malgré les efforts de subvention

demeure encore inaccessible à une grande partie de la population.

En outre, l’analyse multivariée a montré que les personnes non vaccinées contre l’hépatite B

avaient environ 6 fois (OR : 5,7 ; 95 % IC : 1,8 - 18,0) plus de risque d’être infectées par le

VHB que celles vaccinées. Cela montre clairement que des efforts supplémentaires doivent

être faits pour améliorer la couverture vaccinale de la population en générale et de la jeunesse

en particulier afin de réduire le risque d'infection dans la population.

La campagne a rapporté une faible prévalence de l’hépatite C (0,9 % soit 2/217) chez les

individus positifs à l’AgHBs. Cependant, d’autres études ont rapporté des prévalences de 4,0


%, et 6,3% respectivement chez les donneurs de sang de Koudougou et des centres régionaux

de transfusion sanguine du Burkina Faso (Nagalo et al., 2011a, Nagalo et al., 2012). Des

prévalences comprises entre 2,0 % et 5,4 % ont aussi été rapportées chez les femmes

enceintes de Ouagadougou (Simpore et al., 2005, Simpore et al., 2006, Serme et al., 2006,

Zeba et al., 2011). Une coïnfection par le VHB/VHC est possible en raison du mode commun

de transmission (Zeba et al., 2012). La coïnfection VHB/VHC est responsable de multiples

dommages hépatiques allant de troubles histologiques mineurs, à la cirrhose et au carcinome

hépatocellulaire (Halima et al., 2010). Elle contribue également à une mauvaise prise en

charge de l’infection par le VHB si elle n’est pas diagnostiquée assez tôt.

L’antigène HBe (AgHBe) était présent chez 6,0 % (13/217) des participants de cette

campagne. Il était essentiellement présent chez les jeunes (12/88) dans la tranche d’âge d’au

plus 30 ans. Ce taux est inférieur à ceux de 11,1 % et de 31,4 % rapportés chez les femmes

enceintes du Burkina Faso (Ilboudo et al., 2002, Sangare et al., 2009). Cependant, d’autres

études ont montré que la présence de l’AgHBe est un facteur de risque de transmission et de

chronicité du VHB (McMahon, 2010, Pande et al., 2013). Les différences observées entre les

taux de l’AgHBe pourraient s’expliquer par la différence de la population d’étude.

Dans cette campagne, l’Anti-HBc était présent chez 100,0 % (217/217) des participants

AgHBs positifs. Ce résultat est supérieur à ceux de 69,6 % et de 76,4 % rapportés

respectivement chez les donneurs de sang de Nouna et de Ouagadougou (Collenberg et al.,

2006). Ces différences pourraient s’expliquer par le fait que notre sous population était biaisée

en raison de la sélection des participants AgHBs positifs. Cependant, la détection des

anticorps anti-HBc est maintenant reconnue comme un marqueur de l'exposition ou comme

évocatrice d'une infection occulte à l’hépatite B (Mulrooney-Cousins and Michalak, 2007,

Mulrooney-Cousins and Michalak, 2015, Sondlane et al., 2016).

2. Modulation de la coïnfection VIH-1/VHB par les polymorphismes d’APOBEC3G au

Burkina Faso

L’objectif de la deuxième étude était de déterminer la fréquence des polymorphismes

d’APOBEC3G chez les personnes coinfectées VIH-1/VHB et les témoins séronégatifs au

VIH/VHB.

Nous avons étudié la distribution de trois variations génétiques, rs8177832, rs3522851 et

rs6001417 dans le gène APOBEC3G dans une population VIH-1, VHB, et VIH-1/VHB


positif (cas) et VIH-1/VHB séronégative (témoin) du Burkina Faso. Nous avons déterminé la

prévalence du VHB dans ces 2 groupes. En effet, la prévalence de 12,8 % de l'infection par le

VHB retrouvée chez les témoins était largement inférieure à celle de 56,7 % rapportée chez

les sujets VIH-1 positifs de la présente étude. Cependant, cette prévalence de 56,7 % est

similaire aux données de coïnfection VIH-1/VHB de l'Afrique sub-saharienne (Burnett et al.,

2005). Seul le génotype E du VHB était présent dans les échantillons. Cela confirme sa

prédominance en Afrique de l'Ouest en général et au Burkina en particulier (Kramvis and

Kew, 2007a, Sayan et al., 2014). En outre, il a été rapporté que le génotype E est plus fréquent

chez les personnes coinfectées VIH-1/VHB (Yousif et al., 2014).

Pour la comparaison des différentes fréquences des polymorphismes rs6001417, rs8177832,

et rs35228531 d’APOBEC3G chez les cas et les témoins, nous avons procédé à un

génotypage puis avons décrit la fréquence des 3 génotypes (SNPs) et leurs haplotypes. Des

faibles fréquences de 0,148 et 0,120 de l’allèle mineur G ont été observées respectivement

chez les cas et les témoins, mais la différence n’était pas significative (Ezzikouri et al., 2013).

L’allèle mineur, du variant rs8177832, avait une fréquence de 0,48 chez les témoins par

rapport à celle de 0,42 chez les sujets coinfectés par le VIH-1/VHB. Les résultats du

génotypage ont montré que tous les 3 loci sont en équilibre de Hardy-Weinberg. Cela suppose

que les variations génétiques de l'hôte jouent un grand rôle dans l’hyper-mutation et ses

conséquences cliniques. Cette remarque confirme les résultats d’une étude récente qui a

montré que le rs8177832 (H186R) ainsi que les variants rs6001417 et rs35228531 seraient

associées à une protection contre l’infection au VIH-1 au Burkina Faso (Compaore et al.,

2016). Nos résultats suggèrent aussi que les allèles mineurs G, T et G sont protecteurs contre

une infection chez les porteurs homozygotes respectivement pour les variants des rs6001417

[OR = 0,78 (IC à 95 % 0,63 à 0. 97), p = 0. 022], rs8177832 [OR = 0,61 (IC à 95 % : 0. 41- 0.

09, p = 0. 01] et rs35228531 [OR = 0,63 ; (IC à 95 % : de 0,50 à 0,78, p < 0,001]. Cela

pourrait s’expliquer par le fort déséquilibre de liaison entre ces variants. La présente étude a

montré une réduction du risque d’infection pour le variant rs35228531 chez les patients

infectés par le VIH-1 et le VHB, porteurs de l'allèle mineur T à l'état homozygote [OR = 0,63

(IC 95 % : 0,50 à 0,78), p < 0,001]. Mais le risque de coïnfection au VIH-1/VHB était presque

double lorsque l'allèle sauvage de type C se présente à l’état homozygote [OR = 1,76 (IC 95

% : 1,26 à 2,38) ; p < 0,001].

Chez les sujets mono-infectés par le VHB, les variants rs6001417 et H186R ont été associés

respectivement à un risque d’infection accrue aux génotypes hétérozygotes CG et AG. Mais il


n’y avait pas d’effet significatif pour les génotypes mineurs. Les génotypes hétérozygotes

pourraient donc favoriser le développement du carcinome hépatocellulaire (CHC). En effet,

certaines études ont montré que l’expression de certains polymorphismes d’APOBEC3G sont

associés au risque de développement du CHC et la survie du patient (He et al., 2017).

Nos résultats montrent que les variants rs6001417 et rs352285311, bien que ne figurant pas

dans la région codante, ont un effet important sur la transcription du gène APOBEC3G. Nous

avons observé des associations spécifiques entre certains haplotypes et l’infection dans le

groupe coinfecté comparé au témoin. En effet, l’haplotype GGT était associé à la protection

contre la coïnfection VIH-1/VHB [OR = 0,57 (IC à 95 % : 0,33 à 0,99), p = 0,05].

L’association entre les autres haplotypes et le risque d’infection n’était pas statistiquement

significative. L’APOBEC3G serait donc un gène de susceptibilité sous la forme sauvage de

certains de ces variants pour la coïnfection au VIH-1/VHB dans notre population d’étude.

3. La caractérisation moléculaire du virus de l'hépatite B chez les donneurs de sang du

Burkina Faso

L’objectif de la troisième étude était de caractériser les génotypes du virus de l’hépatite B

circulants au Burkina Faso.

On sait peu sur l'épidémiologie moléculaire de l'infection à VHB au Burkina Faso, en

particulier chez les donneurs de sang, malgré la prévalence de 12,4 % de l'infection observée

dans la présente étude. Cette prévalence est en accord avec celles de 13 - 19 % précédemment

rapportées dans la région (Collenberg et al., 2006 ; Nagalo et al., 2011a ; Nagalo et al., 2012).

La région pré-S/S du VHB a été amplifiée avec succès dans 37 % (101/273) des échantillons

positifs à l’AgHBs. Ce résultat est similaire au taux d'amplification de 38 % précédemment

rapporté chez les femmes enceintes infectés par le VHB au Ghana (Candotti et al., 2007).

Cependant, il est significativement plus faible que les taux d'amplification de 47 % et 69 %

rapportés respectivement chez les donneurs de sang de la Guinée (Garmiri et al., 2009) et du

Soudan (Mahgoub et al., 2011). Ce faible taux d'amplification des ADN pourrait être lié à la

dénaturation de l’ADN durant les différentes expéditions des échantillons d’ADN. La faible

charge virale dans ces échantillons ne peut être exclu car il a été rapporté que ≈ 50 % des

donneurs de sang de l'Afrique occidentale infectés par le VHB ont une charge virale de l'ADN

du VHB < 102 UI/mL (Allain et al., 2003, Candotti et al., 2006). Le manque de ressources

locales et les volumes limités des échantillons ainsi que le transport des ADN du VHB ont

affaibli l’investigation.


Les séquences pré-S/S de 99 donneurs de sang AgHBs (+) et asymptomatiques ont été

analysées. Le génotype E du VHB était le plus prédominant (72 %), confirmant ainsi les

données antérieures des pays de l'Afrique de l'Ouest (Figure 21) (Mulders et al., 2004,

Olinger et al., 2006, Garmiri et al., 2009, Forbi et al., 2013). L'analyse phylogénétique a

montré un enchevêtrement étendu des 65 séquences pré-S/S Burkinabè avec 301 séquences

VHB/E provenant des pays sub-sahariens, constituant un vaste croissant qui enjambait le long

de la côte Ouest et étendu à l'Afrique de l'Est (Figure 22). Des études antérieures ont suggéré

une lignée du génotype VHB/E distincte avec une diversité génétique plus faible dans la

partie Sud de l’Afrique (Angola, RDC et la Namibie) et une plus grande diversité dans les

isolats de la partie Nord (Hubschen et al., 2008, Lago et al., 2014). L'existence d'un tel groupe

méridional spécifique n'a pas été confirmée dans l'analyse des régions pré-S/S de la présente

étude (Tableau XIX). L'analyse des séquences Burkinabè a confirmé la faible variabilité

génétique de souches du génotype E signalée précédemment, quelle que soit leur origine

géographique, souvent à des milliers de kilomètres de distance et d'autres caractéristiques des

patients. La moyenne de la diversité génétique des séquences pré-S/S Burkinabè était

significativement plus faible que celle des 301 séquences précédentes (0,73 % vs 0,96 % ; P =

0,0002). Dans les pays voisins de l’Afrique de l’Ouest, la diversité génétique du génotype E

de notre étude était similaire à celle de la Guinée (0,64 %), mais nettement inférieure à celle

du Ghana (1,28 %), du Bénin (1,16 %), du Niger (1,47 %) et du Nigeria (1,07 %). Une faible

diversité a également été observée entre les séquences des régions centrales et méridionales de

l’Afrique dont le Cameroun (0,65%), la Centrafrique (0,82 %) et la Namibie (0,36 %). La

similitude de la diversité des séquences observées au Burkina Faso et en Guinée pourrait être

liée à une similarité des populations de donneurs de sang asymptomatiques étudiés (Garmiri et

al., 2009), alors que les séquences du VHB provenant des autres pays ont été obtenues auprès

des groupes hétérogènes de personnes infectées. Des séquences identiques dans la même

étude peuvent soulever des soupçons légitimes à propos de la contamination croisée des

échantillons. Ici, la contamination croisée pendant la procédure d'amplification peut être

définitivement exclue dans la majorité des cas, étant donné que tous les contrôles ont été

négatifs et les réactions PCR ont été réalisées de façon indépendante à 6 mois d'intervalle

dans deux laboratoires différents. En outre, comme indiqué précédemment dans plusieurs

études indépendantes et illustré dans le tableau XIX, des séquences virales identiques ont été

trouvées dans des endroits aussi éloignés que le Burkina Faso, la Guinée, le Niger, le Nigeria

et la RCA (Mulders et al., 2004). Une faible diversité (1,59 %), y compris l'identité des


séquences dans différents pays, a également été décrite pour les séquences prè-C/C du

génotype E (Olinger et al., 2006).

Le génotype A du VHB était le seul génotype minoritaire trouvé chez les donneurs de sang du

Burkina Faso avec une prévalence de 25 % (Figure 21). Cette prévalence était plus élevée par

rapport à celle de 9 % de Mulders et al., au Burkina Faso (Mulders et al., 2004), et de celles

d'autres pays Ouest-africains dont le Bénin [3 % (Mulders et al., 2004, Fujiwara et al., 2005)],

Gambie [5 % (Stewart et al., 2011, Shimakawa et al., 2016)], le Ghana [8 % (Candotti et al.,

2006, Forbi et al., 2013)], la Guinée [1 % (Garmiri et al., 2009)], la Guinée-Bissau [0 %

(Honge et al., 2014)], la Côte-d'Ivoire [10 % (Suzuki et al., 2003, Forbi et al., 2013)], le Mali

[7 % (Mulders et al., 2004, Olinger et al, 2006)], la Mauritanie [12 % (Mansour et al.,

2012)], le Niger [0 % (Abdou Chekaraou et al., 2010)], le Nigeria [7 % (Mulders et al., 2004,

Olinger et al., 2006, Hubschen et al., 2011, Forbi et al., 2013)], et le Togo [(0 % (Mulders et

al., 2004)]. Cependant, une prévalence similaire de 26 % du génotype A et 74 % du génotype

E a été rapportée chez les donneurs de sang et des porteurs asymptomatiques du Sénégal

(Vray et al., 2006, Maylin et al., 2015). Comme indiqué ci-dessus, 37 % des échantillons

AgHBs (+) ont pu être amplifiés par PCR et séquencés. On pourrait formuler comme

hypothèse que les échantillons avec une charge virale élevée ont été préférentiellement

amplifiés et aussi les données de prévalence peuvent être biaisées. Comparativement aux

souches du génotype E, la phase d'infection AgHBe-négative liée à une mutation du codon

stop à la position 1896 n’est pas favorisée dans des souches du génotype A en raison de

contraintes sur la structure secondaire de l'ARN viral à cette position (Alexopoulou and

Karayiannis, 2014). Cependant, à notre connaissance, il n'y a pas de données dans la

littérature suggérant que les infections aux A3QS sont associées à des charges virales plus

élevées par rapport aux infections par le génotype E (Kurbanov et al., 2005 ; Makuwa et al.,

2006).

Une analyse phylogénétique a montré que toutes les séquences pré-S/S Burkinabè de

génotype A étaient regroupées dans le clade Quasi sous-génotype A3 récemment affinée en

même temps que la grande majorité des séquences du génotype A de l’Afrique de l'Ouest

précédemment caractérisée (Figure 23). Dans le clade A3QS, les séquences pré-S/S

Burkinabè à l’exception d’une seule, ont formé leur propre groupe étroitement lié à un sous-

groupe de l’Afrique de l'Ouest comprenant des séquences de la Gambie, de la Guinée et du

Mali. Les sous-groupes monophylétiques du clade A3QS ont tendance à regrouper les

séquences en fonction de leur origine géographique. Des valeurs bootstrap > 70 % ont


soutenu non seulement les sous-groupes regroupant les précédentes séquences Camerounais

A7 "provisoire" et Haïtiennes A5 "provisoires", mais aussi un sous-groupe « Centre-Ouest

africain » des séquences du Cameroun et du Nigeria. Ce lien géographique apparent entre les

séquences Africaines du A3QS peut soutenir une origine Centre-Ouest africaine du A3QS où

il est prédominant [en moyenne 65 % au Cameroun (Mulders et al., 2004, Olinger et al.,

2006, Hubschen et al., 2011, Foupouapouognigni et al., 2011, Forbi et al., 2013) et 81 % au

Gabon (Makuwa et al., 2006, Makuwa et al., 2009)] et co-circule avec le génotype E, et sa

propagation au nord (Zehender et al., 2015). A l'exception de la prévalence de 20 % rapportée

en Haïti (ancien A5), la quasi-absence de souche A3QS chez les Afro-américains suggère

qu’elle s’est récemment répandue en Afrique de l'Ouest, bien qu'une hypothèse alternative

pourrait être qu'elle a été remplacée par le génotype E à la fin de la traite des noires comme

proposé pour le sous-génotype A1 (Andernach et al., 2009, Zehender et al., 2015).

Comme indiqué dans les résultats, les séquences pré-S/S A3QS ont montré une plus grande

variabilité génétique par rapport aux séquences du génotype E (1,55 % contre 0,92 %, P <

0,0001). Ce résultat est similaire à ceux de 1,36 % vs 1,87 % et de 2,85 % vs 2,29 % de

divergence nucléotidique intra-groupe respectivement par rapport au gène S et à la région pré-

C/C du génome complet du VHB (Makuwa et al., 2006, Olinger et al., 2006, Hübschen et al.,

2011). Dans l'ensemble, le A3QS semblait avoir une histoire d'évolution plus longue que le

génotype E. Cependant, à l'exclusion de la séquence BF254, les séquences A3QS du Burkina

Faso ont montré une diversité génétique intra-groupe significativement plus faible (0,75 %)

par rapport aux autres sous-groupes africains A3QS (1,11 % à 1,76 %). Trois triplets des

souches Burkinabè ont montré des séquences pré-S/S identiques (Tableau XIX). Des études

antérieures avaient rapporté des paires de séquences pré-S/S identiques en Guinée et en Haïti,

mais également des séquences pré-C/C identiques (Olinger et al., 2006, Andernach et al.,

2009, Garmiri et al., 2009). Il a été suggéré que la faible similarité des divergences observées

entre les souches haïtiennes (0,79 % par rapport à la région pré-S/S) reflète probablement leur

confinement géographique (Andernach et al., 2009). Cela semble peu probable dans le cas du

Burkina Faso, qui fait partie des principales routes commerciales transafricaines. La faible

diversité génétique des souches A3QS identifiées chez les donneurs de sang de Ouagadougou

peut relativement indiquer une introduction récente et/ou homogène de souches A3QS au

Burkina Faso. L'analyse des ratios dS/dN (substitutions synonymes/Non synonymes) des

régions pré-S/S-Pol des deux génotypes a suggéré une sélection relativement négative et


probablement liée à la présence de chevauchement de deux cadres ouverts de lecture ou un

manque d'efficacité de la réponse immunitaire de l'hôte.

A partir de l'analyse phylogénétique des séquences pré-S/S, six séquences des 99 (6,1 %)

étaient aberrantes à la racine du génotype A ou E. L'analyse avec le logiciel SIMPLOT a

identifié ces séquences comme des recombinants possibles de quasi sous-génotype A3 et le

génotype E (Figure 24). Les investigations visant à confirmer une recombinaison inter-

génotypique n’ont été réalisées que sur trois échantillons en raison de la faible quantité de

l'ADN viral. De nouvelles amplifications de la région pré-S/S en utilisant la même technique

PCR, le clonage des produits amplifiés et le séquençage de plusieurs clones ont montré la

coexistence des séquences non-recombinantes de A3QS et de génotype E dans ces trois

échantillons. En outre, les séquences de recombinaison minoritaires détectées dans les

échantillons BF258 (n = 1) et BF268 (n = 2) montraient une diversité de points d'arrêt par

rapport aux clones individuels et à la séquence consensus initialement obtenue par séquençage

direct des produits PCR. Aucune séquence recombinante n’a été détectée dans l'échantillon

BF276. Ces données suggèrent une coïnfection par les souches A3QS et E du VHB chez les

donneurs de sang Burkinabè plutôt qu’une infection avec des souches recombinantes

circulantes. L’infection mixte avec deux génotypes différents semblait favoriser les artefacts

lors de l'amplification par PCR, ce qui peut conduire à la conclusion erronée qu’il y a eu une

recombinaison inter-génotype (Araujo, 2015). En effet, l'extension de chevauchement de la

PCR est une méthode couramment utilisée par les biologistes moléculaires dans des

expériences in vitro de mutagenèse. Cela a été démontré indirectement par l'obtention de

motif de recombinaison similaire lors du mélange artificiellement de deux souches

indépendantes de génotype A et E du VHB avant l’amplification (Figure 24). Par conséquent,

une attention particulière devrait être accordée à la méthode utilisée pour obtenir à la fois des

séquences partielles et complètes du génome. En particulier, la prévalence des souches

recombinantes circulant de l'hépatite B peut être surestimée lorsque la séquence nucléotidique

complète du génome est obtenue par assemblage de plusieurs séquences à partir des fragments

sous-génomiques de différente PCR au lieu de séquençage d'un produit PCR unique.

Récemment, un total de 436 recombinants inter-génotypiques du génome complet du VHB a

été identifié dans la base de données GenBank (Araujo, 2015). Cependant, les publications

des détails sur les méthodes expérimentales utilisées n’étaient disponibles que pour 317/436

(73 %) des séquences et seulement 223 d'entre eux (70 %) ont été obtenus à partir d'un unique

produit PCR.


Des putatifs artefacts de PCR semblent se produire à des positions favorisées entre 200 - 600

nucléotides dans la région de la séquence pré-S/S (Figure 24). Une tendance similaire a été

signalée dans la séquence pré-S/S d'une souche ghanéenne dont la classification initiale A/E

recombinante peut être réexaminée (Garmiri et al., 2009). Cette région du génome du VHB

pourrait être particulièrement sujette à un réarrangement d'ADN pendant la PCR, mais n'a pas

été identifiée comme un point sensible de recombinaison significative dans les études à

grande échelle (Simmonds and Midgley, 2005, Araujo, 2015). En effet, le point putatif de

rupture trouvé aux environs de 3000 nt dans les séquences BF284 et BF311 était similaire à

ceux observés dans les souches confirmées recombinantes D/E du Niger, du Soudan et du

Ghana ; et une souche recombinante A2/E du Gabon (Makuwa et al., 2006, Garmiri et al.,

2009, Abdou Chekaraou et al., 2010, Mahgoub et al., 2011). Le domaine entre 1 500 - 2 500

nt dans le gène pré-C/C a été caractérisé comme le principal point sensible de recombinaison

(Simmonds et Midgley, 2005, Araujo, 2015). Par conséquent, l'analyse de séquence limitée à

la région pré-S/S peut sous-estimer le taux de recombinaison entre les souches Burkinabè du

VHB.

4. Détermination de l’infection occulte par le virus de l’hépatite B et les génotypes

associés chez les sujets séronégatifs à l’AgHBs au Burkina Faso.

L’objectif de la quatrième étude était de déterminer les cas d’infection occulte par le VHB et

les génotypes associés chez les patients séronégatifs à l’AgHBs.

Dans cette étude, la prévalence globale des anticorps anti-HBc était de 20,1 % (44/219) chez

les sujets négatifs à l’AgHBs. Cette prévalence est inférieure à celle de 44,0 % rapportée chez

les donneurs de sang négatifs à l’AgHBs au Burkina Faso (Somda et al., 2016). Cependant,

elle est supérieure à celle de 7,8 % et de 16,6 % rapportées chez les donneurs de sang négatifs

à l’AgHBs en Egypte (Antar et al., 2010, Said et al., 2013). Ces différences pourraient

s’expliquer par la différence de la taille et le type de la population étudiée mais aussi par

l’endémicité du VHB.

Jusqu’à présent, la majorité des études sur l’infection occulte par le virus de l’hépatite B a été

menée sur les donneurs de sang, les patients polytransfusés ou atteints d’hépatopathies

avérées ou encore coinfectés. Les données sur la prévalence de l'IOB sont limitées en Afrique

subsaharienne notamment chez les sujets présumés sains. La prévalence de l'infection occulte

par le VHB était de 7,3 % dans notre étude. Celle-ci est inférieure à celles de 10 %, 15 % et

de 32,8 % rapportées respectivement chez les patients positifs au VIH en Côte d'Ivoire en


2010 et au Soudan en 2014, et chez les donneurs de sang du Burkina Faso en 2016 (N'Dri-

Yoman et al., 2010, Mudawi et al., 2014, Somda et al., 2016). Néanmoins, la prévalence

observée dans notre étude était comparable à celle de 6,25 % rapportées chez les donneurs de

sang Egyptiens (Antar et al., 2010). Cependant, elle était supérieure à celle de 0,5 % rapportée

chez les donneurs de sang réguliers dans le Sud-Est du Nigéria (Nna et al., 2014). Ces

différences pourraient s’expliquer par la différence de la population étudiée, la sensibilité des

tests de diagnostic utilisés et par l’endémicité du VHB. En effet, plusieurs études ont montré

que l’IOB est significativement associée à l'endémicité du VHB, mais ne se limite pas

seulement aux pays à forte endémicité du VHB (Yuen et al., 2010, Gutierrez-Garcia et al.,

2011). Aussi, l’identification de l'IOB dépend largement des tests de diagnostic de l'AgHBs et

de l'ADN du VHB. Ainsi, les tests utilisant les anticorps polyclonaux présentent une plus

grande sensibilité et spécificité pour la détection de différents types de mutants de l’AgHBs

que ceux utilisant les anticorps monoclonaux (Ireland et al., 2000, Weber, 2006). Il est aussi

important de noter que la nature et la quantité de l'échantillon testé (sang ou tissu hépatique)

ainsi que les risques de contamination peuvent également affecter la détection de l’IOB (Zhu

et al., 2016).

Un faible niveau de charge virale du VHB (< 200 UI/mL) a été observé dans les cas de l’IOB

de la présente étude. En effet, plusieurs études ont montré que dans la majorité des cas d’IOB

le faible niveau de la virémie est dû à une infection par le VHB compétant pour la réplication,

montrant une forte suppression globale de l'activité de réplications et de l'expression des

gènes (Brechot et al., 2001, Vivekanandan et al., 2008, Raimondo et al., 2008). D’autres

études ont aussi montré qu’un nombre restreint de cas d’IOB est dû à des mutants du VHB

ayant une activité défectueuse de réplication ou à la synthèse de protéines S (Blum et al.,

1991, Chaudhuri et al., 2004). Il a également été rapporté que l'ADN du VHB peut intégrer

dans le génome de l'hôte infecté par une IOB (Brechot et al., 2001, Brechot, 2004).

Dans la présente étude, plus de deux tiers des sujets présentant l’ADN viral (40/56) avaient

une charge virale ˃ 200 UI/mL (200 à 13,6 106 UI/mL). Cela pourrait être attribué à des

mutations d’échappements qui peuvent conduire à une modification de l'épitope

immunologique inhibant ainsi la sécrétion de l'AgHBs (Bremer et al., 2009). Une étude avait

rapporté une charge virale située entre indétectable et 3 670 UI/mL dans les « cas d’IOB »

chez les donneurs de sang de l’Asie du Sud-Est (Candotti et al., 2012). Et pourtant en 2008,

les déclarations de la réunion des experts à Taormina sur l'infection occulte par le virus de

l'hépatite B avaient clarifié la définition de l’IOB en établissant une valeur seuil de l'ADN


sérique du VHB < 200 UI/mL (Raimondo et al., 2008). En outre, elle a aussi clarifié la

confusion entre une infection manifeste du VHB et une « fausse IOB ». Ainsi, les cas où les

charges virales sont comparables à ceux des phases d’une infection manifeste du VHB sont

généralement dus à une infection par des mutants d'échappement et devraient être étiquetés

comme des « fausses » IOB (Raimondo et al., 2008). C’est des cas d’hépatite B chronique

manifeste. Nous pensons que la non prise en compte de ces définitions peut contribuer à une

surestimation de la prévalence des IOBs.

Le génotype E était le plus prévalent dans les cas d’IOB de cette étude. Les séquences du

génotype E de la présente étude étaient similaires à celles du génotype E précédemment

caractérisées dans notre deuxième étude. Ces résultats confirment l’endémicité et la faible

diversité génétique du génotype E du VHB en Afrique de l'Ouest (Mulders et al., 2004). De

plus, le sous-génotype A3 du VHB, précédemment rapporté au Burkina Faso, a également été

observé dans la présente étude. Ce résultat confirme ceux des études précédentes qui ont

montré que le sous-génotype A3 du VHB et la recombinaison entre les génotypes A et E du

VHB sont fréquemment observés en Afrique de l'Ouest (Kurbanov et al., 2005 ; Makuwa et

al., 2006).

Dans la présente étude, les mutations L115I/A ; H133F/A, et R149A/D ont été retrouvées

dans les cas d’IOB. Cependant, les résultats des études antérieures ont rapporté que le gène

Pré-S/S a un taux de mutation relativement élevé (Zhu et al., 2016). Ces mutations

ponctuelles peuvent affecter l'antigénicité, l'immunogénicité, la sécrétion et/ou l'expression de

l’AgHBs, conduisant ainsi à l'échec de détection de cet antigène (Ireland et al., 2000, Hsu and

Yeh, 2011). Elles peuvent aussi réduire ou même supprimer la réplication et/ou la sécrétion

du virion, exerçant un effet négatif sur l’AgHBs (Kalinina et al., 2003, Huang et al., 2012). Il

a aussi été rapporté que les substitutions des acides aminés (aa) de l'AgHBs sont fréquemment

retrouvées dans le déterminant « α », qui est situé entre le 124ème

et 147ème

aa de la protéine S

(Zhu et al., 2016). Ce déterminant « α » est un domaine relativement conservé dans la région

hydrophile majeure (MHR) entre le 100ème

et 169ème

aa, qui sert en tant que déterminant

antigénique le plus important dans toutes les souches du VHB et est essentielle à la détection

de l'AgHBs et le développement de vaccins contre le VHB (Norder et al., 1992, Seeger and

Mason, 2000). Les acides aminés dans la région comprise entre le 120ème

et 123ème

se sont

avérés être essentiels à l'antigénicité de l’AgHBs (Tian et al., 2007). Par conséquent, des

mutations ponctuelles ou multiples se produisant à l'intérieur ou à proximité du domaine "α"

peuvent déterminer l'antigénicité et la conformation de l'AgHBs, ce qui entraîne sa non-


détection (Zhu et al., 2016). Toutes les mutations caractérisées dans cette étude étaient situées

dans la région Hydrophile Majeure (MHR) du gène S et pourraient expliquer la nature de

l’infection occulte par le VHB dans notre étude. En outre, les mêmes mutations ont été

observées dans les cas de « fausse IOB ».

La présence des mêmes mutations en plus de celle G145R dans des cas de « fausse IOB » de

la présente étude confirme la conclusion de la réunion des experts à Taormina sur IOB

(Raimondo et al., 2008). En effet, dans les « fausses IOB » la charge virale est semblable à

celle d’une hépatite B chronique manifeste. En outre, le rôle de la mutation G145R a été

clairement établi par plusieurs études dans l’échappement à la vaccination (Kalinina et al.,

2003). D’autres études sont nécessaires pour confirmer les mutations retrouvées dans cette

étude.

CONCLUSION


CONCLUSION GENERALE

Cette étude a rapporté des prévalences de 14,5 % et 9,8 % de l’AgHBs et 1 % de l’Anti-VHC

dans notre population d’étude. Le taux de vaccination avant le dépistage y était très faible.

L’absence de vaccination contre l’hépatite B a été associée à un risque d’environ 6 fois plus

élevé d’être infecté par le VHB. La couverture vaccinale contre l’hépatite B après le dépistage

était de 31,6 %. Cela montre clairement que l’organisation des campagnes de sensibilisation et

dépistage mieux accrues sur le VHB peut augmenter la couverture vaccinale de la population.

Elle a déterminé pour la première fois, le rôle de l’APOBEC3G dans la coïnfection au VIH-

1/VHB au Burkina Faso. Elle a montré qu’APOBEC3G est un gène de susceptibilité contre la

coïnfection à VIH-1/VHB. Elle a également montré d’une part que le risque de coïnfection au

VIH-1/VHB était presque double lorsque l'allèle sauvage de type C du variant rs3522832 se

présente à l’état homozygote ; et d’autre part que les variants rs6001417 et rs8177832 étaient

associés à un risque élevé de mono-infection au VHB respectivement pour les génotypes

hétérozygotes CG et AG.

La présente étude a révélé une prévalence remarquablement élevée du Quasi sous-génotype

A3 du VHB (25 %) co-circulant avec les souches prédominantes du génotype E (72 %) chez

les donneurs de sang asymptomatiques du Burkina Faso. Les infections mixtes aux deux

génotypes ont également été identifiées chez 3 % des donneurs. La faible diversité génétique

des souches du génotype E par rapport à A3QS a été confirmée. L’étude a caractérisé quatre-

vingt-neuf (89) séquences propres au Burkina Faso qui ont été déposées dans la base de

données GenBank (Numéro d’accès : KU702845 à KU702933).

Cette étude a rapporté une prévalence de 7,3 % de l'infection occulte par le VHB chez les

sujets séronégatifs à l’AgHBs au Burkina Faso. Elle confirme la prédominance et la faible

diversité génétique du génotype E du VHB en Afrique de l’Ouest. Elle a aussi confirmé

l’existence d’un sous-groupe de quasi-sous-génotype A3 du VHB propre au Burkina Faso.

Notre étude a aussi fourni des informations sur l’existence de « fausse IOB ». Les mutations

(L115I/A ; H133F/A, et R149A/D) observées dans la région MHR du gène pré S/S peuvent

expliquer la nature occulte de l'infection par le VHB dans notre étude. D’autres études sont

nécessaires pour confirmer les mutations retrouvées dans cette étude.

PERSPECTIVES


PERSPECTIVES

Au regard de nos résultats, nous envisageons comme perspective de :

Caractériser les souches cliniques du virus de l’hépatite B chez les patients atteints

d’hépatite chronique, de cirrhose et du carcinome hépatocellulaire afin d’enduire les

aspects cliniques liés aux génotypes correspondants ;

Caractériser les mutations de résistance aux antiviraux utilisés dans la prise en charge

des patients infectés par le virus de l'hépatite B au Burkina Faso ;

Rechercher l’effet des polymorphismes d’APOBEC3G chez des sujets mono-infectés

par le VHB, en vue de comprendre l’impact de ces polymorphismes sur l’infection au

VHB ;

Déterminer le rôle du polymorphisme d’APOBEC3G dans les cas de carcinome

hépatocellulaire.

REFERENCES


REFERENCES

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ANNEXES


ANNEXES

Annexe I : Fiche d’enquête sur les hépatites B et C

Counseling pré-test

Code…………….. Date…………………………conseiller…………………Age……………

Domicile…………………….. Secteur……………… Profession……………………….

Statut matrimonial…………………Sexe…………………….

1- Avez-vous déjà fait le test de dépistage ? Oui □ Non □

Si oui résultats : AgHBs Pos □ Neg □ NSP□ /AcHCV Pos □ Neg □ NSP□

2- Evaluation du risque

Avez-vous été transfusé ? Oui □ Non □ Si oui en quelle année ?...................

Avez-vous déjà subi une opération chirurgicale ? Oui □ Non□

Avez-vous déjà été longtemps hospitalisé ? Oui □ Non □

Avez-vous une mère porteuse du virus ? Oui □ Non □ Si oui lequel des virus ?..............

Avez-vous une mère porteuse du virus ? Oui □ Non □ Si oui lequel des virus ?.............

Avez-vous un membre de votre famille proche porteur de virus Oui □ Non □ Si oui lequel

des virus ?..................

Avez-vous eu recours à des examens médicaux transcutanés ou à l’acupuncture ? Oui □

Non □

Avez-vous fait un piercing, un tatouage, une circoncision, une excision ou une

scarification ? Si oui préciser laquelle des pratiques………………………Oui□ Non□

Avez-vous été incarcérer à un moment de votre vie ? Oui□ Non□

Etes-vous infectés par le VIH ? Oui □ Non □

Avez-vous eu des relations sexuelles non protégées ? Oui□ Non□

Faites-vous partie du personnel d’un établissement de santé ? Oui□ Non□

Avez-vous déjà pris de la drogue par voie intraveineuse ? Oui□ Non□

3- Etes-vous prêt à accepter un résultat positif ? Oui□ Non □ NSP□

4- Adhésion au dépistage ? Oui□ Non□

5- Résultats des tests Test rapide □ Test ELISA □

● AgHBs Pos □ Neg □ ●Ac HCV Pos□ Neg □

6- Retour pour les résultats : Oui□ Non □

Counseling post-test

Code………….Date………………………………conseiller ………………..

Counseling supplémentaire ? Oui □ Non □

Date de RDV pour une évaluation clinique : …………………………………….

Observations : ……………………………………………………………….


Annexe II : Extraction de ADN/ARN par Genomic DNA Express (Sacace

Biotechnologies)

Protocole d’extraction

Pour l’extraction de l’ADN et de l’ARN, nous avons utilisé le kit selon les indications du

fabricant, comme suit :

1. Ajouter 25 µL protéinase K dans 200 µL de sérum. Si le volume du plasma est inférieur à

200 µL, le compléter avec du PBS.

2. Ajouter 200 µL de tampon de lyse BQ1 aux échantillons puis vortexer pendant 15 à 20

secondes. Le lysat devrait devenir brunâtre pendant l’incubation avec BQ1. Pour l'isolement

de l'ADN à partir d'échantillons de sang conservés pendant longtemps ou coagulé, il est

recommandé d’étendre l’incubation de la protéinase K à 30 minutes, et vortexer plusieurs

fois au cours de cette étape.

3. Ajouter 200 µL d’éthanol (96-100%) aux échantillons puis vortexer pendant 15 à 20

secondes. Après avoir mélangé, centrifuger brièvement le tube de 1,5 mL pour récupérer les

gouttelettes à l'intérieur du couvercle.

4. Appliquer le mélange de l'étape 3 à la colonne (dans un tube collecteur de 2 mL) sans en

mouiller le bord, fermer le bouchon et centrifuger à 11000 g pendant 1 minute. Jeter les tubes

collecteurs.

5. Placer les colonnes dans de nouveaux tubes collecteurs et ajouter 350 µL de tampon.

BQ2. Centrifuger à 11000 g pendant 3 minutes. Jeter les tubes collecteurs.

6. Placer les colonnes dans des tubes de 1,5 mL et ajouter 50 µL de tampon d'élution BE

préalablement chauffé (70 °C). Transférer directement le tampon sur la membrane de silice.

Incuber à température ambiante. Puis centrifuger à 11000 g pendant 1 minute.


Annexe III : Protocole d’extraction par la méthode du Salting out

1. Ajouter 1 mL de tampon de lyse des hématies à 500 µL de culot de sang total (frais ou

congelés). Mélanger délicatement à l’aide de la micropipette pendant 15 secondes.

Vortexer, puis centrifugé à 13000 rpm pendant 1 min. Jeter le surnageant.

2. Répéter l’étape 1. Laver trois fois en ajoutant 1 mL H2O distillée (vortexer et

centrifuger à 13000 rpm pendant 1 minutes puis jeter le surnageant).

3. Reprendre le culot dans 370 μL du Mix (80μl de protéinase K-5X tampon, 30μl de

protéinase K, 20 µL de SDS 20% et 240μl H2O et cela par échantillon), puis vortexer.

4. Incuber à 55 ° C pendant 15 min.

5. Ajouter 200 µL de NaCl 5M, vortexer pendant 15 secondes. Isoler les protéines

précipitées par centrifugation à 13000 rpm pendant 5 min.

6. Transférer 500 μL du surnageant dans de nouveaux tubes de 1,5 mL. Ajouter 1 mL

d'éthanol absolu (T° ambiante). Laissez précipiter l'ADN en agitant les tubes

délicatement à la main. Isoler l'ADN par centrifugation à 13000 rpm pendant 1

minute ; puis jeter le surnageant.

7. Laver deux fois avec 800 µL d'éthanol 70% frais (préalablement conservé à -20°C).

Vortexer, et centrifuger à 13000 rpm pendant 1 min puis jeter le surnageant.

8. Eliminer le reste d'éthanol en égouttant les tubes sur du papier absorbant, puis les

sécher à bouchon ouvert sur incubateur.

9. Dissoudre l'ADN dans 100 µL de Tampon d’élution (TE) et vortexer pendant 30

secondes puis incuber. Utilisez 2 µL d'ADN pour la quantification au Nanodrop.

Conserver l’ADN à -20°C. La pureté de l’ADN utilisé pour le génotypage était

comprise entre 1,8 et 1,9.

Tampon de lyse pour l’extraction : Quantités et concentrations pour 1L

0.32 M Sucrose 109,5 g sucrose

5 mM MgCl2 10 mL 5M MgCl2

12 mM Tris-HCl 12 mL 1M Tris-HCl

1% Triton X-100 10 mL Triton X-100

Tampon 5X Protéinase K (0.375 M Nacl/ 0.12 M EDTA).


Annexe IV : Fiche d’entretien médical pré don

DCSAQ COL_E001

Version 2 Assurance Qualité/Collecte

Date de création :

Tout CRTS 02/11/2005

Date d’application :

15/05/2010

FICHE D’ENTRETIEN MEDICAL PRE DON

Date du jour/___/___/______/Numéro de don :………………………..………….. 1. Type collecte ? Fixe/__/ Mobile/__/ 2. Est-ce votre premier don ? /__/ Oui /__/ Non Si premier don, dites en une phrase vos motivations ? …………………………………………………...

3. Vivez-vous en couple ? /__/OUI : /__/Monogamie /__/Polygamie

/__/NON : /__/Célibataire /__/Divorcé(e) /_/ Veuf (ve) 4. Vous sentez-vous en ‘bonne santé’ en ce moment ? Oui/__/ Non/__/ Avez-vous eu par le passé ou avez-vous actuellement les affections suivantes ? 5. Maladies cardiovasculaires (HTA, HoTA, palpitations, …) ? Non /__/Oui /__/ (précisez) …….

6. Asthme ? Oui /__/ Non /__/

7. Tuberculose ? Oui /__/ Non /__/

8. Diabète ? Oui /__/ Non /__/

9. Epilepsie ou autres maladies neurologiques ? Oui /__/ Non /__/

10. Drépanocytose (SS, SC, CC ….) ? Oui /__/ Non /__/

11. Avez-vous déjà eu une transfusion de sang ? Oui /__/ Non /__/

12. Avez-vous déjà pris de la drogue (en injection, ou nasale ou fumé) Oui /__/ Non /__/

Au cours des 6 derniers mois, avez-vous ; 13. subit une intervention chirurgicale ? Oui/__/ Non/__/

14. Combien de Partenaires sexuels différents avez-vous eu ?/_____/

15 Avez-vous été enceinte, accouché, avorté ? (Sujets féminins uniquement) Oui /__/ Non/__/

Au Cours des 4 derniers mois, avez-vous ; 16. Subi une endoscopie et/ou un traitement par acupuncture ? Oui /__/ Non/__/

17. Fait des tatouages, scarifications, Percées d’oreilles ou autres piercing ? Oui /__/ Non/__/

Au Cours des 3 derniers mois, avez-vous ; 18 Subi des sutures de plaies ? Oui /__/ Non /__/ 19 Eu un nouveau partenaire sexuel ? Oui /__/ Non /__/

Au cours des 30 derniers jours, avez-vous ; 20. Eté vacciné ? Oui /__/ Non /__/

Si oui, quel(s) Vaccins ?

..............................................................................................................................................

Au cours des 15 derniers jours, avez-vous ; 21. subi des soins dentaires ? Oui /__/ Non /__/

22. Fait de la fièvre ? Oui /__/ Non /__/

Récemment ou en ce moment, avez-vous ; 23. Des plaies ou des lésions cutanées en cours ? Oui/__/ Non/__/

24. Pris ou êtes en train de prendre des médicaments ? Oui/__/ Non/__/ .........................................................................................................................................


De quand date la dernière prise (en jours) ? ………….. Motifs du traitement ?

……………...………………………….

25. Allaitez-vous un enfant ? Oui/__/ Non/__/

26. Etes-vous enceinte actuellement ? Oui/__/ Non/__/ 27. Etes-vous en règles (menstruation) ? Oui/__/ Non/__/ 28 : Si Vous êtes un ancien donneur, Avez-vous pris connaissance de vos résultats passés ? Oui

/__/ Non /__/

Si oui, quel avait été les résultats ? Négatifs /__/ Positifs/__/

(Lesquels ?) ….……………………………. 29. Poids : /______/ Kg 30. TA : /____/____/ mmHg (si max > 18 ou min > 10, contrôler

dans 10‟) 31. Taux d’Hb :/______/g/dl 32. Taux d’Hématocrite : /____/ % Partie réservée au personnel d’entretien

CONCLUSION/__/ APTE /__/INAPTE TEMPORAIRE (……... jrs / ………mois /……… année)

/__/INAPTE DEFINIVE Code CI : /____________/

Code, Nom et Signature

Agent :……………………………………………………………………….…


Annexe IV (suite)

FICHE NAVETTE

DATE DU DON:/_____/_____/ 200__/ NUMERO UNIQUE DU DON :

…………….………………..

NOM :…………………… PRENOM(S) : ……..……………………………………….

NOM DE JEUNE FILLE :………………………….……………………………………..

DATE ET LIEU DE NAISSANCE : /____/____/_______/ (……. ans ) à ……………….

SEXE : /_/ M /_/ F

PROFESSION :…………………………..…………………………………..

ADRESSE :Ville ………………….Secteur:/………/Tél :……………….…Email : …………………

DONS ANTERIEURS :

- Premier don ? OUI/___/ NON/____/ N° carte /…………….../ - Si dons antérieurs, date du dernier /____/____ /______/ - Y‟a-t-il eu des incidents ? /_/Non /_/Oui lequel ?/_/ Malaises/_/ Problème de veine

TYPE DE DONNEUR:

/_/ Bénévole /_/ Pour malade /_/Pour soi-même (autotransfusion)

_________________________________________________________________________________

PARTIE RESERVEE A L’ENTRETIEN PRE DON

APTE : /_/QUANTITE A PRELEVER : /__________/ ml

PREPARATION ENVISAGEE : /_/Avec plaquettes/_/ Sans plaquettes

INAPTE TEMPORAIRE : /_/ INAPTE DEFINITIF : /_/ CODE CI :

/___________/

Code/Nom et signature :……………………………………………...………….

_________________________________________________________________________________

PARTIE RESERVEE AU PRELEVEMENT

Heure de prélèvement : /_____/H /_____/mn

Quantité prélevée : /_________/ ml Durée prélèvement : /________/ mn

TYPE DE POCHE : /_/ Simple /_/ Double /_/ Triple /_/ Autre :………..

OBSERVATIONS : /_/ RAS /_/ Problème de veines

/_/ Malaise, /_/ Pendant prélèvement /_/ Post prélèvement

CONCLUSION : /_/ Vol acceptable /_/ Vol insuffisant /_/ Vol excessif/_/ Non

prélevé(e)

Code / Nom et signature du Préleveur :……………………………………………...……………………


Annexe V : Extraction et quantification de l’ADN du VHB

L’extraction a été faite à l’aide du QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden,

Allemagne) en suivant le protocole fourni par le fabriquant. On a procédé comme suit :

Vingt (20) µl de Protéinase K ont été mis dans des tubes eppendorf de 1,5 ml ; ensuite

200 µl d’échantillon (sérum) ; puis 200 µl de tampon de lyse (AL). Les tubes ont été

vortexés puis incubés à 56°C pendant 10 minutes et centrifugés à 8 000 rpm pendant

30 secondes.

Deux cent (200) µl d'éthanol absolu ont été ajoutés dans chaque tube. Les tubes ont

ainsi été vortexés pendant 15 secondes et centrifugés à 8 000 rpm pendant 30

secondes.

Les contenus des tubes eppendorf ont été transférés dans les colonnes QIAamp Mini

spin appropriées et centrifugés à 8000 rpm pendant 1 minute.

Celles-ci ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs de 2 ml ; et les anciens

tubes contenant le filtrat précédent ont été jetés.

Cinq cent (500) µl de la première solution de lavage ont été ajoutés dans les colonnes,

qui à leur tour ont été centrifugées à 8 000 rpm pendant 1 minute.

Ensuite les colonnes ont été placées dans des nouveaux tubes collecteurs. Cinq cent

(500) µl de la deuxième solution de lavage ont été ajoutés dans les colonnes, qui ont

été centrifugées de nouveau à 14 000 rpm pendant 3 minutes.

Les colonnes ont ensuite été placées dans des nouveaux tubes collecteurs et

centrifugées à 14 000 rpm pendant 1 minute.

Elles ont ensuite été placées dans des tubes eppendorf de 1,5 ml appropriés puis 75µl

de tampon d’élution ont été ajoutés dans chaque colonne.

L’ensemble a été incubé à la température ambiante (15-25°C) pendant 1 minute, puis

centrifugé à 8000 rpm pendant 1 minute.

Ces deux dernières étapes ont été répétées une fois. L’ADN a été ainsi élué des

colonnes et conservé à -20°C avant la PCR.

https://www.google.fr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=5&ved=0CHIQFjAE&url=http%3A%2F%2Fwww.qiagen.com%2FProducts%2FCatalog%2FSample-Technologies%2FDNA-Sample-Technologies%2FGenomic-DNA%2FQIAamp-DNA-Blood-Mini-Kit&ei=3Mj4UdaQOoSuOaTvgegP&usg=AFQjCNGdi4AZFqhBqcSkbu1Fd4Yeu7zAgg&bvm=bv.49967636,d.ZWU


Annexe VI : Protocole du TOPO® TA Cloning® Kit

A) Réaction PCR

Mettre en place la réaction PCR suivante dans un volume de 50 μL.

DNA Template 10–100 ng

10X PCR Buffer 5 μL

50 mM dNTPs 0,5 μL

Primers (100–200 ng de chaque) 1 μM de chaque

Water Ajouter à un volume final de 49 μL

Taq Polymérase (1 unité/μL) 1 μL

Total Volume 50 L

Vérifier le produit PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. Vous devriez voir une seule

bande discrète.

B) La réaction TOPO® Cloning

Le tableau suivant décrit comment configurer votre réaction de clonage TOPO® (6 μL) pour

une éventuelle transformation en TOP10 chimiquement compétent ou électro-compétent ou

DH5α ™ -T1R, Mach1 ™ -T1R ou TOP10F 'One Shot® E. coli chimiquement compétents.

Réactif* Volume

Produit PCR frais 0.5–4 μL

Solution saline 1 μL

Eau Ajouter à un volume total de 5 μL

TOPO®

vector 1 μL

Volume final 6 μL

* Stocker tous les réactifs à -20 °C une fois terminé. Les solutions salines et l'eau peuvent être

stockées à température ambiante ou 4 °C. Solution saline = NaCl 200 mM, et MgCl2 10 mM.

1. Mélanger doucement la réaction et incuber à température ambiante (22-23 °C) pendant

5 minutes.

2. Placez la réaction sur la glace avant la transformation chimique One Shot®.


C) Transformation des cellules One Shot® compétentes

Après avoir effectué la réaction de clonage TOPO®, transformer votre construction pCR ™

2.1-TOPO® ou pCR ™ II-TOPO® en E. coli compétente.

1. Transformer les cellules compétentes One Shot® Mach1 ™ -T1R

La souche Mach1 ™ -T1R vous permet de visualiser les colonies 8 heures après le placage

sur des plaques sélectives d'ampicilline.

Préparer la transformation

Pour chaque transformation, vous aurez besoin d'un flacon de cellules compétentes et de deux

plaques sélectives.

• Equilibrer un bain d'eau à 42 °C.

• Réchauffer le flacon de S.O.C. Milieu de la boîte 2 à température ambiante.

• Plaques sélectives chaudes à 37 °C pendant 30 minutes.

• Étaler 40 μl de X-gal 40 mg/mL sur chaque plaque de LB et incuber à 37 °C jusqu'à ce que

vous soyez prêt à l'emploi.

• Décongeler sur la glace 1 flacon de cellules One Shot® pour chaque transformation.

2. Le protocole de transformation chimique One Shot®

Pour une croissance optimale des cellules E. coli Mach1 ™ -T1R, il est essentiel que les

plaques sélectives soient préchauffées à 37 ° C avant la propagation.

1) Ajouter 2 μl de la réaction de clonage TOPO® d’effectuer la réaction de clonage

TOPO®, étape 2 à la page 12 dans un flacon de E. coli chimiquement compétent One

Shot® et mélanger doucement. Ne pas mélanger en pipetant de haut en bas.

2) Incuber sur la glace pendant 5-30 minutes.

3) Chauffer les cellules pendant 30 secondes à 42 ° C sans secousses.

4) Transférer immédiatement les tubes dans de la glace.

5) Ajouter 250 μL de température ambiante S.O.C. moyen.

6) Boucher fermement le tube et secouer le tube horizontalement (200 tr/min) à 37 ° C

pendant 1 heure.

7) Répartir 10-50 μL de chaque transformation sur une plaque sélective préchauffée.

Pour assurer une répartition uniforme des petits volumes, ajouter 20 μL de S.O.C.

moyen. Nous vous recommandons de plaquer deux volumes différents pour vous

assurer qu'au moins une plaque aura des colonies bien espacées.

8) Incuber les plaques à 37 ° C. Si vous utilisez la sélection d'ampicilline, les colonies

visibles devraient apparaître dans les 8 heures, et le dépistage bleu / blanc peut être


effectué après 12 heures. Pour la sélection de la kanamycine, incuber les plaques

pendant une nuit.

9) Une réaction de clonage TOPO® efficace devrait produire plusieurs centaines de

colonies. Choisissez ~ 10 colonies blanches ou bleu clair pour analyse. Ne choisissez

pas les colonies bleues foncées.

D) Analyser les transformant

Analyser les clones positifs

1) Prendre 2 à 6 colonies blanches ou bleu clair et les cultiver toute la nuit dans un milieu

LB contenant 50 μg/mL d'ampicilline ou 50 μg/mL de kanamycine.

2) Isoler l'ADN du plasmide en utilisant le kit PureLink® Quick Plasmid Miniprep.

3) Analyser les plasmides par analyse de restriction pour confirmer la présence et

l'orientation correcte de l'insert. Utilisez une enzyme de restriction ou une

combinaison d'enzymes qui coupent une fois dans le vecteur et une fois dans l'insert.

Procédure d’Analyse des transformant par PCR

1) Pour chaque échantillon, aliquoter 48 μL de PCR SuperMix High Fidelity dans un

tube de micro-centrifugeuse de 0,5 mL. Ajouter 1 μl de chacune des amorces de PCR

avant et inverse.

2) Choisir 10 colonies et les ré-suspendre individuellement dans 50 μL du cocktail PCR

de l'étape 1 de cette procédure.

3) Incuber la réaction pendant 10 minutes à 94 °C pour lyser les cellules et inactiver les

nucléases.

4) Amplifier pendant 20-30 cycles.

5) Pour l'extension finale, incuber à 72 °C pendant 10 minutes. Conserver à 4 °C.

6) Visualiser par électrophorèse sur gel d'agarose.

E) Optimisation de la réaction de clonage TOPO®

Produire le produit PCR de contrôle

1) Pour produire le produit de PCR de contrôle de 750 pb, mettre en place les 50 ul de

PCR suivants :


Modèle ADN témoin (100 ng) 1 μL

10X PCR Buffer 5 μL

DNTP Mix 0,5 μL

Les amorces PCR de contrôle (0,1 μg / μl chacune) 1 μL

Eau 41,5 μL

Taq Polymerase (1 unité / μL) 1 μL

Volume total 50 L

2) Amplifier en utilisant le programme suivant :

Etapes Temps Température Cycles

Dénaturation initiale 2 minutes 94°C 1X

Dénaturation 1mn 94°C 25X

Hybridation 1mn 55°C

Elongation 1mn 72°C

Elongation finale 7mn 72°C 1X

3) Enlever 10 μL de la réaction et l'analyser par électrophorèse sur gel d'agarose. Une

bande discrète de 750 pb doit être visible.


Annexe VII : Fiche de consentement

Je soussigné (e)…………………………………………., certifie avoir lu et compris la note

d’information qui m’a été remise concernant la participation à l’étude sur la caractérisation

moléculaire des génotypes du virus de l’hépatite B. J’en ai discuté avec le Docteur

…………………………………….., qui m’a expliqué la nature et les objectifs de cette étude.

J’ai eu la possibilité de poser toutes les questions que je souhaitais.

J’accepte les contraintes et les avantages liés à ma participation. J’ai bien compris que je suis libre

d’accepter ou de refuser d’y participer. Je connais la possibilité qui m’est offerte d’interrompre le suivi

à tout moment sans avoir à justifier ma décision, ni à subir un quelconque préjudice, mais je m’engage

à en informer le médecin investigateur. Cela ne remettra pas en cause la qualité de mes soins

ultérieurs.

Cette étude a reçu l’avis favorable du comité d’Ethique Institutionnel du Centre Saint-Camille

CERBA et du Comité d’Ethique pour la recherche en Santé du Mali en date du ……………2015 à

Bamako, DELIBERATION N°2015/…..

J’ai eu l’assurance que les décisions qui s’imposent pour ma santé seront prises à tout moment,

conformément à l’état des connaissances et en fonction de l’évolution de ma propre maladie.

J’accepte que les données enregistrées à l’occasion de ce protocole puissent faire l’objet d’un

traitement informatisé. J’ai bien noté que mon droit d’accès s’exerce à tout moment auprès du Docteur

……………………………., et que je pourrai exercer mon droit de rectification et d’opposition auprès

de celui-ci.

J’accepte que tout médecin ou scientifique impliqué dans cette recherche ait accès aux données qui me

concernent dans le respect le plus strict de la confidentialité.

Mon consentement ne décharge en rien les organisateurs de l’étude de leurs responsabilités, je

conserve tous mes droits garantis par la loi.

J’accepte librement de participer à cette recherche dans les conditions précises dans la note

d’information et dans ce document.

Fait à ………………………………. , le …………………………………………………

Signature

Je soussigné (e) Docteur ……………………………., investigateur de l’étude, certifie avoir

communiqué ou fait communiqué à Mme/Mr ………………………………………………… toute

information utile sur les objectifs et les modalités de cette étude.

Je m’engage à faire respecter les termes de ce formulaire de consentement, afin de mener cette

recherche dans les meilleures conditions, conciliant le respect des droits et des libertés individuelles et

les exigences d’un travail scientifique.

Fait à …………………………………….., le ………………………………………

Signature


LES PUBLICATIONS ISSUES DE CETTE THESE

DIARRA B, OUATTARA AK, DJIGMA WF, COMPAORE TR, OBIRI-YEBOAH D,

TRAORE L, SOUBEIGA ST, BADO P, YARA J, PIETRA V, OUEDRAOGO P,

BOUGOUMA A, SANOGO R, SIMPORE J. (2017). World Hepatitis Day 2016 in Burkina

Faso: Awareness, Screening, Identification of Hepatitis B Markers, HBV/HCV coïnfection

and vaccination. Hepatitis Monthly; 17(6):e13789 doi: 10.5812/hepatmon.13789

CANDOTTI, D., DIARRA, B., BISSEYE, C., TAO, I., QUANG, K. P., SANOU, M.,

LAPERCHE, S., SANOGO, R., ALLAIN, J. P. & SIMPORE, J. (2016). Molecular

Characterization of Hepatitis B Virus in Blood Donors from Burkina Faso: Prevalence of

Quasi-Subgenotype A3, Genotype E, and Mixed Infections. J. Med. Virol. DOI

10.1002/jmv.24589.

COMPAORE TR, DIARRA B, ASSIH M, OBIRI-YEBOAH D, SOUBEIGA ST,

OUATTARA AK, TCHELOUGOU D, BISSEYE C, BAKOUAN DR, COMPAORE IP,

DEMBELE A, DJIGMA WF, SIMPORE J. (2016). HBV/HIV coïnfection and APOBEC3G

polymorphisms in a population from Burkina Faso (2016). BMC Infectious Diseases, 16:336

DOI 10.1186/s12879-016-1672-2.

TAO I, COMPAORE TR, DIARRA B, DJIGMA F, ZOHONCON TM, ASSIH M, OUERMI

D, PIETRA V, KAROU SD, SIMPORE J. (2014). Seroepidemiology of hepatitis B and C

viruses in the general population of Burkina Faso. Hepat Res Treat, 2014, 781843.

AUTRES PUBLICATIONS

OUATTARA, A. K., YAMEOGO, P., DIARRA, B., OBIRI-YEBOAH, D., YONLI, A.,

COMPAORE, T. R., SOUBEIGA, S. T., DJIGMA, F. W. & SIMPORE, J. (2016). Molecular

Heterogeneity of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Deficiency in Burkina Faso: G-6-PD

Betica Selma and Santamaria in People with Symptomatic Malaria in Ouagadougou.

Mediterr J Hematol Infect Dis, 8(1): e2016029.

YVETTE FOFIE NB, SANOGO R., DIARRA B., KANADJIGUI F., ET KONE-BAMBA D.

(2013). Antioxidant and anti-hyperglycaemic activity of Euphorbia hirta L. on Wistar rats.

Int. J. Biol. Chem. Sci. 7(6): 2558-2567.

OUATTARA AK, BISSEYE C, BAZIE BV, DIARRA B, COMPAORE TR, DJIGMA

F, PIETRA V, MORET R, SIMPORE J. (2014). Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ouattara%20AK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bisseye%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bazie%20BV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Diarra%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Compaore%20TR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Djigma%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Djigma%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pietra%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Moret%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Simpore%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25183336


deficiency is associated with asymptomatic malaria in a rural community in Burkina Faso.

Pac J Trop Biomed; 4(1).

TRAORE L, TAO I, BISSEYE C, DIARRA B, COMPAORE TR, NEBIE Y, ASSIH M,

OUEDRAOGO A, ZOHONCON T, DJIGMA F, OUERMI D, BARRO N, SANOU M,

OUEDRAOGO RT, SIMPORE J. (2016). Molecular diagnostic of cytomegalovirus, Epstein

Barr virus and Herpes virus 6 infections among blood donors by multiplex real-time PCR in

Ouagadougou, Burkina Faso. Pan Afr Med J. 2016 Aug 3; 24:298.

OUEDRAOGO A R, KABRE M, BISSEYE C, ZOHONCON T M, ASSHI M, SOUBEIGA S

T, DIARRA B, TRAORE L, DJIGMA F W, OUERMI D, PIETRA V, BARRO N AND

SIMPORE J. (2016). Molecular tests in diagnosis of Cytomegalovirus (CMV), human

herpesvirus 6 (HHV-6) and Epstein-Barr virus (EBV) using real-time PCR in HIV positive

and HIV negative pregnant women in Ouagadougou, Burkina Faso. Pan African Medical

Journal. 2016; 24:223. doi:10.11604/pamj.2016.24.223.9406.

SOUBEIGA ST, COMPAORE R, DJIGMA F, ZAGRE N, ASSENGONE E, TRAORE L,

DIARRA B, BISSEYE C, OUERMI D, SAGNA T, KAROU SD, PIETRA V, SIMPORE J.

(2015). Evaluation du traitement antirétroviral chez les femmes enceintes VIH1 positif, sur la

transmission de l’infection de la mère à l’enfant : Cas du Centre Médical Saint Camille de

Ouagadougou, au Burkina Faso. Pan Afr Med J, 20, 399.

SANOGO R., DOUCOURE M., FABRE A., HAIDARA M., DIARRA B., DENOU A.,

KANADJIGUI F., BENOIT V.F., DIALLO D. (2014). Industrial production, standardization

and testing of antimalarial syrup based on extracts from Argemone mexicana L. Revue

CAMES-Série Pharm. Méd. Trad. Afr., 17(1): 15-20.

TRAORE L, TAO I, BISSEYE C, DJIGMA F, OUERMI D, ZOHONCON T, COMPAORE

TR, DIARRA B, ASSHI M, SIMPORE J. (2014). Molecular diagnosis of cytomegalovirus,

Epstein-Barr virus and Herpes virus 6 among blood donors in Ouagadougou, Burkina Faso.

BMC Infectious Diseases, 14 (Suppl 2): P99. http://www.biomedcentral.com/1471-

2334/14/S2/P99.

MANUSCRITS SOUMIS

Caractérisation moléculaire de l’infection occulte par le virus de l’hépatite B et les génotypes

associés chez les sujets séronégatifs à l’AgHBs au Burkina Faso. (BMC Infectious Diseases).


COMMUNICATIONS ORALES

Birama DIARRA, Daniel CANDOTTI, Cyrille BISSEYE, Issoufou TAO, Mahamoudou

SANOU, Rokia SANOGO, Alain BOUGOUMA, Jean-Pierre ALLAIN, Jacques SIMPORE.

Caractérisation moléculaire des génotypes du virus de l’hépatite B chez les donneurs de sang

du centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou (CRTS-O), Burkina Faso. XVI

ème Journées Portes Ouvertes de l’Université Ouaga I Pr Joseph KI-ZERBO (JPO) du 25

au 30 Novembre 2013.

Birama DIARRA, Rebecca COMPAORE, Issoufou TAO, Cyrille BISSEYE, Mahamoudou

SANOU, Rokia SANOGO, Jacques SIMPORE. Caractérisation moléculaire des génotypes du

virus de l’hépatite B (VHB) chez les donneurs de sang du centre régional de transfusion

sanguine de Ouagadougou, Burkina Faso. Deuxièmes Journées Scientifiques du CAMES à

Dakar en Novembre 2015.

Birama DIARRA, Daniel CANDOTTI, Issoufou TAO, Cyrille BISSEYE, Mahamoudou

SANOU, Kei Pham Quang, Syria LAPERCHE, Rokia SANOGO, Jean-Pierre Allain, Jacques

SIMPORE. Caractérisation moléculaire des génotypes du virus de l’hépatite B (VHB) chez

les donneurs de sang du centre régional de transfusion sanguine de Ouagadougou, Burkina

Faso. XVIIe édition des Journées Scientifiques Internationales de Lomé (JSIL), Togo du 03

– 08 Octobre 2016.

epidémiologie moléculaire du virus de l’hépatite b au ... · au professeur rokia sanogo, ce...

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