ergosterol measurement

7/29/2019 Ergosterol Measurement

1/4

V o l . 5 4 , N o . 7P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , J U I Y 1 9 8 8 , p . 1 8 7 6 - 1 8 7 90 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 8 / 0 7 1 8 7 6 - 0 4 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C ) 1 9 8 8 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

F u n d a m e n t a l P r o c e d u r e s f o r D e t e r m i n i n g E r g o s t e r o l C o n t e n t o fD e c a y i n g P l a n t M a t e r i a l b y L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y tS . Y . NEWELL,1* T . L . ARSUFFI,1 AND R . D . FALLON2

U n i v e r s i t y o f G e o r g i a M a r i n e I n s t i t u t e , S a p e l o I s l a n d , G e o r g i a 3 1 3 2 7 , 1 and H a s k e l l L a b o r a t o r y , DuPont Company,N e w a r k , D e l a w a r e 1 9 7 1 1 2R e c e i v e d 8 F e b r u a r y 1 9 8 8 / A c c e p t e d 1 2 A p r i l 1 9 8 8

P o r t i o n s o f p u b l i s h e d p r o c e d u r e s f o r measurement o f e r g o s t e r o l c o n t e n t o f d e c o m p o s i n g p l a n t s weree x a m i n e d f o r t h e i r i n f l u e n c e upon e r g o s t e r o l y i e l d . C o m m on m e t h o d s o f t r e a t m e n t o f p l a n t s a m p l e s p r i o r t os t e r o l e x t r a c t i o n ( e . g . , oven d r y i n g , f r e e z i n g , l y o p h i l i z a t i o n ) l e d t o r e d u c e d r e c o v e r i e s o f e r g o s t e r o l ( c a . 2 0 t o8 0 % ) . T h e l e a s t d e s t r u c t i v e m e t h o d was d i r e c t p l a c e m e n t a n d s t o r a g e i n m e t h a n o l . P h o t o c o n v e r s i o n o fe r g o s t e r o l i s n o t l i k e l y t o cause l o s s e s d u r i n g a n a l y s i s , b u t l o s s e s ar e l i k e l y i f t h e r e i s i n s u f f i c i e n t m i x i n g d u r i n gn e u t r a l - l i p i d p a r t i t i o n i n g f r o m b a s e - h y d r o l y s i s r e a g e n t s . H o m o g e n i z a t i o n ( t w o t i m e s f o r 2 m i n ) a n d r e f l u x i n g( 2 h ) i n m e t h a n o l were e q u a l l y e f f e c t i v e i n e x t r a c t i n g e r g o s t e r o l . D i r e c t e x t r a c t i o n i n b a s e - h y d r o l y s i s r e a g e n t swas l e s s e f f e c t i v e ( b y ca . 4 0 % ) .

E r g o s t e r o l ( 2 4 3 - m e t h y l c h o l e s t a - 5 , 7 , t r a n s 2 2 - t r i e n - 3 1 - o l )h a s g a i n e d i n p o p u l a r i t y a s a q u a n t i t a t i v e c h e m i c a l i n de x f o rf u n g a l m a s s ( e . g . , r e f e r e n c e s 1 0 , 1 3 , 1 7 , a n d 2 7 ) s i n c e i t si n t r o d u c t i o n a s s u c h ( 8 , 2 1 , 2 2 ) . T h e f a c t s t h a t t h e 5 , 7 -d o ub l eb o n d i n g o f e r g o s t e r o l p e r m i t s s e n s i t i v e a s s a y b y m e a s u r e -m e n t o f t h e A 2 8 2 o f UV l i g h t i n n e u t r a l - l i p i d e x t r a c t s a n d t h a tt h i s p a r t i c u l a r d o u b l e b o n d i n g i s r a r e among m a j o r s t e r o l s o fv a s c u l a r p l a n t s ( b u t s e e r e f er e nc es 1 4 a n d 2 4 ) a n d n o n f u n g a ls a p r o t r o p h i c m i c r o b e s ( 2 6 ) make e r g o s t e r o l a p a r t i c u l a r l yu s e f u l f u n g a l - i n d e x m o l e c u l e . I t m a y b e t h a t i t w i l l s e r v eb e t t e r i n t h i s r e g a r d t h a n g l u c o s a m i n e ( 1 4 ; b u t s e e r e f e r e n c e1 5 ) o r t h a t i t c a n b e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h g l u c o s a m i n ea n a l y s i s t o y i e l d r a t i o s o f l i v e / d e a d f u n g a l m a s s ( 2 7 ; s e e a l s or e f e r e n c e 2 8 ) .I n d e v e l o p i n g t h e e r g o s t e r o l - f u n g a l m e t h o d f o r e c o l o g i c a la p p l i c a t i o n , t h r e e i n d e p e n d e n t l y w o r k i n g i n v e s t i g a t o r s p r e -s e n t e d q u i t e d i f f e r e n t p r o c e d u r e s f o r e x t r a c t i o n a n d a n a l y s i s .S e i t z e t a l . ( 2 1 , 2 2 ) e x t r a c t e d g r a i n o r f u n g a l s a m p l e s b yh o m o g e n i z i n g ( 2 m i n ) i n m e t h a n o l ; t h ey a s s a y e d e r g o s t e r o lb y h i g h - p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) . L e e e t a l .( 7 , 8 ) e xt r ac t e d l e av e s a n d s t e m s b y r e f l u x i n g ( 9 6 h ) i nt o l u e n e - m e t h a n o l ; t h e y a s s a y e d e r g o s t e r o l a s i t s a c e t a t ed e r i v a t i v e b y c a p i l l a r y g a s c h r o m a t o g r a p h y . G r i f f i t h s e t a l .( 4 ) e x t r a c t e d a n d s a p o n i f i e d l e a f s a m p l e s i n o n e s te p ( wi t he t h a n o l - K O H , 1 h ) a n d a s s a y e d b y HPLC. I t i s n o t knownw h e t h e r o n e p r o c e d u r e i s m o r e e f f i c i e n t t h a n a no t h e r i ny i e l d i n g e r g o s t e r o l f r o m n a t u r a l s u b s t r a t e s . T h i s i n f o r m a t i o ni s i m p o r t a n t i f e r g o s t e r o l i s t o b e u s e f u l a s a q u a n t i t a t i v em e a s u r e o f f u n g a l b i o m a s s , e s p e c i a l l y i n v i e w o f t h e f a c t t h a tm o l e c u l e s r e l a t e d t o e rg o s t e r o l a re l a b i l e u p o n e x p o s u r e t ol i g h t , h e a t , a n d c h e m i c a l r e a g e n t s ( 2 5 ) . We h a v e c o m p a r e dv a r i o u s p e r i o d s o f m e t h a n o l r e f l u x i n g ( w i t h a n d w i t h o u tKOH) a n d v a r i o u s l e n g t h s o f m e t h a n o l h o m o g e n i z i n g f o rf o u r t y p e s o f s a l t m a r s h p l a n t m a t e r i a l s , f o l l o w e d b y H P L Ca s s a y . I n a d d i t i o n , we h a v e e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n tt y p e s o f s a m p l e s t o r a g e , s a m p l e p r o c e s s i n g , a n d e x p o s u r e o fe r g o s t e r o l t o l i g h t t o t e s t t h e r e s i s t a n c e o f e r g o s t e r o l t od e g r a d a t i v e a n d h a n d l i n g l o s s .A l l p l a n t m a t e r i a l s u s e d w e r e c o l l e c t e d f r o m s a l t m a r s h e so f S a p e l o I s l a n d ( 1 8 ) . S t a n d i n g d e a d l e a v e s w e r e c o l l e c t e d

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t C o n t r i b u t i o n 6 0 3 o f t h e U n i v e r s i t y o f G e o r g i a M a r i n e I n s t i t u t e .

f o r S p a r t i n a a l t e r n i f l o r a L o i s e l . , S p a r t i n a p a t e n s ( A i t o n )M u h l . , a n d J u n c u s r o e m e r i a n u s S c h e e l e , a n d s t a n d i n g d e a ds t e m s ( l e a f s h e a t h s r e m o v e d ; s t e m d i a m e t e r , 4 t o 5 m m ) w e r ec o l l e c t e d f o r S . a l t e r n i f l o r a . L e a v e s a n d s t e m s w e r e r i n s e du n d e r r u n n i n g t a p w a t e r , w i t h r u b b i n g b y h a n d t o r e m o v ea d h e r e n t c l a y . F o r e a c h l e a f , a 1 0 - c m p o r t i o n , b e g i n n i n g 1 0cm d i s t a l t o t h e l i g u l e , wa s c u t i n t o 1 - c m l e n g t h s . S t e m s w e r ec u t i n t o 0 . 5 - c m l e n g t h s . P l a n t p i e c e s w e r e p o o l e d a n d m i x e d ,a n d f i v e p i e c e s o f p l a n t w e r e a l l o t t e d n o n s e l e c t i v e l y t ot r e a t m e n t r e p l i c a t e s . A f t e r a l l o t m e n t , e a c h p i e c e o f S . a l t e r -n i f l o r a w a s c u t l e n g t h w i s e t o o p e n s t e m s a n d t i g h t l y c u r l e dl e a v e s . D u r i n g e a c h e x p e r i m e n t , 2 t o 3 p a r a l l e l r e p l i c a t es a m p l e s w e r e u s e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f mean d r y w e i g h t p e rr e p l i c a t e ( d r y i n g a t 1 0 0 C ; r a n g e o f mean r e p l i c a t e w e i g h t s ,3 8 . 3 m g f o r S . p a t e n s t o 7 5 . 1 m g f o r S . a l t e r n i f l o r a ) .H P L C - g r a d e m e t h a n o l , m e t h y l e n e c h l o r i d e , i s o p r o p a n o l ,a n d p e n t a n e w e r e p u r c h a s e d f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c C o .E r g o s t e r o l wa s p u r c h a s e d f r o m F l u k a C h e m i c a l C o r p . , a n de r g o c a l c i f e r o l wa s p u r c h a s e d f r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o . ,I n c .E x t r a c t i o n s i n v o l v i n g h o m o g e n i z a t i o n ( 1 0 ) w e r e c a r r i e do u t i n 1 5 m l o f m e t h a n o l i n 5 0 - m l c e n t r i f u g e t u b e s i n a n i c eb a t h ( P o l y t r o n w i t h P T 2 0 S T g e n e r a t o r , 2 . 1 x 1 0 4 r p m ;B r i n k m a n I n s t r u m e n t s , I n c . ) . T h e g e n e r a t o r wa s r i n s e d ( 5 m lo f m e t h a n o l ) i n t o t h e s a m p l e . S u b s e q u e n t c e n t r i f u g a t i o n s o fh o m o g e n a t e s w e r e f o r 5 m i n a t 8 7 5 x g . S u p e r n a t a n t s w e r ec o l l e c t e d , a n d c e n t r i f u g a t e s w e r e h o m o g e n i z e d a n d c e n t r i -f u g e d a g a i n . P r i m a r y a n d s e c o n d a r y s u p e r n a t a n t s w e r e c o m -b i n e d ; f i n a l c e n t r i f u g a t e s w e r e d i s c a r d e d .R e f l u x e x t r a c t i o n s ( n o h o m o g e n i z a t i o n ) w e r e p e r f o r m e d i ng l a s s w a r e w i t h T ef l o n- f a ce d s c r e w- t h r ea d c o n n e c t i o n s( W h e a t o n S c i e n t i f i c ) i n 2 5 m l o f m e t h a n o l . R e f l u x f l a s k s w e r es u b m e r g e d i n a w a t e r b a t h h e l d a t 8 0 C . H y d r o l y s i s o f s t e r o le s t e r s wa s e f f e c t e d f o r b o t h t y p e s o f e x t r a c t i o n b y a d d i t i o no f a n i n e r t b o i l i n g c h i p a n d 5 m l o f a 4% s o l u t i o n o f KOH i n95% e t h a n o l t o e a c h r e f l u x f l a s k a n d b y r e f l u x i n g f o r 3 0 m i n .W i t h t h e e x c e p t i o n o f o n e e x p e r i m e n t , s o l i d s w e r e r e m o v e db y c e n t r i f u g a t i o n o r w i t h f o r c e p s b e f o r e t h e a d d i t i o n o f b a s e .S t e r o l s w e r e r e m o v e d . f r o m t h e a l c o h o l i c b a s e b y p a r t i -t i o n i n g i n t o p e n t a n e a f t e r c o o l i n g t o 2 5 C a n d b y t h e a d d i t i o no f 1 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r i n 6 5 - m l g l a s s s c r e w - c a p t u b e s w i t hT e f l o n - l i n e d c a p s . A s e r i e s o f t h r e e p e n t a n e a d d i t i o n s ( 1 0 , 5 ,a n d 5 m l ) w e r e m i x e d b y r e p e a t e d l y i n v e r t i n g t i g h t l y s e a l e d

1 8 7 6


2/4

N O T E S 1 8 7 7t u b e s ; a f t e r each a d d i t i o n and m i x i n g , t h e upper, p e n t a n el a y e r was withdrawn and p e n t a n e f r a c t i o n s f r o m e a c h s a m -p l e were p o o l e d . P e n t a n e f r a c t i o n s w e r e e v a p o r a t e d i n o p e ng l a s s v i a l s i n a T e m p - B l o k ( S c i e n t i f i c P r o d u c t s ) s e t a t 3 0 Cunder s t r e a m s o f n i t r o g e n or a i r i n a fume h o o d . Thedried-down s a m p l e s were r e d i s s o l v e d i n 1 t o 3 m l o f m e t h -a n o l , m e t h y l e n e c h l o r i d e - m e t h a n o l ( 1 : 1 ) , or m e t h y l e n e c h l o -r i d e - i s o p r o p a n o l ( 9 9 : 1 ) ; v i a l s were t i g h t l y s e a l e d a n d s o n i -c a t e d f o r 5 m i n ( B u e h l e r U l t r a m e t I I I S o n i c C l e a n e r ) t oe n ha nce t h e r a t e o f d i s s o l u t i o n ( 2 0 ) . O f t h e t h r e e i n j e c t i o ns o l v e n t s , methanol gave t h e n a r r o w e s t p e a k s f o r e r g o s t e r o l ;a s l i g h t s h o u l d e r was sometimes s e e n f o r m e t h y l e n e c h l o -r i d e - i s o p r o p a n o l . Us e o f m e t h a n o l a l s o e l i m i n a t e d i n j e c t i o n -s o l v e n t p e a k s .

Redissolved s a m p l e s were f i l t e r e d t h r o u g h 0 . 4 5 - , u m - p o r e -s i z e p o l y t e t r a f l u o r o e t h y l e n e m e m b r a n e s ( A c r o d i s c 1 3 C R ;G e l m a n S c i e n c e s , I n c . ) b e f o r e i n j e c t i o n i n t o t h e f o l l o w i n gHPLC s y s t e m : Dionex A n a l y t i c a l Pump APM-1 a n d pneu-m a t i c i n j e c t i o n v a l v e ( 5 0 - p I s a m p l e l o o p ) ( D i o n e x C o r p . ) ;P i e r c e R P - 1 8 , 1 0 - , u m , 4 . 6 - m m - i n s i d e - d i a m e t e r , 2 2 - c m c o l -umn, with R P - 1 8 , 7 - t L m , 1 . 5 - c m g u a r d ( P i e r c e C h e m i c a lC o . ) ; Kratos S p e c t r o f l o w 7 8 3 absorbance d e t e c t o r ( A p p l i e dB i o s y s t e m s ) ; and Dionex 4 2 9 0 i n t e g r a t o r . At a f l o w r a t e o fmethanol e l u an t o f 2 m l . min-1 ( 3 5 0 l b i n - 2 ) and a d e t e c t o rw a v e l e n g t h o f 2 8 2 n m , e r g o s t e r o l was d e t e c t e d a p p r o x i -m a t e l y 3 . 6 m i n a f t e r i n j e c t i o n . T h e d e t e c t i o n l i m i t f o r e r g o s -t e r o l f o r t h i s a s s a y s y s t e m was ca . 1 , u g . m l - ' o f i n j e c t i o nf l u i d . Solvent b l a n k s t a k e n t h r o u g h t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r ed i d n o t c o n t a i n d e t e c t a b l e e r g o s t e r o l .

Several e x p e r i m e n t s were conducted which c o m p a r e dv a r i a n t s of t h e g e n e r a l sc h e me p r e s e n t e d a bo ve a n d d e t e r -m i n e d e f f e c t s of h a n d l i n g an d s t o r a g e upon e r g o s t e r o l , asdescribed below. An a b r i d g e d f l o w c h a r t o f a s u g g e s t e da n a l y t i c a l p r o c e d u r e i n c o r p o r a t i n g i n f o r m a t i o n shown belowi s g i v e n i n F i g . 1.S o l u t i o n s of standard e r g o s t e r o l ( 1 0 0 , u g - m l - ' ) i n 1 0 m l o fm e t h y l e n e c h l o r i d e - m e t h a n o l ( 1 : 1 ) were s t o r e d i n s c i n t i l l a -t i o n v i a l s i n darkness f o r 0 , 1 , 7 , a nd 1 4 d a y s a t - 2 0 , 4 , a nd2 5 C ( n u m b e r o f r e p l i c a t e s [ n ] =3 ) . Th ere was n o d e t e c t a b l el o s s of e r g o s t e r o l with any t r e a t m e n t ( a n a l y s i s o f v a r i a n c e , P> 0 . 0 5 ) . T h e a v e r a g e d i f f e r e n c e from t h e z e r o - d a y mean was-0.5%. V i a l s of t h e same s o l u t i o n were a l s o e x p o s e d t o l i g h tu n d e r varied c o n d i t i o n s , as p r e s e n t e d i n Table 1 . F o i l -w r a p p e d c o n t r o l s showed n o l o s s r e l a t i v e t o c o n t r o l s k e p t i ndarkness a t 4 C i n t h e l a b o r a t o r y . Losses o f e r g o s t e r o l w e r enot detected f o r s a m p l e s e x p o s e d t o f l u o r e s c e n t l a m p s ,whe r e a s e x p o s u r e s l o n g e r than 2 h t o outdoor s u n l i g h t on ab r i g h t , s u n n y d a y d i d b r i n g about l o s s e s ( T a b l e 1 ) . Peaksc o r r e s p o n d i n g t o th e r e t e n t i o n tim e of s t a n d a r d e r g o c a l c i f -e r o l a p p e a r e d i n t h e d i s s o l v e d s a m p l e s e x p o s e d t o outdoors u n l i g h t a t 4 0 C .We t e s t e d t h r e e other p o r t i o n s of t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r ef o r e f f e c t s upon e r g o s t e r o l s t a n d a r d s : ( i ) e x t e n d e d r e f l u x i n gi n t h e a l c o h o l i c b a s e , ( i i ) d r y i n g dow n of p e n t a n e s o l u t i o nwith streams of n i t r o g e n versus a i r , a n d ( i i i ) e x t e n t of m i x i n gof p e n t a n e with water a n d a l c o h o l i c base. R e f l u x i n g i n basef o r u p t o 2 h d i d n ot c a u s e l o s s of e r g o s t e r o l . N i t r o g e n a n d a i rg a v e e qu i v a l en t r e s u l t s ( s e e reference 1 , p . 4 8 3 - 4 8 4 ) , i n d i c a t -i n g t h a t on e n e e d not b u y n i t r o g e n g a s f o r t h i s p r o c e d u r e( h o w e v e r , t h e f l a s h p o i n t of p e n t a n e i s < - 4 0 C ) . However,i n a d e q u a t e m i x i n g ( 1 0 i n v e r s i o n s , r e p e a t e d t h r e e t i m e s ) g a v eo n l y 56% r e c o v e r y , as o p p o s e d t o 100% r e c o v e r y with 30inversions three times ( s e e reference 1 , p . 4 8 4 ) .T y p e s o f p r e ex t r ac t i o n s t o r a g e of s a m p l e s of S . a l t e r n i -f l o r a leaves were tested i n two e x p e r i m e n t s . In one c a s e ,

F I G . 1 . F l o w c h a r t o f t h e b a s i c s t e p s o f a s u g g e s t e d p r o c e d u r e f o ra n a l y s i s o f e r g o s t e r o l b y HPLC. T h e p r o c e d u r e i s d e r i v e d f r o mt h o se p r e se nt e d i n r e f e r e n c e s 1 0 , 2 1 , a n d 2 2 . * , P o i n t a t w h i c hs a m p l e s c an b e s t o r e d w i t h o u t l o s s o f e r g o s t e r o l . MeGH, M e t h a n o l .l e a v e s w e r e e i t h e r d r i e d t o c o n s t a n t t e m p e r a t u r e a t 5 0 0 C ,f r o z e n a t - 2 0 C , o r l y o p h i l i z e d ( f r e e z i n g [ t o - 3 0 C o v e r c a .3 0 m i n ] a n d vacuum d r y i n g i n o n e u n i t ; L a b c o n c o V a c - S t o p+ F r e e z e D r i e r 8 ) . T h e s e s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d d i r e c t l yf o l l o w i n g t r ea t m e nt . I n t h e s e c o n d e x p e r i m e n t , l e a f s a m p l e sw e r e e i t h e r l y o p h i l i z e d a n d s t o r e d o v e r f r e s h d e s i c c a n t i n a

T A BL E 1 . E f f e c t o f l i g h t o n e r g o s t e r o l s t a n d a r d s i nt i g h t l y c a p p e d s c i n t i l l a t i o n v i a l s aE x p o s u r eL i g h t s o u r c e a n d L i g h t D i f f e r e n c e f r o ms t a t e o f e r g o s t e r o l i n t e n s i t y b T i m e Temp c o n t r o l ( % ) C( h ) ( O C )

F l u o r e s c e n t l a m p s , 3 0 1 2 5 - 1 . 0 2 N Ss o l u t i o n ' 1 6 0 1 2 5 + 0 . 0 1F i l t e r e d s u n l i g h t , 1 , 2 0 0 1 3 6 - 1 . 8 0 N Ss o l u t i o n ' 1 , 1 0 0 2 3 2 + 1 . 1 8 N SS u n l i g h t , s o l u t i o n f 1 , 6 8 2 2 2 3 - 3 . 1 7 N S1 , 4 5 8 4 4 0 - 2 8 . 6 2 *S u n l i g h t , d r y f i l m g 1 , 7 2 5 2 3 6 - 1 2 . 6 4 *1 , 4 5 8 4 4 0 - 8 1 . 0 3 *

a L i g h t i n t e n s i t y w i t h i n v i a l r e d u c e d b y 3 0 % o a t c e n t e r o f b a s e .b M i c r o e i n s t e i n s - m e t e r - 2 * s e c o n d ` p h o t o s y n t h e t i c a l l y a v a i l a b l e r a d i a t i o n( L i - C o r L I - 1 8 8 B i n t e g r a t i n g p h o t o m e t e r ) , a v e r a g e f o r e x p o s u r e p e r i o d .c M ean o f 2 t o 3 r e p l i c a t e s . N S , N o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l u m i n u m -f o i l - w r a p p e d c o n t r o l ; * , s i g n i f i c a n t l o s s ( P < 0 . 0 5 ) .d 1 0 cm o r 1 . 5 m f r o m l a m p s , 1 0 0 , u g * m l - ' .' T h r o u g h a window p a n e , 1 0 0 p L g * m l - .f O u t d o o r s , 4 0 , u g * m l - ' .g O u t d o o r s , 2 0 0 , u g d r i e d down a t t h e b a s e o f t h e v i a l s .

V O L . 5 4 , 1 9 8 8


3/4

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .TABLE 2 . R e l a t i v e y i e l d o f e r g o s t e r o l f r o m d e a d p l a n t m a t e r i a l sb y e i t h e r h o m o g e n i z a t i o n i n m e t h a n o l o r r e f l u x i n g i n m e t h a n o l

R e l a t i v e y i e l d a o f e r g o s t e r o l a f t e r :P l a n t e l b H o m o g e n i z a t i o n ( m i n ) ' R e f l u x i n g ( h )

1 2 4 6 2 4 8SA l e a f 9 2 1 0 0 9 7SA l e a f 7 7 1 0 0 8 5 9 7J R l e a f 1 0 0 8 7SP l e a f 1 0 0 9 4 9 9SA s t e m 1 0 0 6 9 9 1 9 0 8 9

a G i v e n a s p e r c e n t a g e s o f t h e h i g h e s t mean v a l u e f o r e a c h r o w ; mean o f 2t o 3 r e p l i c a t e s ; n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s d e t e c t e d w i t h i n a n y ro w ( a n a l y s i s o fv a r i a n c e , P > 0 . 0 5 ) . Y i e l d s a r e c o m p a r a b l e w it h in r o w s .b S A , S p a r t i n a a l t e r n i f l o r a ; S P , S p a rt i na p a t e n s ; J R , J u n c u s r o e m e r i a n u s .c E a c h h o m o g e n i z a t i o n w a s p e r f o r m e d t w i c e f o r e a c h s a m p l e .

p a r t i a l vacuum f o r 1 w e e k a t 2 5 C , l y o p h i l i z e d a n d s t o r e d a t50% r e l a t i v e h u m i d i t y a t 2 5 C f o r 1 w e e k , o r p l a c e d d i r e c t l yi n t o m e t h a n o l a n d s t o r e d a t 4 C f o r 1 w e e k . When c o m p a r e dt o f r e e z e - t h a w i n g a n d m i l d o v e n d r y i n g , l y o p h i l i z a t i o n g a v et h e b e s t y i e l d o f e r g o s t e r o l . As mean p e r c e n t a g e s o f t h e y i e l da f t e r l y o p h i l i z a t i o n , o v e n d r y i n g g a v e 23% a n d f r e e z e -t h a w i n g g a v e 86% ( f r e e z i n g v e r s u s l y o p h i l i z a t i o n , 0 . 1 0 > P> 0 . 0 5 ) . When c o m p a r e d w i t h d i r e c t p l a c e m e n t i n m e t h a n o l ,l y o p h i l i z a t i o n p r o v i d e d 20% l e s s y i e l d o f e r g o s t e r o l , r e g a r d -l e s s o f t y p e o f s u b s e q u e n t s t o r a g e ( P < 0 . 0 5 f o r p o o l e dl y o p h i l i z a t i o n t r e a t m e n t s ) .D u r i n g t h e s t o r a g e e x p e r i m e n t s , we c o m p a r e d r e c o v e r i e sf o r s t a n d a r d e r g o s t e r o l , e i t h e r a d d i n g 5 0 , u g o f s t a n d a r d t om e t h a n o l - a l o n e p r i o r t o r e f l u x i n g o r a d d i n g i t a s a s p i k e t oe x t r a s a m p l e r e p l i c a t e s . R e c o v e r i e s f o r t h e t w o m e t h o d s o fa d d i t i o n w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t ( r a n g e , 9 5 t o 1 0 7 % ; n= 2 t o 3 ) .T i m e s o f h o m o g e n i z a t i o n w e r e t e s t e d a n d c o m p a r e d w i t hv a r i o u s p e r i o d s o f m e t h a n o l r e f l u x i n g o f u n h o m o g e n i z e ds a m p l e s i n s e v e r a l e x p e r i m e n t s ( T a b l e 2 ) . Two m i n u t e s o fh o m o g e n i z a t i o n ( t w o t i m e s ) i n m e t h a n o l wa s e n o u g h t o g i v ea maximum y i e l d o f e r g o s t e r o l f o r t h e t w o t y p e s o f d e a dp l a n t m a t e r i a l t e s t e d . R e f l u x i n g i n m e t h a n o l f o r 2 h g a v ey i e l d s e q u i v a l e n t t o h o m o g e n i z a t i o n . L o n g e r r e f l u x i n g d i dn o t c h a n g e y i e l d s . Mean v a l u e s f o r e r g o s t e r o l c o n t e n t( , u g g d r y w e i g h t ) i n t h e s t a n d i n g d e a d m a t e r i a l w e r e a sf o l l o w s : l e a v e s o f S . a l t e r n i f l o r a , 3 9 2 ; l e a v e s o f S . p a t e n s ,2 6 3 ; l e a v e s o f J . r o e m e r i a n u s , 2 0 2 ; s t e m s o f S . a l t e r n i f l o r a ,3 1 2 .We t r i e d m o v i n g d i r e c t l y t o t h e a l c o h o l i c - b a s e - h y d r o l y s i sr e f l u x i n g ( 3 0 m i n ) w i t h o u t h o m o g e n i z i n g o r c e n t r i f u g i n gs a m p l e s o f S . a l t e r n i f l o r a l e a v e s . T h i s p r o c e d u r e y i e l d e d a na v e r a g e o f 37% l e s s e r g o s t e r o l ( P < 0 . 0 5 ; n = 3 ) t h a n t h e 2x2 - m i n h o m o g e n i z a t i o n - c e n t r i f u g a t i o n p r o c e d u r e f o l l o w e d b ya l c o h o l i c - b a s e r e f l u x i n g o f s u p e r n a t a n t . We a l s o t e s t e d t h r e ed i f f e r e n t t i m e s ( 1 5 , 3 0 , a n d 6 0 m i n ) o f a l c o h o l i c - b a s e r e -f l u x i n g w i t h S . a l t e r n i f l o r a l e a f s a m p l e s , f o l l o w i n g 2 x 2 - m i nh o m o g e n i z a t i o n ; t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e amongmean y i e l d s o f e r g o s t e r o l ( P > 0 . 0 5 ; n = 3 ) , w h i c h w e r ew i t h i n 5 % o f o n e a n o t h e r .T h e l i t e r a t u r e s u g g e s t s t h a t e r g o s t e r o l s h o u l d n o t b ee x p o s e d t o l i g h t d u r i n g e x t r a c t i o n ( e . g . , r e f e r e n c e 2 3 ) . T h i sp r o b a b l y s t e m s f r o m t h e f a c t t h a t e r g o s t e r o l ( a l i a s p r o v i t a -m i n D 2 ) f o r m s v i t a m i n D 2 ( e r g o c a l c i f e r o l ) a n d t w o d i f f e r e n ts t e r o l s , b y wa y o f a n i n t e r m e d i a t e , u p o n e x p o s u r e t o UVi r r a d i a t i o n ( 6 , 2 5 ) . H o w e v e r , 2 h o f e x p o s u r e t o d i r e c t ,s i m u l i t e d , e q u a t o r i a l s o l a r UV i r r a d i a t i o n i s r e q u i r e d f o rp h o t o c o n v e r s i o n o f 50% o f p r o v i t a m i n D 3 ( 7 - d e h y d r o c h o -

l e s t e r o l ) ( 6 ) , a n d o u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t w i t h o u t s e v e r ee x p o s u r e s t o v e r y b r i g h t l i g h t , e r g o s t e r o l i s e v e n morer e s i s t a n t t o p h o t o c o n v e r s i o n l o s s e s ( T a b l e 1 ) . T h i s i s c o n -s i s t e n t w i t h t h e r e s u l t s o f N o u t e t a l . ( 1 5 ) ; 2 0 - h e x p o s u r e o fe t h a n o l s o l u t i o n o f e r g o s t e r o l ( 5 0 p . g * m l - ' ) t o d i f f u s e d a y -l i g h t l e d t o 1 . 6 % l o s s . T h e r e f o r e , o n e n e e d n o t b e o v e r z e a -l o u s i n p r o t e c t i n g e x t r a c t e d e r g o s t e r o l s a m p l e s f r o m l i g h t i nt h e l a b o r a t o r y . A l s o , e x t r a c t e d e r g o s t e r o l i s r e s i s t a n t t ol o s s e s i n d a r k s t o r a g e f o r a t l e a s t s e v e r a l d a y s , e v e n a t roomt e m p e r a t u r e ; t h u s , a s l o n g a s e v a p o r a t i o n i s p r e v e n t e d ,s a m p l e - p r o c e s s i n g s c h e d u l e s c a n i n c l u d e l e n g t h y i n t e r r u p -t i o n s b e f o r e i n j e c t i o n i n t o t h e HPLC s y s t e m .S a m p l e s i n t e n d e d f o r e r g o s t e r o l a n a l y s i s h a v e b e e nt r e a t e d f o r p r e e x t r a c t i o n s t o r a g e b y o v e n d r y i n g ( e . g . , r e f e r -e n c e s 9 a n d 1 6 ) , f r e e z i n g ( e . g . , r e f e r e n c e s 1 1 a n d 1 7 ) , a n dl y o p h i l i z a t i o n ( e . g . , r e f e r e n c e s 4 a n d 1 3 ) . O u r f i n d i n g s i n d i -c a t e t h a t a l l o f t h e s e t r e a t m e n t s , e s p e c i a l l y o v e n d r y i n g ,h a v e t h e p o t e n t i a l f o r l e a d i n g t o l o w e r r e c o v e r y o f e r g o s t e r o lf r o m p l a n t s a m p l e s . S i n c e e x t r a c t e d e r g o s t e r o l w i t h s t a n d sb o i l i n g i n m e t h a n o l ( 6 5 C ) f o r h o u r s , i t i s l i k e l y t h a t t h eo v e n - d r y i n g l o s s e s , a n d p r o b a b l y a l s o t h e f r e e z e - t h a w i n ga n d l y o p h i l i z a t i o n l o s s e s , o c c u r a s t h e l i v i n g f u n g a l m a s sw i t h i n t h e p l a n t s a m p l e s i s k i l l e d . O u r l y o p h i l i z a t i o n y i e l d sm i g h t h a v e b e e n h i g h e r i f t h e s a m p l e s h a d b e e n i n s t a n t l yf r o z e n , p r e v e n t i n g a u t o l y s i s . T h e o p t i m a l s t o r a g e p r o c e d u r ea p p e a r s t o b e t o p l a c e t h e s a m p l e s d i r e c t l y i n t o t h e e x t r a c t -a n t ( m e t h a n o l ) .L i p i d s , i n c l u d i n g s t e r o l s , a r e t r a d i t i o n a l l y e x t r a c t e d f r o mn a t u r a l t i s s u e s b y l e n g t h y e x t r a c t i o n o r b r i e f h o m o g e n i z a t i o ni n n o n p o l a r s o l v e n t s , i n c l u d i n g m e t h a n o l ( 2 , 1 9 ) . E a c h o ft h e s e m e t h o d s h a s b e e n u s e d a s p a r t o f e r g o s t e r o l a n a l y t i c a lp r o c e d u r e s ( 8 , 2 2 ) . O u r d i r e c t c o m p a r i s o n s o f t h e t w o t y p e so f p r o c e d u r e s ( T a b l e 2 ) s h o w t h a t t h e y c a n b e u s e d i n t e r -c h an g e ab l y a nd t h a t t w o 2 - m i n c y c l e s o f h o m o g e n i z a t i o n o r2 h o f m e t h a n o l r e f l u x i n g p r o v i d e s e q u i v a l e n t , m a x i m a ly i e l d s . T h i s w a s t r u e e v e n f o r h i g h l y l i g n i f i e d p l a n t m a t e r i a l s( e . g . , s t e m s o f S . a l t e r n i f l o r a ; s e e r e f e r e n c e 5 ) . D i r e c te x t r a c t i o n i n a l c o h o l i c b a s e ( s a p o n i f i c a t i o n r e a g e n t s ) , i nc o n t r a s t t o t h e f i n d i n g s o f N e s e t a l . ( 1 2 ) , g a v e r e du c e d y i e l d so f e r g o s t e r o l ; t h i s m ay h a v e b e e n a r e s u l t o f s t e r o l a d h e r e n c et o c o m p l e x p o l y s a c c h a r i d e m o l e c u l e s a t t h e s u r f a c e s o f p l a n tp a r t i c l e s ( 3 ) .

T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l S c i e nc e F o u nd at i o ng r a n t s O C E - 8 2 1 4 8 9 9 a n d O C E - 8 6 0 0 2 9 3 .We t h a n k J . D a v i d M i l l e r a n d c o l l e a g u e s a t t h e P l a n t R e s e a r c hC e n t r e , A g r i c u l t u r e C a n a d a , O t t a w a , f o r g e t t i n g u s s t a r t e d i ne r g o s t e r o l a n a l y s i s . E i l e e n H e d i c k p r e p a r e d F i g . 1 .LITERATURE CITED

1 . D i t t m e r , J . C . , a n d M. A . W e l l s . 1 9 6 9 . Q u a n t i t a t i v e a n d q u a l i -t a t i v e a n a l y s i s o f l i p i d a n d l i p i d c o m p o n e n t s . M e t h o d s E n z y m o l .1 4 : 4 8 2 - 5 3 0 .2 . E n t e n m a n n , C . 1 9 5 7 . G e n e r a l p r o c e d u r e s f o r s e p a r a t i n g l i p i dc o m p o n e n t s o f t i s s u e . M e t h o d s E n z y m o l . 3 : 2 9 9 - 3 1 7 .3 . G o n z a l e s , R . A . , a n d L . W. P a r k s . 1 9 7 7 . A c i d - l a b i l i z a t i o n o fs t e r o l s f o r e x t r a c t i o n f r o m y e a s t . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 8 9 :5 0 7 - 5 0 9 .4 . G r i f f i t h s , H . M . , D . G a r e t h - J o n e s , a n d A . A k e r s . 1 9 8 5 . Ab i o a s s a y f o r p r e d i c t i n g t h e r e s i s t a n c e o f w h e a t l e a v e s t o S e p t o -r i a n o d o r u m. A nn . A p p l . B i o l . 1 0 7 : 2 9 3 - 3 0 0 .5 . H o d s o n , R . E . , R . R . C h r i s t i a n , a n d A . E . M a c c u b b i n . 1 9 8 4 .L i g n o c e l l u l o s e a n d l i g n i n i n t h e s a l t m a r s h g r a s s S p a r t i n aa l t e r n i f l o r a : i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s a n d s h o r t - t e r m , p o s t - d e p o s i -t i o n a l c h a n g e s i n d e t r i t a l m a t t e r . M a r . B i o l . 8 1 : 1 - 7 .6 . H o l i c k , M . F . 1 9 8 4 . T h e p h o t o b i o l o g y o f v i t a m i n D 3 i n m a n , p .1 9 7 - 2 1 6 . I n R . Kumar ( e d . ) , V i t a m i n D . B a s i c a n d c l i n i c a la s p e c t s . M a r t i n u s N i j h o f f P u b l i s h i n g , B o s t o n .7 . L e e , C . , R . B . G a g o s i a n , a n d J . W. F a r r i n g t o n . 1 9 7 7 . S t e r o l

1 8 7 8 N O T E S


4/4

N O T E S 1 8 7 9d i a g e n e s i s i n r e c e n t s e d i m e n t s f r o m B uz z ar d s B a y , M a s s a c h u -s e t t s . G e o c h i m . C o s m o c h i m . A c t a 4 1 : 9 8 5 - 9 9 2 .8 . L e e , C . , R . W. H o wa r t h , a n d B . L . H o w e s . 1 9 8 0 . S t e r o l s i nd e c o m p o s i n g S p a r t i n a a l t e r n i f l o r a a n d t h e u s e o f e r g o s t e r o l i ne s t im a ti n g t h e c o n tr i b u ti o n o f f u n g i t o d e t r i t a l n i t r o g e n . L i m n o l .O c e a n o g r . 2 5 : 2 9 0 - 3 0 3 .9 . M a t c h a m , S . E . , B . R . J o r d a n , a n d D . A . W o o d . 1 9 8 5 . E s t i m a -t i o n o f f u n g a l b i o m a s s i n a s o l i d s u b s t r a t e b y t h r e e i n d e p e n d e n tm e t h o d s . A p p l . M i c r o b i o l . T e ch n o l . 2 1 : 1 0 8 - 1 1 2 .

1 0 . M i l l e r , J . D . , J . C . Y o u n g , a n d J . L . T r e n h o l m . 1 9 8 3 . F u s a r i u mt o x i n s i n f i e l d c o r n . 1 . T i m e c o u r s e o f f u n g a l g r o w t h a n dp r o d u c t i o n o f d eo x y n i v al e n o l a n d o t h e r m y co t o x i n s. C a n . J .B o t . 6 1 : 3 0 8 0 - 3 0 8 7 .1 1 . N a e w b a n i j , M . , P . A . S e i b , D . S . C h u n g , L . M. S e i t z , a n d C . W.D e y o e . 1 9 8 6 . E rg o s t e r o l v e rs us d r y m a t t e r l o s s a s q u a l i t yi n d i c a t o r f o r h i g h - m o i s t u r e r o u g h r i c e d u r i n g h o l d i n g . C e r e a lC h e m . 6 3 : 3 1 5 - 3 2 0 .1 2 . N e s , W. R . , I . C . D h a nu k a, a n d W. J . P i n t o . 1 9 8 6 . E v i d e n c e f o rf a c i l i t a t e d t r a n s p o r t i n t h e a b s o rp t i o n o f s t e r o l s b y S a c c h a -r o m y c e s c e r e v i s i a e . L ip i ds 2 1 : 1 02 - 1 06 .1 3 . N e w e l l , S . Y . , R . D . F a l l o n , a n d J . D . M i l l e r . 1 9 8 6 . M e a s u r i n gf u n g a l b i o m a s s d y n a m i c s i n s t a n d i n g - d e a d l e a v e s o f a s a l t - m a r s hv a s c u l a r p l a n t , p . 1 9 - 2 5 . I n S . T . Moss ( e d . ) , T h e b i o l o g y o fm a r i n e f u n g i . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s , N e w Y o r k .1 4 . N e w e l l , S . Y . , J . D . M i l l e r , a n d R . D . F a l l o n . 1 9 8 7 . E r g o s t e r o lc o n t e n t o f s a l t - m a r s h f u n g i : e f f e c t o f g r o w t h c o n d i t i o n s a n dm y c e l i a l a g e . M y c o l o g i a 7 9 : 6 8 8 - 6 9 5 .1 5 . N o u t , M. J . R . , T . M. G . B o n a n t s - V a n L aa r h o v e n , P . d e J o n g h ,a n d P . G . D e K o s t e r . 1 9 8 7 . E r g o s t e r o l c o n t e n t o f R h i z o p h o r u so l i g o s p o r u s NRRL 5 9 0 5 g r o w n i n l i q u i d a n d s o l i d s u b s t r a t e s .A p p l . M i cr o b i o l . B io t e ch n o l . 2 6 : 45 6 - 46 1 .1 6 . O c h o r , T . E . , L . E . T r e v a t h a n , a n d S . B . K i n g . 1 9 8 7 . R e l a t i o n -s h i p o f h a r v e s t d a t e a n d h o s t g e n o t y p e t o i n f e c t i o n o f m a i z ek e r n e l s b y F u s a r i u m m o n i l i f o r m e . P l a n t D i s . 7 1 : 3 1 1 - 3 1 3 .

1 7 . O s s w a l d , W. F . , W. H o l l , a n d E . F . E l s t n e r . 1 9 8 6 . E r g o st e r o l a sa b i o c h e m i c a l i n d i c a t o r o f f u n g a l i n f e c t i o n i n s p r u c e a n d f i rn e e d l e s f r o m d i f f e r e n t s o ur ce s. Z . N a t u r f o r s c h . T e i l C 4 1 : 5 4 2 -5 4 6 .1 8 . P o m e r o y , L . R . , a n d R . G . W i e g e r t ( e d . ) . 1 9 8 1 . T h e e c o l o g y o f as a l t m a r s h . S p r i n g e r - V e r l a g , N e w Y o r k .1 9 . R a d i n , N . S . 1 9 6 9 . P r e p a r a t i o n o f l i p i d e x t r a c t s . M e t h o d sE n z y m o l . 1 4 : 2 4 5 - 2 5 4 .2 0 . R o d r i g u e z , R . J . , a n d L . W. P a r k s . 1 9 8 5 . H i g h - p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f s t e r o l s : y e a s t s t e r o l s . M e t h o d s E n -z y m o l . 1 1 1 : 3 7 - 5 1 .2 1 . S e i t z , L . M . , H . E . M o h r , R . B u r r o u g h s , a n d D . B . S a ue r . 1 9 7 7 .E r g o s t e r o l a s a n i n d i c a t o r o f f u n g a l i n v a s i o n i n g r a i n s . C e r e a lC h e m . 5 4 : 1 2 0 7 - 1 2 1 7 .2 2 . S e i t z , L . M . , D . B . S a u er , R . B u r r o u g h s , H . E . M o h r , a n d J . D .H u b b a r d . 1 9 7 9 . E r g o s t e r o l a s a m e a s u r e o f f u n g a l g r o w t h .P h y t o p a t h o l o g y 6 9 : 1 2 0 2 - 1 2 0 3 .2 3 . S h a p i r o , B . E . , a n d M. E . G e a l t . 1 9 8 2 . E r g o s t e r o l a n d l a n o s t e r o lf r o m A s p e r g i l l u s n i d u l a n s . J . G e n . M i cr o b i o l . 1 2 8 : 1 05 3 - 1 0 5 6 .2 4 . S h e f f e r , M . , A . F r i e d , H . E . G o t t l i e b , A . T i e t z , a n d M. A v r o n .1 9 8 6 . L i p i d c o m p o s i t i o n o f t h e p l a s m a - m e m b r a n e o f t h e h a l o -t o l e r a n t a l g a , D u n a l i e l a s a l i n a . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 5 7 :1 6 5 - 1 7 2 .2 5 . T s u k i d a , K . 1 9 8 0 . A n a l y s i s o f v i t a m i n D 2 i s o m e r s . M e t h o d sE n z y m o l . 6 7 : 3 2 6 - 3 3 5 .2 6 . W e e t e , J . D . , a n d D . J . W e b e r . 1 9 8 0 . L i p i d b i o c h e m i s t r y o f f u n g ia n d o t h e r o r g a n i s m s . P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p . , N e w Y o r k .2 7 . W e s t , A . W . , a n d W. D . G r a n t . 1 9 8 7 . U s e o f e r g o s t e r o l ,d i a m i n o p i m e l i c a c i d a n d g l u c o s a m i n e c o n t e n t s o f s o i l s t o mon-i t o r c h a n g e s i n m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s . S o i l B i o l . B i o c h e m . 1 9 :6 0 7 - 6 1 2 .2 8 . Z e l l e s , L . , K . H u n d , a n d K . S t e p p e r . 1 9 8 7 . D i f f e r e n t i a l d e t e r m i -n a t i o n o f f u n g a l - a n d b a c t e r i a l b i o a c t i v i t y i n t w o s p r u c e f o r e s te c o s y s t e m s . Z . P f l a n z e n e r n a e h r . B o d e n k d . 1 5 0 : 2 5 3 - 2 5 7 .

V O L . 5 4 , 1 9 8 8

ergosterol measurement

Documents