escuela politÉcnica del ejÉrcitorepositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/2931/1/t-espe-030878...
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ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITOESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDADEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍAINGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
AISLAMIENTOAISLAMIENTO YY CARACTERIZACIÓNCARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICAMORFOLÓGICA YY ENZIMOENZIMO--
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍAINGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
FUNCIONALFUNCIONAL DEDE HONGOSHONGOS LIGNINOLIGNINO--CELULOLÍTICOSCELULOLÍTICOS PROCEDENTESPROCEDENTESDEDE LALA CORTEZACORTEZA DEDE ALISOALISO ((AlnusAlnus acuminataacuminata),), ARRAYÁNARRAYÁN ((MyrcianthesMyrcianthes halliihallii)) YYPUMAMAQUIPUMAMAQUI ((OreopanaxOreopanax heterophyllusheterophyllus)) PRESENTESPRESENTES ENEN MANCHASMANCHAS DEDEPUMAMAQUIPUMAMAQUI ((OreopanaxOreopanax heterophyllusheterophyllus)) PRESENTESPRESENTES ENEN MANCHASMANCHAS DEDEBOSQUEBOSQUE NATIVONATIVO DELDEL PASOCHOA,PASOCHOA, BAJOBAJO CONDICIONESCONDICIONES DEDELABORATORIOLABORATORIO..
ÉRIKA CRISTINA CASTILLO TAMAYOÉRIKA CRISTINA CASTILLO TAMAYO
SangolquíSangolquí, marzo 2011 , marzo 2011
1. INTRODUCCIÓN2. MATERIALESY MÉTODOS3 RESULTADOSY DISCUSIÓN3. RESULTADOSY DISCUSIÓN4. CONCLUSIONES5. RECOMENDACIONES
manejo
Preocupación
j
reciclaje
utilizaciónbasura
utilización
biorremediación
• 2004……. Mundo……. 1.600 millones de ton.• 2005……. Ecuador……194.400 ton.• 2007 Quito 1 550 ton• 2007…….Quito……….1.550 ton.
Mi idegradarían basura-desechos opción AprovechamientoMicroorganismos
g basura desechos orgánicos
Aprovechamiento materiales
En el presente trabajo, desarrollado a escala de laboratorio, se plantea elaislamiento y la caracterización morfológica y enzimo-funcional de hongos lignino-celulolíticos
(Cardona et al., 2004; Torres, 2005; El Universo, 2007)
• Descomposición de materiales lignino-celulósicos.
• Estudios sobre hongos lignino-celulolíticos.
Gé T i h d Ph h A ill F i• Géneros Trichoderma, Phanerochaete, Aspergillus, Fusarium yPenicillium.
• Técnicas en la reducción biológica: Fermentación en estadosólido y aplicación de enzimas purificadas.
• El uso de microorganismos potenciales degradadores deresiduos lignino-celulósicos se convierte en una opción viable.
(Vilches, 2002; Diorio et al., 2003)
Ai l t i f ló i i f i l t l dAislar y caracterizar morfológica y enzimo-funcionalmente, a escala de
laboratorio, tres cepas eficientes de hongos lignino-celulolíticos
procedentes de las cortezas de los árboles de aliso (Alnus acuminata),
arrayán (Myrcianthes hallii) y pumamaqui (Oreopanax heterophyllus)
presentes en manchas de bosque nativo del Pasochoa.
•Recolectar las muestras de las cortezas de los árboles de aliso (Alnus•Recolectar las muestras de las cortezas de los árboles de aliso (Alnusacuminata), arrayán (Myrcianthes hallii) y pumamaqui (Oreopanaxheterophyllus).
•Desarrollar, propagar y aislar las cepas lignino-celulolíticas fúngicasnativas a partir de las cortezas.
•Evaluar la capacidad lignino-celulolítica de las cepas fúngicasencontradas.
•Seleccionar tres cepas eficientes en la capacidad lignino-celulolítica ycaracterizarlas morfológicamentecaracterizarlas morfológicamente.
Hongos lignino-celulolíticosg g
á Actividad enzimática
Caracterización morfológica
V l á P h Volcán Pasochoa
Basidiomycetes
• Son una división del
Hongos imperfectos
• Comprenden más
Ascomycetes
C dSon una división delreino Fungi, incluyea los hongos queproducen basidios.
Comprenden másde 15.000 especiesdiferentes que seclasifican juntas
• Comprendenaproximadamente28.500 especies, sumicelio es septado yp
• Contienen a lasclásicas setas y
porque no seconoce en ellas lafase sexual dereproducción
micelio es septado yproducen ascasunicelulares, queforman esporas de
hongos consombrero.
reproducción. origen sexual.
(Pontón et al., 2002; Blanco et al., 2008)
• Teather y Wood (1982).• Hidrólisis de polisacáridos.• Zonas de aclaramiento
Prueba del Rojo Congo Zonas de aclaramiento.
• Sumner (1921).( )• Técnica analítica cuantitativa de azúcares reductores• Ácido 3,5-dinitro-salicílico (DNS)• D.O es proporcional a la cantidad de glucosa
Actividad celulolítica p p g
presente.
L l d l l lA ti id d • Lignina catalizada por un complejo extracelular.• La LiP fue la primera en descubrirse.• Oxidación del alcohol veratrílico a veratraldehído.
Actividad lignino
peroxidásica
(Hendricks et al., 1995; Quintero et al., 2006; Gaitán y Pérez, 2007; Pedroza et al., 2007; Villa, 2007; Moreno y Ospina, 2008; Córdoba, 2009)
ÓÓCARACTERIZACIÓNCARACTERIZACIÓN
MacroscópicaMacroscópica MicroscópicaMicroscópica
) Ti d hif b) l i ió d lCada microorganismo crecede manera diferente.
a) Tipo de hifa; b) la posición del olos esporóforos; c) la presencia deesporangióforo o conidióforo; d) laforma, tamaño y distribución de las
a) color; b) forma; c) tamaño;d) textura; e) olor y, f) brillo.
, yesporas y, e) la presencia o no derizoides.
(Val, 2002; Harris, 2008)
100x40x
El volcán Pasochoa posee unode los últimos remanentes debosque andino.
•Ubicado al sureste de la hoya deGuayllabamba, tiene una extensiónde 500 hectáreasde 500 hectáreas.
•Fuente principal de muchosd
•Árboles como el pumamaqui,el polylepis, el laurel y la palma estudios.el polylepis, el laurel y la palmade ramos han sido de interéscientífico.
Aliso (Alnus acuminata) Pumamaqui (Oreopanax heterophyllus)Arrayán (Myrcianthes hallii)( )Fuente: Ulloa y Møller, 2008
Pumamaqui (Oreopanax heterophyllus)Fuente: Aguilar et al., 2009
Arrayán (Myrcianthes hallii)Fuente: Bustamante, 2010
(Ecuadoronline, 1999)
Identificadas las tres especies vegetalesnativas del Ecuador, se tomaron pedazos delas cortezas de los tallos de diez árboles.
Los pedazos de cortezas fueron recolectadosLos pedazos de cortezas fueron recolectadosmanualmente y depositados en fundas de papel. Lasfundas fueron mantenidas a temperatura ambiente.
30 ºC72 h
30 ºC72 h
PDA, MACorteza
72 h
PDA, MA
72 h
Cepas purasCorteza
vegetal,
Cepas fúngicas
p
macroscópica microscópica
KOH 0,1 M
30 ºC72 h72 h
10040x
PDA, MACepas 5 ºC
AlmacenamientoAlmacenamiento100x40x
puras
(Gilman,1957; Barnett y Hunter,1972; Carrillo, 2003; Sánchez, 2007)
30 ºC 5 mL Rojo congo 1%72 h
j g15 min
Agar CMCCepa fúngica
Pruebascuantitativas
12 h5 ºC
Refrigeración Refrigeración
5 mL NaCl 2M15 min
(Gaitán y Pérez, 2007; Valencia, 2009)
CMCasa
30 ºC
1.000 µL CMC al 1%tampón Act-Na 50mM
SiembraSiembra60 mL caldo
nutritivo Cepa pura
IncubaciónIncubación
30 ºC31 h
extractoenzimático
1.000 µL
CalentamientoCalentamientopH= 5
50 ºC30 min
Cepa pura
1.000 µL avicel al 1%
avicelasa
µtampón Act-Na 50mM
5 min
250 L DNS
EnfriamientoEnfriamiento5 min
EbulliciónEbullición CentrifugaciónCentrifugación5.000 rpm
250 µL sobrenadante
5 minRX
250 µL DNS 10 min
EnfriamientoEnfriamiento Medición D.O.Medición D.O.5 min 540 nm5 min
2.500 µL H2Od
540 nm
(Miller,1959; Pedroza et al., 2007
60 mL caldo nutritivo
SiembraSiembra IncubaciónIncubación
30 ºC72 h
250 µLextracto
9,6 mL tampóntartrato-Na 0,1 M100 µL Tween 8015 µL alcohol
+ 4 g aserrín
pH=3
SiembraSiembra
Cepa pura
IncubaciónIncubación extractoenzimático
15 µL alcoholveratrílico 2 mM20 µL peróxido dehidrógeno 4 mM
CalentamientoCalentamientoEnfriamientoEnfriamiento CalentamientoCalentamiento30 ºC1 h
EnfriamientoEnfriamientoRX
Medición D.O.Medición D.O.
(Tien y Kirk, 1984; Villa, 2007)
330 nm
• Caracterización morfológica macro y microscópica fue realizada con la
colaboración de la Lic.Verónica Luna, del laboratorio DISerLAB.
• Desarrollo de los microorganismos en medio papa dextrosa agar (PDA),
durante 5 días, seguida de la observación bajo el microscopio.
Tabla 1Tabla 1 Frecuencia y porcentaje de hongos d ll d ú l di d l idesarrollados según los medios de cultivo
Medio de cultivo Frecuencia Porcentaje
Malta agar 38 66,7
Papa dextrosa agar 19 33,3p g
Total 57 100,0
T blT bl 22 F i t j d lTablaTabla 22 Frecuencia y porcentaje delnúmero de las resiembras de purificación
Resiembras Frecuencia PorcentajeResiembras Frecuencia Porcentaje
H1 0 23 40,4
H2 1 19 33,3
H3 2 14 24,6
H4 3 1 1,8
T l 57 100 0Total 57 100,0
Tabla 2 Tabla 2 Frecuencia y porcentaje de las especies vegetales
Especie vegetal Frecuencia Porcentaje
Aliso 18 31,6
Tabla 4Tabla 4 División familia o géneros de
Arrayán 10 17,5
Pumamaqui 29 50,9 Tabla 4Tabla 4 División, familia o géneros de las cepas purificadas
División o género Frecuencia Porcentaje
Pumamaqui 29 50,9
Total 57 100,0
gdel hongo
j
Trichoderma 12 32,4Fusarium 10 27 0Fusarium 10 27,0Aspergillus 6 16,2Trichothecium 1 2,7V i illi 1 2 7Verticillium 1 2,7Zygomycete 3 8,1Diplodia 1 2,7Drechslera 1 2,7Sordaria 1 2,7Ascomycete 1 2,7Ascomycete 1 2,7Total 37 100,0
FiguraFigura 11 Resultados de la actividad enzimáticacualitativa positiva de una cepa de Fusarium a las 72h de incubación
FiguraFigura 22 Resultados de la actividad enzimáticacualitativa negativa de una cepa de Aspergillus a las72 h de incubación
8,00 7,92
6,286,62
ÓLI
SIS
Trichoderma Diplodia
5,46
4,695,35
DE
HID
RÓ
1,572,07
1,641,43
1,43 1,401,91
2,892,18
1,581,59
1,61
2,592,24 2,29
O D
E H
. D(c
m)
Pm V
t
m F
s 1
l Zg
1
l Zg
2
m F
s 2
Ap
1
Ap
2
r T
c 1
Ar
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2
Al A
s
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c 3
m T
c 4
l Tc
5
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s 3
r T
c 6
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3
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p
m F
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s 6
m F
s 7
m F
s 8
m F
s 9
Fs
10
0 0 0
ÁM
ET
RO
Figura 3Figura 3 Diámetro de los halos de hidrólisis
MP
PPm
MA
l
MA
l
PPm
MPm
MPm MA
r PA
MA
l
M
MA
r
PPm
PAl
MPm
MA
r
MA
l
MPm PA
MPm
MPm
MPm
MPm
MPm
MPm
DIÁ
183,09
126 47L EN
Z)
Fusarium
Diplodia
126,47114,36
101,11 101,11 104,85
asa
(U/L Fusarium
39,18
55,48
43,48 43,93 47,5641,44
37 70D C
MC
a
Aspergillus
19,81 17,78 17,78
0,68 8,38
31,70 24,2318,12
25,7037,70
8,6111,78
7,25
TIV
IDA
D
MPm
Vt
PPm
Fs
1
PPm
Fs
2
MPm
Ap
1
MPm
Ap
2
MA
r Tc
1
PAr T
t
MA
l Tc
2
MA
l As
MA
r Tc
3
PPm
Tc
4
PAl T
c 5
MPm
Fs
3
MA
r Tc
6
MPm
Fs
4
PAl D
p
MPm
Fs
5
MPm
Fs
6
MPm
Fs
7
MPm
Fs
8
MPm
Fs
9
MPm
Fs
10
MA
l Zg
1
MA
l Zg
2
MA
l Zg
3
AC
T
Figura 4Figura 4 Actividad celulolítica CMCasa
M M M
Cepa fúngica
Figura 4Figura 4 Actividad celulolítica CMCasa
Fusarium
722,05
598 29
Fusarium
598,29U
/LE
NZ)
icel
asa
(
Trichothecium
148,89
120,8193 07
160,33
77 79 80 16 78 13
126,70103,94 110,96
141,99105,41
137,23
DA
D a
vi TrichotheciumVerticillium
Diplodia
Vt 1 2 1 2 1 t 2 As 3 4 5 3 6 4
Dp 5 6 7 8 9 0 1 2 3
93,0771,45
53,44 28,4268,8477,79
60,3580,16
36,57
78,13
99,64 24,68 23,21 23,21
AC
TIV
ID
MPm
V
PPm
Fs
PPm
Fs
MPm
Ap
MPm
Ap
MA
r Tc
PAr T
t
MA
l Tc
MA
l A
MA
r Tc
PPm
Tc
PAl T
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Fs
MA
r Tc
MPm
Fs
PAl D
MPm
Fs
MPm
Fs
MPm
Fs
MPm
Fs
MPm
Fs
MPm
Fs
1
MA
l Zg
MA
l Zg
MA
l Zg
Cepa fúngica
A
Figura 5Figura 5 Actividad celulolítica avicelasa
Cepa fúngica
gu a 5gu a 5 ct v a ce u o t ca av ce asa
A ill
16,30
14,23 14,46
U/L
EN
Z) Aspergillus
Fusarium
14,23
9,90ásic
a (U
6,787,17
4 48
5,965,61
6,12
8,77
4 41pero
xid
1,72 1,95
3,35 3,59
2,22 2,072,73
3,94
1,75
4,48
1,99
4,41
0,47 0,97 0,35 lign
ino
Zygomycete
MPm
Vt
PPm
Fs
1
PPm
Fs
2
Pm A
p 1
Pm A
p 2
MA
r Tc
1
PAr T
t
MA
l Tc
2
MA
l As
MA
r Tc
3
PPm
Tc
4
PAl T
c 5
MPm
Fs
3
MA
r Tc
6
MPm
Fs
4
PAl D
p
MPm
Fs
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MPm
Fs
6
MPm
Fs
7
MPm
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Pm F
s 10
MA
l Zg
1
MA
l Zg
2
MA
l Zg
3
VID
AD
P P M M M M M P M M M M M M M M MP M M M
Cepa fúngica
AC
TI
Figura 6Figura 6 Actividad lignino peroxidásica
Morfología macroscópica de la colonia
Morfología microscópicade la colonia
blanca algodonosa (torna decolor rosa-salmón).
Conidias septadas:17 a 28 x 2,5 a4 µm.
Micelio flocoso. Clamidosporas hialinas: 5 a 10 µm.
Mi idi 5 12 2 2 3 5
Fusarium 2Fusarium semitectum
blanca algodonosa (reversotinte púrpura).
Microconidias: 5 a 12 x 2,2 a 3,5µm.
Macroconidias septadas de 3 a 5Micelio aéreo flocoso.
Macroconidias septadas de 3 a 5septos fusiformes.
ill d ( C idióf hi liFusarium 1
amarilla verdosa (reversoamarillento.
verde oscura
Conidióforos hialinos.
Vesículas globosas a subglobosas:25 45 µm de diámetro
Fusarium oxysporum
verde oscura.
Aspecto polvoriento.
25-45 µm de diámetro.
Conidias: 3 a 6 µm, globosas asubglobosassubglobosas.
Aspergillus 1Aspergillus flavus
•De las cortezas de los árboles de aliso (Alnus acumicata), arrayán(Myrcianthes halii) y pumamaqui (Oreopanax heterophyllus) se obtuvieron 57cepas fúngicas.
•De las 37 cepas evaluadas semi-cuantitativamente, solamente 25 arrojaronresultados positivos Las cepas de Trichoderma presentaron los diámetros deresultados positivos. Las cepas de Trichoderma presentaron los diámetros dehalo de hidrólisis mayores.
•Las tres cepas que presentaron la mayor actividad carboximetilcelulasa•Las tres cepas que presentaron la mayor actividad carboximetilcelulasafueron Fusarium 2 (183,08 U/LENZ), Fusarium 7 (114,35 U/LENZ) y Diplodia(126,47 U/LENZ).
•La mayor actividad avicelasa la presentaron las cepas Fusarium 1 (722,04U/LENZ), Fusarium 2 (598,29 U/LENZ) y Trichothecium (160,32 U/LENZ).
•Las cepas con mayor actividad lignino peroxidásica fueron Aspergillus 1(16,29 U/LENZ), Aspergillus 2 (14,23 U/LENZ) y Fusarium 7 (14,46 U/LENZ).( , ENZ), spe g s ( , ENZ) y s ( , ENZ)
• Las cepas de Aspergillus 1 y Aspergillus 2 se mostraron como las más activasf t l CMC i lfrente al CMC y avicel.
• Fusarium semitectum (Fusarium 2) se presentó como un hongo blanco, contintes color durazno, actividad CMCasa de 183,08 U/LENZ; Fusariumoxysporum (Fusarium 1), hongo blanco con tintes rosados, actividad avicelasay p ( ) gde 722,04 U/LENZ y Aspergillus flavus (Aspergillus 1), hongo verde oliváceo averde amarillento, actividad lignino peroxidásica de 16,29 U/LENZ.
• Las cepas novedosas, en cuanto a la actividad enzimática, que se aislaron enesta investigación pertenecieron a los géneros Diplodia Verticillium yesta investigación pertenecieron a los géneros Diplodia, Verticillium yTrichothecium y constituyen fuentes promisorias de cepas fúngicas conpotencial capacidad degradadora de materiales lignino-celulósicos.
• Realizar la prueba de la actividad enzimática lignino• Realizar la prueba de la actividad enzimática ligninoperoxidásica, pasadas las 72 h de incubación.
• Complementar el estudio con la determinación de la cinética decrecimiento.
• Estudiar a géneros Diplodia, Trochothecium y Verticillium: hongos congran potencial lignino-celulolítico.
• Realizar la caracterización molecular de las cepas con mayorcapacidad enzimáticacapacidad enzimática.
•Diseñar un biorreactor: aplicación semi-industrial o industrial.
•Extender esta investigación con muestras vegetales de otrasmanchas de bosques nativos del área andinamanchas de bosques nativos del área andina,
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ESCUELA POLITÉCNICA ESCUELA POLITÉCNICA NACIONALNACIONAL
CARRERA DE ING. EN CARRERA DE ING. EN BIOTECNOLOGÍABIOTECNOLOGÍA