先端物性測定実習I

質量分析2エレクトロスプレーイオン化法

（ESI - Ion Trap）

•2011年度前期（月曜3限～5限）•担当：高山・野々瀬・高橋

•注射針先端に大きな電場勾配が生じ、静電気力が表面張力に打ち勝って、溶液が荷電液滴となって大気中に放出される。

•シリンジポンプによって、流量5～20μl/minで希薄溶液が注射針に送られる。

•注射針には周囲の電極に対して3～5ｋVの電位が印加される。

エレクトロスプレーイオン化法の原理

エレクトロスプレーイオン化法（ESI）とは、生体分子・有機分子を非破壊的に、溶液中から真空中へ導入するソフトなイオン化法である。大きな分子量を持ち、不揮発性で電荷を帯びる分子の質量分析にはきわめて有用である。

＋

－ ＋＋

＋

＋＋

＋＋

＋

＋

＋＋

＋

－

－

－

－

－

－

－

＋

＋

＋

高圧電源３－５ｋV

＋

－電子

電子

酸化

還元エレクトロスプレーイオン化法

の原理図

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋＋ ＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋

＋

＋＋ ＋

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

Taylor コーン

対極板

注射針

シリンジより送られてきた試料溶液

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋ ＋

＋

＋

＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋

•このような分裂過程が繰り返される。最後には孤立した分子イオンが生成される。

•液滴表面から溶媒分子が蒸発。

•溶媒の蒸発に伴って液滴のサイズが減少し液滴表面の電荷密度が増大。

•静電反発力が表面張力よりも大きくなると、荷電液滴はより小さなサイズの液滴にクーロン分裂。

荷電液滴から孤立分子イオンの生成

蛋白質は20種類のアミノ酸から構成される

酸性溶液中にある蛋白質では、リシン、ヒスチジン、アルギニンのR基およびN-末端のアミノ基にプロトンが付加する。

728.117+

773.616+

825.115+ 883.9

14+

951.813+

1031.012+

1124.711+

1237.010+

1374.49+

1546.28+

09123cyto mass00003.d: +MS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.08x10

Intens.

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z

エレクトロスプレーイオン化法（ESI)を用いた質量分析装置を用いて、蛋白質多電荷イオンのマススペクトルを測定する。

ESIによって蛋白質をイオン化すると多数のプロトンが付加した多電荷イオンが生成される。

蛋白質多電荷イオンの質量分析

H+H+

H+

H+

H+

H+H+

H+

H+

H+

H+

H+

Cytochrome cのマススペクトル分子量～12000 Da

N-H結合をレナード-ジョーンズ・ポテンシャルと仮定すると、次の式であらわされる。ここで、rはN原子とH原子との間の距離(核間距離)である。

化学結合は近距離力

)(321

4

)(4

2

2

0

2

Coulmb

0

2

Coulmb

arar

aZeU

arr

ZeU

612

JonesLenard 4rr

U

蛋白質多電荷イオンの構造を球だと仮定する。半径aの球の内部に電荷Zeが一様に分布しているとする。その場合のクーロンポテンシャルは、次の式であらわされる。

N - H

+ +++ +

+ ++ ++++++

++

+++

+++

クーロン力は遠距離力

+

N-H結合のレナード-ジョーンズ・ポテンシャルと蛋白質内の電荷によるクーロンポテンシャルを足し合わせたもの

+ +

+ + +

+ +

++

++

+++

++

++ +

+

++

N - +H

728.117+

773.616+

825.115+ 883.9

14+

951.813+

1031.012+

1124.711+

1237.010+

1374.49+

1546.28+

09123cyto mass00003.d: +MS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.08x10

Intens.

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z

Cytochrome c とは・・•シトクロムc（cytochrome c）は、ミトコンドリアの内膜に弱く結合しているヘム蛋白質の一種である。ミトコンドリア内で電子伝達系の構成要素を成す。

•分子量は１個あたり約12,000である。

•シトクロムcは高度に保存されたタンパク質で、動物、植物、単細胞生物など非常に多様な生物で確認されている。

Chain Sequence of Cytochrome c

Basic Residues; Lysine;K, Arginine;R, Histidine;H

104 residuesGDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGPNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITWKEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTEREDLIAYLKKATNE

•蛋白質ミオグロビン (myoglobin）リゾチーム (lysozyme）リゾチーム [S-S結合の解離したもの]

•ペプチドアンジオテンシン I (angiotensin I )

•試料溶液試料濃度 1～10μg/ml溶媒 メタノール + 純水（1％） + 酢酸（0.1～1％）

実習に用いる試料

616.1737.923+

771.522+

808.221+

848.520+

893.119+

942.718+

998.117+

1060.416+

1131.115+

1211.814+

1304.913+

1413.512+

myo mass00000.d: +MS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

8x10Intens.

600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z

Myoglobin とは・・・•ミオグロビン（myoglobin）とは筋肉中にあって酸素分子を代謝に必要な時まで貯蔵する色素タンパク質。

•1本のポリペプチド鎖と1分子のヘムからなる。

•分子量は１個あたり約17,000である。

Chain Sequence of Myoglobin

Basic Residues; Lysine;K, Arginine;R, Histidine;H

153 residuesGLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHPGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG

Lysozymeとは・・

•リゾチーム（Lysozyme）とは、真正細菌の細胞壁を構成する多糖類を加水分解する酵素である。ヒトの場合涙や鼻汁、母乳などに含まれている。工業的には卵白から抽出したリゾチームが食品や医薬品に応用されている。

•分子量は～14000amu。•酸性アミノ酸（Asp7、Glu2）に対して塩基性アミノ酸（Arg11、Lys6）の数が多いことと分子量の割にS-S結合が多いことが特徴である。

•食品添加物としては日持ちを向上させるために用いられる。•塩化リゾチーム（リゾチーム塩酸塩）は、グリコサミノグリカンを分解作用があるとして日本でも医薬品として広く用いられている。

Length;129 residuesSecondary structure; 41% helical (7 helices; 54 residues)10% beta sheet (9 strands; 14 residues)

Cystine;C, Disulfide bond;----

Reference; Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb)

Lysozymeの1次構造

OHHS

HN

OC

S

NH

CO

S HSOH

+OH

S

HN

OC

SH

NH

CO

SH SOH

+

Reduction of S-S bonds with DTT

HOSH

OHHS

Dithiothreitol(DTT)

1101.3

1193.0

1301.3

1431.3

1590.2

lysozyme mass 158vcap00000.d: +MS

362.9

845.5

955.3

1023.41102.0

1193.7

1302.1

1432.1

lysozyme+DTT mass 158vcap00000.d: +MS

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.58x10

Intens.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

8x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s]

Lysozymeのマススペクトル

S-S結合の切断前

S-S結合の切断後

m/z

ss

ss

ss

H+

H+H+

H+

Disulfide-intactlysozyme

H+

H+

H+

H+

H+

H+

Disulfide-reducedlysozyme

H+

H+

H+

H+

H+

H+S-S結合によって構造が固定されている内部のサイトにH+が付着できないH+間のクーロン反発が大きい 構造が柔軟

内部のサイトにもH+が付着できるH+間のクーロン反発が小さい

Angiotensin のマススペクトルアンジオテンシン (angiotensin) はポリペプチドの一種で、昇圧作用を持つ生理活性物質。

アンジオテンシンI～IVの4種がある。心臓収縮力を高め、細動脈を収縮させることで血圧を上昇させる。

アンジオテンシンIの1次構造Asp - Arg - Val - Tyr - Ile - His - Pro - Phe - His - Leu - OH

分子量～1300amu。

433.03+

487.3649.1

2+

ang mass00004.d: +MS

0

1

2

3

4

5

7x10Intens.

300 400 500 600 700 800 900 m/z

エレクトロスプレーイオントラップ型質量分析装置Bruker-Daltonics, HCT-ETD II

N2

He

PC Hub

ロータリーポンプ

Source CID

直流電源0－360V

＋

－

+++

エレクトロスプレー

キャピラリー

スキマー

電位勾配によって加速され、中性分子と衝突し、分解する

N2

N2

N2

N2

N2

N2

N2

433.03+

487.3

648.82+

angiotensin mass 129 vcap00000.d: +MS

269.1 380.0

433.03+

513.2

649.02+

784.3

angiotensin mass 230 vcap00000.d: +MS

110.1255.0 343.2

506.2

660.1

784.3

880.4 973.5 1119.41296.6

angiotensin mass 360 vcap00000.d: +MS

0

1

2

3

4

8x10Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

8x10

0

1

2

3

47x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s]m/z

m/z

Angiotensin I キャピラリー電圧依存性（スキマー電圧40V）

Vcap 129V

Vcap 230V

Vcap 360V

616.1

848.520+

893.119+

1060.416+

1131.015+

1211.714+

1304.813+

1413.412+

1541.811+

myoglobin mass 151vcap 00000.d: +MS

616.1893.119+

942.718+

998.117+

1060.416+

1131.015+

1211.714+

1304.813+

1413.512+

1541.911+

myoglobin mass 300vcap 00002.d: +MS

616.1 998.117+

1060.416+

1131.015+

1211.714+

1304.813+

1413.512+

1541.911+

1696.010+

myoglobin mass 360vcap 00000.d: +MS

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

8x10Intens.

0

1

2

3

8x10

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

8x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s]

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Time [s]m/z

m/z

Myoglobin キャピラリー電圧依存性（スキマー電圧40V）

Vcap 151V

Vcap 300V

Vcap 360V

Octapole Ion Guide

＋

＋＋

+

Quadrupole Ion Trap

++++検出器

432.8

433.4

433.8

angiotensin I mass 150vcap 430-440high res00000.d: +MS

0

1

2

3

8x10Intens.

430 432 434 436 438 440 m/z

648.9

649.2

649.8

650.2

angiotensin I mass 150vcap 645-655high res00000.d: +MS

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

8x10Intens.

644 646 648 650 652 654 m/z

Angiotensin I （z=2,3) １３C 同位体分布

3+

2+

1. これならわかるマススペクトロメトリー志田保夫 [ほか] 著 化学同人図書館配架場所 433.2||17

2. マススペクトロメトリーってなあに日本質量分析学会出版委員会編日本質量分析学会図書館配架場所 433.2||18

【参考文献】

レポートの課題・Angiotensin I1. ESI法によってangiotensin Iをイオン化すると、2個あるいは3個のプロトンが付加した多電荷イオンが生成する。一方、MALDI法によってイオン化すると、主として1価のイオンのみが生成する。これはなぜか。その理由について考察しなさい。

1. 試料分子中にプロトンが付加できるサイトは合計何カ所あるか。また、それはどこか。2. ガラスキャピラリー末端とスキマーとの間の電位勾配を大きくすると、イオンが電位勾配によってより大きく加速され、

中性分子との衝突エネルギーが増大する。その結果、イオンの分解反応が促進される。これによって、マススペクトルにどのような変化が観測されているだろうか。簡単に述べなさい。

・Myoglobin1. 得られたマススペクトルからMyoglobinの分子量を推定しなさい。2. ガラスキャピラリー末端とスキマーとの間の電位勾配を大きくすると、電荷数の小さいイオンの生成が促進される。その理由について述べなさい。

Lysozyme1. Lysozymeには4箇所のS-S結合が存在する。DTTによってS-S結合を切断すると、電荷数のより大きな多電荷イオンが観測される。その理由について考察しなさい。

1. Lysozymeの分子量は約14000ダルトン程度である。得られたマススペクトルから分子量を推定しなさい。2. S-S結合の切断前と切断後のマススペクトルにおいて、同じ電荷数（と思われる）イオンの分子量を比較すると、僅かにS-S結合切断後の場合の分子量が大きい。これはなぜか。理由を述べなさい。

終わり

御静聴をどうも有り難うございました。

次回からの実習を楽しみしていて下さい。