ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE

PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’ INGEGNERIA GENETICA

-PROTEINE DI INTERESSE TERAPEUTICO (anticorpi, insulina, ormone crescita).

-PROTEINE DI INTERESSE COMMERCIALE (enzimi).

-PROTEINE DA UTILIZZARE COME ANTIGENI PER LA PRODUZIONE DI ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI.

-REAGENTI PER LA RICERCA DI BASE E APPLICATA.

Applicazioni delle proteine ricombinanti

Sistemi di espressione

Procariotici (E.Coli)

Eucariotici:

Saccharomyces Cerevisiae (lievito)

Cellule di insetto (Baculovirus)

Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.)

Animali transgenici

Piante transgeniche

Per evitare degradazione di proteine eterologhe e per permetterne una più semplice purificazione, queste vengono prodotte come proteine di fusione con una proteina stabile dell’organismo ospite.

PROTEINE DI FUSIONE

Un TAG è una sequenza proteica con proprietà che ci permettono di purificare la proteina d’interesseTAG

TAG DIMENSIONE LIGANDO

GST 25 kDa glutatione

MBP 40 kDa amilosio

FLAG (DYKDDDDK) 8 aa Anticorpo monoclonale

specifico

His-tag 6-10 aa Ni2+

GST

β-Lattamasi

Dominio catalitico PTP1B

GST PT

P

PROTEINE DI FUSIONE

NELLA PRODUZIONE DI PROTEINE ETEROLOGHE IN BATTERI VENGONO UTILIZZATI SPESSO PROMOTORI FORTI E REGOLABILI

UNA PRODUZIONE CONTINUA DELLA PROTEINA PROVOCA:

-inibizione funzioni cellula-perdita energia-perdita plasmide

Forti– Alta affinità per l’RNA polimerasi– Legame forte – trascritto ad alta frequenza– Legame debole- RNA Pol si stacca, no trasc.

Regolabile– L’espressione può essere controllata dal ricercatore, tramite induttori e repressori

Lattosio

IPTG

1. TRASFORMAZIONE DEL VETTORE D’ESPRESSIONE (CODIFICANTE PER LA PROTEINA DI FUSIONE) IN OSPITE.

2. AMPLIFICAZIONE DEL CEPPO BATTERICO TRASFORMATO.

3. INDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.

4. PURIFICAZIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE.

ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA DI FUSIONE

Amp

Gene di interesse

1. TRASFORMAZIONE

E. Coli

Assunzione di DNA da parte di un organismo

1. TRASFORMAZIONE

12-16 ore

37°C

2-5x109 cellule

(N = N02n)

LB: Lysogeny Broth (Luria Broth) Tryptone (fonte aminoacidica) Estratto di lievito (vitamine e elementi in tracce) NaCl

2. AMPLIFICAZIONE

FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano)

FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante

PLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono

FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono

t

Uni

tà f

orm

anti

colo

nie

latenza

espo

nenz

iale

plateau

morte

IPTG2 ore37°C

3. INDUZIONE

DILUIZIONE

1:100

0 1 2

ore

asso

rban

za

LISI BATTERICA ED ESTRAZIONE DELLA COMPONENTE PROTEICA

10’

4000 rpm

supernatante

Pellet (batteri)1. Recupero batteri

2. Lisi

congelamento/scongelamento

Lisozima (1 mg/ml) (agisce sulla membrana esterna)

Sonicazione (ultrasuoni)

3. Recupero componente proteica

detergenti

30’

13000 rpm

Supernatante(proteine)

Pellet (membrane, DNA)

4. PURIFICAZIONE

AZIONE DEL LISOZIMA

PARETE Gram- LISOZIMA

Il lisozima è un enzima di 14,4 kDa presente in tessuti animali dotato di attività battericida. Lisa la parete batterica di alcuni batteri catalizzando l'idrolisi del legame beta 1,4 tra l’acido N-acetilmuramico (NAM) e la N-acetilglucosamina (NAG) che sono la componente principale delpeptidoglicano.

ESTRATTO PROTEICO

+ LAVAGGI con PBS

NaClKClNa2HPO4KH2PO4

GLUTATIONE IMMOBILIZZATO SU BIGLIE DI SEFAROSIO

3000 RPMRIMUOVO IL SUPERNATANTE CONTENENTE LE PROTEINE NON LEGATE

Immobilizzazione della proteina di fusione su supporto solido

SDS-PAGE(Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

POZZETTI PER CARICAMENTO

STACKING GEL

SEPARATING GEL

5. VERIFICA TRAMITE CORSA ELETTROFORETICA

TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8

ACRILAMIDE 5%

SDS

TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8

ACRILAMIDE > 5%

SDS

-

+

running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore.

stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza.

Loading buffer

50 mM Tris-HCl pH 6.8  2% SDS 

10% Glycerol  1% b-Mercaptoethanol 

12.5 mM EDTA  0.02 % Bromophenol Blue

+loading buffer

95° C

COME PREPARARE IL CAMPIONE PER LA CORSA

•L’ELEVATA TEMPERATURA ROMPE IL LEGAME TRA GST E BIGLIE DI SEFAROSIO•L’SDS DENATURA LA PROTEINA E ROMPE LE INTERAZIONI•IL BETA-MERCAPTOETANOLO RIDUCE GLI EVENTUALIPONTI DISOLFURO

+

CENTRIFUGANDO POSSIAMO ISOLARE IL SUPERNATANTE CONTENENTE LA PROTEINA

13000 rpm

PROTEINA NATIVA

RUOLO DELL’SDS NELLA CORSA

PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA

ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA

RAPPORTO CARICA/MASSA SIMILE PER TUTTE LE PROTEINE NEL CAMPIONE

L’SDS LEGA LE PROTEINE IN UN RAPPORTO DI UN ANIONE OGNI 2 aa

LE CARICHE E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA

La separazione avviene quindi per differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa carica per ogni proteina denaturata con SDS rimane costante.

Il trattamento con SDS elimina le differenze di forma, quindi la lunghezza della catena polipeptidica, che riflette la massa, e’ l’unico determinante della velocita’ di migrazione.

IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA

25 mM Tris HCl pH 8.3192 mM Glicina0.1% SDS

Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica negativamente e comincia a migrare con una certa velocità

pH 8.3

Arrivata al loading buffer e allo stacking (entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Cl- sono la specie più veloce

pH 6.8

pH 8.8

Cl-

Cl-Cl-

Cl-

Cl-

Cl- Cl-Cl-

Cl-

GlyGly Gly

Gly

Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse in una regione ad elevata mobilità elettroforetica

EFFETTO STACKING

All’inizio del separating gel il pH 8.8 riporta la glicina ad un rapporto carica/massa maggiore rispetto a quello delle proteine. La glicina supera i polipeptidi, che non trovandosi più in una regione ad elevata mobilità elettroforetica rallentano notevolmentee si ritrovano compattati in una linea molto sottile. Ora le proteine si trovano tutte allo stesso livello.Nel separating la concentrazione di acrilamide è più alta, e comincia la separazionedel campione in base al peso molecolare.

Cl-Cl- Cl- Cl-

Gly PROTEINECOLORANTE

Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il colorante lega arginina, istidina e aminoacidi aromatici, rendendo visibili le proteine su gel in base alla loro quantità.

APPLICAZIONI

1. SI PUO’ SFRUTTARE IL SUPPORTO SOLIDO PER ESPERIMENTI DI PULL DOWN

2. SI PUO’ ELUIRE LA PROTEINA LEGATA DALLA RESINA DI SEFAROSIOE UTILIZZARLA PER SAGGI ENZIMATICI

3. SI PUO’ SFRUTTARE IL PRINCIPIO DEL TAG PER ESPERIMENTI DI DOPPIO IBRIDO