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Fundamentos da Engenharia BioquímicaEscola de Química/UFRJ
Esterilização de Equipamentos e Meios
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1) Conceitos
• Porque esterilizar? Eliminar Microrganismos?
• Esterilização: Processo físico ou químico que destrói ou inativatodas as formas de vida (incluindo formas vegetativas e
esporuladas) presentes em um material
Material estéril é totalmente isento de que qualquer organismo ativo
• Desinfecção: Processo menos rigoroso de eliminação de
microrganismos envolvendo usualmente o uso de um agentequímico, denominado desinfetante ou germicida, geralmentelíquido e à temperatura ambiente ou moderada.
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1) Conceitos
• Desinfetante ou germicida: Agente químicocapaz de promover desinfecção;
• Antisséptico: Agente químico aplicávelem pessoas ou animais, comcapacidade de eliminarmicrorganismos patogênicos;
• Assepsia: Remoção de microrganismospatogênicos ou indesejados;
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2) Tipos de agentes contaminantes
• Inibitórios:- Competitivos- Contaminante libera substâncias inibitórias
• Deletério
• Levam a destruição do produto
• Dificultam a separação e reduzem a pureza do produto
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3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
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Esterilização de Equipamentos e Meios3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Calor úmido: desnaturação irreversível das proteínas (essenciais parasobrevivência e multiplicação celular);
- Função da hidratação da célula
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Esterilização de Equipamentos e Meios3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Calor úmido: desnaturação irreversível das proteínas (essenciais parasobrevivência e multiplicação celular);
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Esterilização de Equipamentos e Meios3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Calor úmido: desnaturação irreversível das proteínas (essenciais parasobrevivência e multiplicação celular);
- Função da hidratação da célula
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3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Calor seco: oxidação dos constituintes químicos;
- Mais lenta e menos eficaz;- Nível de hidratação tende a diminuir: proteção às proteínas;
- Pode ocorrer também coagulação de proteínas;• Radiação ionizante;
- Radiações: alfa, beta, gama; raios X; raios catódicos, etc;- Alvo principal: DNA;- Excitação de grupos químicos: produção de radicais químicosaltamente reativos → quebra de fita de DNA: mutações;
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3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Irradiação por luz ultravioleta
- UV absorvida pelos ácidos nucleicos: lesões- 220 a 330 nm: região “abiótica”; - Ação esterilizante :produção de ligações cruzadasentre pirimidinas adjacentes namesma fita de DNA, formandodímeros.
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Esterilização de Equipamentos e Meios3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Agentes químicos
- Óxido de etileno: agente alquilante
- Glutaraldeído: age na superfície das célulasinterações glutaraldeído-proteína: reação com grupos
amina livres das proteínas da camada depeptideoglicana
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Esterilização de Equipamentos e Meios3) Forma de atuação dos agentes esterilizantes
• Agentes químicos
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
A) Germicidas químicos
- Agem em temperatura ambiente Maior tempo de contato
- Capacidade sanitizante
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Propriedades físicas do material
Características químicas do ambiente
Tipo de microrganismoTempo X Concentração
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
A) Germicidas químicos
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
A) Germicidas químicos
- Agem em temperatura ambiente Maior tempo de contato
- Capacidade sanitizante
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Propriedades físicas do material
Características químicas do ambiente
Tipo de microrganismoTempo X Concentração
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
A) Germicidas químicos
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
A) Germicidas químicos
- Alto nível de atividade germicida:
Soluções aquosas de glutaraldeído;Peróxido de hidrogênio 6 a 30%;Ácido peroxiacético + peróxido de hidrogênio (0,1% e 1%)Dióxido de cloro (ClO2) 0,5% - altamente corrosivoSolução de Formaldeído (6-8%) – efeito cancerígeno
Uso: Esterilização de equipamentos
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
A) Germicidas químicos
- Nível intermediário de ação germicida:
Soluções hidroalcoólicas 70-90% etanol ou isopropanol;Solução aquosa de peróxido de hidrogênio 3 – 6%;Preparações fenólicas;Soluções com Iodo livre (40 a 50 ppm);
Uso: Desinfecção de áreas de laboratório, equipamentos e produção
- Nível baixo de ação germicida:Compostos quaternários de amônio (até 5%)
Uso: limpeza geral e manutenção
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
B) Agentes gasosos
- Não é o método de escolha em industrias de fermentação;
- Uso: assepsia de salas e laboratórios (vapores de formaldeido);
- Agentes gasosos principais:
Óxido de etileno: esterilização de artigos plásticos de laboratório e outrosmateriais;
Óxido de propileno: esterilização de alimentos;
Vapores de formaldeído e betapropiolactona: desinfecção de câmaras, salas eambientes.
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.1) Agentes Químicos
Ciclo de desinfecção/esterilização química de um equipamento:
- Desmontagem do equipamento;
- Limpeza dos componentes: remoção de resíduos (uso de detergentes);
- Lavagem dos componentes com água: remoção dos detergentes utilizados;
- Montagem do equipamento e introdução da solução aquosa germicida;
- Drenagem da solução desinfetante;
- Remoção dos resíduos através da circulação de água ou outro fluido estéril;
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4) Tipos de agentes esterilizantes4.2) Agentes Físicos
A) Calor seco
- Não se aplica para equipamentos;- Uso: filtros de ar, vidrarias, metais
e sólidos resistentes ao calor;
- Em fornos ou estufas (T > 150oC; t > 2 horas);
- Ausência de umidade transferência maior tempo maior probabilidadede calor lenta de formar esporos
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.2) Agentes Físicos
B) Calor úmido
B.1) Pressão atmosférica (até 100oC)
- Vapor fluente: 100oC, por 15-30 minNão é eficiente para esporos
- Pasteurização: TML < T < 100oC, por 15-30 minNão elimina todas os tipos de células;
Alternativa: UHT - leite
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Temperatura Mínima Letal (TML): É a menor temperatura na qual observa-se oinício da destruição do microrganismo por morte, através da ação do calor. ATML é característica do microrganismo e do meio
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.2) Agentes Físicos
B) Calor úmido
B.1) Pressão atmosférica (até 100oC)
- Tintalização: TML < Te < 100oC, por 15-30 min – 3 vezes consecutivasElimina esporos
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Temperatura Mínima Letal (TML): É a menor temperatura na qual observa-se oinício da destruição do microrganismo por morte, através da ação do calor. ATML é característica do microrganismo e do meio
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4) Tipos de agentes esterilizantes
4.2) Agentes Físicos
B) Calor úmido
B.2) Vapor saturado sob pressão (T > 100oC)
- Usualmente 121oC (1 atm) por 20 min
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4) Tipos de agentes esterilizantes4.2) Agentes FísicosC) Radiação
C.1) Radiação não ionizante: Ultravioleta
- Usos: esterilizar materiais sólidos (vidrarias, utensílios metálicos, embalagens)
e câmara de fluxo laminar;- Não pode ser usado na presença de pessoas;- Exposição do material pelo tempo adequado;- Capacidade de penetração baixa: superfície e ar ao redor são esterilizados;
C.2) Radiação ionizante: raios alfa, beta, gama, raios X
- Feito em câmaras especiais;- Material é colocado em uma esteira que circula no interior da câmara de
irradiação;- Usos: esterilização de vidrarias, metais, alimentos, etc.
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Materiais filtragens empregados:
- telas de asbesto – filtro Seitz- terras de diatomáceas – filtroBerkefeld
- porcelana – filtro Chamberland
- ésteres inertes de celulose –
filtro Millipore- fibras de vidro, discos de vidro,etc.
4) Tipos de agentes esterilizantes
4.2) Agentes Físicos
D) Filtração
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Esterilização de Equipamentos e Meios5) Modos de Esterilização do Meio e do Equipamento
5.1) Esterilização do fermentador e do meio separadamente
Esteriliza-se o fermentador por radiação, calor úmido ou método químico;
- Calor úmido
5.2) Esterilização do fermentador e do meio conjuntamente
Injeção de vapordireta
Válvula aberta
Injeção de vapordireta até P=1 atm
Válvula fechada Válvula fechada
testerilização a P=1atm
Entrada de ar estéril
Resfriamento
Meio decultura estéril
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Esterilização de Equipamentos e MeiosEsterilização de Equipamentos e Meios5) Modos de Esterilização do Meio e do Equipamento
5.2) Esterilização do fermentador e do meio conjuntamente
- Modo Descontínuo
A) Aquecimento B) Resfriamento
Agitação do meio é necessária!
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5.2) Esterilização do fermentador e do meio conjuntamente
- Modo Descontínuo
• Fases do modo descontínuo:a) Aquecimento
b) Esterilizaçãoc) Resfriamento
• Vantagem: evita perigo decontaminação
• Desvantagens:
- T alta por longo período;- Consumo de vapor elevado;- Tempo morto;- Corrosão (meio em contato com o reator);
qe
q
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5.2) Esterilização do fermentador e do meio conjuntamente
- Modo Contínuo 1o) Colocar em funcionamento
Vapor a 1 atm em todo o sistemaAr estéril no fermentador
2º) A esterilização do meio
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5.2) Esterilização do fermentador e do meio conjuntamente
- Modo Contínuo
Esquema de representação da variação da temperatura com o tempo
Vantagens do modo contínuo• Tempo em temperatura alta reduzido;• Vazão promove agitação;• Evita primeira etapa de cozimento de matérias-primas amiláceas;
• Dimensões pequenas: tubo pode ser constituído de ligas metálicasespeciais;• Economia de vapor e de água de resfriamento;
qe
q
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qe
q
qe
q
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
A velocidade de destruição pelo calor úmido de microrganismos presentesem um dado meio, depende de vários fatores, a saber:
a) do microrganismo (gênero, espécie, linhagens, idade da cultura,existência ou não de esporos);
b) do meio (composição, pH, presença de sólidos em suspensão);
c) da temperatura;
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Esterilização de Equipamentos e Meios
6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.1) Cinética de destruição
• Representação de um experimento com um microrganismo em um dadomeio submetido a uma temperatura constante.
• Destruição do microrganismo: reação de primeira ordem
N: número de microrganismos vivos existentes no meio após um tempo qk: constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo (min-1);
• k depende de: tipo de microrganismo, meio de cultivo e da temperatura
N k d
dN
q
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Esterilização de Equipamentos e Meios
6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.1) Cinética de destruição
• Se a Temperatura é constante:
No: número de microrganismos vivos existentes no meio antes daesterilização
N: número de microrganismos vivos existentes no meio após um tempo qk: constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo (min-1);
0
0
ln N ln N k
k log N log N
2,3
q
q
Ln( N)
q
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6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.2) Tempo de redução decimal
• Tempo de redução decimal (D): Tempo necessário para reduzir onúmero de microrganismos a 1/10 do valor original
k D
303,2
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.3) Dependência de k com a temperatura
• Segundo a Equação de Arrhenius
E
k A exp RT
A: constante empírica;R: constante universal dos gasesT: temperatura absolutaE: energia aparente de ativação de destruição do mo (kcal/mol).
Para muitos microrganismos E esta em torno de 65 a 85 Kcal/mol.
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.4) Destruição dos nutrientes do meio como consequência da esterilização
Ek A exp
RT
Composto Kcal/molVitamina A 14,6Ácido fólico 16,8Vitamina C 23,1
Kcal/molMicrorganismos 65-85
• Reações indesejáveis
• Quanto maior Te, menor é a destruição de nutrientes
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.4) Destruição dos nutrientes do meio como consequência da esterilização
No: número de mos viáveis inicial;Nf: número de mos após a esterilização;θ1: tempo para reduzir o no. de mos de No para Nf na temperatura T1;
θ2: tempo para reduzir o no de mos de No para Nf na temperatura T2>T1;k1: constante de velocidade de destruição de mos à temperatura T1;k2: constante de velocidade de destruição de mos à temperatura T2;Emo: energia de ativação de destruição dos mos;S0: concentração inicial do nutriente;S
1: concentração final do nutriente após o tratamento em T
1;
S2: concentração final do nutriente após o tratamento em T2;kS1: constante de velocidade de destruição de nutrientes à temperatura T1;kS2: constante de velocidade de destruição de nutrientes à temperatura T2;ES: Energia de ativação de destruição dos nutrientes < Emo;
Exercício: Prove que S2 > S1 Entrega: 31/05
E ili ã d E i M i
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Esterilização de Equipamentos e Meios
6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.5) Considerações sobre o cálculo do tempo de esterilização
T constante
1) Meios de fermentação não possuem apenas uma espécie demicrorganismo a ser destruída. Bacillus stearothermophilus esporulado
2) Escolhe-se o microrganismo de referência. k depende do meio e datemperatura.
N
N
k
0ln1
q
K = 1 min-1 (a 121°C) e E = 75 Kcal/mol
E ili ã d E i M i
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.5) Considerações sobre o cálculo do tempo de esterilização
T constante
3) Definição de esterilização - Ln (N0 /0) ?
Probabilidade de falha (P):Et = número total de operações de esterilização realizadas nas mesmas condições;Ef = numero de operações de esterilização que falharam, ou seja, não conduziram
a um meio estéril.P = E
f /E
t; multiplicando-se por 100, tem-se em percentagem;
Grau de esterilidade = N0/N
N
N
k
0ln1
q
Calcular o grau de esterilidade (No/N) para a uma esterilizaçãodescontínua, com eficiência h = 99,9999999999%
E ili ã d E i M i
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.6) Cálculo do tempo de esterilização – Processo descontínuo
Para calcular qe:Representação de T x q
N k
d
dN
q
)
ee
ek
R A
p
N
k
0ln
1q
E t ili ã d E i t M i
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
6.6) Cálculo do tempo de esterilização – Processo descontínuo
Para calcular qe:
1) Grau de esterilidade ou probabilidade de falha;2) Número de células vivas no meio (N0)
3) Temperatura mínima letal;4) Temperatura de esterilização;5) Curvas de aquecimento e resfriamento;6) Curva de destruição térmica;
Como resolver q d k
)ee
ek R A
p N
k
0ln1q
E t ili ã d E i t M i
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos
Tipo de transf. decalor
Perfil Temperatura - tempo Parâmetros
Vapor direto
Aquecimentoelétrico
Aquecimentoindireto com vapor
Resfriamento
indireto
0
aT T 1, 0
1 b
q q
)0T T 1, 0 a q
)NT T 1 b exp( a ) q
)e0T T 1 b exp( a ) q
(Hiperbólico)
(linear)
(exponencial)
(exponencial)
0 p
hs sa , b
MT C M
0 p
qaMT C
0 N
N
T TUAa , b
Mc T
0 e0
p e0
T Twc UAa 1 exp , b
M C wc T
h = Entalpia do vapor, relativa a temperatura domeio a esterilizar (kcal/kg);
s = Vazão mássica de vapor (kg/s, kg/min, kg/h);M = Massa inicial de meio (kg);T0 = Temperatura inicial (k);q = Taxa de transferência de calor (kcal/s);
U = coeficiente de transferência de calorglobal (kcal/(m2.h.oC));
A = área de transferência de calor (m2);TN = Temperatura da fonte de aquecimento (k);w = Vazão mássica do fluido refrigerante (kg/s, kg/min, kg/h);c´= calor específico do fluido refrigerante (kcal/(kg.oC));c = calor específico do meio (kcal/(kg.oC));Te0 = Temperatura de entrada do fluido refrigerante (k); = densidade do meio;C = capacidade calorífica do meio.
6.6) Cálculo do tempo de esterilização –
Processo descontínuo
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos6.6) Cálculo do tempo de esterilização – Processo descontínuo
Como resolver
- Resolução analítica
- Resolução numérica Valores de θ (em A e R), obtém-se T; Pela relação k=f(T), obtém-se k; Obtém-se k=g(θ)
Resolve a integração
q d k
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos6.6) Cálculo do tempo de esterilização – Processo descontínuo
Como resolver
- Resolução numérica Resolve a integração
q d k
12
)()(
x x
dx x f x f
n
x xh
b xa x
x f x f x f x f x f x f x f h
dx x f
n
n
nnn
b
a
0
0
123210
;
)()(4)(2...)(4)(2)(4)(3
)(
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Para calcular qe:
1) Grau de esterilidade ou probabilidade de falha;2) Temperatura de esterilização;
3) Curva de destruição térmica;
N
N
k ee
0ln1
q
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Esterilização de Equipamentos e Meios6) Cinética de destruição térmica de microrganismos6.6) Cálculo do tempo de esterilização – Processo contínuo
Para dimensionar o tubo de espera
Ve: volume de meio para encher o esterilizadord: diâmetro interno do tubo de esperau = velocidade do meio no tubo de esperaL = comprimento do tubo de esperam = viscosidade do meio na Te; = densidade do meio na Te;F = vazão volumétrica de meio no tubo de espera
e L
d
F
F d
d
q u
u
m
m
u
2
4
Re
4
Re
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14- Trata-se de dimensionar uma esterilização descontínua de 200 m3 de mosto a 120 C,
efetuada no próprio biorreator, em que o processo fermentativo passar-se-á a 25,5 C.A constante de velocidade de destruição dos esporos do contaminante pelo calor é dada pelaequação descrita abaixo, onde R= 1,98 cal/g mol K (constante dos gases perfeitos) e T é atemperatura absoluta em K . K = 7,94 x 1038 exp (-68,7 x 103 /RT) (min-1)A temperatura mínima letal do contaminante (forma esporulada) é 100 C, e as tabelas deaquecimento e resfriamento do mosto do fermentador são as seguintes:
Esterilização de Equipamentos e Meios
Considerando que o mosto inicial apresenta nível de contaminação de 2 x 105 esporos /ml e quesomente se admite uma possibilidade de falha no processo de esterilização em cada 20 dornasesterilizadas, informe:1) Qual o tempo de manutenção do mosto a temperatura de esterilização propriamente dita(120 C).2) Se a esterilização fosse processada em esterilizador contínuo a 120C e com as mesmasexigências de esterilidade, qual seria o comprimento da seção de espera (Diâmetro= 10 in),para assegurar uma vazão de 50 m3/h de mosto esterilizado? (Suponha não havercondensação de vapores no ejetor)
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14- Trata-se de dimensionar uma esterilização descontínua de 200 m3 de mosto a 120 C, efetuada no próprio biorreator, em que oprocesso fermentativo passar-se-á a 25,5 C.A constante de velocidade de destruição dos esporos do contaminante pelo calor é dada pela equação descrita abaixo, onde R=1,98 cal/g mol K (constante dos gases perfeitos) e T é a temperatura absoluta em K . K = 7,94 x 1038 exp (-68,7 x 103 /RT)(min-1)A temperatura mínima letal do contaminante (forma esporulada) é 100 C, e as tabelas de aquecimento e resfriamento do mosto dofermentador são as seguintes:
Esterilização de Equipamentos e Meios
Considerando que o mosto inicial apresenta nívelde contaminação de 2 x 105 esporos /ml e quesomente se admite uma possibilidade de falha noprocesso de esterilização em cada 20 dornasesterilizadas, informe:1) Qual o tempo de manutenção do mosto atemperatura de esterilização propriamente dita(120 C).2) Se a esterilização fosse processada em
esterilizador contínuo a 120C e com as mesmasexigências de esterilidade, qual seria ocomprimento da seção de espera (Diâmetro= 10in), para assegurar uma vazão de 50 m3/h demosto esterilizado? (Suponha não havercondensação de vapores no ejetor)
AQUECIMENTO RESFRIAMENTO
Tempo (min) Temperatura
(C) Tempo (min) Temperatura
(C)
80 100 0 120
81 102 1 118
82 103 2 116
83 105 3 114
84 106 4 112
85 108 5 109
86 109 6 106
87 111 7 104
88 112 8 102
89 113 9 101
90 115 10 100
91 116 20 77
92 118 45 40 92,5 120 60 25,5
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Esterilização de Equipamentos e Meios
AQUECIMENTO RESFRIAMENTO
Tempo (min) Temperatura (C) K(min-1) Tempo (min) Temperatura (C) K(min-1)
80 100 0,0317 0 120 3,6109
81 102 0,0521 1 118 2,2987
82 103 0,0667 2 116 1,4566
83 105 0,1087 3 114 0,9187
84 106 0,1384 4 112 0,5766
85 108 0,2239 5 109 0,2841
86 109 0,2841 6 106 0,1384
87 111 0,4560 7 104 0,0852
88 112 0,5766 8 102 0,0521
89 113 0,7282 9 101 0,0407
90 115 1,1575 10 100 0,031791 116 1,4566 20 77
92 118 2,2987 45 40
92,5 120 3,6109 60 25,5