estimation of copper in natural water and blood using anodic stripping differential pulse...

6
Feature Article Estimation of Copper in Natural Water and Blood Using Anodic Stripping Differential Pulse Voltammetry over a Rotating Side Disk Electrode Rajiv Prakash, R. C. Srivastava, and P. K. Seth Industrial Toxicology Research Centre, M.G. Marg, P.O. Box80, Lucknow-226001, India; e-mail: [email protected] Received: March 26, 2001 Final version May 29, 2001 Abstract Rotating disk electrode voltammetry RDEV) in conjunction with anodic stripping differential pulse voltammetry ASDPV) with a special type of gold side disk electrode has been evaluated for the direct estimation of copper in natural water i.e. river water and underground water) as well as in whole blood without any pretreatment. Copper is quantified with high reproducibility and reliability even below 5 ppb without any interference of the common ions or organic materials dissolved in the samples, i.e., natural water and blood. The voltammetric measurements were carried out using a conventional three electrodes cell i.e., gold as working, platinum as auxiliary and Ag/AgCl as reference electrodes) and the acidified sample. The major problem due to hydrogen evolution at cathode during the deposition of copper ions specially in acidified blood sample is overcome with the help of special design of rotating side disk gold electrode. A new type of rotating side disk electrode was designed to avoid the problem of gas bubbles interference in the stripping voltammetry. The shape, position and the rotation speed of the side disk electrode were optimized as per the requirement in the mild acidic condition. A simultaneous estimation of the zinc, lead and copper is also performed in aqueous sample with KCl as supporting electrolyte. The special design of working electrode and the modified voltammetric conditions are enhanced the sensitivity and reproducibility of the copper estimation at low ppb level with negligible interference. Keywords: Rotating disk electrode voltammetry, Anodic stripping differential pulse voltammetry, Three electrodes cell 1. Introduction It can be demonstrated experimentally in vitro that ex- cessive copper concentrations effect the stability of DNA, alter the fluidity of plasma membranes, inhibit various enzymes and diminish or enhance mitochondria respiration etc. [1]. Acute copper poisoning occurs when several grams of copper salt are ingested. Wilsons disease is the proto- typical disease caused by copper toxicosis, affecting first the liver and later the central nervous system, eyes and kidneys. Copper is also an essential element and the deficiency causes the ischemic heart disease [2]. Hence copper is an essential metal ion as well as toxic and the detection of copper in food, water as well as in blood is very important. However, the analysis methods used for the quantification of copper are based on costly and sophisticated instruments, viz. atomic absorption spectrometry AAS), inductively coupled plasma-mass spectrometry ICP-MS), neutron activation analysis NAA) [3]. The chemical or simple spectrometric analysis or ion-selective electrodes are not capable to detect copper in low ppb levels or it may be too complicated for practical applications [4, 5]. So far less efforts have been made in the development of cost-effective quick and sensitive techniques for the estimation of copper in the natural water and in biological samples. The electrochemical technique, e.g., stripping differential pulse voltammetry for the trace analysis of the metal ions has received considerable attention. It combines low work- ing and maintenance cost with good sensitivity, accuracy and precision [6, 7]. Voltammetric determination of surface active species may be done either by a positive potential scan anodic stripping voltammetry, ASV) or by a negative potential scan cathodic stripping voltammetry, CSV). These techniques are well known for the analysis of various metals, organic species and toxic chemicals etc. in variety of sample matrices from natural waters [8] to body fluids [9]. Anodic stripping voltammetry is based on the enrichment of the species to be determined prior to the voltammetric determination. It is a controlled electrolytic accumulation/ deposition of the metal ion at the working electrode such as hanging mercury drop electrode, metal or graphite electro- des or chemically modified electrodes) followed by electro- lytically stripping the accumulated species by imposition of a potential scan. The deposition/accumulation of the target species must be quantitative and reproducible, to get the correct and reproducible results. Estimation of metal ions or species in complex matrixes is possible mainly in mild to strong acidic electrolytes. In acid electrolytes the major problem occurs of the evolution of hydrogen gas at the ±ve electrode, where metal or species are depositing. Hence the H 2 evolution at the stationary working electrode at higher ± 303 Electroanalysis 2002, 14, No. 4 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69469 Weinheim, Germany, 2002 1040-0397/02/0402-0303 $ 17.50+.50/0

Upload: rajiv-prakash

Post on 06-Jun-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

������� �����

���� ����� �� ������ �� ������ ����� ��� ���� ����� �������������� ����������� ���� ���� ���� ���� � �������� ���� ��� ������������ ������ �� � ���������� ��� �� �� ���

�������� �� ����� �������� ������� ���� ����� ���� �� ��� ������ !""#��$� ����% �!&�' ��()*������$"+��������&

����)��' ����� "#� "��$,�� )����� ��� "-� "��$

�!������������ ��� �������� )���&&���� .�/012 � ���(������ �� ����� ���**�� �33������ *��� )���&&����.45/�12 �� � �*��� ��*� �3 ��� ��� ��� �������� ��� 6��� �)������ 3�� ��� ����� ���&���� �3 ��**�� ������� ���� .��� �)�� ���� ��� ����������� ����2 �� � �� � ��� 6��� ����� ��� *�������&���� ��**�� �7����3�� �� ��� ��*�����6�� ��� ���6�� �)�� 6�� 8 **6 ����� ��� ����3������ �3 ��� ��&&�� ��� �������� &������ ����)�� � ��� ��&*��� ���� ������ ���� ��� 6���� ��� )���&&���� &������&���� ��� ��������� ���� � ���)������ ����� ��������� �� .���� ��� �� ������ *����& �� �� ��� ��� 4�94�� �� ��3���������������2 ��� ��� ���3�� ��&*�� ��� &�(�� *��6�& ��� �� �������� �)����� �� ������� ����� ��� ��*������3 ��**�� ��� �*���� � ���3�� 6��� ��&*� � �)����&� �� ��� ��* �3 �*��� ����� �3 ������� ��� ��� ������������ 4 �� ��*� �3 ������� ��� ��� �������� �� ������� �� �)�� ��� *��6�& �3 ��� 6�66�� ����3������ ���� ���**�� )���&&����� ��� ���*�� *����� ��� ��� ������� �*��� �3 ��� ��� ��� �������� ��� �*�&:�� �� *����� ��7���&��� � ��� &� ���� �������� 4 �&�������� ���&���� �3 ��� :��� ��� ��� ��**�� � ��� *��3��&��� �7����� ��&*� �� ;� �� ��**����� ���������� ��� �*��� ����� �3 ����� �������� ��� ��� &��3��)���&&���� �������� ��� �������� ��� �����)�� ��� ��*�����6�� �3 ��� ��**�� ���&���� �� � **6 �)� �� ����6� ����3�������

"��#����$ ������� ��� �������� )���&&����� 4���� ���**�� �33������ *��� )���&&����� ����� �����������

%& '����������

�� ��� 6� ��&��������� � *��&����� � )��� ���� � !����)� ��**�� ������������� �33��� ��� ���6�� �3 /<4����� ��� 3���� �3 *��&� &�&6������ ��6� )�������:�&�� ��� �&��� �� ������� &��������� ���*��������� =$>� 4���� ��**�� *������ ������ ��� ��)��� ���&��3 ��**�� ��� ��� �������� ?���@� ������ � ��� *����!��*�� ������ ������ 6� ��**�� �� ����� �33����� 3��� ���)�� ��� ���� ��� ������ ���)��� �����&� ���� ��� ���������**�� � ��� �� ������� ��&��� ��� ��� ��3����������� ��� ����&� ����� ������ =">� A���� ��**�� � ��������� &��� �� �� � �� �� � ��� ��� �������� �3��**�� � 3���� ���� �� � �� � 6��� � )��� &*�������A� �)��� ��� ������ &������ ���� 3�� ��� 7����3������3 ��**�� ��� 6���� �� ����� ��� ��*�������� �����&�����):� ���&� �6���*��� �*�����&���� .4452� �����)�����*�� *��&�!&��� �*�����&���� .���!�52� ����������)���� ������ .<442 =B>� ��� ���&�� �� �&*��*�����&���� ������ �� ��!�����)� ��������� ��� �����*�6� �� ������ ��**�� � � **6 �)�� �� � &�� 6� �����&*����� 3�� *������ �**������ =C� 8>� 5� 3�� ����33���� ��)� 6���&��� � ��� ��)��*&��� �3 ����!�33���)�7��� ��� �����)� �����7��� 3�� ��� ���&���� �3 ��**��� ��� ������ ���� ��� � 6����� ��&*���

��� ���������&�� �����7��� ����� ���**�� �33������*��� )���&&���� 3�� ��� ����� ������ �3 ��� &��� ������ ����)�� ��������6� ��������� �� ��&6��� � ���!�� ���&��������� ���� �� ���� �����)��� �������� ���*������ =#� D>� 1���&&���� �����&����� �3 ���3������)� �*���� &�� 6� ���� ����� 6� � *���)� *���������� .����� ���**�� )���&&����� 4512 �� 6� � �����)�*������ ���� .������� ���**�� )���&&����� �512������ �����7��� ��� � ��� � 3�� ��� ������ �3 )�����&����� ������ �*���� ��� �� � ���&��� ���� � )����� �3��&*� &������ 3��& ������ ����� =�> �� 6��� 3��� =->�4���� ���**�� )���&&���� � 6���� �� ��� �����&��� �3��� �*���� �� 6� �����&��� *��� �� ��� )���&&���������&������ �� � � �������� ��������� ����&�����9��*����� �3 ���&��� �� �� ��� ����� �������� .���� �������� &������ ���* ��������� &��� �� ���*��� ������!��� �� ���&��� &��3�� ���������2 3�� �� 6� ������!����� ���**�� ��� ����&����� �*���� 6� &*����� �3� *������ ����� ��� ��*�����9����&����� �3 ��� �������*���� &��� 6� 7�������)� ��� ��*�����6�� �� ��� ���������� ��� ��*�����6� ������� 0��&���� �3&��� ��� ���*���� � ��&*� &��� �� � *���6� &��� � &� �������� ���� ����������� �� ��� ���������� ��� &�(��*��6�& ������ �3 ��� �)����� �3 �������� ��� �� ��� E)���������� ���� &��� �� �*���� ��� ��*������ A���� ���A" �)����� �� ��� ��������� ����� �������� �� ����� E

B�B

0����������� ())(� $C� <�� C F ?��0G!1�A 1���� �&6A� #-C#- ?����&� ���&���� "��" $�C�!�B-D9�"9�C�"!�B�B H $D�8�I�8�9�

)� *������ �33���� ��� ��*����� ��� &�� ����� ������*�����6� ������� �� �)�� ��� *��6�& � �� ��*� �3������� ��� ��� �������� ��� 6��� ������� �� ��� � �,���� $� 4 ��� ��� �� &6����� ��� 6����& ��� �3��� ��3�� ������ ��� ������� ��������� �� �����6� � �� 3��& ���� ��� ��3�� 6��� �� ������� ����������� �� � ������� ����&6� =$�>� ��� �:� ." &&��&����2 ��� �*���9������ ���*� �3 ��� ��� ��� ��������� 6� ���� �3 ��� ��)��� � *��&����� ��� ��������*��� �3 ��� �������� �� ��*� 3��& $��� �� "��� �*&��*����� �� ��� �������� �3 ��� ��������� ��� E)�*������ �**�� �� ��� ��������� ��� ������� &��� 6������ � ���� �3 ����� ���� �������� ��� ����� E)�*������� � ����� �� �)�� ��� ����3������ �3 ���������)������ ��� �� ����� �3 ��� ����� �������� ��� ����� &�� ��)������ � ��� *����� ��� ��*�����6����&���� �3 ��� �*����9&���� � ��� ���� ������������� 45/�1 �����7������ ��� *������ ��� � ��)� ��*����� ��� ���&���� �3

���� ��**�� � � **6 �)� � ��)���&���� ��&*�� �� � �� � ��� 6��� ���� &��� �����)� )���&&���������7��� ��**�� �� ���&���� ���� ����� ���**���33������ *��� )���&&���� � ���&� ���������� ���������� �� � �*��� ��*� �3 ������� ��� ��� ����������� ���� �� 4�94�� �� ��3������ �������� ���*����& �� �� ��� ��������� ��� 7�������)� ��*������3 ���� ��**�� �� ��� �*��� ��*� �3 ��� �������� �����)�� �� � �����)� *������ � ��� *������� �3 ��������������� ��������� �� ��� ��&� �������� � ��� �������������� ��� ����� ���� �� ���� 6� &*���� �33��!���� *��� )���&&����� ��**�� � ����� *��� ���6���)�� � *���)� *������ ����� ��� ���&���� 6��������� ������ &����� �3 ��� ��**��� ��� ���&���� ���� ��� 6��� ����� ��� *�������&��� � �������3������)�� � ��� &��3�� )���&&���� ������� ��� ������ �3 ��� ��� ��� ��� ��������� ���&�(�� *��6�&�3 ����)����� �3 ��� �������� ��� �� ��� ����� ������������� ��� ��*����� �3 ��**�� ��&�&:�� ���� �*�����*� �3 ������� ��� ��� ��� ��������� ��� ��&�)�� ����������� 6�66�� (��� �3��� �� 3��&����� 4 �&�����������&���� �3 ��� :��� ��� ��� ��**�� �� ��� *��3��&��� �7����� ��&*� �� ;�� �� ��**����� ����������

(& �*���� ����

(&%& �������� ��� ��������

��*�� ������ .���"2 �� �6����� 3��& 5�&� ���&!���� 5�� ����� J54� ���� ������ .�6<�B2� :�� ������.K��"2 ��� ;� ��� �6����� 3��& �� �� ����� ��������� B8L ���������� ��� .A�2 �� �6����� 3��&������ �����4 ��� ����� ���&��� ���� ����34���������� ��� ��� �������� �� ����������� � ��� �6���!

����� ��� �������� 6��� �� &��� 3��& � ��3�� ��� ������ .��8 �& ��&���� ��� 8 �& �����2� �7�**�� �� ���� ��������� �� ��� ��*� �� ������ �� ��� �����������&6� �� ��� � � ,���� $� ��� ��� ��� ." &&

��&����2 �� ���� �� �� ��� ��� 6����& �3 ��� ��� ��3�� ������ ��� ������� ��������� ��&��� �� ����)�� ��� ��� ��� ��� ���3��� �� *����� �� 3���&��� *�*�� 3�� �� 6� *����� �� ��&�� ����� �� �&���� 3����4�94�� ��3������ �������� ��� *����& ��� ��������

��� *�������� 3��& ������&� 5 �:������ 4 ������������&�� ��� �� ���� �)�� ��&*���� ����3��������������� D8D 14��&*������� ������&� 5 �:������

(&(& ���� ���� +������ ����

��� ����� ���**�� �33������ *��� )���&&���� �����!7�� �� ���*��� 3�� ��� ���&���� �3 ��� ��**�� � )�������&*��� ��� )���&&���� &������&���� ��� ���� � ������ �������� ���� ��&*���&��� ���������&�� ���������� �3 ����� �������� .���2 ��3������ ��������.4�94��2 ��� �� ��� �������� .*����&2 �� ���&��&*�������� "8 ��� ��� ���� ��&*� .8 &�2� � �����**�� ��� �� 6� ���&����� �� ���3�� �* �� ��$ � �������������� A� .B8L2� ��**�� �� ��*����� �� ���������� ��� �������� �����8 1����$�� 1 .)�� 4�94��23��&���3�� ���� ��&*� ��� "�L6��� ��&*� .� ��$�A�2 ���*���)�� ��� ��6��7����� ���**�� � ��� ��&�&���&� 4 ��� ������� �� ��� ��� �������� .$��� E"��� �*&2 �� �)�� �� ��&�)� ��� �������� ��� 6�66��� ��� 3��&�� ����� ��� ��*����� �� ��� ��� ���������4���� ���**�� �� *��3��&�� 6� �**��� ��� �33������*��� )���&&���� � ��� *������ ����� �� ��� ���� ���� �3$8 &19� 3�� �� 6� � �7�6����� �&� �3 8 � �� ��$ 1 .)��4�94��2� ��**�� � ����� *��� �� �6���)�� �� ��B8 1����8 1 .)�� 4�94��2�

,& ������ ��� ���������

4���� *������ ���� � �33������ *��� )���&&���� ���**�� 3�� ��� 7����3����� �3 ��**��� /�� �� ����&����� �3 ��� ��*���� ������� � �33������ *���)���&&����� ��� �**����� �3 ��� &������&��� &��� ���� �)��� &��� ���)����� ��� *���� ��� ��� &��� ����*����� ��**�� �� ���&���� � ��� ������ ���� ):������������ ���� ��� �)�� ���� ��� � ���@� ��� 6���

,�� $� 5���&��� �����&�3 ��� ��� ��� ����������������

B�C �� ����� �� ���

0����������� ())(� $C� <�� C

����� ��� *�������&��� ���� � ������� ��� ��� ����������� �� �����6�� �6�)� ����� � *��&����� ����������� *������ ��� 6� ����� ��'

��.�29��.��2�4��A������4� .�� �����)� *������2 .$2

����4��A ��.��2�4�� "� .�� *���)� *������2 ."2

��� �������� �� � ����� *������ )���� �� ��� �������3 ����������� ������������� ��&*������� ��� ��������&������� ���� ��� �6�)��������� $ ��� "&�� ����� � ��� �� ����� �3 ��� *������� 4� �*�&�& ������� ������6���� 3�� ��� ���&���� �3 ��**�� � ��� ����&���& �)�� � ��� �������� �� ���& ��&*�������� "8 ���4���� ���**�� )���&&���� � ��� �33������ *���

&��� �� *��3��&�� � ��� *������ ����� �3 � 1 �� ��8 1.)�� 4�94��2 �� � ���� ���� �3 $8 &19� 3�� �� 6� ���7�6����� �&� �3 8 � �� ��� 1 .)�� 4�94��2� ����7�6����� �&� �� 3���� �� 6� )��� &*������ � �������� 4 ��� 6��������� ������� �� �6���)�� ��� ���7�6����� �&� �� �)��� ��� �� *��6�6� ��� �� ���� ����� �3 ��� &*����� 3�� ��� ��� � ����� *������ �� 6�� ��� 1� ��� ��&�)� �3 &��� �3 ��� &*����������� 3������ � � 6��������� ������� ��� ����� � &�������� �� ���&��� ��**�� � � ������������� ��� *���������� )�� ��**�� ������������ *�� �� ���� 3�� ���7����3����� �3 ��**��� �� ��� &������&��� &���� ������*�������� 6�� ��� ��� ��**�� ������������ ��� �������� *��� ������� �� �6����� � � �� ����������������� .**62� ��� ��**�� ������������ � ��� ��&*�� ������&���� 6� � �������� ������ &����� �� ������� 3�� ���&��� ����������

,&%& -������������ �� ������ �� ������ �����

,�� ��� �**����� �3 ��� �����6�� �����7�� � ������ ����� ����������� ���� ��� �)�� ���� ��&*�� �������� ����� ��� *�������&��� 3�� ��� ���&���� �3 �����**���

������ ����������������

J���� ������ ���� ��&*� �� ���3�� .��$ �2 �����**�� ���&���� �� *��3��&�� �� �����6�� � � *��!&���� ������� 4���� ������� )�� *������ *�� ���������� ��� � *��� �� ��B8 1 .)�� 4�94��2 �**����� ����� � � ,���� "� .� ��� ������� *���2��� ��� ��&� ���� ������� 3��� �33����� ������������� �3

��**�� .� ��� ����� �3 $� **6 �� 8� **62 ��� ����� 6����*�� ��� ���� ��&*� )��&� �������� .�������� ���!��� &�����2 ��� ��� � *��&��� �� ��*����� �3��� ���������� �� �����&�� ��� ��**�� ������������ �3 �������������� ���� ��&*�� ��� ����� *���� 3�� ��������� �3 $� **6� "� **6� B� **6� 8� **6 ��� ���������� ��� � � ��� ,���� "� 6� ���)�� 3��& � �� *��� ��������� ����� *��� �������� ��� *��� ������� )�� ��**�������������� �� *����� .��6����� *��2 �� ��� � �

,���� "6� 4 ���� *�� �� �6���)�� ��� ��**�� �����&���� �� 8�$D **6 � ��� ����������� ���� ��&*� .3����� �)����� �3 ����� ��&*��� ��)���� �� ��� BL2�

������ ����� �����

�)�� ���� ��&*�� .������� 3��& ����� �33����� ���� �3��&� �)��� ������ ���� ����2 �� ���3�� .��$ �2�3��� 3������ 6� ������� 3��� *�*�� ��� ��**�� �����&���� �� �����6�� 3�� ����������� ���� ��&*�� ���� ����� ������� )�� *������ *�� �� �������� ��� � *���3�� ��**�� �� �6���)�� 3�� ��� ��&*�� �� ��� � �� ��� �� ,���� B� .� ��� ������� *���2��� ��� ��&� ������ 3��� �33����� ��� � �������������

�3 ��**��� ����� $� **6� "� **6� B� **6 ��� 8� **6 �������� �&�� �� ��� �6�)� �������� �3 ����������� ������ ��� � � ��� ,���� B� 3��& � �� *��� ������� �� �����*��� �������� 4 ���� *�� 3�� *��� ������� )�� ��**�������������� �� �6���)�� �� ��� � � ,���� B6 �����**�� �� ���&���� �� C�" **6 � �)�� ����� 4 ������6����� *�� ��&��������� ��� *�������� �3 ��� ����!

,�� "� �2 ������� )�� *������ ���*���� 3�� ���3�� �����!������ ���� ��&*� .� ��� ������� *���2 ��� �*��� �����&*� �� $�� "�� B� ��� 8� **6 �3 ��**�� ������������� .3��&� �� �� ����� �������2 �3��� � ��*����� *���� �3 #� ������� �����8 1 .)�� 4�94��2 �� $��� �*& �������� �������� ���*������ ���� �� �**�� � ��� ����� �3 ��$ �� ��8 1 .)�� 4�94��2 �� $8 &19� ���� ���� ����� �33������ *��� &����62 ��6����� *�� 3�� ��� 7����3����� �3 ��**�� � ��� �����!������ ���� ��&*��

B�8��**�� � <����� ?���� ��� ����

0����������� ())(� $C� <�� C

�7�� 3�� ��� �������� �3 ��**�� � ��� �)�� ���� .�)������3 ����� ��&*��� ��)���� �� ��� BL2�

,&(& ����� ������� �� ������ �� ����

��� 45/�1 �����7�� �� ��� ���� �� �����&�� ���*������� �3 ��**�� � ���@� 6��� ����� ��� *�������&�������@� 6��� �� ������� ��� ����� � $ '8 ���� �� ��$ �A� ��� ������ ���� 3�� ��� �����&����� �3 ��**�� �������6�� 3�� ���� ��&*��� ��� 6��� ��&*� �� �*��� �� $��� "��� B�� ��� C�� **6 �3 ��**�� ��� � ��� *�����**����� �� ��B8 1 .)�� 4�94��2 ��� �������� �������&�� ��� ������������ �3 ��**�� � 6��� �� ��� �� ,���� C� 4 "�� **6 ��**�� �� ���&���� � ��� "�L6��� ��&*�� ����� ��� ��**�� *������ � ��� ��� ���@�6��� �� ������ $C�� **6� ��� �� ��� )��3�� 6�������� �����)� &������

,&,& �� �������� ����� ������� �� ������ �� �����

4�&�������� �����&������3 ��**�� ���� �� :�� ������ ."�� **6 ����2 �� ������ ��� � ������ �7����������� ���� ��$ < ;� �� ��**����� ��������� �� ��� �� ��� ,���� 8��4 ��6����� ���)� �� *����� 3�� � �����&��� ��� � ��� ����� �3 8� **6 �� ��� **6 ��� ��� "� **6��&*� �3 :��� ��� ��� ��**�� ��� ��� ���&���� ������� � ��&*� �� ��� � � ,���� 86� 4 ��� ����� &������ ��� ���&���� ��� � 8L ������

,�� B� �2 ������� )�� *������ ���*���� 3�� ���3�� �)�� ������&*� .� ��� ������� *���2 ��� �3��� �*��� ��� ��&*� �� $��"�� B� ��� 8� **6 �3 ��**�� ������������� .3��& � �� �� ������������2 �3��� � ��*����� *���� �3 #� ������� �� ���8 1 .)�� 4�94��2 �� $��� �*& �������� �������� ��� *������ ���� ���**�� � ��� ����� �3 ��$ �� ��8 1 .)�� 4�94��2 �� $8 &19����� ���� ����� �33������ *��� &���� 62 ��6����� ���)� 3����� 7����3����� �3 ��**�� � ��� �)�� ���� ��&*��

,�� C� �2 ������� )�� *������ ���*���� 3�� ���3�� ���@� 6������ �3��� �*��� ��� ��&*� �� $��� "��� B�� ��� C�� **6 �3��**�� ������������� .3��& � �� �� ����� �������2 �3��� ���*����� *���� �3 #� ������ �� �$�� 1 .)�� 4�94��2 ��"��� �*& �������� �������� ��� *������ ���� �� �**�� ���� ����� �3 ��$ �� ��8 1 .)�� 4�94��2 �� $8 &19� ���� ��������� �33������ *��� &���� 62 ��6����� *�� 3�� ��� 7����!3����� �3 ��**�� � ��� ���@� 6����

B�# �� ����� �� ���

0����������� ())(� $C� <�� C

,&.& '����������

��**�� �� 7����3�� �� ��� ��*�����6�� ������6�� �)�� 6�� 8 **6 ����� ��� ����3������ �3��� ��&&�� ��� *������ � ��� ���� �� 6���� ):� ��������&� *������&� ����&� &������&� ��**��� :���������� 3������ ��3���� *���*����� ���6������ ���� �������3������ �3 ����� ��� ��� �6������ ���&������ ����� 3���� �� 6� ����6� 3�� ��� ��**�� �� ���&�������� ��� �����7���

.& ��������

4 �����)�� 7��� ��� ���6� )���&&���� �����7�� ���6��� ��)��*�� 3�� ��� 7����3����� �3 ��**�� � ������ ���� �� � �� � 6��� ���� � �*��� ��*� �3 ������� ������ ��� ��������� 4 &� ��� ������� ��� � �����)�*������ �� ���� �� &��� ��� ������ ���� 3����� ������!��:������� ��� �*��� ����� �3 ��� ����� ����������� &��3�� )���&&���� �������� �������� ��� ����!�)�� ��� ��*�����6�� �3 ��� �������� �� � **6 �)� �� ����6� ����3������� ��**��� ��� ��� :�� ��� ����&��������� ���&���� �� ��� �������� ��� ��*����!�6���

,�� 8� �2 ������� )�� *������ ���*���� 3��:��� ��� ��� ��**�� ."�� **6 ����2 � ��$ �;� ������ �3��� � ��*����� *���� �3#� ������� �� �$�$ 1 .)�� 4�94��2 �� $��� �*&�������� �������� ��� *������ ���� ���**�� 3��& ��� ��*����� *������ �� ��� 1.)�� 4�94��2 �� $8 &19� ���� ���� ������33������ *��� &���� 62 ��6����� *�� 3����� 7����3����� �3 :��� ��� ��� ��**��."� **6 ���� � ����� �� ����� �2 � ��$ � ;������� � ��� ����� �3 8� �� ��� **6�

B�D��**�� � <����� ?���� ��� ����

0����������� ())(� $C� <�� C

/& ���������

=$> �� 5�����6� ��������������� %01)� !� $#$8�="> �� �� ;�)��� "��� #$%� &��� '���� %00)� �(!� $-D�=B> �� 5�������)�� 1� 5�����)�� �� ��������)�� "���� �)�

"*�� %001� �+,� $-8�=C> �� �������� �� �� 5�)����)�� -� ����� ����� #��*���*�)� ())%�

� *�����=8> 16�� 5� ���� ��() �������� -� ����� ����� #��*���*�)�

()))� ,� "BC�

=#> �� M� 5� ���6���� �� A� ��:�� <� �� 5��������� "����� %00/���.� $#CD�

=D> �� �� ;�������� ,� �� <�(6� ,� 4� ����&&��� /������%00/� �,� --8�

=�> A� A����� �� ;� /����*��� "���� �)� "*�� %000� �!.� "D�=-> �� 1����� ��� ��� "���� �)� %022� �!(� "8�=$�> �� �������� �� �� 5�)����)�� �� ;� 5���� ����� �������

4**����� <�� ,01#20�...�

B�� �� ����� �� ���

0����������� ())(� $C� <�� C